CN114563577A - 一种高灵敏度的定量检测gfap试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，所述定量检测GFAP试剂盒包括FITC‑抗FITC抗体信号放大体系，所述FITC‑抗FITC抗体信号放大体系由FITC标记的GFAP抗体溶液和抗FITC抗体标记的磁微粒溶液组成，本发明的FITC‑抗FITC抗体信号放大体系在磁微粒数量不变的情况下可以使信号值放大8倍；在信号值相同的情况下可以使磁微粒和抗体2用量减小8倍，节省大量生产成本。在实际应用中会采用折中的方法，一般可以使信号值方法3‑4倍、灵敏度提高50％‑70％、生产成本下降5％‑15％。

Description

一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒。
背景技术
创伤性脑损伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型TBI中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。
疑似TBI的医疗护理流程分为三步，首先使用15分格拉斯哥昏迷量表(GCS)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部CT扫描来可视化骨折和颅内病变，最后根据CT结果制定治疗方案、留院观察或出院。
目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而， CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预。鉴于这些患者的CT扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间纤丝蛋白。人的GFAP由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。GFAP 是一种神经系统特异性蛋白，其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响。
在TBI中，GFAP在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清GFAP显著升高。对TBI 的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。
CN109521004A公开了一种用于检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微粒分离化学发光免疫测定法，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂A、试剂B、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原的缓冲液配制而成；试剂A为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；试剂B为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(ALP) 催化的发光底物溶液。该发明提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为人体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法，但是，该发明采用的磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体易聚沉淀，流动性差，使用时易出现挂壁残留，从而使检测过程中发挥作用的颗粒减少，导致测试结果的准确性和稳定性差。
CN112485445A公开了一种定量检测GFAP的试剂盒及其应用，该发明通过改进磁微粒发光法中的磁微粒载体的缓冲体系，改善了磁微粒抗体偶联物的流动性和沉降性能，提高了试剂盒检测结果的准确性和重复性，稳定性好。
如何在于现有技术的基础上，引进信号放大系统，进一步提高试剂盒的灵敏度，降低材料成本，对提高人外周血胶质纤维酸性蛋白的分析水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，通过增加了“FITC-抗 FITC抗体”信号放大体系，增加了试剂盒的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本。
术语：
FITC：异硫氰酸荧光素。
GFAP：胶质纤维酸性蛋白。
室温：20-30℃。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种FITC-抗FITC抗体信号放大体系，由FITC标记的GFAP抗体溶液和抗FITC抗体标记的磁微粒溶液组成，
其中，所述FITC标记的GFAP抗体溶液包括FITC标记的GFAP抗体2偶联物和缓冲液；所述抗FITC抗体标记的磁微粒溶液包括抗FITC抗体标记的磁微粒和缓冲液。
优选地，所述FITC标记的GFAP抗体2偶联物的制备方法，包括以下步骤：
A1、抗体2连接FITC
称取除盐后的FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比3:100-15:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应，震荡混匀后在室温下反应，得到FITC抗体2连接物；
A2、FITC抗体2连接物的纯化
使用缓冲液作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液；使用15mL缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入步骤A1得到的FITC抗体2连接物；
使用缓冲液将柱内体积补足至2-2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液开始洗脱，收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)；
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL，即得FITC标记的 GFAP抗体2偶联物。
优选地，所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
B1、抗FITC抗体的选择及除盐
使用缓冲液作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液；使用15mL缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体；使用缓冲液将柱内体积补足至2-2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液开始洗脱；收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)；
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL，备用；
B2、抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:3-100:20的比例(即1mg磁珠加入30-200ug抗FITC 抗体)，将步骤B1浓缩后的抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2-8℃条件下持续混匀反应16-24小时，得到抗FITC抗体磁微粒连接物；
B3、抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭、清洗和重悬。
优选地，步骤B1中所述抗FITC抗体为质量比为1:4-4:1的抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC 抗体(盐析纯化)。
优选地，步骤B2中所述磁微粒的活化为：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)用缓冲液溶解至4-15mg/mL；按磁微粒与EDC质量比100:15-100:350的比例(即1mg 磁微粒加入150-3500ugEDC)，将EDC加入磁微粒中在室温下进行活化反应。
进一步优选地，所述磁微粒为粒径0.5-3μm的羧基磁微粒。
本发明还提供了上述FITC-抗FITC抗体信号放大体系在提高定量检测GFAP试剂盒灵敏性中的应用。
本发明还提供了一种检测试剂条，包括上述FITC-抗FITC抗体信号放大体系。
本发明还提供了一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，包括上述检测试剂条。
一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，由检测试剂条、校准品、质控品和盒签二维码组成，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成；盒签二维码中录入了当批次的标准曲线。
