CN110249226A - 评估患者样品中gfap状态的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的改进方法(例如用作创伤性脑损伤的度量或用于其它临床原因)。

Description

评估患者样品中GFAP状态的改进方法
相关申请交叉参考
本申请要求2016年10月3日提交的第62/403,293号美国临时专利申请和2017年2月6日提交的第62/455,269号美国临时专利申请的优先权，并且将这些申请的全部内容通过引用并入本文。
通过引用并入以电子方式提交的材料
本即时申请通过引用全文并入通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表。所述ASCII副本创建日期为2017年10月2日，名称为2017_10_02_12850W001-SEQ-LIST.txt，大小为4,317个字节。
技术领域
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法，例如作为创伤性脑损伤或其他临床原因的测量指标。
背景技术
在许多情况下，都需要观察创伤性大脑、脊髓和其他神经损伤。例如，军事领域护理人员报告称，受伤人员在经受颠簸和高振动的地面及空中运输时，脊柱和头部都会出现剧痛的反应。患者在医疗运输期间，经历反复冲击和振动，可能影响临床结果。脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)和/或其他严重神经损伤的受伤人员最容易受到车辆反复冲击和振动的伤害。神经元、轴突和星形胶质细胞损伤的流体标记物有助于诊断患者的脑震荡以及评估是否需要对其头部创伤进行影像检查，进而预测短期和长期临床结果，了解大脑TBI恢复的时间。目前备选的生物标志物的局限性在于血清检测中的敏感性以及对脑部的特异性不足，而且缺少测定标准。现场分析缺少评估TBI从特急性到急性损伤谱的急性标志物。而且，目前还没有办法确定轻度TBI(mTBI)在发生可导致创伤后应激障碍(PTSD)或慢性神经变性(慢性创伤性脑病(CTE)“拳击醉态”)的脑震荡后，是否会出现可持续性脑损伤。
在全球的军事领域、急诊室、住院医院、门诊诊所、运动场和竞技场中，轻度TBI或脑震荡的客观检测难度更大，成为日常中的挑战。脑震荡通常不会引起出血等大的病理情况，并且大脑的常规计算机断层扫描结果显示并无异常，而是突发神经元功能障碍，但在几天到几周内会自行消退。大约有15％的轻度TBI患者会持续存在认知功能障碍。
对于在现场、急诊室、住院医院和诊所、运动区和军事活动(例如军事战斗)中对轻度TBI患者进行评估的工具而言，这一需求尚未得到满足。
发明内容
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。本公开内容还涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋)状态改良评估方法，以此作为头部据知已经受到损伤的所述受试者创伤性脑损伤的测量指标。所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第一或第二特异性结合成员包含可检测标记；且
b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的数量为样品中存在的GFAP数量，并且可以利用可检测标记的可检测信号的数量作为创伤性脑损伤的测量指标，评估所述受试者的GFAP状态，
其中，这一方法(i)可测定高达50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)不需要稀释生物样品，(iii)使用现场即时装置即可进行。
本公开内容涉及测量从受试者采集的生物样品中的GFAP的方法，而且所述受试者头部可能受过损伤。本公开内容还涉及测量从受试者采集的生物样品中的GFAP的方法，而且，据知所述受试者头部受过损伤。该方法包括(a)从所述受试者身上采集生物样品，(b)将生物样品以任意顺序同时或依次接触：
(1)捕捉抗体：该抗体与GFAP或GFAP片段上的表位结合，形成捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)检测抗体：包含一个可检测标记，而且与GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕捉抗体-GFAP抗原检测抗体复合物，以及
(c)基于捕捉抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中GFAP的数量或浓度，其中，可以使用该方法测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法，以此作为所述受试者头部可能受到损伤的创伤性脑损伤的测量指标。本公开内容还涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋)状态改良评估方法，以此作为头部据知已经受到损伤的所述受试者创伤性脑损伤的测量指标。所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者身上采集的生物样品中至少一种生物标志物，其中至少有一种生物标志物为GFAP，并且其中，该方法(i)可以测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)动态范围为5个对数，(iii)在动态范围内呈线性。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法，以此作为头部可能受到损伤的受试者创伤性脑损伤的测量指标。本公开内容还涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法，以此作为头部据知已受到损伤的受试者创伤性脑损伤的测量指标。所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP特异性结合，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；且
b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，并且可以利用可检测标记的可检测信号的存在作为创伤性脑损伤的测量指标，评估所述受试者的GFAP状态，
其中，使用该方法可以测定水平不超过50,000pg/mL的GFAP水平，其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良测量方法，以此作为头部可能受到损伤的受试者创伤性脑损伤的测量指标。本公开内容还涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良测量方法，以此作为头部据知已受到损伤的受试者创伤性脑损伤的测量指标。所述方法包括以下步骤：
a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP特异性结合，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；
b)检测来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，并且
c)测量可检测标记中的可检测信号的数量为样品中存在的GFAP数量，并且可以利用可检测标记的可检测信号的数量作为创伤性脑损伤的测量指标，评估所述受试者的GFAP状态，
其中，所述分析能够测定数量不超过50,000pg/mL，体积小于20微升的测试样品的GFAP，并且其中所述分析的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
上述每种方法都能提供扩展检测窗口。扩展检测窗口是宽大的检测窗口，例如比现有技术测定更宽的检测窗口。具体而言，上述方法可以实施于任何受试者身上，而无需考虑受试者的临床状况、实验室检测值、临床状况和实验室检测值，TBI轻度、中度或重度，GFAP水平低或高，和/或受试者头部可能受到伤害事件发生的时间。上述方法还可以实施于任何受试者身上，而无需考虑受试者的临床状况、实验室检测值、临床状况和实验室检测值，TBI轻度、中度或重度，GFAP水平低或高，和/或受试者头部据知已受到伤害事件发生的时间。除此之外或作为另外一种选择，上述方法的检测限值(LoD)的下限大约为10pg/mL。
另外，上述每种方法均可以使用体积小于20微升的所述生物样品。
此外，上述每种方法均可用于测定选自以下范围的GFAP水平：约10pg/mL至50,000pg/mL，约20pg/mL至50,000pg/mL，约25pg/mL至50,000pg/mL，约30pg/mL至50,000pg/mL，约40pg/mL至50,000pg/mL，约50pg/mL至50,000pg/mL，约60pg/mL至50,000pg/mL，约70pg/mL至50,000pg/mL，约75pg/mL至50,000pg/mL，约80pg/mL至50,000pg/mL，约90pg/mL至50,000pg/mL，约100pg/mL至50,000pg/mL，约125pg/mL至50,000pg/mL，以及约150pg/mL至50,000pg/mL。
另外，在上述方法中，可以将第一特异性结合成员或第二特异性结合成员(无论哪种不包含可检测标记的成员)固定在实心载体上。
而且，在上述方法中，可以与一种或多种其他生物标志物一起评估GFAP。
并且，在上述方法中，不需要稀释生物样品。例如，在上述方法中，生物样品可选自全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品。在上述方法中，生物样品约为1至25微升。
此外，上述方法可以在大约5至20分钟内完成。或者，上述方法在大约15分钟内完成。或者，上述方法在大约不到30分钟内完成，例如大约不到25分钟，大约不到20分钟，或大约不到15分钟内。
另外，在上述方法中，可能无从得知获得生物样品与受试者可能已经受到头部损伤之间的时间有多久。或者，获得生物样品与受试者可能已经受到头部损伤之间的时间可能选自如下时间段：约0至12小时，约12至24小时，约24至36小时，约36至48小时，约48至72小时，约72至96小时，约96至120小时，约120小时至7天，约7天至1个月，约1个月至3个月，约3个月至6个月，约6个月至1年，约1年至3年，约3年至6年，约6年到12年，约12年到20年，约20年到30年，约30年到50年。或者，获得生物样品与受试者可能已经受到头部损伤之间的时间可选自如下时间段：不到50年，不到30年，不到20年，不到12年，不到6年，不到3年，不到1年，不到约6个月，不到约3个月，不到约1个月，不到约7天，不到约120小时，不到约96小时，不到约72小时，不到约48小时，不到约36小时，不到约24小时，或不到约12小时。
在上述方法中，生物样品可以在受试者可能受到头部损伤后获得，损伤原因包括物理振动、机械外力或其他导致闭合或开放性头部创伤的力所造成的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或其他类型的钝力创伤。
在上述方法中，可以在受试者摄入或接触化学品、毒素或化学物质和毒素的混合物后，获得生物样品。
在上述方法中，化学品或毒素可以是火、霉菌、石棉、农药、杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或上述物质的一种或多种混合物。
在上述方法中，可以从患有疾病的受试者中获得生物样品，疾病类型包括自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒、脑膜炎、脑积水或并发上述疾病。在上述方法中，疾病类型还包括血管损伤。
在上述方法中，可以进行确认是否存在创伤性脑损伤。例如，该方法可用于辅助受试者的诊断、风险判定、确认、评估和/或预测是否存在创伤性脑损伤。在上述方法中，该方法可用于评估头部损伤和/或脑震荡，预测是否需要进行影像检查，预测创伤性脑损伤的严重程度(例如轻度TBI)，以及预测创伤性脑损伤。
在上述方法中，创伤性脑损伤可以是轻度创伤性脑损伤。
在上述方法中，可以同时进行接触。或者，可以依次进行接触。
在上述方法中，可以通过在单个时间点测量GFAP的水平或量来评估状态。或者，在上述方法中，可以通过在多个时间点测量GFAP的水平或量来评估受试者的GFAP状态。
在任何上述方法中，第一特异性结合成员和第二特异性结合成员与人GFAP结合。
在任何上述方法中，第一特异性结合成员和第二特异性结合成员可能是抗体或抗体片段。例如，在任何上述方法中，第一特异性结合成员和第二特异性结合成员可各自为单特异性抗体，例如与人GFAP结合的单克隆抗体。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第一或第二特异性结合成员包含可检测标记；且b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的数量为样品中存在的GFAP数量，其中，这一方法(i)可测定高达50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)不需要稀释生物样品，(iii)使用现场即时装置即可进行。
本公开内容涉及测量从受试者采集的生物样品中的GFAP的方法。该方法包括(a)从所述受试者身上采集生物样品，(b)将生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)捕捉抗体：该抗体与GFAP或GFAP片段上的表位结合，形成捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)检测抗体：包含一个可检测标记，而且与GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕捉抗体-GFAP抗原检测抗体复合物，以及(c)基于捕捉抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中GFAP的数量或浓度，其中，可以使用该方法测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者身上采集的生物样品中至少一种生物标志物，其中至少有一种生物标志物为GFAP，并且其中，该方法(i)可以用来测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)动态范围为5个对数，(iii)在动态范围内呈线性。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；且b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，其中，这一方法可测定不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良测量方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，c)测量可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，其中，上述分析方法可测定不超过50,000pg/mLGFAP的数量，体积少于20微升的测试样品，其中所述分析方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法，以此作为人体受试者生物样品创伤性脑损伤的测量指标，其中所述受试者头部可能受到过损伤，或据知已经受到过损伤，所述方法包括以下步骤：(a)将人体受试者的生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)捕捉抗体：该抗体固定在实心载体上且与人GFAP上的表位结合，形成捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)检测抗体：包含一个可检测标记，而且与人GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕捉抗体-GFAP抗原检测抗体复合物，其中捕捉抗体和检测抗体为单克隆抗体，(b)基于捕捉抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中GFAP的水平，其中，该方法可以测定范围在5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度≤10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态测量方法，以此作为受试者创伤性脑损伤的测量指标，并且所述受试者头部可能受到过损伤，或据知已经受到过损伤，所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记，其中第一特异性结合成员固定在实心载体上；b)检测来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，c)测量可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，并且可以利用可检测标记的可检测信号的数量作为创伤性脑损伤的测量指标，评估所述受试者的GFAP状态，其中，所述分析能够测定动态范围在5pg/mL到50,000pg/mL的GFAP水平，例如约10pg/mL至50,000pg/mL或约20pg/mL到50,000pg/mL，并且使用体积小于20微升的所述生物样品，在动态范围内能保证精度≤10％CV，线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生至少一种第一特异性结合成员-GFAP-至少一种第二特异性结合成员的至少一种第一复合物，其中至少一个第一或至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；且b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的数量为样品中存在的GFAP数量，其中，这一方法(i)可测定高达50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)不需要稀释生物样品，(iii)使用现场即时装置即可进行。
本公开内容涉及测量从受试者采集的生物样品中的GFAP的方法。该方法包括：(a)从所述受试者身上采集生物样品，(b)将生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)至少一种捕捉抗体：该抗体与GFAP或GFAP片段上的表位结合，形成至少一种捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)至少一种检测抗体：包含一个可检测标记，而且与GFAP上未与至少一种捕捉抗体结合的表位结合，形成至少一种捕捉GFAP抗原-至少一种检测抗体复合物，以及(c)基于至少一种捕捉抗体-GFAP抗原-至少一种检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中GFAP的数量或浓度，其中，可以使用该方法测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者身上采集的生物样品中至少一种生物标志物，其中至少有一种生物标志物为GFAP，并且其中，该方法(i)可以用来测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)动态范围为5个对数，(iii)在动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；且b)评估来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，其中，这一方法可测定不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良测量方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，c)测量可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，并且可以利用可检测标记的可检测信号的数量评估所述受试者的GFAP状态，其中，上述分析方法可测定不超过50,000pg/mL GFAP的数量，体积少于20微升的测试样品，其中所述分析方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。该方法包括以下步骤：(a)将从人体受试者身上采集的生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)至少一个捕捉抗体：该抗体固定在实心载体上且与人GFAP上的表位结合，形成至少一个捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)至少一个检测抗体：包含一个可检测标记，而且与人GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成至少一个捕捉抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物，其中至少一个捕捉抗体和至少一个检测抗体为单特异性抗体，或者可以为单克隆抗体，(b)检测至少一个捕捉抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，其中可检测标记的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，(c)测量可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，其中，该方法可以测定范围大约在5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度小于10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良测量方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；其中至少一个第一特异性结合成员固定在实心载体上；b)检测来自该复合物或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中的可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，c)测量可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，其中，上述分析方法可测定动态范围大约在20pg/mL至50,000pg/mL，测试样品体积少于20微升的GFAP水平，并且精度小于10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者身上采集的生物样品中至少一种生物标志物，其中至少有一种生物标志物为GFAP，并且其中，该方法(i)可以用来测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)动态范围为5个对数，(iii)在动态范围内呈线性。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物；且b)检测样品中存在的一种或多种第一复合物，其中该方法：(i)可用于检测数量不超过50,000pg/mL的GFAP，并且不需要稀释生物样品；或(ii)可以用来测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性，或(iii)可以测定范围大约在5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度小于10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及受试者GFAP(胶质纤维酸性蛋白)状态改良评估方法。所述方法包括以下步骤：a)将所述受试者的生物样品以任意顺序与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生一种或多种包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物，其中第一特异性结合成员或第二特异性结合成员包含可检测标记；且b)评估一种或多种第一复合物中的信号，其中可检测标记中的可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP数量，其中该方法：(i)可用于检测数量高达50,000pg/mL的GFAP，并且不需要稀释生物样品；或(ii)可以用来测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性，或(iii)可以测定范围大约在5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度小于10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
本公开内容涉及测量从受试者采集的生物样品中的GFAP的方法。该方法包括(a)从所述受试者身上采集生物样品；(b)将生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)至少一个捕捉抗体：该抗体与GFAP或GFAP片段上的表位结合，形成捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)至少一个检测抗体：包含一个可检测标记，而且与GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成至少一个捕捉抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体-复合物，以及(c)基于至少一个捕捉抗体-GFAP抗原-至少一个第一检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中GFAP的数量或浓度，其中该方法：(i)可以用于测定数量不超过50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法的动态范围为5个对数，并且在所述动态范围内呈线性；或者(ii)可以测定范围大约在5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度小于10％CV，在动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
上述每种方法都能使用现场床边装置进行。在上述每种方法中，UCH-L1可以通过免疫测定或单分子检测测定进行检测。
附图简要说明
图1为GFAP校准曲线。
图2显示了正常(即表观健康)供体的GFAP样品分布情况。
图3为GFAP生物标志物描述情况。时间点如实施例3所述。
图4为箱线图，显示了患者群体中GFAP结果的广泛分布情况。采样时间点如图3所示。
图5显示了稀释液1中GFAP的预期浓度与实际观察浓度(如示例1所述)。
图6显示了稀释液2中GFAP的预期浓度与实际观察浓度(如示例1所述)。
具体实施方式
本公开内容涉及一种改良的检测、分析或检测并分析生物或测试样品中GFAP水平的辅助测定法。本文所述的改良测定法可以是该领域任何已知类型的测定法。理想的测定类型为免疫测定法。本改良式测定法可以出于任何目的，用于检测、分析或检测并分析或评估GFAP。在具体实施方案中，该改良测定法可用于检测、分析，检测并分析或评估生物或测试样品中的GFAP水平，从而快速诊断创伤性脑损伤(TBI)、监测病情进展和/或预测受试者的结局，无论受试者是疑似头部受伤还是已经受到实际伤害。
更令人想不到的是，该改良免疫测定法可用于在较大浓度范围测量或评估生物样品中水平较低的GFAP，从而提供更通用、更灵敏的测定分析，例如，用于辅助诊断和甄别患者的TBI类型。而且，所公开免疫测定法，浓度范围更大，能更加准确、灵敏地进行测定，并且可以选择用于辅助诊断和甄别患者的TBI类型，评估头部损伤和/或脑震荡情况，预测是否需要进行影像检查，预测创伤性脑损伤的严重程度，以及预测创伤性脑损伤。因此，所公开免疫测定法可用于在低水平或高水平GFAP下，测定稀释或未稀释样品中GFAP浓度，相对于对照或校准物样品，是否增加或降低，从而可选择性地用于确定患者的TBI。另外，所公开免疫测定法可在测定动态范围内保持线性。而且，所公开免疫测定法的动态范围不超过5个对数(即5-50,000)。例如，GFAP免疫测定法的使用可以辅助准确诊断患者TBI，并辅助患者的后续治疗。
先进的生物或测试样品GFAP水平测定方法(例如免疫测定)，可能无法检测超出本文所述改良测定法动态范围的GFAP水平。在这种情况下，必须在稀释后重新测量GFAP水平(例如，样品浓度超过检测上限)，或使用体积更大的样品(例如，测量的GFAP浓度低于检测限值(LoD))。重新测量会产生额外费用，而且会浪费时间，因此存在一定的问题，尤其是在使用这种测定法辅助诊断、监测病情进展或预测疑似或已确定受到TBI(或其他GFAP相关严重疾病或病症)，因为这时最为关键的便是快速准确、经济有效的检测。因此，改良测定法增加或扩大了该领域已知测定法的动态范围，能减少重新测定的次数，而且可以快速准确、经济有效地辅助患者的诊断工作，包括创伤性脑损伤患者，和有此需要的受试者。
所公开测定法在现有的已知测定法基础上，进行了诸多改进。具体而言，所公开测定法，动态范围更大，灵敏度更高。首先，所公开测定法的检测限值(LoD)的下限为约1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、15pg/mL、20pg/mL、25pg/mL或30pg/mL。另外，所公开测定法的动态范围为不超过5个对数(即5pg/mL-50,000pg/mL)。所公开改良测定法的具体实例是免疫测定法，其LoD约为10pg/mL或20pg/mL。改良测定法的另一个具体实例是动态范围不超过5个对数的免疫测定法。所公开测定法，对低端灵敏度进行了改良，因而可以避免本文先前讨论的重新测量样品的问题。此外，生物或测试样品不论是否稀释，所公开测定法均可进行测定，因为其对稀释没有要求。
另外，所公开改良测定法能快速进行测定，并且自开始进行测定到取得结果，用时大约不到5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟和20分钟。所公开改良测定法的具体实例是免疫测定法，在开始不到10分钟，便可取得结果。所公开改良测定法的另一个具体实例是免疫测定法，其LoD约为10pg/mL，而且不到10分钟便可取得结果。所公开改良测定法的另一个具体实例是免疫测定法，其LoD约为20pg/mL，而且不到10分钟便可取得结果。
由于所公开测定法能快速进行测定，并且很快便能取得结果，因此可以控制测定产生的信号量，从而减少信号的过饱和现象。与该领域的已知测定法相比，所公开测定法能减少信号的过饱和现象，所以与现有的已知其他测定法相比，所公开测定法的钩状效应更低。
所公开改良测定法在较大浓度范围测量或评估生物样品中水平较低的GFAP时，相比该领域的其他已知测定法而言，能提供更通用、更灵敏的创伤性脑损伤评估结果。因此，所公开测定法测定浓度范围的增加，提供了更加准确和灵敏的测定，从而辅助诊断和甄别患者的创伤性脑损伤。因此，所公开改良免疫测定法可用于在低水平或高水平GFAP下，相对于对照或校准物样品，测定稀释或未稀释样品中GFAP浓度是否增加或降低，从而用于确定患者的TBI。
摆脱理论的束缚，所公开改良测定的改进有诸多因素的推动。一个关键原因便是测定时间缩短，从而减少了钩状效应的发生。通过该领域已知的其他方法(例如，增加缀合物浓度)也可以避免钩状效应(或前带现象)，但有些方法可能破坏测定的低端灵敏度，而且可能导致高端信号的饱和现象。但在本案例中，特别注意保持测定的低端灵敏度，例如通过优化测定中所用试剂的浓度。此外，还特别注意筛选对GFAP具有不同结合特异性的抗体，允许抗体结合不同的位点，从而既可以用于捕捉，也可以用于检测。这种优化工作使用该领域的常规技术便可实现。
此外，有发现表明，使用至少两种与GFAP分解产物(BDP)内的非重叠表位结合的抗体(例如由GFAP蛋白质序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸60-383定义的38kDa BDP)，有助于维持免疫测定的动态范围和低端灵敏度。一方面，至少两种抗体结合38kDa BDP N末端附近的非重叠表位。另一方面，至少两种抗体结合SEQ ID NO：1氨基酸60-383之间的非重叠表位。另外，至少一种第一抗体(例如捕捉抗体)结合38kDa BDP的N-末端附近的表位，并且至少一种第二抗体(例如检测抗体)结合与第一抗体不重叠的38kDa BDP中间附近的表位。另外，至少一种第一抗体(例如捕捉抗体)结合SEQ ID NO：1氨基酸60-383之间的表位，并且至少一种第二抗体结合与第一抗体不重叠SEQ ID NO：1氨基酸60-383之间的表位。第一抗体结合的表位，长度可以是10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。第二抗体结合的表位，长度可以是10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。该领域的技术人员使用该领域已知的常规技术，便可以轻松确定与SEQ ID NO：1氨基酸60-383定义的38kDa BDP内的非重叠表位结合的抗体。
也可以选择其他抗体，同样可以帮助维持免疫测定的动态范围和低端灵敏度。例如，选择与38kDa BDP的N-末端附近的表位结合的至少一种第一抗体(例如捕捉抗体)以及与第一抗体不重叠的38kDa BDP中间附近的表位结合的至少一种第二抗体(例如检测抗体)，也能起到相同的作用。其他变化也是可能的，而且普通技术人员便可轻松测试出来(例如，使用本文示例1中所述的方法)。例如，通过检测与短肽的结合，然后使用较低校准物浓度筛选抗体对，确认抗体与不同表位结合。此外，筛选对GFAP具有不同亲和力的抗体，也有助于维持或增加测定的动态范围。文献中对GFAP抗体进行了描述，现可在市场上买到(例如，本文第4.e章节)。
本章节及本文的整个公开内容使用的章节标题只是为了组织的目的，而不应该被解释成限定本申请所描述的主题。
1.定义
除非另有说明，否则，本文使用的所有技术和科学术语，含义与该领域普通技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。下文描述了理想的方法和材料，但在实践中或测试本公开发明时，可使用与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献皆通过整体引用并入本文。本文公开的材料、方法和示例只是为了便于说明，而非限定本申请所描述的主题。
本文所用术语“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“包含”及其变体形式为开放性过渡短语、术语或词组，不排除其他行为或结构的可能性。单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象，除非上下文另有说明。本公开内容视其他“包含”、“组成”和“基本组成”本文介绍的实施例或要素为实施例，无论是否明确阐述。
文中数字范围的叙述明确包括范围之间具有相同精度的每个中间数。例如，对于范围6-9，除了6和9之外，同样包括数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
“亲和力成熟抗体”在本文中指一个或多个CDR中具有一个或多个变化形式的抗体，与不具有变化形式的母体抗体相比，所述变化形式抗体对靶抗原的亲和力(即KD、kd或ka)更高。典型的亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔亲和力，甚至皮摩尔亲和力。该领域已经掌握了多种产生亲和力成熟抗体的程序，包括筛选使用生物展示而制备的组合抗体库。例如，Marks等人，BioTechnology，10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域混编促使亲和力成熟。CDR和/或框架残基群的随机诱变的描述文献包括：Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene，169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.，155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.，154(7)：3310-3319(1995)；以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992).美国专利编号6,914,128 R1中介绍了在选择性诱变位置和具有活性增强氨基酸残基群的接触或超突变位置发生的选择性突变。
本文中使用的“抗体”，是指单克隆抗体、单特异性抗体(例如，既可以为单克隆抗体，也可以是普通生殖细胞产生抗体之外的其他方法所产生的抗体)、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的抗体)、动物抗体(例如但不限于：鸟类(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)、或者非人灵长类(例如，猴子、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(“sdFv”)和抗独特型(“anti-Id”)抗体、双域抗体、双重可变域(DVD)或三重可变域(TVD)抗体(双重可变域免疫球蛋白及其制备方法的描述文献为Wu，C.，等人，NatureBiotechnology，25(11)：1290-1297(2007)和PCT国际申请WO 2001/058956，所述文献内容各自通过引用并入本文)，或者域抗体(dAbs)(例如文献Holt等人(2014)Trends inBiotechnology 21：484-490)中描述的抗体)，包括软骨鱼类和骆驼科动物中天然存在的单域抗体sdAb，或者纳米抗体、VHH或其他域结构之类的合成抗体)，以及任何上述功能活性表位结合片段。另外，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类的蛋白分子。为了简便起见，文中对抗分析物的抗体通常称为“抗分析物抗体”或更简化的“分析物抗体”(例如抗GFAP抗体或GFAP抗体)。
本文中使用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。这部分抗体不包括完整抗体Fc区的恒重链域(即，CH2、CH3或CH4，具体取决于抗体类型)。抗体片段的示例包括但不限于：Fab片段、Fab’片段、Fab’-SH片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、双链抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含一个轻链可变域的单链多肽、含有轻链可变域的3个CDR的单链多肽、仅含一个重链可变区的单链多肽，以及含有重链可变区的3个CDR的单链多肽。
“曲线下面积”或“AUC”是指ROC曲线下的面积。ROC曲线下的AUC是对精确度的度量。AUC为1表示测试完美，AUC为0.5，表示测试无意义。理想的AUC可能为至少约0.700、至少约0.750、至少约0.800、至少约0.850、至少约0.900、至少约0.910、至少约0.920、至少约0.930、至少约0.940、至少约0.950、至少约0.960、至少约0.970、至少约0.980、至少约0.990，或至少约0.995。
文中交替使用的“珠”和“颗粒”指大体为球形的实心载体。珠或颗粒的示例为微粒。本文中使用的微粒可以是该领域任何已知的类型。例如，珠或颗粒可以是磁性微珠或磁性颗粒。磁性微珠/颗粒可以是铁磁性、亚铁磁性、顺磁性、超顺磁性或磁性流体。典型的铁磁材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁性材料示例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(或FeO·Fe2O3)。珠芯可以是具有磁性的实心部分，并且被一层或多层非磁性材料包围。或者，磁性部分可以是一层围绕非磁芯的材料。微粒的尺寸可以是适合本文所述方法的任意尺寸，例如，约0.75-5nm，或约1-5nm，或约1-3nm。
本文中的“结合蛋白”指的是与结合配偶体结合形成复合物的单体或多聚体蛋白质，例如多肽、抗原、化合物或其他分子，或任何一种底物。结合蛋白与结合配偶体特异性结合。结合蛋白包括抗体及其抗原结合片段，及其在该领域已知并于下文所述的其它各种形式和衍生物，以及包含一个或多个结合抗原分子或抗原分子上特定位点(表位)的抗原结合结构域的其他分子。因此，结合蛋白包括但不限于：抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植性抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体，以及保留结合抗原能力的任何此类抗体的片段。
本文中的“双特异性抗体”指的是通过以下技术产生的全长抗体：quadroma(细胞杂交瘤)技术(参见Milstein等人，Nature，305(5934)：537-540(1983))，两种不同单克隆抗体的化学交联法(参见Staerz等人，Nature，314(6012)：628-631(1985))，或knob-into-hole(杂二聚技术)或类似方法，在Fc区引入突变(参见Holliget等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(14)：6444-6448(1993))，产生多种不同的免疫球蛋白种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。双特异性抗体有两个结合臂(一对HC/LC)，其中一个结合臂结合一个抗原(或表位)，另一个结合臂(不同的一对HC/LC)结合另一种抗原(或表位)。通过该定义可以看出，一个双特异性抗体有两个不同的抗原结合臂(特异性和CDR序列中皆为如此)，并且对于其结合的每种抗原都具有单价性。
本文中的“CDR”指的是抗体可变序列内的“互补决定区”。在重链和轻链的每个可变区，都存在三个CDR。从重链或轻链的N-末端开始，每个可变区可表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。本文所用的术语“CDR集”是指在结合抗原的单个可变区中出现的三个CDR集合。因此，抗原结合位点可包括六个CDR，重链和轻链可变区各有一个CDR集。包含单个CDR的多肽(例如，CDR1、CDR2或CDR3)可称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析证明，CDR的氨基酸残基群与结合的抗原形成广泛的接触点，其中最广泛的接触点是与重链CDR3的接触点。因此，分子识别单元可能是抗原结合位点特异性的主要原因。通常，CDR残基群直接以最显著的方式影响抗原结合。
根据不同的系统，这些CDR的准确边界，确立的也有所不同。Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)及(1991))所描述的系统，不仅提供了明确的残基群编号系统，适用于抗体的任何可变区，而且还准确确立了三个CDR的残基群边界。这些CDR又可以称为“Kabat CDR”。Chothia及其共同工作者(Chothia以及Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)；以及Chothia等人，Nature，342：877-883(1989))发现，尽管Kabat CDR有多种氨基酸序列，但其中的某些亚部分，肽骨架构象几乎相同。这些亚部分被命名为“L1”、“L2”和“L3”，或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”表示轻链和重链区域。这些区域可以称为“Chothia CDR”，边界与Kabat CDR重叠。Padlan，EASEBJ.，9：133-139(1995)，以及MacCallum，J.Mol.Biol.，262(5)：732-745(1996)介绍了与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界。其他CDR边界的定义可能并未严格遵循本文中的系统，但仍然会与Kabat CDR重叠，尽管有预测或实验结果表明，特定残基群或残基群组，甚至整个CDR并不会显著影响抗原结合，但可能会缩短或延长。本文使用的方法可以利用根据任意系统定义的CDR，尽管某些实施例使用的是Kabat-或Chothia-定义的CDR。
“变异系数”(CV)又称“相对变异性”，等于分布的标准偏差除以其平均值。
“组分”或“至少一种组分”基本指的是捕获抗体、检测抗体或缀合物、校准物、对照物、灵敏度试片、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅助因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如溶液)、终止溶液等，根据本文所述的方法和本领域已知的其他方法，可以放入测定样品的试剂盒中的成分，例如患者尿液、全血、血清或血浆样品。某些组分可以加入溶液中或冻干进行重组后，再用于测定。
本文所用的“CT扫描”是指计算机断层扫描(CT)扫描。CT扫描是一组从不同角度拍摄的X射线图像，然后使用计算机处理技术，创建人体内的骨骼、血管和软组织的横断层面影像或切片。CT扫描可以使用X射线CT、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机轴向断层扫描(CAT扫描)或计算机辅助断层扫描。CT扫描又分为常规CT扫描或螺旋式CT扫描。常规CT扫描逐层地进行扫描，每经过一层，扫描便会停止，然后向下移动到下一层，例如，从腹部上部向下移动到骨盆。常规CT扫描需要患者屏住呼吸，避免运动产生的伪影。螺旋式CT扫描以螺旋方式拍摄进行连续扫描，由于扫描图像连续，因此很快便能完成。
本文所用的抗体“衍生物”指的是在天然抗体或亲本抗体基础上，氨基酸序列发生一个或多个改变，域结构发生变化的抗体。衍生物仍然呈现天然抗体中存在的典型域构型以及氨基酸序列，并且能够特异性结合靶标(抗原)。典型的抗体衍生物有偶联到其他多肽上、重排抗体域或抗体片段的抗体。抗体衍生物也可以包含至少一种其他化合物，例如，通过共价或非共价键连接的蛋白质结构域。连接方式可以根据该领域已知的方法进行遗传融合。含有抗体的融合蛋白中存在其他结构域，可以优选通过柔性连接头(最理想的是肽接头)进行连接，其中所述肽接头包含多个肽键合的亲水氨基酸，其长度足以跨越蛋白质结构域肽C-末端与抗体N-末端(或反向)的距离。抗体可以与具有构象适合于生物活性或选择性结合实心载体、生物活性物质(例如细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物的效应分子进行连接。
本文所用的“滥用药物”指的是出于非医学原因(例如，娱乐和/或改变心智效果)而摄取的一种或多种成瘾物质(例如毒品)。过度使用或依赖此类滥用药物的行为通常称为“药物滥用”。滥用药物的例子包括酒精、巴比妥酸盐、苯二氮、大麻、可卡因、致幻剂(如氯胺酮、墨斯卡灵、五氯苯酚、赛洛西宾、二甲基色胺及/或麦角酰二乙胺)、安眠酮、阿片类药物、安非他命(包括去甲麻黄碱)、合成代谢类固醇、吸入剂(即含有精神活性特性挥发性物质的物质，例如亚硝酸盐、喷漆、清洁液、记号笔、胶水等)及上述物质的组合物。
“双特异性抗体”在本文中指的是有两个结合臂(一对HC/LC)，两个结合臂分别结合两个不同的抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT publication WO 02/02773)。因此，双特异性结合蛋白有两个相同的抗原结合臂，特异性和CDR序列相同，并且对于其结合的每种抗原表现为二价。
“双重可变域”在本文中指的是与蛋白上的两个或两个以上的抗原结合位点结合，可以是二价(两个抗原结合位点)、四价(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。DVD(双重可变域)又分为单特异性和多特异性，前者能够结合一种抗原(或一种特异性表位)，后者能够结合两种或两种以上的抗原(即，相同靶抗原分子的两个或不同靶抗原的两个以上表位或两个或两个以上表位)。理想的DVD结合蛋白由两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽组成，故而称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。因此，这种DVD-Ig结合蛋白是四聚体蛋白，类似IgG分子，不过，其抗原结合位点比IgG分子多。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半都类似IgG分子的一半，并且由一条重链DVD多肽和一条轻链DVD多肽组成，但与IgG分子不同的是，IgG分子的一对重链和轻链有一个单抗原结合结构域，而DVD-Ig的一对重链和轻链有两个或两个以上的抗原结合位点。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可能衍生于供体(“亲本”)单克隆抗体，因此由一个重链可变结构域(VH)和一个轻链可变结构域(VL)组成，共有六个CDR参与每个抗原结合位点的抗原结合。因此，结合两个不同表位(即，两个不同抗原分子的两个不同表位，或相同抗原分子的两个不同表位)的DVD-Ig结合蛋白，包括衍生自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点和第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
PCT Publication No.WO 2007/024715，U.S.专利号7,612,181以及Wu等人，Nature Biotech.，25：1290-1297(2007)介绍了DVD-Ig结合分子的构造、表达和表征。理想的DVD-Ig分子包括重链(组成结构式为VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1为第一重链可变结构域，VD2为第二重链可变结构域，C为重链常数结构域，X1为连接基团(但不能是CH1)，X2为Fc区，n为0或1(但1优先))，和一条轻链(组成结构式为VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1为第一轻链可变域，VD2为第二轻链可变域，C为轻链常数结构域，X1为连接基团(但不能是CH1)，X2不能包含Fc区；n为0或1(但1优先))。这类DVD-Ig可以包含两条此类重链和两条此类轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，在可变区之间没有插入的恒定区，其中重链和轻链结合形成串联功能性抗原结合，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链结合，形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。另一个示例是，DVD-Ig分子可以包含重链和轻链，每个重链和轻链包含串联连接的三个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，在可变结构域之间没有中间恒定区，其中一对重链和轻链可以结合形成三个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链结合，形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
理想的优选的实施方案中，DVD-Ig结合蛋白不仅结合与其亲本单克隆抗体结合的相同靶分子，而且还具有一种或多种其亲本单克隆抗体的一种或多种所需特性。理想情况下，这种额外的特性是一种或多种亲本单克隆抗体的抗体参数。可以从其中一种或多种亲本单克隆抗体促成DVD-Ig结合蛋白的抗体参数包括但不限于，抗原特异性、抗原亲和力、效价、生物学功能、表位识别、蛋白质稳定性、蛋白质溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合性。
DVD-Ig结合蛋白结合至少一个GFAP表位。DVD-Ig结合蛋白的参考示例包括，结合一个或多个GFAP表位的DVD-Ig结合蛋白，结合人GFAP表位和另一物种(例如小鼠)的GFAP表位的DVD-Ig结合蛋白，以及结合人GFAP表位和另一靶分子表位的DVD-Ig结合蛋白。
本文所用的“滥用药物”指的是出于非医学原因(例如，娱乐和/或改变心智效果)而摄取的一种或多种成瘾物质(例如毒品)。过度使用或依赖此类滥用药物的行为通常称为“药物滥用”。滥用药物的例子包括酒精、巴比妥酸盐、苯二氮卓类药物、大麻、可卡因、致幻剂(如氯胺酮、墨斯卡灵、五氯苯酚、赛洛西宾、二甲基色胺及/或麦角酰二乙胺)、安眠酮、阿片类药物、安非他命(包括去甲麻黄碱)、合成代谢类固醇、吸入剂(即含有精神活性特性挥发性物质的物质，例如亚硝酸盐、喷漆、清洁液、记号笔、胶水等)及上述物质的组合物。
“动态范围”在本文中指的是测定读数与待分析样品中的靶分子或分析物的量成比例的范围。动态范围可以是标准曲线的线性范围。
“表位”或“目标表位”是指经识别可以与其特异性结合配偶体上的互补位点结合的分子上的位点。这个分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以位于多肽、蛋白质、半抗原、碳水化合物抗原(例如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖上。其特异性结合配偶体可以是抗体，但不限于抗体。
“扩展检测窗口”在本文中指的是与其他GFAP测定相比，所述和/或要求保护的改良方法可在多种临床情况下实施。例如，本公开的方法的实施对象可以使任何受试者，而无需考虑选自受试者的临床状况(例如，除了检查GFAP的原因之外是否合并并发症，或者是否正在评估除TBI以外的某些临床情况)、受试者的实验室检测值(例如，除GFAP水平以外的实验室检测值，包括但不限于用于评估患者总体健康状况的标准实验室检测值，以及因受试者疑似具有某种情况或接触某种创伤(包括但不限于可能导致头部受伤的创伤)而进行的更具体的检测)、受试者TBI轻度、中度或重度分级情况、受试者的GFAP水平表现(例如，展现或占有)低或高，以及使受试者头部可能受到损伤的事件所发生的时间(例如，相对于进行检测的时间)。所要求保护的方法的扩展检测窗口不同于先前该领域已知的可能或需要进行稀释的其他方法，或者可能缺少如本文所述的改良测定法的一种或多种优点(例如，测量范围高达50,000pg/mL，动态范围为5个对数，动态范围内的测定线性，能够在体积小于20微升的样品中测量GFAP，以及扩展检测窗口等等)。
“片段抗原结合片段”或“Fab片段”在本文中指的是结合抗原并且含有一个抗原结合位点、一条完整的轻链和部分重链的抗体的片段。Fab是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。Fab由重链和轻链中各自的一个恒定域和一个可变域组成。可变域含有互补位(抗原结合位点)，在单体的氨基末端的有一组互补决定区。因此Y的每个臂与抗原上的一个表位结合。可以利用该领域介绍的方法，例如使用酶木瓜蛋白酶，产生Fab片段，这一方法可以将免疫球蛋白单体切割成两个Fab片段和一个Fc片段，或者也可以通过重组方法产生。
“F(ab’)2片段”在本文中指的是通过胃蛋白酶消化整个IgG抗体产生的抗体，以除去大部分Fc区，同时保留一部分铰链区。F(ab’)2片段有两个二硫键连接的抗原结合F(ab)部分，因此为二价，分子量约为110kDa。二价抗体片段(F(ab’)2片段比整个IgG分子小，能够更好地渗透到组织中，从而能够更好地在免疫组织化学中识别抗原。F(ab’)2片段的使用还可以避免与活细胞或蛋白A/G上的Fc受体进行非特异性结合。F(ab’)2片段可以结合抗原，也可以沉淀抗原。
“框架”(FR)或“框架序列”在本文中指的是可变区除CDR外的剩余序列。由于CDR序列可以根据不同的系统(例如，参见上文)确定准确定义，所以框架序列的含义也有相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)同时将轻链和重链每条链上的框架区划分为四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。在未将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，框架区域代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的FR组合。在本文中，FR表示四个子区域中的子区域。
该领域对人重链和轻链FR序列有所了解，可用作重链和轻链“受体”框架序列(或简称“受体”序列)，以使用该领域已知的技术人源化非人抗体。在具体实施方案中，人重链和轻链受体序列选自公众可获得的数据库，例如V-base(超文本传输协议：//vbase.mFc-cpe.cam.ac.uk/)，或者在国际信息系统(超文本传输协议：//imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中列出的框架序列。
“功能性抗原结合位点”在本文中指的是结合蛋白(例如抗体)上能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力，相比于衍生抗原结合位点的亲本结合蛋白(例如亲本抗体)，可能并不是很强，但必须使用已知的多种评估蛋白质(例如抗体)与抗原结合的方法中的任何一种来测量结合抗原的能力。此外，本文中的多价蛋白质(例如多价抗体)的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不需要具有相同的数量。
“GFAP”在本文中指的是胶质纤维酸性蛋白。GFAP是由人体中的CFAP基因编码的蛋白质，其他物种(例如，通过重组方式)同样可以生产这种蛋白。
“GFAP状态”表示在某个时间点GFAP的水平或量(例如使用GFAP的单一测量值)、与监测相关的GFAP的水平或量(例如为了判断GFAP量增加或减少，而对受试者进行的重复测试相关的监测)、与治疗创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)相关的GFAP的水平或量，或者上述多种因素结合情况下的GFAP的水平或量。
“格拉斯哥昏迷量表”或“GCS”在本文中指的是根据总体社交能力或对其他人的依赖程度，对脑损伤结局进行评估及分级的量表，共有15个分数评级。该测试可以评估运动反应、言语反应和睁眼反应，分数评级如下：I.运动反应(6-完全服从命令；5-局限于有害刺激；4-回避有害刺激；3-屈曲异常，即去皮质体位；2-伸肌反应，即去大脑姿势；1-无反应)；II.言语反应(5-警惕和导向；4-混乱但语言连贯；3-词语使用不恰当的词语中单词使用混乱；2-声音难以理解；1-无声音)；III.睁眼反应(4-自发睁眼；3-说话睁眼；2-疼痛睁眼；1-无睁眼反应)。将I、II、III的分数相加，得出最终得分。最终得分代表四种可能的生存水平，得分越低，表示损伤越严重，预后越差：轻微(13-15)；中度残疾(9-12)(意识丧失超过30分钟；康复治疗可能解决的身体或认知障碍，康复治疗有帮助)；严重残疾(3-8)(昏迷：无意识状态。没有有意义的反应，没有自愿活动)；植物人状态(小于3)(睡眠唤醒周期；觉醒，但与环境无相互作用；没有对疼痛的局部反应)。中度脑损伤指的是导致意识丧失20分钟至6小时的脑损伤，格拉斯哥昏迷量表评分为9至12，即代表中度脑损伤。严重脑损伤指的是导致意识丧失超过6小时的脑损伤，格拉斯哥昏迷量表评分为3至8，即代表重度脑损伤。
“格拉斯哥预后量表”在本文中指的是功能结果的全局量表，对患者状态有五种分级方式：死亡、植物状态、严重残疾、中度残疾或预后良好。
本文中替换使用的“扩展格拉斯哥预后量表”或“GOSE”对严重残疾、中度残疾和预后良好细化分成了八类，如表1所示。
表1
“人源化抗体”在本文中指的是来自非人物种(例如小鼠)含有重链和轻链可变区序列的抗体，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被修改为接近“人类”，即更类似于人类种系可变序列。“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性结合目标抗原，并且含有基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区域以及基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补确定区域(CDR)。本文中的术语“基本上”在CDR的上下文中指的是氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％相同的CDR。人源化抗体基本上包含至少一个，但通常是两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区与非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区对应，所有或基本上所有框架区与人免疫球蛋白共有序列相对应。在具体实施方案中，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施例中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施例中，人源化抗体只含有一条人源化轻链。在一些实施例中，人源化抗体只含有一条人源化重链。在具体的实施例中，人源化抗体只含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可选择特定的恒定结构域，使用该领域熟知的技术优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过取代、插入和/或删除至少一个氨基酸残基来诱变供体抗体CDR或共有框架，使得该位点的CDR或框架残基与供体抗体或共有框架不对应。然而，在理想的实施方案中，不会大范围诱导突变。通常，人源化抗体残基，至少有80％，理想情况为至少85％，更理想的情况为至少90％，最理想的情况为至少95％，与亲本FR和CDR序列的抗体残基对应。术语“共有框架”在本文指的是共有免疫球蛋白序列中的框架区。术语“共有免疫球蛋白序列”在本文指的是，由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如，Winnaker，FromGenes to Clones (Verlagsgesellschaft，Weinheim，1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，占据共有序列每个位置的是在该家族位置中最常出现的氨基酸。如果同时由两个氨基酸频繁出现，则二者都可以包括在共有序列中。
在本文两个或两个以上多肽或多核苷酸序列的介绍中使用的“相同”，表示该序列与在指定区域具有相同特定百分比的残基。百分比的计算方式为，以最佳的方式对齐两个序列，比较指定区域上的两个序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置的数量，得出匹配位置的数量，用指定区域中的位置总数除以匹配位置的数量，再讲结果乘以100即可得出序列相同度的百分比。若两个序列的长度不同，或者对齐后，会产生一个或多个交错末端，并且指定的比较区域仅包括单个序列，则单个序列的残基计入分母中而非分子中。
本文中使用的“头部损伤”指的是头皮、头骨或大脑所受到的任何创伤。此类损伤可以包括头骨所受的轻微撞击，也可以是严重的脑损伤。此类损伤包括大脑的原发性损伤和/或大脑的继发性损伤。原发性脑损伤发生在最初的损伤期间，原因是大脑物理结构发生移位。具体而言，原发性脑损伤是在创伤事件期间发生的对薄壁组织(组织、血管)的物理损伤，会导致周围脑组织的剪切和压缩。继发性脑损伤发生于原发性损伤之后，可能涉及一系列细胞过程。更具体来讲，继发性脑损伤是指在原发性脑损伤后的一段时间(短至几个小时，长到几天)内发生的变化。继发性脑损伤包括大脑中细胞、化学、组织或血管变化的整个一系列损伤，会进一步破坏脑组织。
头部损伤可能是闭合性损伤，也可能是开放性损伤(穿通性损伤)。闭合性头部损伤是指头骨没有被撞击物体刺入的头皮、颅骨或大脑创伤。开放性头部损伤是指头骨被撞击物体刺入的头皮、颅骨或大脑创伤。头部损伤可能是由于人的物理晃动、外部机械力或其他力的钝性撞击而导致的闭合性或开放性头部创伤(例如汽车、飞机、火车等交通事故；用棒球棒或者枪支击打头部)、脑血管意外(例如中风)、一次或多次跌倒(如运动或其他活动时)、爆炸(称为“爆炸伤”)和其他类型的钝器创伤。或者，头部损伤也能是由于摄入和/或接触化学品、毒素或化学品和毒素共同引起的损伤。此类化学品和/或毒素的示例包括火、霉菌、石棉、农药和杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、毒气(如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(如甲基汞、四乙铅和有机锡)以及/或者滥用一种或多种药物)。或者，头部损伤也可能发生于患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水、缺氧或并发上述疾病的受试者身上。在某些情况下，无法确定是否发生过任何此类事件或伤害。例如，患者或受试者可能无病史，受试者可能无法说话，受试者可能不知道或者没有全面了解自身所接触的事件。这类情况在本文中称为“头部可能曾经受过伤”。在本文所述的某些实施例中，闭合性脑损伤不包括并且明确排除中风之类的脑血管意外。
“分离的多核苷酸”在本文中指的是多核苷酸，此类多核苷酸由于其来源(例如，基因组来源、cDNA、或合成来源、或上述综合来源)，分离的多核苷酸不与在自然界中发现该“分离的多核苷酸”与之结合的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸操作性连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
“标记”和“可检测标记”在本文中指的是与抗体或分析物连接，方便检测抗体和分析物之间反应的部分，故而，这样标记的抗体或分析物则称为“可检测标记”。标记可以产生通过视觉手段或仪器手段检测到的信号。各种标记包括产生信号的物质，例如发色团、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。具有代表性的标记示例包括啶酯类化合物之类产生光的部分，以及荧光素之类产生荧光的部分。文中介绍了其他标记。就这一点而言，标记部分本身可能无法检测出来，不过，在与另一部分反应后，便可能能够检测。本文中使用的术语“可检测标记”包括这种标记。
该领域已知的任何合适的可检测标记都可以使用。例如，可检测标记可以是放射性标记(例如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(如吖啶酯、硫酯或磺胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记(如荧光素等(比如5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌封端的硒化镉)、温度标记或免疫聚合酶链式反应标记。Polak以及Van Noorden，Introduction toImmunocytochemistry，2nd ed.，Springer Verlag，N.Y.(1997)以及Haugland，Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals(1996)对标记、标记程序和标记检测进行了介绍。Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals是一本手册，也是目录，出版社为俄勒冈州尤金的Molecular Probes，Inc.。荧光标记可用于FPIA(荧光偏振免疫分析)(参见，例如，美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其全部内容通过整体引用并入本文)。吖啶化合物可用作均相化学发光测定中的可检测标记(参见，例如，Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16：1324-1328(2006)；Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.4：2313-2317(2004)；Adamczyk等人，Biorg.Med.Chem.Lett.14：3917-3921(2004)；以及Adamczyk等人，Org.Lett.5：3779-3782(2003)).