优选地，所述检测试剂条，包括试剂B和试剂C，其中，试剂B为含一定浓度生物素FITC 标记的GFAP抗体溶液；试剂C为含一定浓度抗FITC抗体标记的磁微粒溶液。
本发明还提供了上述试剂盒在在检测人外周血和/或血清GFAP含量中的应用。
本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1、免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A、50uL试剂C依次加入反应孔位A中，在37℃条件下反应20min；
S2、磁分离及清洗：在清洗孔位M1加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位M1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位M2、清洗孔位M3分别进行 1次磁分离及清洗；
S3、读值：在测读孔加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位 M3，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后检测相对发光强度(RLU)；
S4、根据检测的校准品数值，获得一条GFAP浓度-发光值标准曲线，所述标准曲线使用四参数Logistic方程拟合；
S5、样本的检测值与标准曲线上的浓度值对应，从而实现对样本的浓度检测。
本发明的有益效果为：
(1)本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段(主要为CT)相比，本专利更能客观的反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判。
(2)本发明使用的磁微粒化学发光法可以使检测灵敏度达到皮克级别(10-12g/mL)，而 CT依赖像素达到更高的分辨率。由于本发明是对脑损伤特异性标志物进行检测，检测窗口比 CT提前很多。在CT阴性的情况下，即可对正常人和轻度TBI患者进行有效区分。
(3)本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，30分钟即可得到准确结果。而CT检测时间较长，一般需要等待4小时才可能取得检测结果。
(4)本发明使用浓度数值进行判断，取得结果即可得知患者是否患病，客观性较强。而 CT检测需要医师进行阅片，依医师的业务水平，主观判断性较强，容易造成漏判、误判。
(5)本发明改进了胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测试剂盒的反应体系，提高了灵敏度、增加了信号值、降低了材料成本。
附图说明
图1为免疫反应流程图。
图2GFAP检测试剂条示意图。
其中：A-反应孔位、M1-清洗孔位、M2-清洗孔位、M3-清洗孔位、B-测读孔。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。如无特殊说明，本发明所采用的水为纯化水，采用的缓冲液均经0.22μm的滤膜进行过滤处理。
如附图1和2所示，本发明提供了一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和盒签二维码组成(如表1所示)，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由GFAP抗原和缓冲液配制而成；盒签二维码中录入了当批次的标准曲线。
表1试剂盒的组分表
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述检测试剂条由试剂A、试剂B、试剂C、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的GFAP抗体溶液；试剂B为含一定浓度FITC 标记的GFAP抗体溶液；试剂C为含一定浓度抗FITC抗体标记的磁微粒溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为ALP催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值。
一、所述试剂A的制备方法为：
将酶标GFAP抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；
其中，所述缓冲液8，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6-5.9g/L、NaH2PO40.55-0.60g、 NaCl 9.0g/L和牛血清白蛋白1.0-50g/L，pH为7.0-7.6；
所述酶标GFAP抗体偶联物的制备方法：包括以下步骤：
1.1抗体的活化
抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比15:1～30:1的比例(即：1mg抗体1加入10～20μl 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30 分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5～20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。
1.2碱性磷酸酶(ALP)的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比15:1～60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5～34.5μl SMCC 溶液)。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入10～50μl缓冲液2 的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
1.3抗体和ALP的连接
抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与ALP质量比1:2～1:1的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液(即：1.0mg抗体1加入1.0～2.0mg ALP)。震荡混匀后，将混合物在2℃～8℃环境中反应12-18小时。
1.4抗体1偶联物的终止和纯化
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入4-20μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入10～50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5～2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。
其中，
缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺14.8-15.1g/L和NaCl5.8-6.0g/L，pH为7.3-7.6。
缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/L。
二、所述试剂B的制备方法：
将FITC标记的GFAP抗体溶解于缓冲液8中，混合均匀。
所述FITC标记的GFAP抗体的制备方法，包括以下步骤：
2.1抗体2的除盐
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为： 6000-8000rpm、离心10～20分钟。
2.2抗体2连接FITC
称取FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比3:100-15:100的比例(即1mg抗体加入30-150μg FITC)，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应18小时。
2.3FITC抗体2连接物的纯化
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的FITC抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。
其中，
缓冲液10，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6-5.9g/L、NaH2PO4 0.55-0.60g/L、NaCl 9.0g/L和KCl 2.0-5.0g/L。
缓冲液15，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷12-18g/L，pH为8.0-9.5。
三、所述试剂C的制备方法：
将抗FITC抗体标记的磁微粒溶解于缓冲液9中，混合均匀；