就某一方面而言，吖啶鎓化合物包括吖啶-9-甲酰胺。吖啶9-甲酰胺的制备方法记载文献有Mattingly，J.Biolumin.Chemilumin.6：107-114(1991)；Adamczyk等人，J.Org.Chem.63：5636-5639(1998)；Adamczyk等人，Tetrahedron 55：10899-10914(1999)；Adamczyk等人，Org.Lett.1：779-781(1999)；Adamczyk等人，Bioconjugate Chelm.11：714-724(2000)；Mattingly等人，In Luminescence Biotechnology：Instruments andApplicatiohs；Dyke，K.V.Ed.；CRC Press：Boca Raton，pp.77-105(2002)；Adamczyk等人，Org.Lett.5：3779-3782(2003)；以及美国专利号5,468,646、5,543,524及5,783,699(为了相关的教导，所有内容皆通过整体引用并入本文)。
吖啶化合物还包括吖啶-9-羧酸芳基酯。式II结构的吖啶-9-羧酸芳基酯的示例包括10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶氟磺酸盐(出自Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)。吖啶-9-羧酸芳基酯的制备方法记载文献有McCapra等人，Photochem。Photobiol.4：1111-21(1965)；Razavi等人，Luminescence 15：245-249(2000)；Razavi等人，Luminescence 15：239-244(2000)；以及及美国专利号5，241，070(为了相关的教导，所有内容皆通过整体引用并入本文)。这类吖啶-9-羧酸芳基酯，在信号强度和/或信号速度方面而言，都称得上是过氧化氢(由至少一种氧化酶氧化分析物产生)的有效化学发光指示剂。吖啶-9-羧酸芳基酯的化学发光过程可以在1秒内迅速完成，而吖啶-9-甲酰胺化学发光的过程则需要2秒。然而，吖啶-9-羧酸芳基酯在存在蛋白质的情况下，会失去其化学发光性质。因此，在使用时，在产生信号和检测期间，需要确保不存在蛋白质。该领域技术人员所熟知的分离或去除样品中蛋白质的方法包括但不限于超滤、提取、沉淀、透析、色谱和/或消解(参见，例如，Wells，High Throughput Bioanalytical Sample Preparation.Methods and AutomationStrategies，Flsevier(2003))。从测试样品中去除或分离的蛋白质数量可以为约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。关于吖啶-9-羧酸芳基酯及其使用的更多详情阐述于美国专利申请号11/697，835(2007年4月9日提交)中。可将吖啶-9-羧酸芳基酯溶于任何适当的溶剂，例如，脱气的无水N、N-二甲基甲酰胺(DMF)或胆酸钠水溶液。
本文中所用的“空白限(LoB)”，是指重复测试不含分析物的空白样品时，预计会出现的最高的可见分析物浓度。
本文中所用的“检测限(LoD)”，是指在特定置信水平下可以检测出的被测变量(即，计划测量的数量)的最低浓度。置信水平通常为95％，假阴性测量的可能性为5％。LoD是有可能可靠区别于LoB并且可进行检测的最低分析物浓度。可以利用已知含有低分析物浓度的样品的测得LoB和重复测试来确定LoD。本文中所用的术语LoD以临床和实验室标准协会(CLSI)协议EP17-A2(“确定检测限和定量限的协议；批准指南-第二版”，EP17A2E，作者James F.Pierson-Perry等人，临床和实验室标准协会，2012年6月1日)中的定义为依据。
本文中所用的“定量限(LoQ)”，是指不仅可以可靠地检测出分析物，而且可以满足偏差和不精确性方面的某些预定目标的最低浓度。LoQ的浓度可能等于或高于LoD。
“线性”是指特定操作范围内方法或测定的实际效果接近直线的程度。可以根据与理想直线的偏差或非线性来测量线性。“线性偏差”可以用全刻度百分比来表示。在本文中公开的一些方法中，在测定的动态范围之内，线性偏差(DL)小于10％。“线性”是指与所述的典型范围或数值之间存在小于或等于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％或约8％的变化。
“连结序列”或“连结肽序列”是指连接到一个或多个目标多肽序列(如全长、片段等)的天然或人工多肽序列。术语“连接”是指连结序列与目标多肽序列的连接。此类多肽序列最好是通过一个或多个肽键连接。连结序列的长度可以是约4至约50个氨基酸。连结序列的长度最好是约6至约30个氨基酸。天然连结序列可以通过氨基酸置换、加成或缺失进行修改，以形成人工连结序列。连结序列可用于多种目的，包括用于重组Fab。典型的连结序列包括但不限于：(i)组氨酸(His)标签，如6XHis标签，其具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO：2)，可用作连结序列，以促进目标多肽和抗体的分离和纯化；(ii)肠激酶切割位点，如His标签，用于目标蛋白和抗体的分离和纯化。通常，肠激酶切割位点与His标签一同用于目标蛋白和抗体的分离和纯化。本领域已知有多个肠激酶切割位点。肠激酶切割位点的示例包括但不限于氨基酸序列DDDDK(SEQ ID NO：3)及其衍生物(如，ADDDDK(SEQ ID NO：4))等；(iii)各种各样的序列均可用于连结或连接单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其他连结序列的示例可参见Bird等人，Science 242：423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA85：5879-5883(1988)；和McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)。连结序列也可以经修改而具有其他功能，例如连接药物或连接到实心载体。在本公开内容的背景下，单克隆抗体，例如可以含有连结序列(如His标签)、肠激酶切割位点或以上两者。
本文中所用的“单克隆抗体”，是指从大体上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了少量抗体可能发生自然存在的突变以外，构成群体的个体抗体都是完全相同的。单克隆抗体针对单一抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。本文所述的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体的相应序列相同或同质，而该链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类以及此类抗体的片段的抗体的相应序列相同或同质，前提是它们表现出所需的生物学特征。
本文中替换使用的“磁共振成像”或“MRI”，是指放射学用于针对人体的健康和疾病情况形成人体解剖学和生理过程图像的医学成像技术。MRI是一种医学成像技术，可以测量人体组织的原子核被置于强磁场中时对高频无线电波的反应，并生成内脏的图像。MRI扫描仪基于核磁共振(NMR)原理，利用强磁场、无线电波和场梯度来生成人体内部的图像。
本文中所用的“多价结合蛋白”，是指包含两个或以上抗原结合位点(在本文中也称为“抗原结合域”)的结合蛋白。多价结合蛋白最好是经过设计改造而具有三个或以上抗原结合位点，并且通常为非自然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两种或以上相关或无关靶标的结合蛋白，包括能够结合同一靶标分子的两种或以上不同表位的结合蛋白。
本文中所用的“预定截止”和“预定水平”，是指测定截止值，其用于通过将测定的结果与预定截止/水平进行比较，来评估诊断、预测、治疗功效的结果，其中预定截止/水平已经与多种临床参数(例如，是否存在疾病、病情阶段、疾病严重程度、疾病有无进展或改进等)关联或相关。本公开内容提供了典型的预定水平。然而，众所周知，截止值可能因免疫测定的性质(例如，采用的抗体、反应条件、样品纯度等)而异。另外，基于本公开内容的描述使本公开内容适用于其他免疫测定以获得关于此类其他免疫测定的免疫测定特异性截止值，这一点完全在本领域普通技术人员的一般能力范围内。尽管各测定之间预定截止/水平的精确值可能各不相同，但本文所述的相关性应当是普遍适用的。
“床边装置”是指用于在照护患者的时间和地点(如，医院、医生办公室、紧急或其他医疗护理设施、患者家中、疗养院和/或长期护理和/或临终关怀设施)，在床边或附近(即实验室外)提供医学诊断测试的装置。床边装置的一些示例包括由Abbott Laboratories(伊利诺伊州，雅培科技园)(如，i-STAT和i-STAT Alinity)、Universal Biosensors(澳大利亚，罗维尔)(参见US 2006/0134713)、Axis-Shield PoC AS(挪威，奥斯陆)和ClinicalLab Products(洛杉矶，美国)生产的装置。
在本文所述的免疫测定和试剂盒的背景下，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照物和灵敏度组。为了确立校准(标准)曲线以插入分析物(如，抗体或分析物)的浓度，通常使用(例如，一个或多个，如多个)“校准物”或“标准”。或者，可以使用接近预定阳性/阴性截止、参考水平或对照水平(如，“低”、“中”或“高”水平)的单个校准物。可以共同使用多个校准物(即，一个以上校准物或不同数量的校准物)，从而构成“灵敏度组”。
“受试者工作特征”曲线或“ROC”曲线是指表明二元分类器系统的性能随着其鉴别阈值发生变化的图表。例如，ROC曲线可以是诊断测试不同潜在截止点的真阳性率与假阳性率之比的绘图。该图是通过绘制在不同阈值设定下，阳性中的真阳性比率分数(TPR＝真阳性率)与阴性中的假阳性比率分数(FPR＝假阳性率)得来的。TPR也被称为灵敏度，而FPR则是灵敏度减去特异性或真阴性率。ROC曲线显示了灵敏度和特异性之间的权衡关系(灵敏度的任何上升都将伴随着特异性的降低)；曲线越靠近左边界和ROC空间的顶部边界，测试越准确；曲线越靠近ROC空间的45度对角线，测试越不准确；截止点切线的斜率给出了测试中该值的概率比(LR)；而曲线下方的面积则是测试精度的测量指标。
“重组抗体(recombinant antibody)”和“重组抗体(recombinant antibodies)”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，所述步骤包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体的全部或一部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达所述抗体。该术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、由抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能性抗体、杂缀合Abs、s和本文(i)中所述的其他抗体。(双重-可变域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu，C.等人的Nature BioTechnology，25：1290-1297(2007)中)。本文中所用的术语“双功能性抗体”，是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一组和对不同抗原位点具有特异性的第二组的抗体，即，双功能性抗体具有双重特异性。
本文中所用的“参考水平”，是指测定截止值，其用于评估诊断、预测或治疗功效，并且已经与多种临床参数(例如，是否存在疾病、病情阶段、疾病严重程度、疾病有无进展或改进等)关联或相关。本公开内容提供了典型的参考水平。然而，众所周知，参考水平可能因免疫测定的性质(例如，采用的抗体、反应条件、样品纯度等)而异，并且测定可以进行比较和标准化。另外，基于本公开内容的描述使本公开内容适于其他免疫测定以获得关于此类其他免疫测定的免疫测定特异性参考水平，这一点完全在本领域普通技术人员的一般能力范围内。尽管各测定之间参考水平的精确值可能各不相同，但本文所述的发现应当是普遍适用的并且能够推算到其他测定中。
本文中所用的受试者(如患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险识别”或“风险分层”，是指评估生物标志物等因素，以预测包括疾病发作或疾病进展等未来事件发生的风险，从而可以在更加知情的基础上做出有关受试者的治疗决策。
本文中所用的“样品”、“测试样品”、“样本”、“受试者样品”、和“患者样品”可替换使用，并且可以是血液样品，如全血、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。所述样品可自患者处采集后而直接使用，或者可进行预处理，例如通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、离心、使干扰组分钝化、添加试剂等，从而以本文所述的某种方式或本领域已知的其他方式改变样品的特性。
多种细胞类型、组织或体液均可用于采集样品。此类细胞类型、组织或体液可以包括组织切片，例如活检和尸检样品、出于组织学目的而获取的冷冻切片、血液(如全血)、血浆、血清、红细胞、血小板、组织液、脑脊液等。细胞类型和组织也可以包括淋巴液、脑脊液，通过组织或细胞类型采集的体液可以通过从人类和非人类动物中取出的细胞样品来提供，但也可以通过利用先前分离的细胞(例如，在其他时间和/或出于其他目的从另一人体中分离的细胞)来实现。也可以使用，例如，具有治疗或结果病史的存档组织。蛋白或核苷酸的分离和/或纯化可能并非必要。
本文中所用的测定的“灵敏度”，是指结果为阳性且被正确确定为阳性的受试者比例。
本文中所用的测定的“特异性”，是指结果为阴性且被正确确定为阴性的受试者比例。
“校准组合物系列”是指包含已知浓度的GFAP的多个组合物，其中每个组合物的GFAP浓度均不同于该系列中的其他组合物。
本文中替换使用的“固相”或“实心载体”，是指任何可用于连接和/或吸引及固定(1)一种或多种捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)一种或多种检测剂或检测特异性结合配偶体的材料。可针对固相吸引和固定捕获剂的固有能力而进行选择。或者，固相可以连接具有吸引和固定(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体的能力的交联剂。交联剂可以包括例如带电物质，该物质相对于捕获剂(如，捕获特异性结合配偶体)或检测剂(如，检测特异性结合配偶体)本身具有相反电荷，或相对于缀合到(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体上的带电荷物质具有相反电荷。一般而言，交联剂可以是任何结合配偶体(首选特异性)，该配偶体固定在(连接在)固相上并通过结合反应而具有固定(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体的能力。交联剂使得在执行测定之前或在执行测定期间能够将捕获剂间接结合到固相材料上。固相可以是例如塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括试管、微量测试孔、薄板、珠、微粒、芯片以及本领域普通技术人员已知的其他结构。
本文中所用的“特异性结合”或“特异性地结合”，可指抗体、蛋白或肽与第二化学物种的相互作用，其中所述相互作用取决于化学物种中是否存在特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合至特异性蛋白结构而非一般蛋白。如果抗体对表位“A”具有特异性，那么在包含已标记“A”和抗体的反应中，包含表位A(或游离的、未标记A)的分子的存在，将减少与抗体结合的已标记A的量。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两种不同的分子，它们通过化学或物理方式彼此特异性地结合。因此，除了常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可能包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素)、碳水化合物和凝集素、互补的核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶和酶抑制剂，等等。此外，特异性结合对可能还包括作为原始特异性结合成员类似物的成员，例如，分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，抗体又包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物和片段，无论是分离的还是经重组产生的。
本文中替换使用的“受试者”和“患者”，是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，如食蟹猴或猕猴，黑猩猩等)和人类)。在某些实施例中，受试者可以是人类或非人类。受试者或患者可以经历过其他形式的治疗。在某些实施例中，如果受试者是人类，那么将不包括任何曾经患有脑血管意外(如，中风)的人。在某些实施例中，我们怀疑受试者头部曾经受过伤。在某些实施例中，我们无从得知受试者头部是否曾经受过伤。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有轻度、中度或重度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有轻度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有中度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有重度TBI。
本文中替换使用的“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”，用于描述该术语所适用的疾病和/或损伤的进程或所述疾病的一种或多种症状的逆转、缓解或抑制。根据受试者的情况，该术语也可指预防疾病，包括预防疾病的发作，或预防疾病的相关症状。治疗可以急性或慢性方式进行。该术语还指在患病之前减轻疾病或与所述疾病相关的症状的严重程度。此类在患病之前对疾病严重程度的预防或减轻是指将药物组合物施予受试者，并且在给药时所述受试者未患病。“预防”还指预防疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状的复发。“治疗”和“治疗性地”是指治疗的行动，如上文对“治疗”的定义。
本文中所用的术语“单分子检测”是指在非常低的浓度水平(如pg/mL或毫微微克/毫升水平)下检测和/或测量测试样品中分析物的单分子。本领域已知有多种不同的单分子分析仪或装置，包括纳米孔和纳米井装置。有关纳米孔装置的示例详述于国际专利公开号W0 2016/161402中，通过整体引用并入本文。有关纳米井装置的示例详述于国际专利公开号W0 2016/161400中，通过整体引用并入本文。
本文中替换使用的“创伤性脑损伤”或“TBI”，是指带有多种症状和残疾状况的复杂损伤。与其他损伤类似，TBI通常为急性事件。TBI可分为“轻度”、“中度”或“重度”。导致TBI的原因多种多样，包括例如人为的身体晃动、车祸、枪械损伤、脑血管意外(如，中风)、跌倒、爆炸以及其他类型的钝力损伤。导致TBI的其他原因包括摄入和/或接触一种或多种化学品或毒素(例如火、霉菌、石棉、农药和杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、毒气(如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(如甲基汞、四乙铅和有机锡)，滥用一种或多种药物或上述物质组合)。或者，TBI也可能发生在遭患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或并发上述疾病的受试者身上。青壮年和老年人是罹患TBI风险最高的年龄群体。在本文所述的某些实施例中，创伤性脑损伤或TBI不包括并且明确排除脑血管意外，如中风。
本文中所用的“轻度TBI”，是指造成短暂性丧失意识(通常为几秒或几分钟)和/或意识模糊和迷失方向的时间不足1小时的脑损伤。轻度TBI也被称为脑震荡、轻微头部创伤、轻微TBI、轻微脑损伤和轻微头部损伤。虽然通常MRI和CT扫描结果显示正常，但患有轻度TBI的个体可能会出现认知问题，例如头痛、思考困难、记忆问题、注意力缺陷、情绪波动和沮丧。
轻度TBI是最常见的TBI，并且在最初损伤时经常容易被忽视。通常，受试者的格拉斯哥昏迷评分数值在13-15之间(如13-15或14-15)。百分之十五(15％)患有轻度TBI的患者症状会持续3个月或以上。轻度TBI被定义为头部的强力运动或冲击导致的后果，精神状态(意识模糊、迷失方向或丧失记忆)发生短暂性变化或意识丧失不超过30分钟。轻度TBI的常见症状包括疲劳、头痛、视力障碍、记忆丧失、注意力/集中度分散、睡眠障碍、头晕/失去平衡、易怒情绪障碍、抑郁情绪和癫痫。与轻度TBI有关的其他症状包括恶心、嗅觉丧失、对光和声敏感、情绪变化、感到迷茫或困惑和/或思维迟钝。
本文中所用的“中度TBI”，是指丧失意识和/或意识模糊和迷失方向的时间在1小时至24小时之间，并且受试者的格拉斯哥昏迷评分数值在9-12之间的脑损伤。患有中度TBI的个体具有异常的脑成像结果。本文中所用的“重度TBI”，是指丧失意识超过24小时，损伤或颅骨贯通伤导致的记忆丧失时间超过24小时，并且受试者的格拉斯哥昏迷评分数值在3-8之间的脑损伤。缺陷涵盖较高程度的认知功能损伤到昏迷状态等。幸存者可能会遭遇手臂或腿部功能受限、讲话或语言能力异常、思维能力丧失或情绪问题。患有重度损伤的个体可能会长期处于反应迟钝的状态。对于很多患有重度TBI的患者而言，通常需要进行长期康复治疗，以最大限度地恢复自身功能和独立性。
中度至重度TBI的常见症状包括认知障碍，包括注意力、集中度、注意力分散、记忆力、处理速度、意识模糊、持续言语、冲动、语言处理和/或“执行功能”等困难；无法理解口头语言(感觉性失语)、讲话和理解困难(表达性失语)、言语不清、语速过快或过慢、阅读障碍、书写障碍；对触感、温度、动作、肢体位置和惩罚、歧视等的解释存在困难，以及将感官印象整合或模仿成心理上意义重大的数据方面存在困难；视力部分或完全丧失、眼肌无力和双重视野(复视)、视力模糊、难以判断距离、无意识的眼球运动(眼球震颤)、畏光；听力问题，如听力下降或丧失、耳鸣、对声音更加敏感；嗅觉丧失或减弱(嗅觉缺失症)；味觉丧失或减弱；几种与癫痫相关的抽搐，可能涉及意识、感官知觉或运动动作以及对肠道和膀胱控制的中断、睡眠障碍、耐力丧失、食欲改变、体温拜变化、月经问题、依赖行为、情绪能力、缺乏动力、易怒、具有攻击性、抑郁、抑制解除或拒绝/缺乏意识。
本文中所用的“变体”用于描述通过氨基酸的插入、缺失或保守置换而在氨基酸序列上有所不同，但保持至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性示例包括被特异性抗体结合的能力或引发免疫应答的能力。本文中所用的变体也用于描述其氨基酸序列与参考蛋白基本相同的蛋白，所述参考蛋白的氨基酸序列保留至少一种生物活性。氨基酸的保守置换，即，用本领域中被认为通常涉及微小变化且具有相似特性(例如，带电区域的亲水性、程度和分布)的不同氨基酸替换原氨基酸。如本领域所理解的，可以通过考虑氨基酸的亲水性指数而部分确定此类微小变化。Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以置换具有相似亲水性指数的氨基酸，而仍然保持蛋白功能。一方面，置换亲水性指数±2的氨基酸。也可以利用氨基酸的亲水性来揭示置换将引发蛋白保持生物学功能。就肽而言，考虑氨基酸的亲水性将允许对该肽的最大局部平均亲水性进行计算，据报道这是一项与抗原性和免疫原性具有良好关联的有用测量指标。美国专利号4,554,101，通过引用整体并入本文。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的置换可以引发肽保持生物学活性(如免疫原性)。可以用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸来实施置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸具体侧链的影响。疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的结果与这一观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸置换理解为取决于氨基酸，特别是此类氨基酸侧链的相似性。“变体”也可用于指抗-GFAP抗体的抗原反应性片段，其在氨基酸序列上不同于抗-GFAP抗体的相应片段，但仍然具有抗原反应性，并且可与抗-GFA抗体的相应片段竞争与GFAP的结合。“变体”也可用于描述已经经过不同加工(例如蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰)而仍然保持其抗原反应性的多肽或其片段。
本文中所用的“载体”用于描述能够运输已与之连结的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，是指额外DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中额外DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在其已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，且因此可连同宿主基因组一同进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之操作性连结的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中所用的表达载体通常为质粒的形式。“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，也可以使用其他形式的表达载体，例如具有同等功能的病毒载体(如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。就这一点而言，RNA形式的载体(包括RNA病毒载体)也可用于本公开内容的情况。
除非本文另有规定，否则本公开内容中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质与核酸化学和杂交相关的技术以及与所述技术共同使用的任何术语均为本领域众所周知且常用的。此类术语的含义和范围应清晰明确；但是，如果存在任何潜在的歧义，那么本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应具有复数含义，复数术语也应具有单数含义。
2.基于胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的方法
本公开内容涉及利用改良的免疫测定评估胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的方法，以快速辅助诊断创伤性脑损伤(TBI)，监测进展并由此预测急需的受试者结果(包括接受TBI治疗的受试者以及未接受TBI治疗的受试者)。利用第一特异性结合成员和第二特异性结合成员执行所述方法，每个成员分别与GFAP特异性地结合并形成包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物。在某些实施例中，第二特异性结合成员标有可检测标记。在某些实施例中，在床边装置上实施免疫测定。可以使用的床边装置的一个示例为(伊利诺伊州，雅培科技园的Abbott Laboratories)。
改良的免疫测定可用于测定低水平和较高水平的GFAP，从而提供一种在无需稀释或浓缩生物样品的情况下，测定样品中更大浓度范围内GFAP数量的方法。该免疫测定为评估创伤性脑损伤提供了更加通用和灵敏的测定。本公开免疫测定可提供灵敏的GFAP血清检测以及可用于评估TBI(如轻度TBI)的标准化测定。该免疫测定可测量生物样品中高达50,000pg/mL的GFAP，并且不需要稀释生物样品。该免疫测定也可测量生物样品中小于或等于50,000pg/mL的GFAP，并且不需要稀释生物样品。该免疫测定还可以在测定的动态范围内保持测定线性。在某些实施例中，该免疫测定的动态范围为5个对数。在其他实施例中，该免疫测定的动态范围为5个对数，并且可在动态范围内保持测定线性。同样在其他实施例中，可评估的生物样品中低水平和较高水平的GFAP均在测定的动态范围内，不需要稀释或浓缩生物样品。同样在其他实施例中，该免疫测定能够测量体积小于20微升的测试样品中小于或等于5pg/mL的GFAP的数量。同样在其他实施例中，该免疫测定：(1)能够测量体积小于20微升的测试样品中小于或等于50,000pg/mL的GFAP的数量；(2)动态范围为5个对数；(3)并且在所述动态范围内呈线性。
可以利用本公开免疫测定测量的GFAP浓度范围的增加提供了更加准确和灵敏的测定，以辅助诊断和甄别患者的创伤性脑损伤。因此，本公开免疫测定可用于测量或评估稀释或未稀释样品中低水平GFAP下的GFAP浓度相对于对照物或校准物样品的增加或降低，从而用于判定患者的TBI。GFAP免疫测定的使用可以为创伤性脑损伤患者的诊断和后续治疗提供准确的辅助。此外，本公开免疫测定还提供了扩展检测窗口。
在某些实施例中，与其他市售GFAP免疫测定相比，本公开内容中可测定GFAP的范围至少扩大约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约400％或约500％。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估范围为约0pg/mL至约150,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约150,000pg/mL、约0.001pg/mL至约150,000pg/mL、约0.01pg/mL至约150,000pg/mL、约0.1pg/mL至约150,000pg/mL、约0.5pg/mL至约150,000pg/mL、约1.0pg/mL至约150,000pg/mL、约2.0pg/mL至约150,000pg/mL、约3.0pg/mL至约150,000pg/mL、约4.0pg/mL至约150,000pg/mL、约5.0pg/mL至约150,000pg/mL、约6.0pg/mL至约150,000pg/mL、约7.0pg/mL至约150,000pg/mL、约8.0pg/mL至约150,000pg/mL、约9.0pg/mL至约150,000pg/mL、约10.0pg/mL至约150,000pg/mL、约20pg/mL至约150,000pg/mL、约25pg/mL至约150,000pg/mL、约30pg/mL至约150,000pg/mL、约40pg/mL至约150,000pg/mL、约50pg/mL至约150,000pg/mL、约60pg/mL至约150,000pg/mL、约70pg/mL至约150,000pg/mL、约75pg/mL至约150,000pg/mL、约80pg/mL至约150,000pg/mL、约90pg/mL至约150,000pg/mL、约100pg/mL至约150,000pg/mL、约110pg/mL至约150,000pg/mL、约120pg/mL至约150,000pg/mL、约125pg/mL至约150,000pg/mL、约130pg/mL至约150,000pg/mL、约140pg/mL至约150,000pg/mL、约150pg/mL至约150,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约140,000pg/mL、约0.001pg/mL至约140,000pg/mL、约0.01pg/mL至约140,000pg/mL、约0.1pg/mL至约140,000pg/mL、约0.5pg/mL至约140,000pg/mL、约1.0pg/mL至约140,000pg/mL、约2.0pg/mL至约140,000pg/mL、约3.0pg/mL至约140,000pg/mL、约4.0pg/mL至约140,000pg/mL、约5.0pg/mL至约140,000pg/mL、约6.0pg/mL至约140,000pg/mL、约7.0pg/mL至约140,000pg/mL、约8.0pg/mL至约140,000pg/mL、约9.0pg/mL至约140,000pg/mL、约10.0pg/mL至约140,000pg/mL、约20pg/mL至约140,000pg/mL、约25pg/mL至约140,000pg/mL、约30pg/mL至约140,000pg/mL、约40pg/mL至约140,000pg/mL、约50pg/mL至约140,000pg/mL、约60pg/mL至约140,000pg/mL、约70pg/mL至约140,000pg/mL、约75pg/mL至约140,000pg/mL、约80pg/mL至约140,000pg/mL、约90pg/mL至约140,000pg/mL、约100pg/mL至约140,000pg/mL、约110pg/mL至约140,000pg/mL、约120pg/mL至约140,000pg/mL、约125pg/mL至约140,000pg/mL、约130pg/mL至约140,000pg/mL、约140pg/mL至约140,000pg/mL、约150pg/mL至约140,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约130,000pg/mL、约0.001pg/mL至约130,000pg/mL、约0.01pg/mL至约130,000pg/mL、约0.1pg/mL至约130,000pg/mL、约0.5pg/mL至约130,000pg/mL、约1.0pg/mL至约130,000pg/mL、约2.0pg/mL至约130,000pg/mL、约3.0pg/mL至约130,000pg/mL、约4.0pg/mL至约130,000pg/mL、约5.0pg/mL至约130,000pg/mL、约6.0pg/mL至约130,000pg/mL、约7.0pg/mL至约130,000pg/mL、约8.0pg/mL至约130,000pg/mL、约9.0pg/mL至约130,000pg/mL、约10.0pg/mL至约130,000pg/mL、约20pg/mL至约130,000pg/mL、约25pg/mL至约130,000pg/mL、约30pg/mL至约130,000pg/mL、约40pg/mL至约130,000pg/mL、约50pg/mL至约130,000pg/mL、约60pg/mL至约130,000pg/mL、约70pg/mL至约130,000pg/mL、约75pg/mL至约130,000pg/mL、约80pg/mL至约130,000pg/mL、约90pg/mL至约130,000pg/mL、约100pg/mL至约130,000pg/mL、约110pg/mL至约130,000pg/mL、约120pg/mL至约130,000pg/mL、约125pg/mL至约130,000pg/mL、约130pg/mL至约130,000pg/mL、约140pg/mL至约130,000pg/mL、约150pg/mL至约130,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约125,000pg/mL、约0.001pg/mL至约125,000pg/mL、约0.01pg/mL至约125,000pg/mL、约0.1pg/mL至约125,000pg/mL、约0.5pg/mL至约125,000pg/mL、约1.0pg/mL至约125,000pg/mL、约2.0pg/mL至约125,000pg/mL、约3.0pg/mL至约125,000pg/mL、约4.0pg/mL至约125,000pg/mL、约5.0pg/mL至约125,000pg/mL、约6.0pg/mL至约125,000pg/mL、约7.0pg/mL至约125,000pg/mL、约8.0pg/mL至约125,000pg/mL、约9.0pg/mL至约125,000pg/mL、约10.0pg/mL至约125,000pg/mL、约20pg/mL至约125,000pg/mL、约25pg/mL至约125,000pg/mL、约30pg/mL至约125,000pg/mL、约40pg/mL至约125,000pg/mL、约50pg/mL至约125,000pg/mL，关于、约60pg/mL至约125,000pg/mL、约70pg/mL至约125,000pg/mL、约75pg/mL至约125,000pg/mL、约80pg/mL至约125,000pg/mL