其中，所述缓冲液9，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6-5.9g/L、NaH2PO40.55-0.60g、 NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白1.0-50g/L、蔗糖80-140g/L、黄原胶0.1-5.0g/L、海藻酸钠0.1-5.0g/L 和明胶1.0-15g/L，pH为6.2-8.0。
所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
3.1磁微粒的清洗
选择0.5-3μm的磁微粒原料充分混匀0.5～1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤。
3.2磁微粒的重悬
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
3.3抗FITC抗体的选择及除盐
按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以1:4-4:1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC 抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10～20分钟。
3.4磁微粒的活化
选择粒径为0.5-3μm的羧基磁微粒进行活化。(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至 4-15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:1-100:30的比例(即1mg磁微粒加入10-300ugEDC)，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。
3.5活化磁微粒的清洗
使用缓冲液11对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液11将磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。
3.6抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:3-100:20的比例(即1mg磁珠加入30-200ug抗FITC 抗体)，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2-8℃条件下持续混匀反应16-24 小时。
3.7抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭
在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
3.8抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗
在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。
3.9抗FITC抗体磁微粒连接物的重悬
在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/20～1/50的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。
其中，
缓冲液11，由以下组分组成：2-(N-吗啡啉)乙磺酸12-30g/L。
缓冲液12，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷2.5-5.0g/L、NaCl 9.0g/L和牛血清白蛋白50-20g/L，pH为7.0-7.6。
缓冲液13，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷2.5-5.0g/L，NaCl 9.0g/L和吐温0.2-2ml/L pH为7.0-7.6。
缓冲液14，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷8.5-15g/L、NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白 20-150g/L、蔗糖15-100g/L和ProClin300 1-20ml/L、pH为7.5-9.2。
四、标准品
所述校准品1为20pg/mL的GFAP重组蛋白溶液，所示标准品2为160pg/mL的GFAP 重组蛋白溶液，其制备方法为：将GFAP重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。
其中，
缓冲液7，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷12-15g/L、牛血清白蛋白5-50g/L和甘氨酸1.0-30g/L，pH为7.6-8.8。
五、质控品
所述质控品为浓度为40pg/mL的GFAP重组蛋白溶液，其制备方法为：将GFAP重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。
本发明在原有工艺基础上加入了信号放大体系。原有的待测物结构“碱性磷酸酶-抗体1- 抗原-抗体2-磁微粒”是一种单一的线性结构，一个抗原对应一个磁微粒。由于每个抗FITC抗体都可以和8个FITC相连接，因此，新的待测物“碱性磷酸酶-抗体1-抗原-抗体2-FITC-抗FITC 抗体-磁微粒”是一种球状发散结构。这种结构在磁微粒数量不变的情况下可以使信号值放大8倍；在信号值相同的情况下可以使磁微粒和抗体2用量减小8倍，节省大量生产成本。在实际应用中会采用折中的方法，一般可以使信号值方法3-4倍、灵敏度提高50％-70％、生产成本下降5％-15％。
为了方便本领域技术人员对本发明的理解，下面结合具体实施例对发明的技术方案和技术效果进行进一步阐述。
实施例1
一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和盒签二维码组成，如表1所示，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由GFAP 抗原和缓冲液配制而成；盒签二维码中录入了当批次的标准曲线。
表1试剂盒的组分表
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
所述检测试剂条由试剂A、试剂B、试剂C、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的GFAP抗体溶液；试剂B为含一定浓度FITC 标记的GFAP抗体溶液；试剂C为含一定浓度抗FITC抗体标记的磁微粒溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为ALP催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值。
一、所述试剂A的制备方法为：
将酶标GFAP抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；
其中，所述缓冲液8，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.9g/L、NaH2PO40.55g、NaCl9.0 g/L和牛血清白蛋白1.0g/L，pH为7.0-7.6；
所述酶标GFAP抗体偶联物的制备方法：包括以下步骤：
1.1抗体的活化
抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比20:1的比例将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。
1.2碱性磷酸酶(ALP)的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比30:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入25μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
1.3抗体和ALP的连接
抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与ALP质量比1:1的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液。震荡混匀后，将混合物在6℃环境中反应14小时。
1.4抗体1偶联物的终止和纯化