、约90pg/mL至约125,000pg/mL、约100pg/mL至约125,000pg/mL、约110pg/mL至约125,000pg/mL、约120pg/mL至约125,000pg/mL、约125pg/mL至约125,000pg/mL、约130pg/mL至约125,000pg/mL、约140pg/mL至约125,000pg/mL、约150pg/mL至约125,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约120,000pg/mL、约0.001pg/mL至约120,000pg/mL、约0.01pg/mL至约120,000pg/mL、约0.1pg/mL至约120,000pg/mL、约0.5pg/mL至约120,000pg/mL、约1.0pg/mL至约120,000pg/mL、约2.0pg/mL至约120,000pg/mL、约3.0pg/mL至约120,000pg/mL、约4.0pg/mL至约120,000pg/mL、约5.0pg/mL至约120,000pg/mL、约6.0pg/mL至约120,000pg/mL、约7.0pg/mL至约120,000pg/mL、约8.0pg/mL至约120,000pg/mL、约9.0pg/mL至约120,000pg/mL、约10.0pg/mL至约120,000pg/mL、约20pg/mL至约120,000pg/mL、约25pg/mL至约120,000pg/mL、约30pg/mL至约120,000pg/mL、约40pg/mL至约120,000pg/mL、约50pg/mL至约120,000pg/mL、约60pg/mL至约120,000pg/mL、约70pg/mL至约120,000pg/mL、约75pg/mL至约120,000pg/mL、约80pg/mL至约120,000pg/mL、约90pg/mL至约120,000pg/mL、约100pg/mL至约120,000pg/mL、约110pg/mL至约120,000pg/mL、约120pg/mL至约120,000pg/mL、约125pg/mL至约120,000pg/mL、约130pg/mL至约120,000pg/mL、约140pg/mL至约120,000pg/mL、约150pg/mL至约120,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约110,000pg/mL、约0.001pg/mL至约110,000pg/mL、约0.01pg/mL至约110,000pg/mL、约0.1pg/mL至约110,000pg/mL、约0.5pg/mL至约110,000pg/mL、约1.0pg/mL至约110,000pg/mL、约2.0pg/mL至约110,000pg/mL、约3.0pg/mL至约110,000pg/mL、约4.0pg/mL至约110,000pg/mL、约5.0pg/mL至约110,000pg/mL、约6.0pg/mL至约110,000pg/mL、约7.0pg/mL至约110,000pg/mL、约8.0pg/mL至约110,000pg/mL、约9.0pg/mL至约110,000pg/mL、约10.0pg/mL至约110,000pg/mL、约20pg/mL至约110,000pg/mL、约25pg/mL至约110,000pg/mL、约30pg/mL至约110,000pg/mL、约40pg/mL至约110,000pg/mL、约50pg/mL至约110,000pg/mL、约60pg/mL至约110,000pg/mL、约70pg/mL至约110,000pg/mL、约75pg/mL至约110,000pg/mL、约80pg/mL至约110,000pg/mL、约90pg/mL至约110,000pg/mL、约100pg/mL至约110,000pg/mL、约110pg/mL至约110,000pg/mL、约120pg/mL至约110,000pg/mL、约125pg/mL至约110,000pg/mL、约130pg/mL至约110,000pg/mL、约140pg/mL至约110,000pg/mL、约150pg/mL至约110,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约100,000pg/mL、约0.001pg/mL至约100,000pg/mL、约0.01pg/mL至约100,000pg/mL、约0.1pg/mL至约100,000pg/mL、约0.5pg/mL至约100,000pg/mL、约1.0pg/mL、约100,000pg/mL、约2.0pg/mL至约100,000pg/mL、约3.0pg/mL至约100,000pg/mL、约4.0pg/mL至约100,000pg/mL、约5.0pg/mL至约100,000pg/mL、约6.0pg/mL至约100,000pg/mL、约7.0pg/mL至约100,000pg/mL、约8.0pg/mL至约100,000pg/mL、约9.0pg/mL至约100,000pg/mL、约10.0pg/mL至约100,000pg/mL、约20pg/mL至约100,000pg/mL、约25pg/mL至约100,000pg/mL、约30pg/mL至约100,000pg/mL、约40pg/mL至约100,000pg/mL、约50pg/mL至约100,000pg/mL、约60pg/mL至约100,000pg/mL、约70pg/mL至约100,000pg/mL、约75pg/mL至约100,000pg/mL、约80pg/mL至约100,000pg/mL、约90pg/mL至约100,000pg/mL、约100pg/mL至约100,000pg/mL、约110pg/mL至约100,000pg/mL、约120pg/mL至约100,000pg/mL、约125pg/mL至约100,000pg/mL、约130pg/mL至约100,000pg/mL、约140pg/mL至约100,000pg/mL、约150pg/mL至约100,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约90,000pg/mL、约0.001pg/mL至约90,000pg/mL、约0.01pg/mL至约90,000pg/mL、约0.1pg/mL至约90,000pg/mL、约0.5pg/mL至约90,000pg/mL、约1.0pg/mL至约90,000pg/mL、约2.0pg/mL至约90,000pg/mL、约3.0pg/mL至约90,000pg/mL、约4.0pg/mL至约90,000pg/mL、约5.0pg/mL至约90,000pg/mL、约6.0pg/mL至约90,000pg/mL、约7.0pg/mL至约90,000pg/mL、约8.0pg/mL至约90,000pg/mL、约9.0pg/mL至约90,000pg/mL、约10.0pg/mL至约90,000pg/mL、约20pg/mL至约90,000pg/mL、约25pg/mL至约90,000pg/mL、约30pg/mL至约90,000pg/mL、约40pg/mL至约90,000pg/mL、约50pg/mL至约90,000pg/mL、约60pg/mL至约90,000pg/mL、约70pg/mL至约90,000pg/mL、约75pg/mL至约90,000pg/mL、约80pg/mL至约90,000pg/mL、约90pg/mL至约90,000pg/mL、约100pg/mL至约90,000pg/mL、约110pg/mL至约90,000pg/mL、约120pg/mL至约90,000pg/mL、约125pg/mL至约90,000pg/mL、约130pg/mL至约90,000pg/mL、约140pg/mL至约90,000pg/mL、约150pg/mL至约90,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约80,000pg/mL、约0.001pg/mL至约80,000pg/mL、约0.01pg/mL至约80,000pg/mL、约0.1pg/mL至约80,000pg/mL、约0.5pg/mL至约80,000pg/mL、约1.0pg/mL至约80,000pg/mL、约2.0pg/mL至约80,000pg/mL、约3.0pg/mL至约80,000pg/mL、约4.0pg/mL至约80,000pg/mL、约5.0pg/mL至约80,000pg/mL、约6.0pg/mL至约80,000pg/mL、约7.0pg/mL至约80,000pg/mL、约8.0pg/mL至约80,000pg/mL、约9.0pg/mL至约80,000pg/mL、约10.0pg/mL至约80,000pg/mL、约20pg/mL至约80,000pg/mL、约25pg/mL至约80,000pg/mL、约30pg/mL至约80,000pg/mL、约40pg/mL至约80,000pg/mL、约50pg/mL至约80,000pg/mL、约60pg/mL至约80,000pg/mL、约70pg/mL至约80,000pg/mL、约75pg/mL至约80,000pg/mL、约80pg/mL至约80,000pg/mL、约90pg/mL至约80,000pg/mL、约100pg/mL至约80,000pg/mL、约110pg/mL至约80,000pg/mL、约120pg/mL至约80,000pg/mL、约125pg/mL至约80,000pg/mL、约130pg/mL至约80,000pg/mL、约140pg/mL至约80,000pg/mL、约150pg/mL至约80,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约75,000pg/mL、约0.001pg/mL至约75,000pg/mL、约0.01pg/mL至约75,000pg/mL、约0.1pg/mL至约75,000pg/mL、约0.5pg/mL至约75,000pg/mL、约1.0pg/mL至约75,000pg/mL、约2.0pg/mL至约75,000pg/mL、约3.0pg/mL至约75,000pg/mL、约4.0pg/mL至约75,000pg/mL、约5.0pg/mL至约75,000pg/mL、约6.0pg/mL至约75,000pg/mL、约7.0pg/mL至约75,000pg/mL、约8.0pg/mL至约75,000pg/mL、约9.0pg/mL至约75,000pg/mL、约10.0pg/mL至约75,000pg/mL、约20pg/mL至约75,000pg/mL、约25pg/mL至约75,000pg/mL、约30pg/mL至约75,000pg/mL、约40pg/mL至约75,000pg/mL、约50pg/mL至约75,000pg/mL、约60pg/mL至约75,000pg/mL、约70pg/mL至约75,000pg/mL、约75pg/mL至约75,000pg/mL、约80pg/mL至约75,000pg/mL、约90pg/mL至约75,000pg/mL、约100pg/mL至约75,000pg/mL、约110pg/mL至约75,000pg/mL、约120pg/mL至约75,000pg/mL、约125pg/mL至约75,000pg/mL、约130pg/mL至约75,000pg/mL、约140pg/mL至约75,000pg/mL、约150pg/mL至约75,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约70,000pg/mL、约0.001pg/mL至约70,000pg/mL、约0.01pg/mL至约70,000pg/mL、约0.1pg/mL至约70,000pg/mL、约0.5pg/mL至约70,000pg/mL、约1.0pg/mL至约70,000pg/mL、约2.0pg/mL至约70,000pg/mL、约3.0pg/mL至约70,000pg/mL、约4.0pg/mL至约70,000pg/mL、约5.0pg/mL至约70,000pg/mL、约6.0pg/mL至约70,000pg/mL、约7.0pg/mL至约70,000pg/mL、约8.0pg/mL至约70,000pg/mL、约9.0pg/mL至约70,000pg/mL、约10.0pg/mL至约70,000pg/mL、约20pg/mL至约70,000pg/mL、约25pg/mL至约70,000pg/mL、约30pg/mL至约70,000pg/mL、约40pg/mL至约70,000pg/mL、约50pg/mL至约70,000pg/mL、约60pg/mL至约70,000pg/mL、约70pg/mL至约70,000pg/mL、约75pg/mL至约70,000pg/mL、约80pg/mL至约70,000pg/mL、约90pg/mL至约70,000pg/mL、约100pg/mL至约70,000pg/mL、约110pg/mL至约70,000pg/mL、约120pg/mL至约70,000pg/mL、约125pg/mL至约70,000pg/mL、约130pg/mL至约70,000pg/mL、约140pg/mL至约70,000pg/mL、约150pg/mL至约70,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约60,000pg/mL、约0.001pg/mL至约60,000pg/mL、约0.01pg/mL至约60,000pg/mL、约0.1pg/mL至约60,000pg/mL、约0.5pg/mL至约60,000pg/mL、约1.0pg/mL至约60,000pg/mL、约2.0pg/mL至约60,000pg/mL、约3.0pg/mL至约60,000pg/mL、约4.0pg/mL至约60,000pg/mL、约5.0pg/mL至约60,000pg/mL、约6.0pg/mL至约60,000pg/mL、约7.0pg/mL至约60,000pg/mL、约8.0pg/mL至约60,000pg/mL、约9.0pg/mL至约60,000pg/mL、约10.0pg/mL至约60,000pg/mL、约20pg/mL至约60,000pg/mL、约25pg/mL至约60,000pg/mL、约30pg/mL至约60,000pg/mL、约40pg/mL至约60,000pg/mL、约50pg/mL至约60,000pg/mL、约60pg/mL至约60,000pg/mL、约70pg/mL至约60,000pg/mL、约75pg/mL至约60,000pg/mL、约80pg/mL至约60,000pg/mL、约90pg/mL至约60,000pg/mL、约100pg/mL至约60,000pg/mL、约110pg/mL至约60,000pg/mL、约120pg/mL至约60,000pg/mL、约125pg/mL至约60,000pg/mL、约130pg/mL至约60,000pg/mL、约140pg/mL至约60,000pg/mL、约150pg/mL至约60,000pg/mL、约0.0001pg/mL至约50,000pg/mL、约0.001pg/mL至约50,000pg/mL、约0.01pg/mL至约50,000pg/mL、约0.1pg/mL至约50,000pg/mL、约0.5pg/mL至约50,000pg/mL、约1.0pg/mL至约50,000pg/mL、约2.0pg/mL至约50,000pg/mL、约3.0pg/mL至约50,000pg/mL、约4.0pg/mL至约50,000pg/mL、约5.0pg/mL至约50,000pg/mL、约6.0pg/mL至约50,000pg/mL、约7.0pg/mL至约50,000pg/mL、约8.0pg/mL至约50,000pg/mL、约9.0pg/mL至约50,000pg/mL、约10.0pg/mL至约50,000pg/mL、约20pg/mL至约50,000pg/mL、约25pg/mL至约50,000pg/mL、约30pg/mL至约50,000pg/mL、约40pg/mL至约50,000pg/mL、约50pg/mL至约50,000pg/mL、约60pg/mL至约50,000pg/mL、约70pg/mL至约50,000pg/mL、约75pg/mL至约50,000pg/mL、约80pg/mL至约50,000pg/mL、约90pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约110pg/mL至约50,000pg/mL、约120pg/mL至约50,000pg/mL、约125pg/mL至约50,000pg/mL、约130pg/mL至约50,000pg/mL、约140pg/mL至约50,000pg/mL或约150pg/mL至约50,000pg/mL的GFAP。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估选自以下范围的GFAP范围：约10pg/mL至约50,000pg/mL、约20pg/mL至约50,000pg/mL、约25pg/mL至约50,000pg/mL、约30pg/mL至约50,000pg/mL、约40pg/mL至约50,000pg/mL、约50pg/mL至约50,000pg/mL、约60pg/mL至约50,000pg/mL、约70pg/mL至约50,000pg/mL、约75pg/mL至50,000pg/mL、约80pg/mL至约50,000pg/mL、约90pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约125pg/mL至约50,000pg/mL以及约150pg/mL至约50,000pg/mL。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估的范围为约5pg/mL至约50,000pg/mL。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估的范围为约10pg/mL至约50,000pg/mL。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估的范围为约12pg/mL至约50,000pg/mL。
在某些实施例中，可以测定、测量或评估的范围为约20pg/mL至约50,000pg/mL。
除了床边装置之外的一些仪器(例如，Abbott Laboratories的仪器及其他核心实验室仪器)也可以测量生物样品中高于50,000pg/mL的GFAP水平。因此，在某些实施例中，可以根据本公开内容的方法测量的GFAP浓度可能高于50,000pg/mL。本文所述的方法可以为此类装置提供一项或多项本文所述的益处(例如，测量范围高达50,000pg/mL，动态范围为5个对数，动态范围内的测定线性，能够测量体积小于20微升的样品中的GFAP，以及具有扩展检测窗口等等)。
其他检测方法包括使用或调整以适用于纳米孔装置或纳米井装置，如单分子检测。有关纳米孔装置的示例详述于国际专利公开号W0 2016/161402中，通过整体引用并入本文。有关纳米井装置的示例详述于国际专利公开号W0 2016/161400中，通过整体引用并入本文。也可以使用适合于单分子检测的其他装置和方法。
a.评估GFAP状态以此作为创伤性脑损伤测量指标的方法
在一个实施例中，本文所述的方法可用于评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态，以此作为创伤性脑损伤的测量指标。所述方法包括以下步骤：a)将生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员进行接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性地结合至GFAP，从而产生一种或多种包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测来自一种或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表示样品中存在GFAP，可检测标记中可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP的数量，以便可以利用可检测标记中可检测信号的存在和/或数量评估所述受试者的GFAP状态，以此作为创伤性脑损伤的测量指标。所述方法(i)可测定高达50,000pg/mL的GFAP水平，(ii)不需要稀释生物样品，并且(iii)使用床边装置即可进行。可以使用的床边装置的一个示例为(伊利诺伊州，雅培科技园的Abbott Laboratories)。
在一个实施例中，本文所述的方法可用于评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态，以此作为人体受试者生物样品中创伤性脑损伤的测量指标。所述受试者可能头部曾经受过伤或者已知头部曾经受过伤。所述方法包括以下步骤：(a)将从人体受试者身上采集的生物样品以任意顺序同时或依次接触：(1)捕捉抗体：该抗体固定在实心载体上且与人GFAP上的表位结合，形成捕捉抗体-GFAP抗原复合物，和(2)检测抗体：该抗体包含一个可检测标记，并且与人GFAP上未与捕捉抗体结合的表位结合，形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕捉抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物，其中捕捉抗体和检测抗体为单克隆抗体，(b)根据捕捉抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号测定生物样品中的GFAP水平。所述方法能够在动态范围内对5pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平进行定量，并且精度小于10％CV，动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
在一个实施例中，本文所述的方法可用于测量胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态，以此作为受试者创伤性脑损伤的测量指标，所述受试者可能头部曾经受过伤或者已知头部曾经受过伤。所述方法包括以下步骤：a)将采集自所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员同时或依次接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自特异性地结合至GFAP，从而产生一种或多种包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；其中第一特异性结合成员固定在实心载体上；b)检测来自一种或多种第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表示样品中存在GFAP；c)可检测标记中可检测信号的数量表示样品中存在的GFAP的数量，以便可以利用可检测标记中可检测信号的数量评估所述受试者的GFAP状态，以此作为创伤性脑损伤的测量指标。所述方法能够在动态范围内测定体积小于20微升的测试样品的20pg/mL至50,000pg/mL的GFAP水平，并且精度小于10％CV，动态范围内的线性偏差(DL)小于10％。
在某些实施例中，所述方法均可用于测定以下范围的GFAP水平：约10.0pg/mL至约50,000pg/mL、约20pg/mL至约50,000pg/mL、约25pg/mL至约50,000pg/mL、约30pg/mL至约50,000pg/mL、约40pg/mL至约50,000pg/mL、约50pg/mL至约50,000pg/mL、约60pg/mL至约50,000pg/mL、约70pg/mL至约50,000pg/mL、约75pg/mL至约50,000pg/mL、约80pg/mL至约50,000pg/mL、约90pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约125pg/mL至约50,000pg/mL或约150pg/mL至约50,000pg/mL。在某些实施例中，所述方法均可用于测定以下范围的GFAP水平：约10.0pg/mL至约150,000pg/mL、约20pg/mL至约150,000pg/mL、约25pg/mL至约150,000pg/mL、约30pg/mL至约150,000pg/mL、约40pg/mL至约150,000pg/mL、约50pg/mL至约150,000pg/mL、约60pg/mL至约150,000pg/mL、约70pg/mL至约150,000pg/mL、约75pg/mL至约150,000pg/mL、约80pg/mL至约150,000pg/mL、约90pg/mL至约150,000pg/mL、约100pg/mL至约150,000pg/mL、约100pg/mL至约150,000pg/mL、约125pg/mL至约150,000pg/mL或约150pg/mL至约150,000pg/mL。在某些实施例中，所述方法均可用于测定选自以下群组的GFAP水平：约10.0pg/mL至约50,000pg/mL、约20pg/mL至约50,000pg/mL、约25pg/mL至约50,000pg/mL、约30pg/mL至约50,000pg/mL、约40pg/mL至约50,000pg/mL、约50pg/mL至约50,000pg/mL、约60pg/mL至约50,000pg/mL、约70pg/mL至约50,000pg/mL、约75pg/mL至约50,000pg/mL、约80pg/mL至约50,000pg/mL、约90pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约125pg/mL至约50,000pg/mL、约150pg/mL至约50,000pg/mL、约100pg/mL至约50,000pg/mL、约125pg/mL至约50,000pg/mL，以及约150pg/mL至约50,000pg/mL。在某些实施例中，所述方法均可用于测定选自以下群组的GFAP水平：约10.0pg/mL至约150,000pg/mL、约20pg/mL至约150,000pg/mL、约25pg/mL至约150,000pg/mL、约30pg/mL至约150,000pg/mL、约40pg/mL至约150,000pg/mL、约50pg/mL至约150,000pg/mL、约60pg/mL至约150,000pg/mL、约70pg/mL至约150,000pg/mL、约75pg/mL至约150,000pg/mL、约80pg/mL至约150,000pg/mL、约90pg/mL至约150,000pg/mL、约100pg/mL至约150,000pg/mL、约100pg/mL至约150,000pg/mL、约125pg/mL至约150,000pg/mL或约150pg/mL至约150,000pg/mL。
在某些实施例中，可以检测到生物样品中至少为0.5pg/mL、0.10pg/mL、0.50pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、15pg/mL、20pg/mL、31pg/mL、32pg/mL、33pg/mL、34pg/mL、35pg/mL、40pg/mL、50pg/mL、60pg/mL、70pg/mL、80pg/mL、90pg/mL或100pg/mL的GFAP(或GFAP片段)水平。在某些实施例中，可以检测到生物样品中低于约150,000pg/mL、低于约100,000pg/mL、低于约90,000pg/mL、低于约80,000pg/mL、低于约70,000pg/mL、低于约60,000pg/mL、低于约50,000pg/mL、低于约40,000pg/mL、低于约30,000pg/mL或低于约25,000pg/mL的GFAP(或GFAP片段)水平。
在某些实施例中，可以检测到生物样品中至少约10,000pg/mL、至少约15,000pg/mL、至少约20,000pg/mL、至少约25,000pg/mL、至少约30,000pg/mL、至少约35,000pg/mL、至少约40,000pg/mL、至少约45,000pg/mL、至少约50,000pg/mL、至少约60,000pg/mL、至少约70,000pg/mL、至少约80,000pg/mL、至少约90,000pg/mL、至少约100,000pg/mL或至少约150,000pg/mL的GFAP(或GFAP片段)水平。
在某些实施例中，测定的检测限(LoD)下限为约10pg/mL、约15pg/mL、约20pg/mL、约25pg/mL、约30pg/mL、约40pg/mL或约50pg/mL。
在某些实施例中，在约10pg/mL至约50,000pg/mL的范围内，测定的线性偏差(DL)小于10％。例如，在约10pg/mL至约50,000pg/mL、约12pg/mL至约50,000pg/mL、约12pg/mL至约13,660pg/mL、约12pg/mL至约900pg/mL、约370pg/mL至约50,000pg/mL或约420pg/mL至约50,000pg/mL的范围内，测定的线性偏差可能为小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％。
在某些实施例中，当变动系数(CV)为20％时，所述方法的GFAP定量范围为20pg/mL至50,000pg/mL。在某些实施例中，当变动系数(CV)为20％时，所述方法的GFAP检测范围为20pg/mL至50,000pg/mL。
在某些实施例中，第一特异性结合成员固定在实心载体上。在某些实施例中，第二特异性结合成员固定在实心载体上。在某些实施例中，第一特异性结合成员为如下所述的GFAP抗体。在某些实施例中，第二特异性结合成员为如下所述的GFAP抗体。在某些实施例中，第一特异性结合成员和第二特异性结合成员均为GFAP抗体。
在某些实施例中，生物样品已经过稀释或未经过稀释。生物样品的体积可以为约1至约25微升、约1至约24微升、约1至约23微升、约1至约22微升、约1至约21微升、约1至约20微升、约1至约18微升、约1至约17微升、约1至约16微升、约15微升或约1微升、约2微升、约3微升、约4微升、约5微升、约6微升、约7微升、约8微升、约9微升、约10微升、约11微升、约12微升、约13微升、约14微升、约15微升、约16微升、约17微升、约18微升、约19微升、约20微升、约21微升、约22微升、约23微升、约24微升或约25微升。在某些实施例中，生物样品的体积为约1至约150微升或以下，或者约1至约25微升或以下。
在某些实施例中，我们怀疑受试者头部曾经受过伤。在某些实施例中，我们无从得知受试者头部是否曾经受过伤。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有轻度、中度或重度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有轻度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有中度TBI。在某些实施例中，我们怀疑受试者患有重度TBI。
在某些实施例中，无从得知采集生物样品与受试者受到损伤之间的时间有多久。在某些实施例中，生物样品可能采集自受试者受到损伤(例如，该损伤可能为头部损伤)后的约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月、约24个月、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年之内。在某些实施例中，生物样品可能采集自受试者受试者摄入或接触化学品、毒素或化学品或两者组合后的约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月、约24个月、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年之内。此类化学品和/或毒素的示例包括火、霉菌、石棉、农药和杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、毒气(如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(如甲基汞、四乙铅和有机锡)以及/或者滥用一种或多种药物)。在某些实施例中，可以从患有疾病的受试者身上采集生物样品，疾病类型包括自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或并发上述疾病。在某些实施例中，可以利用所述方法确认是否存在创伤性脑损伤。所述方法可以在约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时等之后进行。
b.为患有创伤性脑损伤的受试者提供诊断辅助的方法
在另一实施例中，本文所述的方法可用于通过测定受试者的GFAP水平来为患有创伤性脑损伤的受试者提供诊断辅助。所述方法可用于利用如下所述的抗-GFAP抗体或其抗体片段来检测或评估受试者的创伤性脑损伤。所述方法包括以下步骤：(a)从所述受试者身上采集生物样品，(b)利用抗-GFAP抗体或其抗体片段测定生物样品的GFAP水平，(c)将生物样品的GFAP水平与GFAP的参考水平进行比较，(d)如果生物样品的GFAP水平高于GFAP的参考水平，则可以判定受试者患有创伤性脑损伤，并且(e)选择性地对判定患有创伤性脑损伤的受试者实施治疗方案。在某些实施例中，在床边装置上实施所述方法。
与其他市售的GFAP免疫测定相比，所述方法通过测量和评估GFAP，成功地对更多疾病进行更准确地诊断和后续治疗。所述方法可调整以适用于自动化系统或半自化动系统。
通常，可以采用预定水平作为基准，根据所述基准来评估测定试验样品的GFAP所获得的结果。通常，在进行此类比较时，通过将特定测定在适当的条件下运行足够的次数来获得预定水平，从而将分析物的存在与否、数量或浓度与TBI的特定阶段或终点，或与特定标记进行联系或关联。通常，利用参考受试者(或受试者群体)的测定获得预定水平。测得GFAP可以包括其GFAP片段、其降解产物和/或其酶切割产物。
所述方法的参考水平可以是患有创伤性脑损伤患者的GFAP水平。在某些实施例中，参考水平在本文所述的方法的动态范围内。在某些实施例中，动态范围为约5pg/mL至约50,000pg/mL、约10.0pg/mL至约50,000pg/mL、约12pg/mL至约50,000pg/mL或约20pg/mL至约50,000pg/mL。在某些实施例中，血清的GFAP水平大于或等于5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、30pg/mL、40pg/mL、50pg/mL、60pg/mL、70pg/mL、80pg/mL、90pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL或50000pg/mL可判定受试者患有创伤性脑损伤。在某些任选的实施例中，血清的GFAP水平大于或等于100000pg/mL、500000pg/mL、1000000pg/mL、150000pg/mL、200000pg/mL或500000pg/mL可判定受试者患有创伤性脑损伤。在某些实施例中，血浆的GFAP水平大于或等于5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、30pg/mL、40pg/mL、50pg/mL、60pg/mL、70pg/mL、80pg/mL、90pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL或50000pg/mL可判定受试者患有创伤性脑损伤。在某些任选的实施例中，血浆的GFAP水平大于或等于100000pg/mL、500000pg/mL、1000000pg/mL、150000pg/mL、200000pg/mL或500000pg/mL可判定受试者患有创伤性脑损伤。
c.预测患有创伤性脑损伤的受试者是否为疗法或治疗候选人的方法
同样在另一实施例中，本文所述的方法也可用于通过利用如下所述的抗-GFAP抗体或其抗体片段测定受试者的GFAP水平，来预测之前患有TBI的受试者是否为疗法的候选人。因此，在特定实施例中，本公开内容还提供了用于测定患有或处于患有本文所讨论且本领域已知的创伤性脑损伤风险之中的受试者是否为疗法或治疗的候选人的方法。通常，受试者至少为以下人群之一：(i)头部曾经受过伤；(ii)曾经摄入和/或接触过一种或多种化学品和/或毒素；(iii)患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或并发上述疾病；或(iv)同时并发(i)-(iii)所述任何症状；或，实际被诊断为患有TBI或处于患有TBI的风险之中的人员(例如，患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或并发上述疾病的受试者)，和/或如本文所述，GFAP或GFAP片段的浓度或数量不利(即，在临床上不合需要)的人员。
具体而言，所述方法包括以下步骤：(a)利用本文所述或本领域已知的方法测定受试者测试样品中GFAP的浓度或数量；(b)将步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量与预定水平进行比较，其中，如果步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相对于预定水平是有利的，那么可判定受试者不是疗法或治疗的候选人。然而，如果步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相对于预定水平是不利的，那么可判定受试者是本文f章节所述且本领域已知的疗法或治疗的候选人。在某些实施例中，在床边装置上实施所述方法。可以使用的床边装置的一个示例为(伊利诺伊州，雅培科技园的Abbott Laboratories)。
d.监测受试者创伤性脑损伤进展的方法
同样在另一实施例中，本文所述的方法也可用于通过利用如下所述的抗-GFAP抗体或其抗体片段测定受试者的GFAP水平，来监测疾病和/或损伤(如创伤性脑损伤)的进展。所述方法优选包括以下步骤：(a)利用如下所述的抗-GFAP抗体或其抗体片段测定受试者测试样品中的GFAP的浓度或数量；(b)利用如下所述的抗-GFAP抗体或其抗体片段测定受试者最新测试样品中的GFAP的浓度或数量；(c)将步骤(b)中测定的GFAP的浓度或数量与步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量进行比较，其中，如果与步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相比，步骤(b)中测定的GFAP的浓度或数量是无变化的或不利的，那么可判定受试者的疾病已经持续、发展或恶化。相反，如果与步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相比，步骤(b)中测定的GFAP的浓度或数量是有利的，那么可判定受试者的疾病已经停止、消退或改善。在某些实施例中，在床边装置上实施所述方法。可以使用的床边装置的一个示例为(伊利诺伊州，雅培科技园的Abbott Laboratories)。
所述方法可选择性地进一步包括将例如步骤(b)中测定的GFAP的浓度或数量与预定水平进行比较。此外，如果比较显示例如步骤(b)中测定的GFAP的浓度或数量相对于预定水平发生不利变化，那么所述方法可选择性地包括利用一种或多种药物组合物对所述受试者进行一段时间的治疗。
更进一步，所述方法可用于监测接受一种或多种药物组合物治疗的受试者的治疗情况。具体而言，所述方法涉及在对受试者施用一种或多种药物组合物之前，提供来自受试者的第一测试样品。然后，测定(例如，利用本文所述的或本领域已知的方法)来自受试者的第一测试样品中GFAP的浓度或数量。测定GFAP的浓度或数量之后，可选择性地再将GFAP的浓度或数量与预定水平进行比较。如果在第一测试样品中测定的GFAP的浓度或数量低于预定水平，那么受试者将不会接受一种或多种药物组合物治疗，或者，受试者可接受一种或多种药物组合物治疗。如果在第一测试样品中测定的GFAP的浓度或数量高于预定水平，那么受试者将接受一段时间的一种或多种药物组合物治疗，或者，受试者将不接受一种或多种药物组合物治疗。本领域技术人员可以确定受试接受一种或多种药物组合物治疗的时间段(例如，时间段可以是约七(7)天至约两年，最好是约十四(14)天至约一(1)年)。
然后，在施用一种或多种药物组合物治疗期间，从受试者身上采集第二和后续测试样品。测试样品的数量以及从受试者身上采集所述测试样品的时间并不重要。例如，第二测试样品可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后七(7)天采集，第三测试样品可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后两(2)周采集，第四试验样品可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后三(3)周采集，第五试验样品可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后四(4)周采集，等等。
从受试者身上采集第二或后续测试样品后，测定(例如，利用本文所述的或本领域已知的方法)第二或后续测试样品中GFAP的浓度或数量。然后将第二和后续测试样品中测定的GFAP的浓度或数量与第一测试样品(例如，最初任选与预定水平进行比较的测试样品)中测定的GFAP的浓度或数量进行比较。如果与步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相比，步骤(c)中测定的GFAP的浓度或数量是有利的，那么可判定受试者的疾病已经停止、消退或改善，且应当对受试者继续施用步骤(b)中所述的一种或多种药物组合物。然而，如果与步骤(a)中测定的GFAP的浓度或数量相比，步骤(c)中测定的GFAP的浓度或数量无变化或是不利的，那么可判定受试者的疾病已经持续、进展或恶化，且应当用更高浓度的步骤(b)中施予受试者的一种或多种药物组合物对受试者进行治疗，或者应当用不同于步骤(b)中施予受试者的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物对受试者进行治疗。具体而言，可以用不同于受试者先前接受的用于减少或降低受试者GFAP水平的一种或多种药物组合物对受试者进行治疗。
通常，对于可以进行重复测试的测定(例如，监测疾病进展和/或对治疗的反应)，在从受试者身上采集第一测试样品之后的一段时间采集第二或后续测试样品。具体而言，可以在从受试者身上采集第一测试样品之后的数分钟、数小时、数天、数周或数年采集第二测试样品。例如，可以在从受试者身上采集第一测试样品之后的如下时间段采集第二测试样品：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年。
当用于监测疾病进展时，上述测定可用于监测患有急性病症的受试者的疾病进展。急性病症，也称为重症监护病症，是指涉及例如心血管系统或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学病症。通常，重症监护病症是指需要在基于医院的环境(包括但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心或其他急救护理环境)中进行紧急医学干预或由护理人员或其他现场医务人员给药的病症。对于重症监护病症，通常在较短的时间范围内进行重复监测，即数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，而最初的测定同样通常在较短的时间范围内完成，例如疾病或病症发作的约数分钟、数小时或数天内。
所述测定也可用于监测患有慢性或非急性病症的受试者的疾病进展。非重症监护或非急性病症是指除了涉及例如心血管系统和/或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学病症之外的病症。通常，非急性病症包括持续时间较长的病症。对于非急性病症，通常在较长的时间范围内进行重复监测，例如数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，而最初的测定同样通常在较长时间范围内完成，例如疾病或病症发作的约数小时、数天、数月或数年。
此外，可以使用从受试者身上采集的第一测试样品进行上述测定，其中所述第一测试样品采集自一个来源，例如尿液、全血、血清或血浆。然后可以选择性地利用从受试者身上采集的第二测试样品重复上述测定，其中所述第二测试样品采集自自另一个来源。例如，如果从尿液中采集第一测试样品，则可以从全血、血清或血浆中采集第二测试样品。可以比较使用第一测试样品和第二测试样品的测定所获得的结果。可以将比较结果用于评估受试者的疾病或病症的状态。
具体而言，对于用于监测疾病进展和/或治疗或用于测定受试者形成创伤性脑损伤的风险的预定水平，GFAP或GFAP片段的数量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或“有利改变的”)或“不利的”(或“不利改变的”)。“升高的”或“增加的”是指测试样品中的数量或浓度高于一般或正常水平或范围(如预定水平)或高于另一参考水平或范围(如较早的样品或基线样品)。术语“降低的”或“减少的”是指测试样品中的数量或浓度低于一般或正常水平或范围(如预定水平)或低于另一参考水平或范围(如较早的样品或基线样品)。术语“改变的”是指样品中的数量或浓度相对于一般或正常水平或范围(如预定水平)或相对于另一参考水平或范围(如较早的样品或基线样品)发生改变(增加或减少)。
根据标准实践定义GFAP的一般或正常水平或范围。如果与一般或正常水平或范围或参考水平或范围相比，存在实验误差或样品差异无法解释的任何净变化时，那么可视为已经出现了所谓的改变水平或改变。因此，在特定样品中测得的水平将与来自所谓的正常受试者的类似样品中测定的水平或水平范围进行比较。在此情况下，“正常受试者”是例如没有可检测疾病或病症的个体，而“正常”(有时也被称为“对照”)患者或群体是例如没有表现出可检测疾病或病症的患者或群体。“表面正常受试者”是其GFAP尚未进行评估或正在进行评估的受试者。当分析物在正常情况下检测不到(例如，正常水平为零，或在正常群体的约25％至约75％的范围内)，但是在测试样品中可检测到时，以及当分析物以高于正常的水平存在于测试样品中时，那么该分析物的水平被认为是“升高的”。因此，除其他方面之外，本公开内容还提供了一种筛查患有创伤性脑损伤或处于患有创伤性脑损伤的风险之中的受试者的方法。
e.其他因素
如上所述，辅助诊断、预测和/或评估的方法可进一步包括利用其他因素来辅助诊断以及预测和评估。如上所述，评估和预测方法可进一步包括利用其他因素来进行评估和预测。在某些实施例中，可以利用格拉斯哥昏迷评分或扩展格拉斯哥结局评分(GOSE)来诊断创伤性脑损伤。其他测试、评分或指数也可以单独使用或与格拉斯哥昏迷评分结合使用。其中一个示例为瑞秋洛斯阿米哥斯认知功能量表(Ranchos Los Amigos Scale)。瑞秋洛斯阿米哥斯认知功能量表可测量意识、认知、行为以及与环境交互的水平。瑞秋洛斯阿米哥斯认知功能量表包含：I级：无反应；II级：笼统反应；III级：局部反应；IV级：混淆-躁动；V级：混淆-不适应；VI级：混淆一适应；VII级：自主-适应；以及VIII级：有目的-适应。
f.患有创伤性脑损伤的受试者的药物治疗
可以利用本领域已知的医学技术，对在上述方法中被判定或评估为患有创伤性脑损伤(例如，轻度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤)的受试者进行治疗。在某些实施例中，所述方法进一步包括利用创伤性脑损伤治疗方法(例如本领域已知的任何治疗方法)对被评估为患有创伤性脑损伤的人体受试者进行治疗。例如，创伤性脑损伤的治疗可以采取多种形式，具体取决于头部损伤的严重程度。例如，对于患有轻度TBI的受试者，治疗方法可以包括休息、避免体育活动(如运动)、外出时避免光照或佩戴太阳镜、服用可缓解头痛或偏头痛的药物、止吐药等其中的一种或多种。对患有重度TBI的患者的治疗可以包括施予一种或多种适当的药物(例如，利尿剂、抗惊厥药物、镇静药物以及将个体置于药物引起的昏迷中的药物或其他药物或生物制药(已知或已开发未来用于治疗TBI)、一种或多种外科手术(例如，血肿切除、颅骨损伤修复、去骨瓣减压术等)以及一种或多种疗法(例如，一种或多种康复疗法、认知行为疗法、愤怒管理、心理辅导等)。
g.患有创伤性脑损伤的受试者的监测
可以利用本领域已知的方法，对在上述方法中被判定或评估为患有创伤性脑损伤(例如，轻度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤)的受试者进行监测。例如，可以通过CT扫描或MRI对患有创伤性脑损伤(例如，轻度创伤性脑损伤或重度创伤性脑损伤)的患者进行监测。
3.6FKP与其他生物标志物的结合
如下文将进一步详细讨论的，本文中所述的抗体可用于多种方法中，以结合一种或多种对疾病具有特异性的生物标志物或免疫测定来检测和测量GFAP的水平和浓度。本公开内容预期，与单独测量GFAP相比，将GFAP与一种或多种对疾病具有特异性的生物标志物或免疫测定结合，可以在健康对照者和患有疾病的个体之间提供更大的差异。例如，与单独的GFAP组相比，测量GFAP和其他创伤性脑损伤生物标志物的一组，可以在健康对照者和患有疾病的个体之间提供更大的差异。GFAP与至少一种或多种生物标志物的结合，可以在健康对照者和患有创伤性脑损伤的个体之间提供更大的差异。一种或多种生物标志物的示例包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、S100钙结合蛋白B(S100b)、脑脂结合蛋白(BLBP)、醛縮酶C(ALDOC)、星形胶质细胞磷酸化蛋白15(PEA15)、谷氨酰胺合成酶(GS)、晶体蛋白B链(CRYAB)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脑源性神经营养因子(BDNF)、Tau、Tau蛋白、C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白A-I(ApoA1)和NFL。可选择性地通过比较单独测定(如单重测定)来进行此类小组测定。
或者，可以利用多重测定来完成本文所述的方法。此类多重方法可选择性地包括一个或多个(或者两个或以上)特异性结合成员，以在多重测定中检测样品中一种或多种(或者两种或以上)靶标分析物。所述一个或多个(或者两个或以上)特异性结合成员中的每一个都可以选择性地结合至不同的靶标分析物，并且每个特异性结合成员与不同的信号生成化合物或信号生成基质缀合。例如，第一特异性结合成员结合至第一靶标分析物，第二特异性结合成员结合至第二靶标分析物，第三特异性结合成员结合至第三靶标分析物等等；而第一特异性结合成员标记为第一信号生成化合物或第一信号生成基质，第二特异性结合成员标记为第二信号生成化合物或第二信号生成基质，第三特异性结合成员标记为第三信号生成化合物或第三信号生成基质等等。在某些实施例中，如果第一特异性结合成员标记为信号生成化合物或第一信号生成基质，那么第一条件将导致第一信号生成化合物或第一信号生成基质的活化、裂解或释放；如果第二特异性结合成员标记为信号生成化合物或信号生成基质，那么第二条件将导致第二信号生成化合物或第二信号生成基质的活化、裂解或释放；如果第三特异性结合成员标记为信号生成化合物或信号生成基质，那么第三条件将导致第三信号生成化合物或第三信号生成基质的活化、裂解或释放。在某些实施例中，可以在测定期间的不同时间改变样品的条件，以允许检测第一信号生成化合物或第一信号生成基质、第二信号生成化合物或第二信号生成基质、第三信号生成化合物或第三信号生成基质等，从而检测一种或多种(或者两种或以上)靶标分析物。在某些实施例中，可同时检测一种或多种(或者两种或以上)已活化或已裂解的信号生成化合物或信号生成基质。在某些实施例中，可连续检测一种或多种(或者两种或以上)已活化或已裂解的信号生成化合物或信号生成基质。在某些实施例中，一种或多种(或者两种或以上)已活化或已裂解的信号生成化合物或信号生成基质可生成不同的可检测信号，例如不同波长的荧光信号。
或者，所述一个或多个(或者两个或以上)特异性结合成员中的每一个都结合至不同的靶标分析物，并且每个特异性结合成员与不同的实心载体(如不同的荧光珠)缀合。例如，第一特异性结合成员结合至第一靶标分析物，第二特异性结合成员结合至第二靶标分析物，第三特异性结合成员结合至第三靶标分析物等等；第一特异性结合成员标记为第一信号生成化合物或第一信号生成基质，第二特异性结合成员标记为第二信号生成化合物或第二信号生成基质，第三特异性结合成员标记为第三信号生成化合物或第三信号生成基质等等；而第一特异性结合成员固定在第一实心载体上，第二特异性结合成员固定在第二实心载体上，第三特异性结合成员固定在第三实心载体上等等。在某些实施例中，一种或多种(或者两种或以上)已活化或已裂解的信号生成化合物或信号生成基质可生成不同的可检测信号，例如不同波长的荧光信号，并且可同时或连续检测不同的实心载体。
在某些实施例中，第一特异性结合成员结合至第一靶标分析物，第二特异性结合成员结合至第二靶标分析物，第三特异性结合成员结合至第三靶标分析物等等；第一特异性结合成员、第二特异性结合成员、第三特异性结合成员等等均标记为信号生成化合物或信号生成基质；而第一特异性结合成员固定在第一实心载体上，第二特异性结合成员固定在第二实心载体上，第三特异性结合成员固定在第三实心载体等等。在某些实施例中，已活化或已裂解的信号生成化合物或信号生成基质可生成不同的可检测信号，例如不同波长的荧光信号，并且可同时或连续检测不同的实心载体。
4.GFAP抗体
本文所述的方法可以使用特异性结合至人胶质纤维酸性蛋白(“GFAP”)(或其片段)的分离抗体，简称“GFAP抗体”。具体而言，GFAP抗体特异性地识别并结合GFAP分解产物中的表位。GFAP抗体可用于评估GFAP状态，以此作为创伤性脑损伤的测量指标，检测生物样品中是否存在GFAP并量化生物样品中存在的GFAP的数量，或检测生物样品中是否存在GFAP并量化GFAP的数量。
a.胶质纤维酸性蛋白(GFAP)
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种50kDa的胞质内丝状蛋白，其构成了星形胶质细胞中细胞骨架的一部分，并且已经证明是星形细胞族中最具特异性的标记物。GFAP蛋白由人GFAP基因编码。GFAP是成熟星形胶质细胞的主要中间丝状体。在分子的中央杆状区域内，GFAP与其他中间丝状体共享相当大的结构同源性。GFAP通过为星形细胞突起提供结构稳定性而参与星形胶质细胞的运动和成形。胶质纤维酸性蛋白及其分解产物(GFAP-BDP)均为脑特异性蛋白，可作为创伤性脑损伤(TBI)病理生理学反应的一部分释放到血液中。发生由创伤、遗传疾病或化学品引起的人体CNS损伤后，星形胶质细胞增殖、细胞体和细胞突起呈现大幅肥大，并且GFAP明显上升。相反，随着星形胶质细胞恶化，GFAP的产生逐步衰退。也可以在施旺细胞、肠神经胶质细胞、唾液腺肿瘤、转移性肾癌、会厌软骨、垂体细胞、未成熟少突胶质细胞、乳头状脑膜瘤和乳腺肌上皮细胞中检测到GFAP。
人GFAP具有以下氨基酸序列：
所述人GFAP可以是SEQ ID NO：1的片段或变体。GFAP片段的长度可以是介于5和400个氨基酸、介于10和400个氨基酸、介于50和400个氨基酸、介于60和400个氨基酸、介于65和400个氨基酸、介于100和400个氨基酸、介于150和400个氨基酸、介于100和300个氨基酸或介于200和300个氨基酸之间。所述片段可包含来自SEQ ID NO：1的连续数量的氨基酸。SEQ ID NO：1的人GFAP片段或变体可以是GFAP分解产物(BDP)。GFAP BDP可以是38kDa、42kDa(弱41kDa)、47kDa(弱45kDa)；25kDa(弱23kDa)；19kDa、或20kDa。
b.GFAP-识别抗体
所述抗体是结合至GFAP、其片段、GFAP的表位或其变体的抗体。所述抗体可以是抗-GFAP抗体片段或其变体或衍生物。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。所述抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟的抗体、人抗体、人源化抗体、完全人抗体或抗体片段，例如Fab片段或其混合物。抗体片段或衍生物可包含F(ab’)2、Fv或scFv片段。所述抗体衍生物可通过模拟肽而产生。此外，所述产生单链抗体的技术可适用于产生单链抗体。
抗-GFAP抗体可以是嵌合抗-GFAP或人源化抗-GFAP抗体。在一个实施例中，人源化抗体和嵌合抗体均为单价。在一个实施例中，人源化抗体和嵌合抗体均包含与Fc区关联的单Fab区。
人抗体可以衍生自噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以由人体内免疫应答产生和分离。参见，例如Funaro等人，BMC Biotechnology，2008(8)：85。因此，抗体可以是人类而非动物抗体库的产物。其起源于人类，因此可以最大程度降低对自身抗原的反应风险。或者，可利用标准酵母展示文库和展示技术来选择和分离人抗-GFAP抗体。例如，可利用人源单链可变区抗体片段(scFv)的初始抗体库(即，来自之前未接触过抗原的宿主)来选择人抗-GFAP抗体。可以利用转基因动物来表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，该抗体分子结合了具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
所述抗体与已知抗体的区别在于前者具有与本领域已知的抗体不同的生物学功能。
(1)表位
所述抗体可免疫特异性地结合至GFAP(SEQ ID NO：1)、其片段其变体。所述抗体可免疫特异性地识别并结合至表位区内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸或至少十个氨基酸。所述抗体可免疫特异性地识别并结合至表位区具有至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个连续氨基酸、至少九个连续氨基酸或至少十个连续氨基酸的表位。
c.抗体制备/生产
抗体可采用多种技术中的任何一种来制备，包括该领域的专业人员所熟知的技术。一般而言，抗体可通过细胞培养技术生产，包括使用常规技术生产单克隆抗体，或通过将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主内来生产抗体，而这些抗体可能是重组抗体。“转染”有多种形式，它包括广泛用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔法、磷酸钙沉淀法和DEAE-葡聚糖转染等。尽管可在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但更佳的选择是在真核细胞中表达抗体，而最佳的方法则是在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更容易合成和分泌正确折叠且具备免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的典型哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，参见Urlaub以及Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980))，可结合使用DHFR选择标记，参见Kaufman以及Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过对宿主细胞进行一段时间的充分培养，使抗体在宿主细胞中表达以生产抗体。而更理想的情况是，将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中。可使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
也可利用宿主细胞产生功能性抗体片段，如Fab片段或scFv分子。不难理解，以上程序在实际操作中可能会有所变化。例如，可能需要用编码抗体轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除结合目标抗原所不需要的编码轻链或/和重链的部分或全部DNA。抗体也包括由这种截短的DNA分子表达的分子。此外还能生产双功能抗体，即一条重链和一条轻链是抗体(即结合人GFAP)，而另一条重链和轻链以标准化学交联方法将抗体与第二抗体交联，从而对人GFAP以外的抗原具有特异性。
在一个用于抗体或其抗原结合部位重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引进dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内部，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件进行有效连接，以推动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已由该载体转染的CHO细胞。对选定的转化体宿主细胞进行培养，使抗体重链和轻链进行表达，并从培养基中回收完整的抗体。标准分子生物学技术被用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞，以及从培养基中回收抗体。此外，合成重组抗体的方法还包括在合适的培养基中培养宿主细胞，直至合成重组抗体。该方法可进一步包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法包括制备能产生具备所需特异性的抗体的永生细胞系，可通过取自免疫动物的脾细胞来生产这些细胞系，动物可使用GFAP或其片段和/或变体进行免疫。用于对动物进行免疫的肽可包含编码人Fc的氨基酸，例如人抗体片段的可结晶区域或尾部区域。然后可通过与骨髓瘤细胞融合配偶体融合等方法使脾细胞永生化。融合技术非常多样化，例如可将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子洗涤剂结合数分钟，然后以低密度接种在支持杂交细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。有一种此类技术使用次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷(HAT)选择，还有一种技术需要用到电融合。经过足够的时间(通常约1-2周)之后，观察杂交细胞的集落。选择单一集落并检测其培养上清液对多肽的结合活性。可使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可从正在生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，还可通过各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中，然后从腹水或血液中收集单克隆抗体。抗体中的杂质可通过常规技术去除，例如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取。亲和色谱法就是一种可用于抗体纯化过程的实例。
木瓜蛋白酶优先将IgG分子切割为几个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各包含一个有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能将IgG分子切割为几个片段，其中包括有两个抗原结合位点的F(ab’)2片段。
Fv片段可通过IgM的选择性蛋白水解切割产生，在极少数情况下可通过IgG或IgA免疫球蛋白分子产生。Fv片段可使用重组技术衍生而来。Fv片段包含一个非共价VH：：VL异二聚体，后者包含一个在很大程度上保留天然抗体分子抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可包含重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，它们分别被插入重链和轻链框架(“FR”)组之间，这两个框架组为CDR提供支持，并定义CDR相对于彼此的空间关系。CDR组可包含重链或轻链V区的三个高变区。
还可使用其他适当方法来生产或分离具有必要特异性的抗体，包括但不限于从肽或蛋白质文库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA，酵母等展示文库)中选择重组抗体的方法，例如可使用本领域已知的方法从Cambridge Antibody Technologies(英国剑桥郡)、MorphoSys(德国马丁斯瑞德/普拉内格)、Biovation(英国苏格兰亚伯丁郡)和BioInvent(瑞典隆德)等各家商业供应商处获得。参见美国专利第4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862号。替代方法依赖于能产生本领域已知和/或此处所述的人类抗体库的转基因动物免疫(如SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41：901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118；Eren等人(1998)Immunol.93：154-161)。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如选择淋巴细胞抗体法(“SLAM″)(美国专利第5,627,052号，Wen等人(1987)J.Immunol.17：887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848)；凝胶微包埋和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8：333-337；One Cell Systems，(马萨诸塞州坎布里奇)；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182：155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13：787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports 19：125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可通过本领域已知的众多方法中的任何一种来生产。例如，Marks等人在BioTechnology，10：779-783(1992)中描述了借助VH和VL结构域改组的亲和力成熟。Barbas等人在Proc.Nat.Acad..Sci.USA，91：3809-3813(1994)中描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。Schier等人，Gene，169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol，155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol，154(7)：3310-3319(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)。美国专利第6,914,128 B1中描述了选择性诱变位置和具有活性增强氨基酸残基的接触或超突变位置的选择性突变。
抗体变体的另一种制备方法是将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主，以获得在乳汁中产生此类抗体的转基因动物或哺乳动物，例如山羊、牛、马、绵羊等。这些是本领域已知的方法，某些美国专利中也有描述，例如第5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362和5,304,489号专利。
还有一种制备抗体变体的方法是通过递送多核苷酸来获得转基因植物和人工培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)，它们分别在植株部位或培养的细胞中产生此类抗体、指定部分或变体。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240：95-118及此处引用的参考文献均描述了表达大量重组蛋白的转基因烟草叶的生产，例如使用诱导型启动子。转基因玉米已被用于表达哺乳动物蛋白质，并已达到商业生产水平，这种蛋白质的生物活性与在其他重组系统中产生或从天然来源纯化的蛋白质的生物活性相当。例如，参见Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464：127-147及此处引用的参考文献。此外还从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产了抗体变体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv抗体)。例如，参见Conrad等人(1998)Plant Mol.Biol.38：101-109及此处引用的参考文献。因此，根据已知方法，也可以使用转基因植物生产抗体。
例如，可通过添加外源序列以改变免疫原性，或降低、增强或改变结合性、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他适当特征，以生产抗体衍生物。通常会保持部分或全部非人类或人类CDR序列，同时用人类氨基酸或其他氨基酸替换可变区和恒定区的非人类序列。
小抗体片段可以是有两个抗原结合位点的双体抗体，这些片段在同一条多肽链(VH VL)中包含相连的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。例如，参见EP 404,097；WO 93/11161，以及Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。通过使用过短的接头，使同一条链上的两个结构域无法相互配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。也可参见Chen等人的美国专利第6,632,926号，本文引用了其全部内容。此专利公开了具有一个或多个插入亲本抗体高变区的氨基酸和对靶抗原的结合亲和力的抗体变体，该靶抗原的结合亲和力比抗原亲本抗体的结合亲和力至少强两倍。
抗体可以是一种线性抗体。制备线性抗体的方法是本领域已知的，在Zapata等人(1995)Protein Eng.8(10)：1057-1062中也有描述。简言之，这些抗体包含一对串联Fd片段(VH-CHl-VH-CHl)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可通过已知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可用于纯化。
对抗体进行可检测性标记或许是有用的。将抗体与这些检测试剂缀合的方法是本领域已知的。可使用例如放射性原子、发色团、荧光团等可检测的基团标记抗体，以仅作说明之用。这种被标记的抗体可以在活体内或分离的测试样本中用于诊断技术。它们可以与细胞因子、配体或另一种抗体相连。用于偶联抗体以实现抗肿瘤效果的合适试剂包括细胞因子，例如白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；光敏剂，用于光动力疗法，包括铝(III)酞菁四磺酸盐、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，如阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新制癌素和卡铂；细菌、植物和其他毒素，如白喉毒素，假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思豆毒素-A毒素、蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)、TGF-d毒素、中华眼镜蛇(naja naja atra)的细胞毒素和白树毒素(一种植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，例如限制素(一种由局限曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(一种来自肥皂草的核糖体失活蛋白)和核糖核酸酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟化嘌呤核苷)；含有抗囊性剂的脂质体(例如反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；以及其他抗体或抗体片段，例如F(ab)。
下文将更详细地阐述如何通过杂交瘤技术、选择淋巴细胞抗体法(SLAM)、转基因动物和重组抗体文库生产抗体。
(1)使用杂交瘤技术的抗GFAP单克隆抗体
本领域已知的多种技术均可用于制备单克隆抗体，包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，可使用杂交瘤技术生产单克隆抗体，这包括本领域已知的那些技术和文献中所教授的方法，例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，第二版，(Cold Spting Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1988)；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，(Flsevier，N.Y.，1981)。还应注意，本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指的是衍生自单个克隆的抗体(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)，而不是指生产该抗体的方法。