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用 DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入10μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入30μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5～2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级 2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。
其中，
缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺15g/L和NaCl 5.9g/L，pH为7.3-7.6。
缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/L。
二、所述试剂B的制备方法：
将FITC标记的GFAP抗体溶解于缓冲液8中，混合均匀。
所述FITC标记的GFAP抗体的制备方法，包括以下步骤：
2.1抗体2的除盐
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为： 6000-8000rpm、离心10～20分钟。
2.2抗体2连接FITC
称取FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比5:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应18小时。
2.3FITC抗体2连接物的纯化
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的FITC抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。
其中，
缓冲液10，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.7g/L、NaH2PO4 0.58g/L、NaCl9.0g/L和 KCl 2.0g/L。
缓冲液15，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷15g/L，pH为8.0-9.5。
三、所述试剂C的制备方法：
将抗FITC抗体标记的磁微粒溶解于缓冲液9中，混合均匀；
其中，所述缓冲液9，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.7g/L、NaH2PO40.56g、NaCl9.0 g/L、牛血清白蛋白20g/L、蔗糖100g/L、黄原胶1.5g/L、海藻酸钠2g/L和明胶5g/L，pH为6.2-8.0。
所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
3.1磁微粒的清洗
选择0.5-3μm的磁微粒原料充分混匀0.5小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为8mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤。
3.2磁微粒的重悬
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
3.3抗FITC抗体的选择及除盐
按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以1:1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC 抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10～20分钟。
3.4磁微粒的活化
选择粒径为0.5-3μm的羧基磁微粒进行活化(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)。
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至 8mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:10的比例，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。
3.5活化磁微粒的清洗
使用缓冲液11对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液11将磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。
3.6抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:10的比例，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在6℃条件下持续混匀反应18小时。
3.7抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭
在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
3.8抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗
在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。
3.9抗FITC抗体磁微粒连接物的重悬
在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/30的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。
其中，
缓冲液11，由以下组分组成：2-(N-吗啡啉)乙磺酸15g/L。
缓冲液12，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷3.0g/L、NaCl 9.0g/L和牛血清白蛋白 10g/L，pH为7.0-7.6。
缓冲液13，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷3.0g/L，NaCl 9.0g/L和吐温1ml/LpH 为7.0-7.6。
缓冲液14，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷12g/L、NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白50g/L、蔗糖30g/L和ProClin30010ml/L、pH为7.5-9.2。
四、标准品
所述校准品1为20pg/mL的GFAP重组蛋白溶液，所示标准品2为160pg/mL的GFAP 重组蛋白溶液，其制备方法为：将GFAP重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。
其中，
缓冲液7，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷13g/L、牛血清白蛋白10g/L和甘氨酸 10g/L，pH为7.6-8.8。
五、质控品
所述质控品为浓度为40pg/mL的GFAP重组蛋白溶液，其制备方法为：将GFAP重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。
实施例2
一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒其与实施例1的区别在于，
所述缓冲液8，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6g/L、NaH2PO4 0.60g、NaCl9.0g/L 和牛血清白蛋白50g/L，pH为7.0-7.6；
所述酶标GFAP抗体偶联物的制备方法：包括以下步骤：
1.1抗体的活化
抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比15:1的比例将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。
1.2碱性磷酸酶(ALP)的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比15:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
1.3抗体和ALP的连接
抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与ALP质量比1:2的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液。震荡混匀后，将混合物在2℃环境中反应18小时。
1.4抗体1偶联物的终止和纯化