生产单克隆抗体的方法以及通过该方法生产的抗体可包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中更好的方法是通过融合从动物(例如大鼠或小鼠)体内分离的脾细胞获得杂交瘤，用带骨髓瘤细胞的GFAP进行免疫，然后筛选出由分泌能与本发明的多肽相结合的抗体的杂交瘤克隆融合产生的杂交瘤。简言之，可以用GFAP抗原对大鼠进行免疫。在更理想的实施方案中，同时施用GFAP抗原和佐剂以刺激免疫应答。这些佐剂包括完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。它们可通过将多肽隔离在局部沉积物中来避免其快速分散，或者它们可能含有某种物质，其能刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他组分具有趋化性的因子。理想情况下，若正在施用多肽，则免疫程序将涉及两次或多次施用多肽，并需要持续数周；但单次施用多肽的方法也是可取的。
在使用GFAP抗原免疫动物后，可从动物体内获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过放血或杀死动物，可获得含有抗GFAP抗体的血清。然后可从该血清中获得免疫球蛋白部分，或从血清中纯化抗GFAP抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质性。
一旦检测到免疫反应，例如在大鼠血清中检测到对抗原GFAP有特异性的抗体，即收获大鼠脾脏并分离出脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如来自美国模式培养物保藏中心(ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释来选择和克隆杂交瘤。然后使用本领域已知的方法测定杂交瘤克隆所分泌的能够结合GFAP的抗体的细胞。通过用阳性杂交瘤克隆对大鼠进行免疫，可产生通常含有高水平抗体的腹水流体。
在另一种实施方案中，可通过免疫动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。对动物进行免疫后将其杀死，取出其脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，这是本领域熟知的方法。例如，参见上文中Harlow和Lane的文献。在优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。进行融合和抗生素选择后，使用GFAP或其部分或表达GFAP的细胞来筛选杂交瘤。在优选的实施方案中，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)进行初始筛选，其中ELISA是首选。ELISA筛选的实例在PCT公开号W0 00/37504中有记载。
选择和克隆产生抗GFAP抗体的杂交瘤，并进一步根据所需的特性进行筛选，这些特性包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产量和所需的抗体特征。通过同源动物、免疫系统缺失的动物(例如裸鼠)可实现杂交瘤的体内培养和扩增，或在细胞培养基中进行体外培养和扩增。本领域的普通技术人员已熟知杂交瘤的选择、克隆和扩增方法。
在理想的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一种实施方案中，杂交瘤在小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马等非人和非大鼠物种中产生。还有一种理想的实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌型骨髓瘤与表达抗GFAP抗体的人细胞融合。
识别特异性表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，可利用诸如木瓜蛋白酶(以产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)2片段)，通过蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生本发明的Fab和F(ab’)2片段。IgG分子的F(ab’)2片段保留较大(“亲本”)IgG分子的两个抗原结合位点，包括轻链(含有可变轻链区和轻链恒定区)、重链的CH1结构域以及亲本IgG分子形成二硫键的铰链区。相应地，F(ab’)2片段仍能与抗原分子交联，例如亲本IgG分子。
(2)使用SLAM的抗GFAP单克隆抗体
本发明的另一个方面是使用本领域称为“选择淋巴细胞抗体法”(SLAM)的方法，由单个分离的淋巴细胞产生重组抗体，可参见美国专利第5,627,052号；PCT公开号W0 92/02551；以及Babcook等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848(1996)。在此方法中，首先通过具有抗原特异性的溶血空斑试验筛选出分泌目标抗体的单细胞(例如来自任何一只免疫动物的淋巴细胞)，使用接头(例如生物素)将这些单细胞的抗原GFAP、GFAP的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，以鉴定出分泌对GFAP具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定出分泌目标抗体的细胞后，通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞中获得重链和轻链可变区的cDNA，使所述可变区与合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)联合在哺乳动物宿主细胞(例如COS或CHO细胞)内表达。然后可对转染由体内选出的淋巴细胞所扩增的免疫球蛋白序列的宿主细胞作进一步的体外分析及体外筛选，例如通过筛选出转染的细胞来分离表达GFAP抗体的细胞。此外还可对扩增的免疫球蛋白序列进一步进行体外操作，例如通过体外亲和力成熟法。例如，可参见PCT公开号W0 97/29131和PCT公开号W0 00/56772。
(3)使用转基因动物的抗GFAP单克隆抗体
在本发明的另一种实施方案中，通过用GFAP抗原免疫包含部分或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物来生产抗体。在一种实施方案中，非人动物是一只转基因小鼠，这种工程化小鼠品系包含人免疫球蛋白基因座的大片段，且在小鼠抗体产生方面有缺陷。参见Green等人，Nature Genetics，7：13-21(1994)和美国专利第5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364号。也可参见PCT公开号W0 91/10741、W0 94/02602、W0 96/34096、W0 96/33735、W0 98/16654、W0 98/24893、W0 98/50433、W0 99/45031、W0 99/53049、W0 00/09560和WO 00/37504。转基因小鼠产生成体人源完整人抗体库，并产生抗原特异性人单克隆抗体。通过导入兆碱基大小的人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，转基因小鼠包含约80％的人抗体库。参见Mendez等人，Nature Genetics，15：146-156(1997)，6reen和Jakobovits，J.Exp.Med.，188：483-495(1998)，此处引用其公开内容作为参考。
(4)使用重组抗体文库的抗GFAP单克隆抗体
也可利用体外方法制备本发明的抗体，其中需要筛选抗体文库以鉴定具备所需GFAP结合特异性的抗体。这种筛选重组抗体文库的方法是本领域熟知的，包括例如以下文献中描述的方法：美国专利第5，223，409号(Ladner等人)；PCT公开号W0 92/18619(Kang等人)；PCT公开号W0 91/17271(Dower等人)；PCT公开号W0 92/20791(Winter等人)；PCT公开号W0 92/15679(Markland等人)；PCT公开号W0 93/01288(Breitling等人)；PCT公开号W092/01047(McCafferty等人)；PCT公开号W0 92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人，Bio/Technology，9：1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas，3：81-85(1992)；Huse等人，Science，246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.，12：725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580(1992)；Garrard等人，Bio/Technology，9：1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)；美国专利申请第2003/0186374号；以及PCT公开号W0 97/29131，此处引用了这些文献的内容作为参考。
重组抗体文库可来自用GFAP或GFAP的一部分进行免疫的受试者。或者，重组抗体文库可以来自无经验受试者，即未用GFAP进行免疫的受试者，例如来自未用人GFAP进行免疫的人受试者的人抗体文库。本发明的抗体选择方法是用包含人GFAP的肽对重组抗体文库进行筛选，从而选择出识别GFAP的抗体。这种筛选和选择的方法是本领域熟知的，在上一段的参考文献中也有提及。要选择对GFAP具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如那些以特定Koff速率常数从人GFAP解离的抗体，可使用本领域已知的表面等离子体共振法来选择具有所需Koff速率常数的抗体。要选择对hGFAP具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC50的抗体，可使用本领域已知的用于评估GFAP活性抑制情况的标准方法。
一方面，本发明涉及结合人GFAP的分离抗体或其抗原结合部分。更理想的情况下，该抗体是一种中和抗体。在多种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，也可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带为其编码的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。这种噬菌体可用于展示从库或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合结构域。可使用抗原选择或鉴定表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用标记抗原或者结合或捕获到固体表面或珠子的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括由噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域通过重组方法融合到噬菌体的基因III或基因VIII蛋白。有关可用于制备抗体的噬菌体展示方法的实例，可参见Brinkmann等人，J.Immuno.Nethods，182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods，184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.，24：952-958(1994)；Petsic等人，Gene，187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunollogy，57：191-280(1994)；PCT公开号W0 92/01047；PCT公开号W0 90/02809；W0 91/10737；W0 92/01047；W0 92/18619；W0 93/11236；W0 95/15982；W0 95/20401；以及美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段的完整抗体，并在所需的任何宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。下文将详述此内容。例如，也可使用本领域已知的方法通过重组技术生产Fab、Fab’和F(ab’)2片段，例如以下文献中公开的方法：PCT公开号W0 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques，12(6)：864-869(1992)；Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunoll.，34：26-34(1995)；以及Better等人，Science，240：1041-1043(1988)。可用于产生单链Fv和抗体的技术实例包括那些在以下文献中公开的方法：美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston等人，Methods in Enzymology，203：46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science，240：1038-1041(1988)。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代方法，本领域已知的用于筛选大型组合文库的其他方法可用于鉴定本发明的抗体。其中一种类型的替代表达系统是重组抗体文库以RNA-蛋白质融合体的形式表达，例如PCT公开号W0 98/31700(Szostak和Roberts)，以及Roberts以及Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12297-12302(1997)中公开的方法。在该系统中，3’端携带嘌呤霉素(一种肽基受体抗生素)的合成mRNA在体外翻译后，产生了mRNA和由其编码的肽或蛋白质的共价融合体。因此，基于编码的肽或蛋白质(例如抗体)或其部分(例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合)的特性，可以从mRNA的复杂混合物(例如组合文库)中浓缩特定mRNA。对所述文库进行筛选所获得的编码抗体或其部分的核酸序列，可按上述重组方式进行表达(例如在哺乳动物宿主细胞内)，也可通过对已经将突变引入最初选择的序列中的mRNA-肽融合体进行更多轮的筛选以促进亲和力成熟，或采用上述其他的重组抗体体外亲和力成熟方法。该方法的一个理想示例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，也可使用本领域已知的酵母展示法产生抗体。酵母展示法利用遗传方法将抗体结构域连接到酵母细胞壁，并将它们展示在酵母的表面。特别地，这种酵母可用于展示从库或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合结构域。可用于制备抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利第6,699,658号(Wittrup等人)中公开的一些方法，本文引用了这些方法作为参考。
d.重组GFAP抗体的生产
本领域已知的许多技术中的任何一种均可用于生产抗体。例如宿主细胞的表达，其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。“转染”有多种形式，它包括广泛用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔法、磷酸钙沉淀法和DEAE-葡聚糖转染等。尽管可在原核或真核宿主细胞中表达该发明的抗体，但更佳的选择是在真核细胞中表达抗体，而最佳的选择是在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更容易合成和分泌正确折叠且具备免疫活性的抗体。
用于表达该发明的重组抗体的典型哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，参见Urlaub以及Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)，可结合使用DHFR选择标记，参见Kaufman以及Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过对宿主细胞进行一段时间的充分培养，使抗体在宿主细胞中表达以生产抗体。而更理想的情况是，将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中。可使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
也可利用宿主细胞产生功能性抗体片段，如Fab片段或scFv分子。不难理解，以上程序在实际操作中可能会有所变化。例如，可能需要用编码本发明抗体轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除结合目标抗原所不需要的编码轻链或/和重链的部分或全部DNA。本发明的抗体也包括由这种截短的DNA分子表达的分子。此外还能生产双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即结合人GFAP)，而另一条重链和轻链以标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联，从而对人GFAP以外的抗原具有特异性。
在一个用于本发明抗体或其抗原结合部位重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引进dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内部，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件进行有效连接，以推动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已由该载体转染的CHO细胞。对选定的转化体宿主细胞进行培养，使抗体重链和轻链进行表达，并从培养基中回收完整的抗体。标准分子生物学技术被用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞，以及从培养基中回收抗体。此外，本发明提供了一种合成重组抗体的方法，即在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞，直至合成本发明的重组抗体。该方法可进一步包括从培养基中分离重组抗体。
(1)人源化抗体
人源化抗体可以是抗体或其变体、衍生物、类似物或部分，其免疫特异性地与目标抗原结合，并包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区域和和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人源化抗体可以来自与所需抗原相结合、且具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的非人物种抗体。
本文在CDR语境中使用的术语“基本上”是指，CDR所具有的氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少具备90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。人源化抗体包含基本上至少一个(通常是两个)全部可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区均与非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区相一致，且所有或基本上所有框架区为人免疫球蛋白共有序列的框架区。一方面，人源化抗体还包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区。在某些实施方案中，人源化抗体除含有轻链外，还至少含有重链的可变结构域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。而在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定的实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自一种以上类别或同种型的序列，并且可使用本领域熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基来诱变供体抗体CDR或共有框架，使CDR或该位点的框架残基与供体抗体或共有框架不一致。然而，在一项实施方案中，此类突变不会是广泛的。通常，至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的残基相对应。本文所使用的术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。本文所用的术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在一个免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由最常出现在该家族该位置上的氨基酸占据。若两个氨基酸出现在该位置的频率相同，则二者中任何一个都可以包括在共有序列中。
可以对人源化抗体进行设计，使对啮齿动物抗人抗体的不必要免疫应答最小化，因为这种抗人抗体限制了这些基团在人类受体中治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可以具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人残基通常被称为“输入”残基，它们通常取自可变结构域。人源化可通过用高变区序列取代人抗体的相应序列来进行。相应地，这种“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列所取代。例如，可参见美国专利第4,816,567号，此处引用其内容作为参考。人源化抗体可以是人抗体，其中某些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代。可使用任何已知的方法对当前公开的抗体进行人源化或工程化处理，例如但不限于美国专利第5,723,323；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539和4,816,567号中描述的那些方法。
人源化抗体可以保持对GFAP的高亲和力以及其他有利的生物学特性。人源化抗体可通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。通常可获得三维免疫球蛋白模型。有计算机程序可以说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。通过检查这些展示，可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原相结合的能力的残基。通过这种方式，可从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，例如更高的6FAP亲和力。一般而言，高变区残基可直接且最充分地参与对抗原结合的影响。
可生成人抗体(在本文中也称为“完全人抗体”)，作为人源化的替代。例如，可通过PR0fusion和/或酵母相关技术从文库中分离人抗体。也有可能生成转基因动物(例如经过免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白的情况下产生完整人抗体库的小鼠)。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体。可根据美国专利第5,770,429；5,833,985；5,837,243；5,922,845；6,017,517；6,096,311；6,111,166；6,270,765；6,303,755；6,365,116；6,410,690；6,682,928和6,984,720号所描述的方法制备人源化或完全人抗体，此处引用了这些专利的内容作为参考。
e.抗GFAP抗体
可使用上述技术和本领域已知的常规技术生产抗GFAP抗体。在某些实施方案中，抗GFAP抗体可以是未缀合的GFAP抗体，例如可从以下公司获得的GFAP抗体：Dako(目录号：M0761)，ThermoFisher Scientific(目录号：MA5-12023、A-21282、13-0300、MA1-19170、MA1-19395、MA5-15086、MA5-16367、MA1-35377、MA1-06701或MA1-20035)，AbCam(目录号：ab10062、ab4648、ab68428、ab33922、ab207165、ab190288、ab115898或ab21837)，EMDMillipore(目录号：FCMAB257P、MAB360、MAB3402、04-1031、04-1062、MAB5628)，Santa Cruz(目录号：sc-166481、sc-166458、sc-58766、sc-56395、sc-51908、sc-135921、sc-71143、sc-65343或sc-33673)，Sigma-Aldrich(目录号：G3893或G6171)或Sino Biologicai Inc.(目录号：100140-R012-50)。抗GFAP抗体可以与荧光团缀合，例如可从以下公司获得的缀合GFAP抗体：ThermoFisher Scientific(目录号：A-21295或A-21294)，EMD Millipore(目录号：MAB3402X、MAB3402B、MAB3402B或MAB3402C3)或AbCam(目录号：ab49874或ab194325)。
5.评估受试者的GFAP状态以检测创伤性脑损伤情况的方法改进
在另一种实施方案中，目前公开的内容涉及对一种创伤性脑损伤量度方法的改进，该方法通过评估生物样本中GFAP的存在或数量情况来评估受试者的GFAP状态。这项改进在于通过使用这种方法，可测量出高达50,000pg/mL的GFAP，且无需对生物样本进行稀释。在某些实施方案中，若GFAP是被评估的唯一生物标志物，则改进还包括将此方法与照护点即时检测装置一起使用。该方法使用第一特异性结合成员和第二特异性结合成员进行操作，每个特异性结合成员与GFAP进行特异性结合并形成包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物。在某些实施方案中，第二特异性结合成员分别由可检测标记物进行标记。
其他检测方法包括使用或可调整为使用纳米孔装置或纳米板装置，例如单分子检测。纳米孔装置的实例可参见国际专利公开号W0 2016/161402，此处进行了完整引用作为参考。纳米板装置的实例可参见国际专利公开号W0 2016/161400，此处进行了完整引用作为参考。此外也可以使用适合单分子检测的其他装置和方法。
6.方法的变化
此处可能涉及确定样本中目标分析物(GFAP)的存在或数量情况的公开方法。考虑到用于分析分析物的其他方法，还可以对这些方法进行调整。已熟知的变化实例包括但不限于免疫测定，如夹心免疫测定(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定、单克隆-多克隆夹心免疫测定，包括酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))、竞争性抑制免疫测定(例如正向和反向)、酶增殖免疫测定(EMIT)、竞争性结合测定、生物发光共振能量转移(BRET)、一步法抗体测定、均相测定、非均相测定、即时捕获测定等。
a.免疫测定
在免疫测定中，可使用GFAP抗体分析目标分析物和/或其片段的肽(例如GFAP和/或其肽或其片段，即GFAP片段)。可使用抗体并检测与分析物(例如GFAP)的特异性结合情况来确定分析物(例如GFAP)的存在或数量情况。例如，抗体或其抗体片段可能与分析物(例如GFAP)进行特异性结合。若需要，可将一种或多种抗体与一种或多种市售单克隆/多克隆抗体组合使用。此类抗体在R&D Systems，Inc.(明尼苏达州明尼阿波利斯市)和Enzo LifeSciences International，Inc.(宾夕法尼亚州普利茅斯会议)有售。
通过免疫测定可轻松确定样本中分析物(例如GFAP)的存在或数量情况，免疫测定方法包括夹心免疫测定(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定、单克隆-多克隆夹心免疫测定，包括放射性同位素检测(放射免疫测定法(RIA))和酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如明尼苏达州明尼阿波利斯市R&D Systems公司的Quantikine ELISA测定)。可使用的照护点即时检测装置的实例是(伊利诺伊州雅培科技园AbbottLaboratories公司)。可使用的其他方法包括化学发光微粒免疫测定，例如使用ARCHITECT自动分析仪(伊利诺伊州雅培科技园Abbott Laboratories公司)的测定方法。其他方法包括质谱法和免疫组织化学(例如来自组织活检的切片)，它们使用抗分析物(例如抗GFAP)抗体(单克隆、多克隆、嵌合、人源化、人等)或抗分析物(例如GFAP)的上述抗体片段。其他检测方法包括美国专利第6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524和5,480,792号描述的方法，此处进行了完整引用作为参考。抗体与分析物(例如GFAP)的特异性免疫结合可以通过直接标记来检测，例如荧光或发光标记、与抗体连接的金属和放射性核素，也可采用间接标记，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
免疫测定中还可使用固定化抗体或其抗体片段。可将抗体固定在各种支持物上，例如磁性颗粒或色谱基质颗粒、测定板的表面(例如微量滴定孔)、固体基质材料片等。可将抗体或多个抗体以阵列形式涂在固体支持物上，以制备测定条。然后可将该测定条浸入测试生物样本中，并通过洗涤和检测步骤进行快速处理，以生成可测量的信号，例如有色斑点。
可使用均相形式。例如，从受试者获得测试样本后，即制备混合物。该混合物中含有评估分析物(例如GFAP)的测试样本、第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体。加入测试样本、第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体，形成混合物。三者的添加顺序不重要。使测试样本同时接触到第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体。在某些实施方案中，第一特异性结合配偶体和测试样本中包含的任何GFAP可形成第一特异性结合配偶体-分析物(例如GFAP)-抗原复合物，第二特异性结合配偶体可形成第一特异性结合配偶体-目标分析物(例如GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。在某些实施方案中，第二特异性结合配偶体和测试样本中包含的任何GFAP可形成第二特异性结合配偶体-分析物(例如GFAP)-抗原复合物，第一特异性结合配偶体可形成第一特异性结合配偶体-目标分析物(例如GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。第一特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如结合具有包含SEQ ID NO：1的至少三个连续(3)氨基酸的氨基酸序列的表位的抗GFAP抗体)。第二特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如结合具有包含SEQ ID NO：1的至少三个连续(3)氨基酸的氨基酸序列的表位的抗GFAP抗体)。此外，第二特异性结合配偶体采用上述可检测标记物标记，或含有上述可检测标记物。
可采用异相形式。例如，从受试者获得测试样本后，即制备第一混合物。该混合物含有评估分析物(例如GFAP)的测试样本和第一特异性结合配偶体，其中第一特异性结合配偶体和测试样本中包含的任何GFAP形成第一特异性结合配偶体-分析物(例如GFAP)-抗原复合物。第一特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如结合具有包含SEQ ID NO：1的至少三个连续(3)氨基酸的氨基酸序列的表位的抗GFAP抗体)。加入测试样本和第一特异性结合配偶体，形成混合物。二者的添加顺序不重要。
第一特异性结合配偶体可以固定在固相上。免疫测定中使用的固相(对于第一特异性结合配偶体和任选的第二特异性结合配偶体)可以是本领域已知的任何固相，例如但不限于磁性颗粒、珠子、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘和芯片。在以珠子作为固相的实施方案中，珠子可以是磁性珠子或磁性粒子。磁性珠子/粒子可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。典型的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁材料的实例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(或FeO·Fe2O3)。珠子可以是由一个或多个非磁性层包围的磁性固体核心。磁性部分也可以是围绕非磁核心的一层。第一特异性结合成员固定的固体支持物能以干燥形式或液体形式储存。在采用第一特异性结合成员固定的磁珠的样本接触之前或之后，磁珠可能会通过一个磁场区域。
含有第一特异性结合配偶体-分析物(例如GFAP)抗原复合物的混合物形成后，即使用本领域已知的任何技术从复合物中去除任何未结合的分析物(例如GFAP)。例如，可通过洗涤的方式去除未结合的分析物(例如GFAP)。但理想情况下，测试样本中第一特异性结合配偶体的数量要多于任何分析物(例如GFAP)，从而测试样本中存在的所有分析物(例如GFAP)被第一特异性结合配偶体所结合。
去除任何未结合的分析物(例如GFAP)后，将第二特异性结合配偶体添加到混合物中，即形成第一特异性结合配偶体-目标分析物(例如GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如结合具有包含SEQ ID NO：1的至少三个连续(3)氨基酸的氨基酸序列的表位的抗GFAP抗体)。此外，第二特异性结合配偶体采用上述可检测标记物标记，或含有上述可检测标记物。
免疫测定中还可使用固定化抗体或其抗体片段。可将抗体固定在各种支持物上，例如磁性颗粒或色谱基质颗粒(例如磁珠)、乳胶颗粒或改性的表面乳胶颗粒、聚合物或聚合物薄膜、塑料或塑料薄膜、平面基质、测定板的表面(例如微量滴定孔)、固体基质材料片等。可将抗体或多个抗体以阵列形式涂在固体支持物上，以制备测定条。然后可将该测定条浸入测试生物样本中，并通过洗涤和检测步骤进行快速处理，以生成可测量的信号，例如有色斑点。
(1)夹心免疫测定
夹心免疫测定法测量两层抗体(即至少一种捕获抗体)和检测抗体(即至少一种检测抗体)之间的抗原量。捕获抗体和检测抗体与抗原的不同表位相结合，例如GFAP等目标分析物。理想情况下，捕获抗体与抗原表位的结合不会干扰检测抗体与抗原表位的结合。单克隆或多克隆抗体均可用作夹心免疫测定中的捕获和检测抗体。
一般至少使用两种抗体来分离和量化测试样本中的分析物(例如GFAP)。具体而言，至少两种抗体与分析物(例如GFAP)的特定表位相结合，形成一种被称作“夹心”的免疫复合物。可使用一种或多种抗体来捕获测试样本中的分析物(例如GFAP)(这些抗体通常被称作“捕获”抗体)，并使用一种或多种抗体将可检测的(即可量化的)标记与夹心(这些抗体通常被称作“检测”抗体)相结合。在夹心测定中，理想情况下抗体与其表位的结合不会因测定中任何其他抗体与其各自表位的结合而减少。对抗体进行选择，使与怀疑含有分析物(例如GFAP)的测试样本接触的一种或多种第一抗体不与第二种或后继抗体识别的表位的全部或部分相结合，以免干扰该一种或多种第二检测抗体与分析物(例如GFAP)结合的能力。
在所述免疫测定中，这些抗体可用作第一抗体。抗体免疫特异性地结合到分析物(例如GFAP)的表位。除了当前公开的抗体外，所述免疫测定可包含与未被第一抗体识别或结合的表位进行免疫特异性结合的第二抗体。
怀疑含有分析物(例如GFAP)的测试样本可以同时或按顺序与至少一种(或一类)第一捕获抗体和至少一种第二检测抗体接触。在夹心测定形式中，首先将怀疑含有分析物(例如GFAP)的测试样本与至少一种第一捕获抗体接触，该第一捕获抗体在允许形成第一抗体-分析物(例如GFAP)抗原复合物的条件下，特异性地结合特定表位。若使用多于一种捕获抗体，则形成第一种多重捕获抗体-GFAP抗原复合物。在夹心测定中，抗体(理想情况下，至少一种捕获抗体)的用量是摩尔过量的测试样本中预期的分析物(例如GFAP)最大数量。例如，可使用浓度为约5μg/mL至约1mg/mL抗体的微粒包被缓冲液。
(a)抗GFAP捕获抗体
根据不同的情况，在测试样本与至少一种第一捕获抗体接触之前，可将至少一种第一捕获抗体结合至促进第一抗体-分析物(例如GFAP)复合物与测试样本分离的固体支持物。可使用本领域已知的任何固体支持物，包括但不限于由槽、管道或珠子(例如微粒)形式的聚合物材料制作而成的固体支持物。抗体(或多种抗体)可通过吸附、化学偶联剂的共价键合或本领域已知的其他方式结合至固体支持物，但这种结合不得干扰抗体结合分析物(例如GFAP)的能力。此外，必要时可将固体支持物衍生化，允许其与抗体上的各种官能团发生反应。这种衍生化需要使用某些偶联剂，例如但不限于马来酸酐、N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
怀疑含有分析物(例如GFAP)的测试样本经过孵育后，形成第一捕获抗体(或多抗体)-分析物(例如GFAP)复合物。孵育可以在约4.5至约10.0的pH值和约2℃至约45℃的温度下进行，并持续至少约一(1)分钟至约十八(18)小时，可以为约2-6分钟、约7-12分钟、约5-15分钟，或约3-4分钟。
(b)检测抗体
在形成第一/多个捕获抗体-分析物(例如GFAP)复合物后，复合物与至少一种第二检测抗体接触(在可形成第一/多抗体-分析物(例如GFAP)抗原-第二抗体复合物的条件下)。在某些实施方案中，测试样本和捕获抗体同时与检测抗体接触。若第一抗体-分析物(例如GFAP)复合物与一种以上的检测抗体接触，则形成第一/多重捕获抗体-分析物(例如GFAP)-多抗体检测复合物。与第一抗体一样，当至少第二(和后继)抗体与第一抗体-分析物(例如GFAP)复合物接触时，需要在与上述类似的条件下孵育一段时间，以形成第一/多抗体-分析物(例如GFAP)-第二/多抗体复合物。理想情况下，至少一种第二抗体含有可检测标记物。在形成第一/多抗体-分析物(例如GFAP)-第二/多抗体复合物之前、同时或之后，可检测标记可以与至少一种第二抗体结合。可使用本领域已知的任何可检测标记物。
化学发光测定的操作方法可参见Adamczyk等人，Anal.Chim.Acta 579(1)：61-67(2006)中公开的方法。尽管可使用任何合适的测定形式，但微孔板化学发光分析仪(Mithras LB-940，Berthold Technologies U.S.A.，LLC，田纳西州橡树岭)能够快速测定多个小体积样本。化学发光分析仪可使用96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Costar#3792)配备多个试剂注射器。可将每个样本加入单独的孔中，然后根据所采用的测定类型同时/按顺序加入其他试剂。理想情况下，避免含有吖啶芳基酯的中性或碱性溶液中形成假碱，例如通过酸化作用。然后记录逐个孔中的化学发光响应。该过程中，记录化学发光响应的时间在部分程度上取决于添加试剂和所用的特定吖啶之间的延迟时间。
加入测试样本和特异性结合配偶体，以形成用于化学发光测定的混合物。二者的添加顺序并不重要。若用吖啶化合物对第一特异性结合配偶体进行可检测性标记，则形成可检测标记的第一特异性结合配偶体-GFAP抗原复合物。或者，若使用第二特异性结合配偶体和用吖啶化合物对第二特异性结合配偶体进行可检测性标记，则形成可检测标记的第一特异性结合配偶体-分析物(例如GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。可使用本领域已知的任何技术(例如洗涤)从混合物中去除任何未结合的、标记或未标记的特异性结合配偶体。
过氧化氢可以在混合物中原位产生，也可在加入上述吖啶化合物之前、同时或之后提供或供应给混合物。过氧化氢能以多种方式原位产生，这是本领域技术人员所熟知的。
也可简单地将过氧化氢源添加到混合物中。例如，过氧化氢源可以是一种或多种缓冲剂或已知含有过氧化氢的其他溶液。这种情况下，简单地添加过氧化氢溶液即可。
在添加过氧化氢溶液的同时或之后，向样本中加入至少一种碱性溶液时，产生指示GFAP存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液应含有至少一种碱，且pH大于或等于10，最好是大于或等于12。碱性溶液包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。向样本中添加多少碱性溶液取决于该碱性溶液的浓度。本领域技术人员可根据所使用碱性溶液的浓度轻松确定向样本中添加多少碱性溶液。也可使用化学发光标记以外的其他标记，例如酶标记(包括但不限于碱性磷酸酶)。
可使用本领域技术人员已知的常规技术对产生的化学发光信号或其他信号进行检测。基于所产生信号的强度，可以对样本中的目标分析物(例如GFAP)进行量化。具体而言，样本中分析物(例如GFAP)的数量与产生的信号的强度成比例。可将产生的光量与分析物(例如GFAP)的标准曲线进行对比，或与某项参考标准进行比较，以量化所产生的分析物(例如GFAP)。可利用系列稀释液或已知浓度的分析物(例如GFAP)的溶液，通过质谱法、重量分析法和本领域已知的其他技术来生成标准曲线。
(2)正向竞争抑制测定
在正向竞争形式中，使用已知浓度的已标记目标分析物(例如具有荧光标记或附有可分离接头的标签等)的等分试样与测试样本中的目标分析物竞争，同时与目标分析物抗体结合。
在正向竞争测定中，固定的特异性结合配偶体(例如抗体)可按顺序或同时接触测试样本和标记的目标分析物、目标分析物片段或目标分析物变体。目标分析物肽、目标分析物片段或目标分析物变体可以用任何可检测的标记物进行标记，包括由附有可分离接头的标记物组成的可检测标记物。在该测定中，抗体可固定在固体支持物上，也可与固定在固体支持物(例如微粒或平面基质)上的抗体(例如抗种抗体)偶联。
根据上述夹心测定形式，在相应的条件下对标记的目标分析物、测试样本和抗体进行孵育，可产生两个不同种类的目标抗体-分析物复合物。具体而言，其中一种目标抗体-分析物复合物含有可检测标记物(例如荧光标记等)，而另一种目标抗体-分析物复合物不含可检测标记物。在量化可检测标记物之前，目标抗体-分析物复合物可以但并非必须与测试样本的其余部分分离。无论目标抗体-分析物复合物是否与测试样本的其余部分分离，均可量化目标抗体-分析物复合物中的可检测标记物。然后可按上述方法确定测试样本中目标分析物的浓度(例如目标膜相关分析物、目标可溶性分析物、目标可溶性分析物的片段、目标分析物的变体(目标膜相关或可溶性分析物)或其任何组合)。
(3)反向竞争抑制测定
在反向竞争测定中，固定的目标分析物可以按顺序或同时接触测试样本和至少一种标记抗体。
目标分析物可以结合至固体支持物，例如上述夹心测定形式相关的固体支持物。
根据上述夹心测定形式，在相应的条件下对固定的目标分析物、测试样本和至少一种标记的抗体进行孵育，可产生两个不同种类的目标分析物-抗体复合物。具体而言，其中一种目标分析物-抗体复合物是固定的，且含有可检测标记物(例如荧光标记等)，另一种目标分析物-抗体复合物是非固定的，并也含有可检测标记物。通过本领域已知的技术(例如洗涤)从固定的目标分析物-抗体复合物中去除非固定的目标分析物-抗体复合物和剩余的测试样本。一旦非固定的目标分析物-抗体复合物被去除，在标记物分离后即可量化固定的目标分析物-抗体复合物中的可检测标记物。然后可通过上述可检测标记物的数量对比来确定测试样本中目标分析物的浓度。
(4)一步法免疫测定或“即时捕获”测定
在即时捕获免疫测定中，预先对固体基质涂上固定剂。将捕获剂、分析物和检测剂一起添加到固体基质中，然后在检测前执行洗涤步骤。捕获剂可以结合分析物，并包含用于固定剂的配体。捕获剂和检测剂可以是抗体或能进行本文所述或本领域已知的捕获或检测的任何其他基团。配体可包含肽标签，固定剂可包含抗肽标签抗体。配体和固定剂也可以是能够结合在一起以便在即时测定中进行捕获的任何一对试剂(例如特异性结合对和本领域已知的其他试剂)。该测定可测量一种或以上的分析物。在某些实施方案中，固体基质可以由抗原包被，待分析的分析物是一种抗体。
在某些其他实施方案中，进行一步法免疫测定或“即时捕获”测定时使用预先涂有固定剂(例如生物素、链霉抗生物素蛋白等)的固体支持物(例如微粒)，并至少使用第一特异性结合成员和第二特异性结合成员(分别用作捕获和检测试剂)。第一特异性结合成员包含用于固定剂的配体(例如，若固体支持物上的固定剂是链霉抗生物素蛋白，则第一特异性结合成员上的配体可以是生物素)，该成员也与目标分析物结合。第二特异性结合成员包含可检测标记物，并也与目标分析物结合。可将固体支持物和第一与第二特异性结合成员添加到测试样本中(按顺序或同时添加均可)。第一特异性结合成员上的配体与固体支持物上的固定剂结合，形成固体支持物/第一特异性结合成员复合物。样本中含有的任何目标分析物与固体支持物/第一特异性结合成员复合物结合，形成固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物。第二特异性结合成员与固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物结合，即可检测到可检测标记物。在检测之前可采用一种任选的洗涤步骤。在某些实施方案中，进行一步法测定时可测量一种以上的分析物。而某些其他实施方案中，可以使用两种以上的特异性结合成员。还有一些实施方案中，可以添加多种可检测标记物。另一些实施方案中，可以检测多种目标分析物，或测量、确定或评估它们的数量、水平或浓度。
可采用本文所述和本领域已知的各种形式进行即时捕获动态测定。例如，可以选择上述夹心测定形式，但也可以采用竞争测定，可以使用单一特异性结合成员，也可以使用其他变体(例如已知变体)。
7.样本
a.测试或生物样本
本文所使用的词汇“样本”、“测试样本”和“生物样本”是指含有或怀疑含有GFAP的流体样本。样本可以衍生自任何合适的来源。在某些情况下，样本可包含液体、流动的颗粒固体或固体颗粒的流体悬浮液。在某些情况下，可根据本文的描述，在分析之前对样本进行处理。例如，可以在分析之前将样本从其来源分离或纯化；但在某些实施方案中，可以直接测定含有分析物的未处理样本。分析物分子的来源可以是合成的(例如在实验室中生产)、环境(例如空气、土壤、流体样本，例如供水等)、动物(例如哺乳动物)、植物或其任何组合。在特定实例中，分析物的来源是人体物质(例如体液或血液，例如全血、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊髓液、粪便、组织或器官等)。组织可包括但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、宫颈组织、皮肤等。样本可以是液体样本，也可以是固体样本的液态提取物。在某些情况下，样本的来源可以是器官或组织，例如可通过组织崩解/细胞裂解所液化的活组织检查样本。
可以分析许多不同体积的流体样本。在某些示例性实施方案中，样本体积可为约0.5nL、约1nL、约3nL、约0.01μL、约0.1μL、约1μL、约5μL、约10μL、约100μL、约1mL、约5mL、约10mL等。在某些情况下，流体样本的体积可能为约0.01μL至约10mL、约0.01μL至约1mL、约0.01μL至约100μL，或约0.1μL至约10μL。
在某些情况下，测定前可对流体样本进行稀释。例如，在分析物分子的来源为人体体液(例如血液、血清)的实施方案中，可以用适当的溶剂(例如PBS等缓冲液)进行稀释。流体样本在使用之前可以稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更高。在其他情况下，测定之前不对流体样本进行稀释。
在某些情况下，可能要对样本进行预分析处理。预分析处理可以提供额外的功能，例如非特异性蛋白质去除和/或经济有效的混合功能。预分析处理的一般方法可包括使用电动捕获、AC电动力学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳或本领域已知的其他预浓缩技术。在某些情况下，可在测定之前对流体样本进行浓缩。例如，在分析物分子的来源是人体体液(例如血液或血清)的实施方案中，可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或它们的组合来浓缩该流体。流体样本在使用之前可以浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更高。
b.对照
有些情况下可能需要使用对照样本。可以将上述来自主体的样本和对照样本同时进行分析。可以将主体样本的分析结果与对照样本的分析结果进行对比。可以提供标准曲线，并利用该标准曲线比较生物样本的测定结果。若使用荧光标记，则这种标准曲线表示标记物水平关于测定单位的函数，即荧光信号强度。使用来自多个供体的样本，则标准曲线可反映正常健康组织中GFAP的对照或参考水平，以及取自具有上述一种或多种特征的供体的组织中GFAP的“风险”水平。
针对上述情况，有一种方法可用于确定测试样本中GFAP的存在、数量或浓度情况。该方法包括通过免疫测定法测定测试样本中的GFAP，例如，使用至少一种结合GFAP抗原表位的捕获抗体和至少一种结合GFAP抗原表位的检测抗体(检测抗体所结合的抗原表位与捕获抗体结合的抗原表位不同，且可以视情况包含可检测标记物)，还包括将由可检测标记物产生的信号作为测试样本中GFAP存在、数量或浓度情况的直接或间接指示，与校准品中生成的作为GFAP的存在、数量或浓度情况的直接或间接指示的信号进行对比。根据不同的情况，校准品可以是(最好是)一系列GFAP浓度彼此各异的校准品的一部分。在某些实施方案中，校准品可包含GFAP或其片段，如上文第4a节所述。
8.试剂盒
此处提供的是一个可用于测定或评估测试样本的GFAP或GFAP片段的试剂盒。该试剂盒包含至少一种用于测定测试样本的GFAP的组分，可用于测定测试样本的GFAP。例如，该试剂盒可包含通过免疫测定法测定测试样本的GFAP的说明，例如化学发光微粒免疫测定法。试剂盒中包含的说明可以贴在包装材料上，也可以作为说明书放置在包装内。尽管说明书通常是书面或印刷材料，但并不仅限于这些形式。此处考虑了能够存储这些说明并将它们传递给最终用户的任何介质。这种介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)和光学介质(例如CD ROM)等。此处使用的术语“说明”可以包括提供说明的互联网网站的地址。
所述的“至少一种组分”可包括至少一种成分，该成分中含有与GFAP进行特异性结合的一种或多种分离的抗体或抗体片段。抗体可以是GFAP捕获抗体和/或GFAP检测抗体。
此外，有的试剂盒可包含一个校准品或对照物，例如纯化或冻干的(视情况而定)GFAP和/或至少一个进行测定的容器(例如软管、微量滴定板或滴定条，这些容器上可能已经涂有抗GFAP单克隆抗体)和/或缓冲液，例如测定缓冲液或洗涤缓冲液，可以是浓缩溶液、可检测标记物(例如酶标记物)的基质溶液或停止溶液。在某些实施方案中，校准品或对照品可包含GFAP或其片段，如上文第4a节所述。理想情况下，试剂盒包含测定所需的所有组分，即试剂、标准品、缓冲剂、稀释剂等。使用说明还可包括用于生成标准曲线的说明。
试剂盒可能还包括用于量化GFAP的参考标准，该参考标准可用于构建GFAP浓度的内插和/或外推的标准曲线。参考标准可包括高GFAP浓度水平，例如约100000pg/mL，约125000pg/mL、约150000pg/mL、约175000pg/mL、约200000pg/mL、约225000pg/mL、约250000pg/mL、约275000pg/mL或约300000pg/mL；中GFAP浓度水平，例如约25000pg/mL、约40000pg/mL、约45000pg/mL、约50000pg/mL、约55000pg/mL、约60000pg/mL、约75000pg/mL或约100000pg/mL；和/或低GFAP浓度水平，例如约1pg/mL、约5pg/mL、约10pg/mL、约12.5pg/mL、约15pg/mL、约20pg/mL、约25pg/mL、约30pg/mL、约35pg/mL、约40pg/mL、约45pg/mL、约50pg/mL、约55pg/mL、约60pg/mL、约65pg/mL、约70pg/mL、约75pg/mL、约80pg/mL、约85pg/mL、约90pg/mL、约95pg/mL或约100pg/mL。
试剂盒中的任何抗体(例如对GFAP具有特异性的重组抗体)均可包含可检测的标记物，例如荧光团、放射性基团、酶、生物素/抗生物素蛋白标记物、发色团、化学发光标记物等；试剂盒还可包含用于标记或检测抗体的试剂(例如检测抗体)和/或用于标记或检测分析物的试剂。抗体、校准品和/或对照品可以在单独的容器中提供，也可以预先处理为合适的测定形式，例如分配到微量滴定板中。
根据不同的情况，试剂盒可能包含质量控制组分(例如灵敏度试片、校准品和阳性对照品)。质量控制试剂的制备方法已是本领域熟知的，且已在各种免疫诊断产品的内插页中有所描述。根据不同的情况，灵敏度试片用于构建测定性能特征，并且进一步作为免疫测定试剂盒试剂的完整性及测定标准化的有用指示剂。
试剂盒还可视情况包含进行诊断测定或促进质量控制评估所需的其他试剂，例如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、基底和检测试剂等。试剂盒中还可能包含用于分离和/或处理测试样本的缓冲液和溶液(例如预处理试剂)等其他组分，也可包含一种或多种其他对照品。可将试剂盒的一种或多种组分进行冻干处理，在这种情况下，试剂盒可以进一步包含适合于重构冻干组分的试剂。
根据不同的情况，试剂盒的各种组分可按需以适当的容器提供，例如微量滴定板。试剂盒还可包括用于盛装或储存样本的容器(例如用于盛装或储存尿液、全血、血浆或血清样本的容器或药筒)。适当情况下，试剂盒还可包含反应容器、混合容器和便于制备试剂或测试样本的其他组分。试剂盒还可包含一个或多个协助获得测试样本的仪器，例如注射器、移液管、镊子、测量勺等。
若可检测标记物为至少一种吖啶化合物，则试剂盒可包含至少一种吖啶-9-甲酰胺、至少一种吖啶-9-羧酸芳基酯、或其任何组合。若可检测标记物为至少一种吖啶化合物，则试剂盒还可包含过氧化氢源，例如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。如有需要，试剂盒可包含一种固相，例如磁性颗粒、珠子、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片等。
如有需要，试剂盒还可包含单独或与说明书进一步组合的一种或多种组分，用于测定测试样本中的另一种分析物，该分析物可以是一种生物标志物，例如创伤性脑损伤或病症的生物标志物。
a.试剂盒与方法的调整
试剂盒(或其组分)以及使用本文所述的免疫测定方法评估或测定测试样本中GFAP浓度的方法可适用于各种自动化和半自动化系统(包括那些固相包含一种微粒的系统)，如美国专利第5，063，081号、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164以及例如由Abbott Laboratories(伊利诺伊州雅培科技园)进行商业销售的Abbott Point of Care(或i-STAT Alinity，Abbott Laboratories)、美国专利第5,089,424和5,006,309号、以及例如由Abbott Laboratories(伊利诺伊州雅培科技园)进行商业销售的或Abbott Alinity设备。
自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如ELISA)相比，不同之处包括第一特异性结合配偶体(例如分析物抗体或捕获抗体)所附着的基底(可影响夹心形成和分析物反应性)，以及捕获、检测和/或任何洗涤步骤的长度和时间。而非自动化形式(例如ELISA)中样本和捕获试剂可能需要相对更长的孵育时间(例如约2小时)，自动或半自动化形式(例如和任何后继平台，Abbott Laboratories)的孵育时间可能相对较短(例如约需18分钟)。类似地，ELISA等非自动化形式可对检测抗体(例如缀合物试剂)进行相对更长时间的孵育(例如约2小时)，而自动或半自动化形式(例如和任何后继平台)的孵育时间则相对较短(例如和任何后继平台为约4分钟)。
可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于(参见美国专利第5,294,404号等，本文进行了整体引用作为参考)、EIA(珠子)和QuantumTMII以及其他平台。此外还能以其他形式使用测定、试剂盒和试剂盒组分，例如在电化学分析系统或其他手持或照护点即时检测分析系统上。如前所述，目前公开的内容适用于进行夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care(Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。美国专利第5,063,081号、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164等对免疫传感器及其在一次性测试装置中的制造和操作方法进行了描述，本文引用了其全部内容，以提供相关指导。
特别地，若使用系统进行测定，则首选以下配置。用一对金安培计工作电极和一个银-氯化银参比电极制造微型硅芯片。在一个工作电极上，将具有固定捕获抗体的聚苯乙烯珠(直径0.2mm)粘附到电极上的模式化聚乙烯醇聚合物涂层上。该芯片被组装到一个药筒中，该药筒为适合免疫分析的流控形式。硅芯片的一个部位上有GFAP的特异性结合配偶体，例如一种或多种GFAP抗体(一种或多种单克隆/多克隆抗体或其片段、变体、或其可结合GFAP的变体片段)或一种或多种抗GFAP DVD-Ig(或其片段、变体，或其可结合GFAP的变体片段)，其中任何一种都能进行可检测性标记。药筒的流体袋中装的是含有对氨基苯酚磷酸盐的含水试剂。
在操作过程中，将取自怀疑患有TBI的受试者的样本添加到测试盒的存放室中，然后将药筒插入读取器中。使用药筒中的泵元件将样本推入含有芯片的导管中。使样本与传感器接触，使酶缀合物溶解于样本中。样本在传感器上振荡约2-12分钟，以促进夹层的形成。在测定的倒数第二步，将样本推入废物室，用含有碱性磷酸酶基底的洗涤液将过量的酶缀合物和样本从传感器芯片上冲洗掉。在测定的最后一步，碱性磷酸酶标记物与对氨基苯酚磷酸酯发生反应，磷酸基团被裂解，使释放出的对氨基苯酚在工作电极处被电化学氧化。基于测量的电流，读取器能够通过嵌入算法和工厂确定的校准曲线计算样本中GFAP的含量。
此处所述的方法和试剂盒须包括用于进行免疫测定的其他试剂和方法。例如，包括本领域已知的和/或便于制备或优化以用于洗涤、作为缀合物稀释剂和/或作为校准品稀释剂的各种缓冲剂。缀合物稀释剂的一个实例是某些试剂盒中使用的缀合物稀释剂(伊利诺伊州雅培科技园Abbott Laboratories公司)，其含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、一种盐、一种蛋白质阻断剂、一种抗微生物剂和一种洗涤剂。校准品稀释剂的一个实例是某些试剂盒中使用的人类校准品稀释剂(伊利诺伊州雅培科技园AbbottLaboratories公司)，其包含由MES、其他盐、一种蛋白质阻断剂和一种抗微生物剂组成的缓冲液。另外，如2008年12月31日提交的美国专利申请第61/142,048号所述，可使用与信号抗体连接的核酸序列作为信号放大器，以获得更强的信号，例如以药筒的形式。
尽管本文的某些实施方案在用于评估疾病(例如创伤性脑损伤)时是有利的，但测试和试剂盒也可视情况用于评估其他疾病、病症和其他适当情况中的GFAP。
测定方法也可用于鉴定改善诸如创伤性脑损伤等疾病情况的化合物。例如，可以使表达GFAP的细胞与候选化合物接触。可使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中GFAP的表达水平与对照细胞中的表达水平进行对比。
当前公开的内容是多方面的，将通过以下非限制性实例进行说明。
9.实施例
对于本领域的熟练人员而言显而易见的是，本文所述的当前公开方法的其他适当修改和调整是适用的和可以理解的，并且可在不脱离当前公开范围或本文公开的方面和实施方案的情况下，利用合适的等同物进行此修改和调整。鉴于本文已对本发明进行了详细阐述，以下实例参考将有利于对本发明的更清晰理解，这些实例仅用于说明本发明的一些方面和实施方案，而不应被视为限制本发明的公开范围。本文提及的所有期刊参考文献、美国专利和出版物的公开内容均为整体引用。
另外，本申请完整引用了2016年10月3日提交的美国临时申请第62/403,293号和2017年2月6日提交的美国临时申请第62/455,269号所公开的内容。
本申请还完整引用了美国申请第XX/XXX，XXX号和PCT/US2017/XXXXXX中的每一篇标题为“评估患者样本中GFAP状态的更优方法”和美国申请第XX/XXX，XXX号和PCT/US2017XXXXXX中每一篇标题为“评估患者样本中UCH-L1状态的更优方法”所公开的内容，以上所有申请均于2017年10月2日提交。
当前公开的内容是多方面的，将通过以下非限制性实例进行说明。
实施例1
GFAP测定
抗体的筛选采用目标测定形式(i-STAT)。选择在测定中产生信号的成对抗体。初始选择标准基于多项因素，包括使用低校准品浓度筛选时使用成对抗体检测信号。测试单克隆抗体对，例如作为捕获单克隆抗体的抗体A和作为检测单克隆抗体的抗体B。抗体A和抗体B是Abbott Laboratories(伊利诺伊州雅培科技园)内部开发的示例性抗GFAP抗体。抗体A和抗体B都结合相同GFAP分解产物(BDP)中的抗原表位。将二者结合使用时，抗体的组合产生协同效应并产生更强的信号。该数据的生成方式是购买短的重叠肽序列并确定抗体以96孔板形式与哪种肽相结合。GFAP测定设计根据关键性能属性进行评估。药筒配置为抗体配置：抗体A(捕获抗体)/抗体B(检测抗体)；试剂条件：0.8％的固体，250μg/mL Fab碱性磷酸酶簇缀合物；进样口印刷：专门针对GFAP。测定时间为10-15分钟(样本捕获时间为7-12分钟)。
测定校准。使用OriGene重组GFAP(0-50,000pg/mL)(OriGene Technologies，Inc.，马里兰州罗克维尔市)在EDTA血浆库中制备校准品。GFAP浓度基于供应商标签上的声明。将校准品等分成小份，并冷冻储存(-70℃)。曲线拟合为4PLC(4参数逻辑曲线)。见图1；另见表2，其基于n＝75reps/cal水平。
表2
测定精度。5日精度研究设计基于CLSI协议的指南(EP5-A2(NCCLS.Evaluation ofPrecision Performance of Quantitative Measurement Methods；Approved Guideline-Second Edition.NCCLS document EP5-A2[ISBN 1-56238-542-9].NCCLS，940 WestValley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2004.)和EP15-A2(Clinical and Laboratory Standards Institute.User Verification of Performancefor Precision and Trueness；Approved Guideline-Second Edition.CLSI documentEP15-A2[ISBN 1-56238-574-7].Clinical and Laboratory Standards Institute，940West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2005.))。测试方案包括5天、2批/天、4次重复/批(n＝40次重复/样本)。该分析使用JMP软件程序(来自北卡罗来纳州凯里SAS的统计发现程序)，利用嵌套模型来确定天数、批次和重复方差分量。目标GFAP浓度的试条(n＝6)的制备见表3。
表3
*Cliniqa(加利福尼亚州福尔布鲁克)血清基质用作i-STAT TBI质量控制材料的基质。SCL来自Analytical Biological Services，Inc.(特拉华州威明顿)。
如表4所示，在GFAP的各个药筒上，从100-4，400pg/mL的所有组中观察到的总CV少于10％。
表4
检测限(LoD)。LoD研究设计基于临床和实验室标准协会(CLSI)协议EP17-A2指南(“Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits ofQuantitation；Approved Guideline-Second Edition”，EP17A2E，James F.Pierson-Perry等人，Clinical and Laboratory Standards Institute，2012年6月1日，80页[ISBN：1562387952])。测试协议使用零水平血浆库来确定空白限(LoB)。共测试了60次重复。通过将浓度升高的GFAP样本掺入血浆库中来制备50pg/mL的GFAP试条。制备目标浓度为10-40pg/mL的稀释液。在3天内对GFAP试条进行40次重复测试。数据分析如下：LoB＝零分析物样本浓度的95百分位数；LoD＝LoB+Cp×SD(实验室内)，Cp是95百分位SD(实验室内)的乘数因子。SD(实验室内)是所有五份试条的合并标准偏差。
结果：每份试条的精确度曲线显示，试条＞20pg/mL的CV范围是5-8％。见表5。通过拟合等式，所得结果用于确定功能灵敏度：
表5
*以重复测试结果替换比均值＞10SD的一个数据点
确定LoD＜10pg/mL。该结果基于单个试剂批次和药筒批次。功能灵敏度(20％CV)为＜20pg/mL。见表6。功能灵敏度是定量限(LoQ)的估计值。
表6
测定 LoB(pg/mL) LoD(pg/mt) 功能灵敏度，20％Cv(pg/mt)
GFAP 4 8 11
线性/测定范围。使用以下一系列稀释液评估测定线性。在每次稀释研究中，通过混合高浓度和低浓度样品制备一系列稀释液。使用高浓度样本的第一稀释液的制备方法是将组织裂解物掺入EDTA血浆库，直至达到约15,000pg/mL的目标GFAP浓度。第二稀释液使用来自疑似TBI患者的EDTA合并血浆样本。目标初始GFAP浓度是约1，000pg/mL。第三稀释液研究的评估方法是将掺料组织裂解物加入EDTA血浆库中，直至达到约50,000pg/mL的目标GFAP浓度。第四稀释液研究的评估方法是将掺料组织裂解物加入血清库中，直至达到约50,000pg/mL的目标GFAP浓度。数据分析如下：绘制期望vs.观测浓度，确定相关系数。通过将数据拟合到第一、第二和第三阶多项式回归，根据CLSI EP6-A进行线性评估。最佳拟合模型用于确定线性偏差。
结果：稀释液1：相关系数(观测值vs.期望值)为r＝0.9985。表7；图5.从20到13,660pg/mL，实现了小于10％的线性偏差(DL)。稀释液2：相关系数(观测值vs.期望值)为r＝0.9989。表8；图6.从12到900pg/mL，实现了小于10％的线性偏差(DL)。稀释液3：相关系数(观测值vs.期望值)为r＝0.9990。表9。从420到＞50,000pg/mL，实现了小于10％的线性偏差。稀释液4：相关系数(观测值vs.期望值)为r＝0.9993。表10。从370到＞50,000pg/mL，实现了小于10％的线性偏差。
表7
表8
表9
表10
正常供体样本。在i-STAT GFAP测定中测试通过商业来源获得的表观健康供体的100个血浆样本。GFAP水平非常低，中值为12pg/mL，最大值小于70pg/mL。见图2和表11。
表11
GFAP浓度(pg/mL)
均值 13.0
SD 9.1
四分位
25<sup>th</sup>％ile 8.1
中值 12.1
75<sup>th</sup>％ile 15.6
GFAP测定显示：检测限(LoD)＜20pg/mL；测定校准达到50,000pg/mL；测定线性达到50,000pg/mL；精度＜10％CV，从100-4,000pg/mL；结果测定时间≤15分钟。
实施例2
潜在的测定干扰
对GFAP测定的潜在干扰和交叉反应物进行的评估如表12所示。简言之，将干扰物掺入一份目标浓度为150-200pg/mL的GFAP试条。干扰物测试浓度基于CLSI EP7-A2指南(Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference Testing in ClinicalChemistry；Approved Guideline-Second Edition.CLSI document EP7-A2[ISBN 1-56238-584-4].Clinical and Laboratory Standards Institute，940 West ValleyRoad，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2005.)。在500ng/mL的浓度水平进行潜在的交叉反应物测试。验收标准为干扰<10％。
具体而言，就是对GFAP测定进行评估以检查是否存在潜在的内源性干扰。潜在的干扰物质在选定缓冲溶液/溶剂中制备，然后添加到含有目标分析物的测试样品中。同时还制备了一个对照样品，其中仅添加了选定缓冲溶液/溶剂。然后，根据对照样品和含有干扰物质的测试样品之间的测量结果的差值百分比来计算干扰。
对含有以下潜在的内源性干扰物质的样品进行了评估以检查是否存在干扰：胆红素(非结合和结合)；甘油三酯；血红蛋白；总蛋白；肝素；内源性抗体(HAMA、RF)。使用目标为150-200pg/mL的组织裂解物在锂肝素抗凝血浆中制备GFAP板。所有样品在GFAP盒上进行测试。通过将测试溶液与对照溶液之间的差值除以对照溶液再乘以100以计算干扰百分比，如方程所示：干扰百分比＝100x(测试-对照)/对照。
胆红素：如上所述，按照CLSI EP7-A2指导中的建议，分别测试结合和非结合胆红素以检查是否存在干扰。通过在ARCHITECT临床化学分析仪上测试样品，可确认胆红素浓度。表12显示，对于GFAP，胆红素含量超过20mg/dL时，干扰百分比低于10％。
甘油三酯：将甘油三酯原液(脂肪乳剂)掺入到含有GFAP的样品中，然后将缓冲溶液/基质掺入到含有GFAP的样品中以制备对照样品。通过在ARCHITECT临床化学分析仪上测试样品，可确认甘油三酯浓度。表12显示，对于GFAP，甘油三酯含量超过3,000mg/dL时，干扰百分比低于10％。
血红蛋白：由于样本中可能存在溶血，因此对血红蛋白进行了评估。血红蛋白的来源通常是由洗涤红细胞制备的溶血产物。可以在血液分析仪上确认样品中的血红蛋白含量。表12显示，对于GFAP，血红蛋白含量超过500mg/dL时，效应百分比低于10％。
总蛋白：人类样本中的总蛋白含量显示出一些变异性，正常范围为6.4-8.3g/dL(Tietz)，99％的样本中，此含量低于9g/dL(内部分析)。为评估总蛋白的效应，使用HSA(人血清白蛋白)补充了样品并与正规样品进行了对比。使用ARCHITECT临床化学总蛋白测试可单独确定样品的蛋白质含量。表12显示，对于GFAP，总蛋白含量为8.8g/dL时，干扰百分比低于10％。
肝素：肝素在采血管中用作抗凝血剂，并且被评估为潜在的干扰物质，因为肝素化全血和血浆是i-STAT测定中的潜在样品类型。肝素管含有大约15U/mL的肝素，因此如果未完全填充收集管(短时抽取)，则测试浓度将代表可能存在的较高浓度。表12显示，对于GFAP，由于样品中存在90U/mL的肝素，干扰百分比低于10％。
内源性抗体(HAMA、RF)：免疫测定依赖于抗体和目标分析物之间的特异性相互作用以获得最佳性能。但是，某些样本可能含有与测定中使用的抗体产生交叉反应的内源性抗体。将非特异性抗体作为非特异性相互作用的阻断蛋白添加到测定中，从而降低干扰的可能性。免疫测定中使用两种常见的潜在干扰来源：HAMA(人抗鼠抗体)和RF(类风湿因子)。HAMA和RF浓缩物可从以下商业来源获得：Roche(罗氏)、Scantibodies和Bioreclamation。可将这些浓缩物掺入到还添加了少量GFAP的血浆池中以评估潜在的干扰。通过将缓冲溶液掺入到相应的样品中来制备对照样品。恢复情况将相对于掺入了HAMA或RF的血浆池来确定。结果显示在表12中。如果存在HAMA和RF，GFAP恢复情况为100(误差在±10％以内)。
同源蛋白质的交叉反应率和干扰：潜在的GFAP交叉反应物-根据主要序列比对，波形蛋白和结蛋白与GFAP具有较高(～60％)的序列同源性。在500ng/mL的浓度下对波形蛋白和结蛋白的交叉反应率(不存在GFAP)和干扰(存在GFAP)进行了评估。重组波形蛋白和结蛋白购自OriGene。根据以下方程来确定交叉反应百分比：100*(测试-对照)/交叉反应物浓度。表12中显示的结果表明，在GFAP测定中，没有明显的交叉反应率，并且波形蛋白和结蛋白的干扰百分比低于10％。
表12
实施例3
TBI人群研究
TBI患者人群研究使用了i-STAT GFAP测定。
研究样本：总共登记了260名患有中度至重度TBI的受试者，每名受试者最多8个时间点；所有样品均为血清。表13；图3.