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用 DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入4μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5～2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级 2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。
其中，
缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺14.8g/L和NaCl5.8g/L，pH为7.3-7.6。
缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/L。
二、所述试剂B的制备方法：
将FITC标记的GFAP抗体溶解于缓冲液8中，混合均匀。
所述FITC标记的GFAP抗体的制备方法，包括以下步骤：
2.1抗体2的除盐
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为： 6000-8000rpm、离心10～20分钟。
2.2抗体2连接FITC
称取FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比3:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应18小时。
2.3FITC抗体2连接物的纯化
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的FITC抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。
其中，
缓冲液10，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6g/L、NaH2PO4 0.60g/L、NaCl9.0g/L和 KCl 5g/L。
缓冲液15，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷12g/L，pH为8.0-9.5。
三、所述试剂C的制备方法：
将抗FITC抗体标记的磁微粒溶解于缓冲液9中，混合均匀；
其中，所述缓冲液9，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.9g/L、NaH2PO40.55g、NaCl9.0 g/L、牛血清白蛋白1.0g/L、蔗糖140g/L、黄原胶0.1g/L、海藻酸钠0.1g/L和明胶1.0g/L，pH 为6.2-8.0。
所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
3.1磁微粒的清洗
选择0.5-3μm的磁微粒原料充分混匀0.5～1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤。
3.2磁微粒的重悬
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
3.3抗FITC抗体的选择及除盐
按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以1:4的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC 抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10～20分钟。
3.4磁微粒的活化
选择粒径为0.5-3μm的羧基磁微粒进行活化(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)。
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至 4-15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:1的比例，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。
3.5活化磁微粒的清洗
使用缓冲液11对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液11将磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。
3.6抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:3的比例，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2℃条件下持续混匀反应24小时。
3.7抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭
在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
3.8抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗
在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。
3.9抗FITC抗体磁微粒连接物的重悬
在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/20的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。
其中，
缓冲液11，由以下组分组成：2-(N-吗啡啉)乙磺酸12g/L。
缓冲液12，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷2.5g/L、NaCl 9.0g/L和牛血清白蛋白5.0g/L，pH为7.0-7.6。
缓冲液13，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷5.0g/L，NaCl 9.0g/L和吐温0.2ml/L pH 为7.0-7.6。
缓冲液14，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷8.5g/L、NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白150 g/L、蔗糖15g/L和ProClin300 1ml/L、pH为7.5-9.2。
实施例3
一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒与实施例1的区别在于：
所述缓冲液8，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.9g/L、NaH2PO40.55g、NaCl9.0g/L 和牛血清白蛋白1.0g/L，pH为7.0-7.6；
所述酶标GFAP抗体偶联物的制备方法：包括以下步骤：
1.1抗体的活化
抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4～8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比30:1的比例，将2IT溶液加入抗体1 溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。
1.2碱性磷酸酶(ALP)的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2～4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
1.3抗体和ALP的连接
抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与ALP质量比1:1的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液。震荡混匀后，将混合物在8℃环境中反应12小时。
1.4抗体1偶联物的终止和纯化
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用 DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入20μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入10μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5～2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级 2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体1偶联物。
其中，
缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺15.1g/L和NaCl 6.0g/L，pH为7.3-7.6。
缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/L。
二、所述试剂B的制备方法：
将FITC标记的GFAP抗体溶解于缓冲液8中，混合均匀。
所述FITC标记的GFAP抗体的制备方法，包括以下步骤：
2.1抗体2的除盐
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为： 6000-8000rpm、离心10～20分钟。
2.2抗体2连接FITC
称取FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比15:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应18小时。
2.3FITC抗体2连接物的纯化
使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的FITC抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。
其中，
缓冲液10，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.9g/L、NaH2PO4 0.55g/L、NaCl9.0g/L和 KCl 2g/L。
缓冲液15，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷18g/L，pH为8.0-9.5。
三、所述试剂C的制备方法：
将抗FITC抗体标记的磁微粒溶解于缓冲液9中，混合均匀；
其中，所述缓冲液9，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6g/L、NaH2PO4 0.60g、NaCl 9.0 g/L、牛血清白蛋白50g/L、蔗糖80g/L、黄原胶5.0g/L、海藻酸钠5.0g/L和明胶15g/L，pH 为6.2-8.0。
所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
3.1磁微粒的清洗
选择0.5-3μm的磁微粒原料充分混匀0.5～1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤。
3.2磁微粒的重悬
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
3.3抗FITC抗体的选择及除盐
按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以4:1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC 抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10～20分钟。
3.4磁微粒的活化
选择粒径为0.5-3μm的羧基磁微粒进行活化(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)。
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至 4-15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:30的比例，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。
3.5活化磁微粒的清洗
使用缓冲液11对活化后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
一共重复三次重悬、分离步骤，最终使用缓冲液11将磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。
3.6抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:20的比例，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在8℃条件下持续混匀反应16小时。
3.7抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭
在偶联反应完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
3.8抗FITC抗体磁微粒连接物的清洗
在封闭完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。
3.9抗FITC抗体磁微粒连接物的重悬
在清洗完成后，将抗FITC抗体磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，混匀5分钟。加入总体积1/50的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃～8℃环境中保存。
其中，
缓冲液11，由以下组分组成：2-(N-吗啡啉)乙磺酸30g/L。
缓冲液12，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷5.0g/L、NaCl 9.0g/L和牛血清白蛋白 20g/L，pH为7.0-7.6。
缓冲液13，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷2.5g/L，NaCl 9.0g/L和吐温2ml/LpH 为7.0-7.6。
缓冲液14，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷15g/L、NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白20g/L、蔗糖100g/L和ProClin300 20ml/L、pH为7.5-9.2。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：
所述试剂B的制备方法：
2.2抗体2连接FITC
称取FITC用缓冲液15配合成终浓度0.5mg/mL的FITC浓缩液，按FITC与抗体2质量比20:100的比例，将FITC加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应18小时。
2.3FITC抗体2连接物的纯化
缓冲液10，由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.5g/L、NaH2PO4 0.65g/L、NaCl8.0g/L和 KCl 0.2g/L。
缓冲液15，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷10g/L，pH为8.0-9.5。
三、所述试剂C的制备方法：
3.3抗FITC抗体的选择及除盐
按质量比将抗FITC抗体(亲和纯化)和FITC抗体(盐析纯化)以5：1的比例混合，形成新的抗FITC抗体。使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC 抗体。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10～20分钟。
3.4磁微粒的活化
选择粒径为0.5-3μm的羧基磁微粒进行活化(即表面有大量羧基功能团的磁微粒)。
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至 4-15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:35的比例，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀40分钟。
3.6抗FITC抗体连接磁微粒
按磁微粒：抗FITC抗体质量比100:2的比例，将抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2℃条件下持续混匀反应24小时。
实施例4
采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪对实施例1制备的试剂盒进行检测，如图2所示。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：
S1、免疫反应：将30uL样本、50uL试剂B、50uL试剂A、50uL试剂C依次加入反应孔位A中，在37℃条件下反应20min；
S2、磁分离及清洗：在清洗孔位M1加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位M1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位M2、清洗孔位M3分别进行 1次磁分离及清洗；
S3、读值：在测读孔加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位 M3，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后检测相对发光强度(RLU)；
S4、根据检测的校准品数值，获得一条GFAP浓度-发光值标准曲线，所述标准曲线使用四参数Logistic方程拟合；
S5、样本的检测值与标准曲线上的浓度值对应，从而实现对样本的浓度检测。
实施例5试剂盒性能分析
按照实施例4的检测方法对实施例1-3和对比例制备的定量检测GFAP的试剂盒进行检测，对试剂盒的准确度、空白值、线性和重复性等指标进行分析。
(1)准确度
实验要求：将已知浓度的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)加入到低值样本中，其回收率应在 [85,115]％范围内；
实验方法：将浓度为800pg/mL(允许偏差±10％)的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)液(A)加入到浓度为0pg/mL～5pg/mL的样本B中，所加入胶质纤维酸性蛋白抗原(GFAP)与样本B 之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率R，检测结果如表2所示。
Figure BDA0003476458520000271
式中：
R—回收率；
V—样品A液的体积；
V0—血清样品B液的体积；
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0—血清样品B液的3次测量平均值；
CS—样品A液的浓度。
表2
试剂盒 回收率％
实施例1 106
实施例2 111
实施例3 98
对比例1 77
由上表可见，本发明实施例1-3制备的试剂盒回收率在[85,115]％范围内，符合要求，而对比例1的试剂盒的回收率，不符合规定。
(2)空白限
实验要求：≤5pg/mL。
实验方法：将零浓度校准品作为样本，重复测试20次，得到20次测试结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值
Figure BDA0003476458520000281
和标准差(SD)。根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将平均值
Figure BDA0003476458520000282
所对应的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003476458520000283
由上表可见，本发明实施例1-3制备的试剂盒的空白限不高于5pg/mL，符合要求，而对比例1的试剂盒的空白限高于5pg/mL不符合规定。
(3)线性区间
实验要求：在[10,320]pg/mL的线性范围内，相关系数r应≥0.990。
实验方法：将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值。以稀释浓度为自变量，以测定结果均值为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，结果如表4所示。
Figure BDA0003476458520000291
式中：
r———相关系数；
xi———稀释比例；
yi———各个样本测定结果均值；
Figure BDA0003476458520000292
———稀释比例的均值；
Figure BDA0003476458520000293
———样本测定结果总均值。
表4
试剂盒 相关系数r
实施例1 0.9972
实施例2 0.9965
实施例3 0.9988
对比例1 0.8713
由上表可知，实施例1-3的试剂盒的线性相关系数(r)实验结果不低于0.9900，因此可以定义实施例1-3的试剂盒的线性范围为[10，320]pg/mL。
(4)重复性
实验要求：样本各测试10次，CV≤8％。
实验方法：同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0003476458520000294
和标准差SD。按公式(3)计算变异系数(CV)，结果如表5所示。
Figure BDA0003476458520000295
式中：
SD——样本测试值的标准差；
Figure BDA0003476458520000301
——样本测试值的平均值。
表5
Figure BDA0003476458520000302
由上表可知，本发明实施例1-3的试剂盒的重复性不高于8％，而对比例1的试剂盒的重复性大于10％不符合规定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，由FITC标记的GFAP抗体溶液和抗FITC抗体标记的磁微粒溶液组成，
其中，所述FITC标记的GFAP抗体溶液包括FITC标记的GFAP抗体2偶联物和缓冲液；所述抗FITC抗体标记的磁微粒溶液包括抗FITC抗体标记的磁微粒和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，所述FITC标记的GFAP抗体2偶联物的制备方法，包括以下步骤：
A1、抗体2连接FITC
称取除盐后的FITC用缓冲液配合成FITC浓缩液，将FITC加入抗体2溶液中进行反应，震荡混匀后在室温下反应，得到FITC抗体2连接物；
A2、FITC抗体2连接物的纯化
用缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入步骤A1得到的FITC抗体2连接物；
使用缓冲液将柱内体积补足至2-2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入缓冲液开始洗脱，收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积；
将除盐后的FITC抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL，即得FITC标记的GFAP抗体2偶联物。
3.根据权利要求2所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，步骤A1中所述FITC与抗体2的质量比为3:100-15:100。
4.根据权利要求1所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，所述抗FITC抗体标记的磁微粒的制备方法，包括以下步骤：
B1、抗FITC抗体的选择及除盐
用缓冲液清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗FITC抗体；使用缓冲液将柱内体积补足至2-2.6mL，当柱内液体完全进入柱料时，加入缓冲液洗脱；收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积；
将除盐后的抗FITC抗体加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL，备用；
B2、抗FITC抗体连接磁微粒
将步骤B1浓缩后的抗FITC抗体加入活化后的磁微粒进行反应，在2-8℃条件下持续混匀反应16-24小时，得到抗FITC抗体磁微粒连接物；
B3、抗FITC抗体磁微粒连接物的封闭、清洗和重悬，即得所述抗FITC抗体标记的磁微粒。
5.根据权利要求4所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，步骤B2中所述抗FITC抗体为质量比1:4-4:1的亲和纯化抗FITC抗体和盐析纯化FITC抗体。
6.根据权利要求4所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，步骤B2中所述磁微粒的活化，包括：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐用缓冲液，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入磁微粒中在室温下进行活化反应。
7.根据权利要求4所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系，其特征在于，步骤B2中所述磁微粒和抗FITC抗体的质量比为100:3-100:20。
8.根据权利要求1-7任一项所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系在提高定量检测GFAP试剂盒灵敏性中的应用。
9.一种检测试剂条，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的FITC-抗FITC抗体信号放大体系。
10.一种高灵敏度的定量检测GFAP试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述的检测试剂条。
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