表13
研究样本的分布。图3显示了每个时间点的所有GFAP测定结果的中值结果，这表明GFAP在B1样品中较高，并且在接下来的时间点趋于降低。图4显示了每个样品时间点的箱形图(对数尺度)，该图显示了整个患者人群的GFAP结果的广泛分布。这些箱子代表四分位距(第一四分位数、第二四分位数和第三四分位数)。
总之，共有250名受试者可用于测试。并非所有受试者都需要所有时间点。部分样品的体积有限或不足。GFAP结果涵盖整个测定范围(低于0.1至超过50ng/mL)，并且在大于50,000pg/mL时读取了20个样品。
当然，前面的详细描述和所附的示例仅用于说明，不应视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求及其等同要求来定义。
针对公开的具体实施方案的各种变更和修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行此类变更和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、综合体，组分、制剂或使用方法有关的变更和修改。
出于完整性的考虑，本发明的各个方面将在以下编号的条款中列出：
条款1.一种测量受试者的生物样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时接触：
(1)捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，
从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物；
(c)根据捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法可用于在体积小于20微升的所述生物样品中确定低于或等于50,000pg/mL的含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款2.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于在体积小于20微升的所述生物样品中确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款3.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)具有5log的动态范围；(ii)在所述动态范围内是线性的。
条款4.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；
b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP，并且可使用可检测标记中可检测信号的存在对所述受试者的
GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，
其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中检测出低于或等于50,000pg/mL的GFAP含量，并且所述测定具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款5.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第一或第二特异性结合成员包含可检测标记；
b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，
其中该方法(i)可用于确定高达50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)不需要稀释生物样品；(iii)使用照护点即时检测设备执行。
条款6.一种测量受试者的生物样品中GFAP的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：
(1)捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，
从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物；
(c)根据捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款7.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款8.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；
b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP，并且可使用可检测标记中可检测信号的存在对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，
其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款9.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：
a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；
b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；
c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，
其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定低于或等于50,000pg/mL的GFAP含量，并且所述测定具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款10.条款5-8中的任一方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款11.条款5-10中的任一方法，其中该方法可用于确定从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
条款12.条款5、8或9中的任一方法，其中第一特异性结合成员或第二特异性结合成员(取不包含可检测标记的一个)固定在实心载体上。
条款13.条款5-12中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款14.条款6-13中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款15.条款5-14中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款16.条款5-15中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款17.条款5-16中的任一方法，其中该方法在大约15分钟内执行。
条款18.条款5-17中的任一方法，其中生物样品为约1至约25微升。
条款19.条款5-18中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间未知。
条款20.条款5-19中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间选自包含以下范围的组：0-～12小时、～12-～24小时、～24-～36小时、～36-～48小时、～48-～72小时、～72-～96小时、～96-～120小时、～120小时-～7天、～7天-～1个月、～1个月-～3个月、～3个月-～6个月、～6个月-～1年、～1年-～3年、～3年-～6年、～6年-～12年、～12年-～20年、～20年-～30年、～30年-～50年。
条款21.条款5-20中的任一方法，其中生物样品在受试者的头部因以下原因而受损后获取：身体颤抖、由外部机械或其他作用力的钝性撞击导致头部的闭合或开放性创伤、一次或多次跌倒、爆炸或其他类型的钝力创伤。
条款22.条款5-20中的任一方法，其中生物样品在受试者摄入或暴露于化学物质、毒素或化学物质和毒素的组合后获取。
条款23.条款22中的方法，其中化学物质或毒素为火、霉菌、石棉、农药、杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、药物滥用或其中一种或多种的组合。
条款24.条款5-20中的任一方法，其中生物样品从患有自身免疫疾病、代谢障碍、脑肿瘤、缺氧、病毒、脑膜炎、脑积水或其中几种组合的受试者获取。
条款25.条款5-24中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款26.条款5-24中的任一方法，其中创伤性脑损伤为轻度创伤性脑损伤。
条款27.条款5、6、8和9中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款28.条款5、6、8和9中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款29.条款5、7、8和9中的任一方法，其中，通过在单个时间点测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款30.条款5、7、8和9中的任一方法，其中，通过监控测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款31.条款5-24中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款32.条款5-24中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款33.条款5-24中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款34.条款5-24中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑受试者的临床状况、实验室值、临床状况和实验室值；轻度、中度或重度TBI分类；展示出较低或较高水平的GFAP，并且/或者不考虑对受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款35.条款1-34中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款36.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第一或第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，其中该方法(i)可用于确定高达50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)不需要稀释生物样品；(iii)使用照护点即时检测设备执行。
条款37.一种测量受试者的生物样品中GFAP的方法，其中受试者的头部可能受损，该方法包括(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获-抗体-GFAP抗原复合物；(2)检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物；(c)根据捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款38.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款39.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP，并且可使用可检测标记中可检测信号的存在对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款40.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定低于或等于50,000pg/mL的GFAP含量，并且所述测定具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款41.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：(a)使从人类受试者处获得的生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)捕获抗体，它固定在实心载体上，与人类GFAP上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)检测抗体，它包含可检测标记并与人类GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物，其中捕获抗体和检测抗体是单特异性抗体，也可以是单克隆抗体；(b)检测捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；(c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，其中该方法能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于或等于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款42.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量以作为创伤性脑损伤量度的方法，其中所述受试者的头部可能受损，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记，而第一特异性结合成员固定在实心载体上；b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度，其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定约20pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于或等于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款43.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第一或第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，该方法(i)可用于确定高达50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)不需要稀释生物样品；(iii)使用照护点即时检测设备执行。
条款44.一种测量受试者的生物样品中GFAP的方法，该方法包括(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物；(c)根据捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款45.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款46.一种对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP，该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款47.一种对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定低于或等于50,000pg/mL的GFAP含量，并且所述测定具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款48.条款43、46和47中的任一方法，其中所述方法可用作创伤性脑损伤的量度，而所述受试者的头部可能受损，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款49.条款48中的方法，使用所述方法，可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款50.条款48或49中的方法，其中所述方法可用作创伤性脑损伤的量度，而所述受试者的头部可能受损。
条款51.条款43-50中的任一方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款52.条款43-51中的任一方法，其中该方法可用于确定从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
条款53.条款43、46或47中的任一方法，其中第一特异性结合成员或第二特异性结合成员(取不包含可检测标记的一个)固定在实心载体上。
条款54.条款43-53中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款55.条款44-54中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款56.条款43-55中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款57.条款43-56中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款58.条款43-57中的任一方法，其中该方法在大约435分钟内执行。
条款59.条款43-58中的任一方法，其中生物样品为约43至约25微升。
条款60.条款43-59中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间未知。
条款61.条款43-60中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间选自包含以下范围的组：0-～12小时、～12-～24小时、～24-～36小时、～36-～48小时、～48-～72小时、～72-～96小时、～96-～120小时、～120小时-～7天、～7天-～1个月、～1个月-～3个月、～3个月-～6个月、～6个月-～1年、～1年-～3年、～3年-～6年、～6年-～12年、～12年-～20年、～20年-～30年、～30年-～50年。
条款62.条款43-61中的任一方法，其中生物样品在受试者的头部因以下原因而受损后获取：身体颤抖、由外部机械或其他作用力的钝性撞击导致头部的闭合或开放性创伤、一次或多次跌倒、爆炸或其他类型的钝力创伤。
条款63.条款43-61中的任一方法，其中生物样品在受试者摄入或暴露于化学物质、毒素或化学物质和毒素的组合后获取。
条款64.条款63中的方法，其中化学物质或毒素为火、霉菌、石棉、农药、杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、药物滥用或其中一种或多种的组合。
条款65.条款43-61中的任一方法，其中生物样品从患有自身免疫疾病、代谢障碍、脑肿瘤、缺氧、病毒、脑膜炎、脑积水或其中几种组合的受试者获取。
条款66.条款43-65中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款67.条款43-65中的任一方法，其中创伤性脑损伤为轻度创伤性脑损伤。
条款68.条款43、44、46和47中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款69.条款43、44、46和47中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款70.条款43、45、46和47中的任一方法，其中，通过在单个时间点测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款71.条款43、45、46和47中的任一方法，其中，通过监控测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款72.条款43-71中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款73.条款43-71中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款74.条款43-71中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款75.条款43-74中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款76.条款43-75中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款77.一种对从人类受试者处获得的生物样品中受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使从人类受试者处获得的生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：
(1)捕获抗体，它固定在实心载体上，与人类GFAP上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；
(2)检测抗体，它包含可检测标记并与人类GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成GFAP抗原-检测抗体复合物，
从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物，
其中捕获抗体和检测抗体是单特异性抗体，也可以是单克隆抗体；
(b)检测捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；
(c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，
其中该方法能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于或等于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款78.条款77中的方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款79.一种对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量的方法，该方法包括以下步骤：
a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一结合成员-GFAP-第二结合成员的第一复合物，其中第二特异性结合成员包含可检测标记，而第一特异性结合成员固定在实心载体上；
b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；
c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，
其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定约20pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于或等于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款80.条款77或79中的方法，使用所述方法对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估以用作创伤性脑损伤的量度，其中所述受试者的头部可能受损，因此可使用步骤(c)中测量的可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款81.条款77-80中的任一方法，其中该方法可用于确定从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
条款82.条款77-81中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款83.条款77-82中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款84.条款77-83中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款85.条款77-84中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款86.条款77-85中的任一方法，其中该方法在大约10分钟内执行。
条款87.条款77-86中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间未知。
条款88.条款77-87中的任一方法，其中，从获取生物样品到受试者的头部受损之间的时间选自包含以下范围的组：0-～12小时、～12-～24小时、～24-～36小时、～36-～48小时、～48-～72小时、～72-～96小时、～96-～120小时、～120小时-～7天、～7天-～1个月、～1个月-～3个月、～3个月-～6个月、～6个月-～1年、～1年-～3年、～3年-～6年、～6年-～12年、～12年-～20年、～20年-～30年、～30年-～50年。
条款89.条款77-88中的任一方法，其中生物样品在受试者的头部因以下原因而受损后获取：身体颤抖、由外部机械或其他作用力的钝性撞击导致头部的闭合或开放性创伤、一次或多次跌倒、爆炸或其他类型的钝力创伤。
条款90.条款77-88中的任一方法，其中生物样品在受试者摄入或暴露于化学物质、毒素或化学物质和毒素的组合后获取。
条款91.条款90中的方法，其中化学物质或毒素为火、霉菌、石棉、农药、杀虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、药物滥用或其中一种或多种的组合。
条款92.条款77-88中的任一方法，其中生物样品从患有自身免疫疾病、代谢障碍、脑肿瘤、缺氧、病毒、脑膜炎、脑积水或其中几种组合的受试者获取。
条款93.条款77-92中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款94.条款77-92中的任一方法，其中创伤性脑损伤为轻度创伤性脑损伤。
条款95.条款77-94中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款96.条款77-94中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款97.条款77-96中的任一方法，其中，通过在单个时间点测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款98.条款77-97中的任一方法，其中，通过监控测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款99.条款77-98中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款100.条款77-98中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款101.条款77-100中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款102.条款77-101中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款103.条款77-102中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款104.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第一特异性结合成员或至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，该方法(i)可用于确定高达50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)不需要稀释生物样品；(iii)使用照护点即时检测设备执行。
条款105.一种测量受试者的生物样品中GFAP的方法，该方法包括：(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)至少一个捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成至少一个捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)至少一个检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与至少一个捕获抗体结合的表位结合以形成至少一个捕获GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物；(c)根据至少一个捕获抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款106.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款107.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP，该方法可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款108.一种对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记；b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估，其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定低于或等于50,000pg/mL的GFAP含量，并且所述测定具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的。
条款109.条款104、107和108中的任一方法，其中所述方法可用作创伤性脑损伤的量度，而所述受试者的头部可能受损，因此可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款110.条款106和109中的方法，使用所述方法，可使用可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款111.条款109或110中的方法，其中所述方法可用作创伤性脑损伤的量度，而所述受试者的头部可能受损。
条款112.条款104-111中的任一方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款113.条款104-112中的任一方法，其中该方法可用于确定从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
条款114.条款104、106或107中的任一方法，其中至少一个第一特异性结合成员或至少一个第二特异性结合成员(取不包含可检测标记的一个)固定在实心载体上。
条款115.条款104-114中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款116.条款105-115中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款117.条款104-116中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款118.条款104-117中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款119.条款104-118中的任一方法，其中该方法在大约15分钟内执行。
条款120.条款104-119中的任一方法，其中生物样品为约1至约25微升。
条款121.条款104-120中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款122.条款104-120中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款123.条款104-122中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款124.条款104-123中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款125.条款105-124中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款126.条款104-125中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款127.条款104-125中的任一方法，其中创伤性脑损伤为轻度创伤性脑损伤。
条款128.条款104、105、107和108中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款129.条款104、105、107和108中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款130.条款104、106、107和108中的任一方法，其中，通过在单个时间点测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款131.条款104、106、107和108中的任一方法，其中，通过监控测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款132.条款104-131中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款133.条款104-132中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款134.条款104-133中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款135.条款104-134中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款136.条款104-135中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款137.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：(a)使从人类受试者处获得的生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)至少一个捕获抗体，它固定在实心载体上，与人类GFAP上的表位结合以形成至少一个捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)至少一个检测抗体，它包含可检测标记并与人类GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成至少一个捕获抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物，其中至少一个捕获抗体和至少一个检测抗体是单特异性抗体，也可以是单克隆抗体；(b)检测至少一个捕获抗体-GFAP抗原-至少一个检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；(c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，其中该方法能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款138.条款137中的方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款139.一种对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行测量的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含至少一个第一特异性结合成员-GFAP-至少一个第二特异性结合成员的第一复合物，其中至少一个第二特异性结合成员包含可检测标记，而至少一个第一特异性结合成员固定在实心载体上；b)检测一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的存在表明样品中存在GFAP；c)测量可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，其中所述测定能够在体积小于20微升的测试样品中确定约20pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款140.条款137-139中的任一方法，使用所述方法对受试者的GFAP状态进行评估以用作创伤性脑损伤的量度，其中所述受试者的头部可能受损，因此可使用步骤(c)中测量的可检测标记中可检测信号的含量对所述受试者的GFAP状态进行评估以作为创伤性脑损伤的量度。
条款141.条款137-140中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款142.条款137-141中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款143.条款137-142中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款144.条款137-143中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款145.条款137-144中的任一方法，其中该方法在大约10分钟内执行。
条款146.条款137-145中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款147.条款137-146中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款148.条款137-146中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款149.条款137-148中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款150.条款137-148中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款151.条款137-150中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款152.条款137-151中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款153.条款137-152中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款154.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：检测所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中至少一种生物标志物是GFAP，并且该方法(i)可用于确定含量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；(iii)在所述动态范围内是线性的。
条款155.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物；b)检测样品中存在的一个或多个第一复合物中的GFAP，其中该方法：(i)可用于确定低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平，并且不需要稀释生物样品；或者(ii)可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，其中所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的；或者(iii)能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款156.一种对受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态进行评估的方法，该方法包括以下步骤：a)以任意顺序同时或按顺序使所述受试者的生物样品与至少一个第一特异性结合成员和至少一个第二特异性结合成员接触，其中第一特异性结合成员和第二特异性结合成员各自与GFAP进行特异性结合，从而产生一个或多个包含第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的第一复合物，其中第一特异性结合成员或第二特异性结合成员包含可检测标记；b)评估一个或多个第一复合物的信号，其中可检测标记中可检测信号的含量表明样品中存在的GFAP含量，该方法：(i)可用于确定高达50,000pg/mL的GFAP水平，并且不需要稀释生物样品；或者(ii)可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，其中所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的；或者(iii)能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款157.一种测量受试者的生物样品中GFAP的方法，该方法包括(a)从所述受试者处获得生物样品；(b)使生物样品与以下各项以任意顺序同时或按顺序接触：(1)至少一个捕获抗体，它与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)至少一个第一检测抗体，它包含可检测标记并与GFAP上未与捕获抗体结合的表位结合以形成至少一个捕获抗体-GFAP抗原-至少一个第一检测抗体复合物；(c)根据至少一个捕获抗体-GFAP抗原-至少一个第一检测抗体复合物中可检测标记生成的信号，确定生物样品中GFAP的含量或浓度，其中该方法：(i)可用于确定低于或等于50,000pg/mL含量的GFAP水平，并且所述方法具有5log的动态范围，在所述动态范围内是线性的；或者(ii)能够量化约5pg/mL到约50,000pg/mL的动态范围内的GFAP水平，精度小于10％CV，在动态范围内与线性度(DL)的偏差小于10％。
条款158.条款154或155中的方法，其中GFAP通过免疫测定或单分子检测测定来检测。
条款159.条款154-158中的任一方法，其中该方法可用于确定从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
条款160.条款155或156中的方法，其中第一特异性结合成员或第二特异性结合成员(取不包含可检测标记的一个)固定在实心载体上。
条款161.条款154-160中的任一方法，其中该方法使用照护点即时检测设备执行。
条款162.条款154-161中的任一方法，其中GFAP与一种或多种其他生物标志物一起评估。
条款163.条款154-162中的任一方法，其中该方法可检测从以下组合的组中选择的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～35pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～15,000pg/mL、～175pg/mL-～10,000pg/mL。
条款164.条款155-163中的任一方法，其中所述接触是同时进行的。
条款165.条款155-163中的任一方法，其中所述接触是按顺序进行的。
条款166.条款157-165中的任一方法，其中至少一个捕获抗体固定在实心载体上。
条款167.条款154-166中的任一方法，其中该方法在约5至约20分钟内执行。
条款168.条款154-167中的任一方法，其中该方法在大约15分钟内执行。
条款169.条款154-168中的任一方法，其中生物样品选自包含全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品的组。
条款170.条款154-169中的任一方法，其中该方法用于确认发生了创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
条款171.条款170中的方法，其中创伤性脑损伤为轻度创伤性脑损伤。
条款172.条款154、155、156、158-165或167-171中的任一方法，其中，通过在单个时间点测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款173.条款154、155、156、158-165或167-171中的任一方法，其中，通过监控测量GFAP的水平或含量来评估状态。
条款174.条款154-173中的任一方法，其中所述方法可对任何受试者施行，而不考虑从包含以下情况的组中选择的因素：受试者的临床状况、受试者的实验室值；受试者的轻度、中度或重度TBI分类；受试者展示出较低或较高水平的GFAP，以及对所述受试者的头部造成损伤的任何事件的时间。
条款175.条款154-174中的任一方法，其中所述方法使用体积小于20微升的所述生物样品完成。
条款176.条款154、157-159或161-175中的任一方法，其中生物样品不需要稀释。
条款177.条款154-176中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为10pg/mL。
条款178.条款154-176中的任一方法，其中所述方法的检测限(LoD)下限约为20pg/mL。
条款179.条款154-178中的任一方法，其中所述方法提供扩展的检测时段。
条款180.条款155、156或160中的任一方法，其中一个第一GFAP特异性结合成员固定在实心载体上。
条款181.条款155、156或160中的任一方法，其中至少一个第二GFAP特异性结合成员固定在实心载体上。
条款182.条款155、156或160中的任一方法，其中至少一个第一GFAP特异性结合成员和至少一个第二GFAP特异性结合成员为单特异性抗体。
条款183.条款169中的方法，其中生物样品已稀释或未稀释。

Claims (30)

1.一种评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的方法，所述方法包括以下步骤：
检测来自所述受试者的生物样品中的至少一种生物标志物，其中所述生物标志物中的至少一种是GFAP，并且其中所述方法(i)可用于确定其量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平；(ii)具有5log的动态范围；并且(iii)在所述动态范围内是线性的。
2.一种评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使来自所述受试者的生物样品同时或以任意顺序依次与至少一种第一特异性结合成员和至少一种第二特异性结合成员接触，其中所述第一特异性结合成员和所述第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生包含所述第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的一种或多种第一复合物；
b)检测所述样品中存在的所述一种或多种第一复合物中的GFAP，
其中所述方法：
(i)可用于确定少于或等于50,000pg/mL GFAP的水平，并且不需要稀释所述生物样品；或者
(ii)可用于确定其量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法具有5log的动态范围，并且在所述动态范围内是线性的，或者
(iii)能够在约5pg/mL至约50,000pg/mL的动态范围内定量所述GFAP水平，其中精度小于10％CV，并且在所述动态范围内实现线性偏差(DL)小于10％。
3.一种评估受试者的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)状态的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使来自所述受试者的生物样品同时或以任意顺序依次与至少一种第一特异性结合成员和至少一种第二特异性结合成员接触，其中所述第一特异性结合成员和所述第二特异性结合成员各自特异性结合GFAP，从而产生包含所述第一特异性结合成员-GFAP-第二特异性结合成员的一种或多种第一复合物，其中所述第一特异性结合成员或第二特异性结合成员包含可检测标记；以及
b)评估来自所述一种或多种第一复合物的信号，其中所述可检测标记中可检测信号的量表明所述样品中GFAP的存在量，
其中所述方法：
(i)可用于确定少于或等于50,000pg/mL GFAP的水平，并且不需要稀释所述生物样品；或者
(ii)可用于确定其量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法具有5log的动态范围，并且在所述动态范围内是线性的，或者
(iii)能够在约5pg/mL至约50,000pg/mL的动态范围内定量GFAP水平，其中精度小于10％CV，并且在所述动态范围内实现线性偏差(DL)小于10％。
4.一种测量来自受试者的生物样品中GFAP的方法，所述方法包括
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)使所述生物样品同时或以任意顺序依次与以下物质接触：
(1)至少一种捕获抗体，其与GFAP或GFAP片段上的表位结合以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物；(2)至少一种第一检测抗体，其包含可检测标记并与GFAP上未被所述捕获抗体结合的表位结合以形成至少一种捕获抗体-GFAP抗原-至少一种第一检测抗体复合物；以及
(c)根据所述至少一种捕获抗体-GFAP抗原-至少一种第一检测抗体复合物中由所述可检测标记生成的信号，确定所述生物样品中GFAP的量或浓度，
其中所述方法：
(i)可用于确定其量低于或等于50,000pg/mL的GFAP水平，并且其中所述方法具有5log的动态范围，并且在所述动态范围内是线性的；或者
(ii)能够在约5pg/mL至约50,000pg/mL的动态范围内定量GFAP水平，其中精度小于10％CV，并且在所述动态范围内实现线性偏差(DL)小于10％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过免疫测定或单分子检测测定来检测GFAP。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法可用于确定选自由以下组成的组中的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～20pg/mL-～50,000pg/mL、～25pg/mL-～50,000pg/mL、～30pg/mL-～50,000pg/mL、～40pg/mL-～50,000pg/mL、～50pg/mL-～50,000pg/mL、～60pg/mL-～50,000pg/mL、～70pg/mL-～50,000pg/mL、～75pg/mL-～50,000pg/mL、～80pg/mL-～50,000pg/mL、～90pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～50,000pg/mL。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其中任何不包含所述可检测标记的所述第一特异性结合成员或第二特异性结合成员固定在实心载体上。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法使用床旁设备执行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中GFAP与一种或多种其它生物标志物一起评估。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法检测选自由以下组成的组中的GFAP水平：～10pg/mL-～50,000pg/mL、～35pg/mL-～50,000pg/mL、～100pg/mL-～50,000pg/mL、～125pg/mL-～50,000pg/mL、～150pg/mL-～15,000pg/mL、～175pg/mL-～10,000pg/mL。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述接触是同时进行的。
12.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述接触是依次进行的。
13.根据权利要求4-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种捕获抗体固定在实心载体上。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法在约5分钟至约20分钟内执行。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法在约15分钟内执行。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自由全血样品、血清样品、脑脊髓液样品和血浆样品组成的组。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法用于确认发生创伤性脑损伤或不存在创伤性脑损伤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述创伤性脑损伤是轻度创伤性脑损伤。
19.根据权利要求1、2、3、5-12或14-18中任一项所述的方法，其中通过在单个时间点测量GFAP的水平或量来评估状态。
20.根据权利要求1、2、3、5-12或14-18中任一项所述的方法，其中通过在监视下完成测量GFAP的水平或量来评估状态。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述方法可在任何受试者上施行，而不考虑选自由以下组成的组中的因素：所述受试者的临床状况，所述受试者的实验室值，所述受试者被分类为轻度、中度或重度TBI，所述受试者的GFAP表现为低或高水平，以及其中所述受试者可能已经收受到头部损伤的任何事件的时间。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法使用小于20微升体积的所述生物样品进行。
23.根据权利要求1、4-6或8-22中任一项所述的方法，其中所述生物样品不需要稀释。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法具有10pg/mL的下端检测限(LoD)。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法具有20pg/mL的下端检测限(LoD)。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述方法提供扩展的检测窗口。
27.根据权利要求2、3或7所述的方法，其中所述一种第一GFAP特异性结合成员固定在实心载体上。
28.根据权利要求2、3或7所述的方法，其中至少一种第二GFAP特异性结合成员固定在实心载体上。
29.根据权利要求2、3或7所述的方法，其中所述至少一种第一GFAP特异性结合成员和至少一种第二GFAP特异性结合成员是单特异性抗体。
30.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样品被稀释或未被稀释。
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