CN114624448B

CN114624448B - 一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒

Info

Publication number: CN114624448B
Application number: CN202210270435.2A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 王法龙; 刘聪; 杨涛; 冯玉静; 张广俊
Original assignee: Beijing Meilian Taike Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Meilian Taike Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-03-18
Also published as: CN114624448A

Abstract

本发明提供了一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒，所述的试剂盒中包括两种抗胶质纤维酸性蛋白抗体、链霉亲和素、生物素、碱性磷酸酶。本发明提供的方法使待测物形成“碱性磷酸酶‑抗体1‑抗原‑抗体2‑生物素‑链霉亲和素‑磁微粒”的树状结构。这种结构在磁微粒数量不变的情况下可以使信号值放大4倍；在信号值相同的情况下可以使磁微粒和抗体2用量减小4倍，节省大量生产成本。

Description

一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的试剂盒。

背景技术

创伤性脑损伤(TBI)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型TBI中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。TBI是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。

疑似TBI的医疗护理流程分为三步。首先是使用15分格拉斯哥昏迷量表(GCS)(美国外科医师学会创伤委员会，1997)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部CT扫描来可视化骨折和颅内病变。最后根据CT结果制定治疗方案、留院观察或出院。

目前，CT扫描是广泛用于帮助临床医师评估TBI的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，CT结果的正确性与CT设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度TBI(有时被称为“脑震荡”)的CT扫描结果呈阴性。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预。鉴于这些患者的CT扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间纤丝蛋白。人的GFAP由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。GFAP是一种神经系统特异性蛋白。其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响。

在TBI中，GFAP在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清GFAP显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。

现有技术已公开利用生物素-亲和素放大系统,将一组抗抗苗勒氏管激素(AMH)的第一抗体包被微孔板,同时用生物素标记第二抗体,与第一抗体-抗原复合物结合之后,再与生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物结合,加入发光底物,建立AMH酶促化学发光免疫分析方法,同时对这一体系的线性,灵敏度,特异度,稳定性,回收率等参数进行检测,并与常规ELISA法进行相比检测AMH浓度.结果显示该法线性检测范围为(0.42-50.00)U/mL,该体系稳定性好,灵敏度0.42U/mL,批内差异小于10.0％,批间差异小于10.0％,与常规ELISA对比差异有统计学意义。表明AMH的生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶促化学发光免疫分析易于操作,灵敏度高,价格低廉,适用于临床检测。^[1]

现有技术中还公开了建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心一步法测量人胰岛素化学发光免疫分析方法,并进行临床应用检测。方法包括:以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记另一株单克隆抗体。校准品与胰岛素国家标准品进行溯源,建立免疫分析方法,进行性能参数测试。收集40例正常人，12例1型，29例2型糖尿病人血清，统计整理参考值，并与国外同类试剂盒进行对比。结果显示该方法回收率94.13％，线性范围(2-200)μIU/mL,灵敏度0.05μIU/mL，批内、批间变异系数(CV)分别为2.87％-7.06％和3.24％-9.14％，与牛胰岛素，猪胰岛素，人前胰岛素原，胰岛素样生长因子Ⅰ交叉反应率分别为27.2％、19.7％、0.16％、0.07％，与C肽、胰高血糖素、生长抑素无交叉反应。该法与国外同类试剂盒同时检测40份正常人葡萄糖耐量试验血清，r为0.9869，37℃7d热稳定性良好。该法各项指标均满足临床检测要求，达到国外同类产品水平，反应快速，操作简单，便于临床检验应用。^[2]

对于生物素-亲和素放大系统在GFAP检测中的应用，现有技术尚未公开。

[1]薛燕平,王坤,李莉华,等.抗苗勒氏管激素的生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶促化学发光免疫分析方法的建立[J].临床血液学杂志(输血与检验),2019,32(01):80-83.

[2]吴在荣,王宏锐.链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用[J].放射免疫学杂志,2010(05):560-563.

发明内容

本发明的目的是为了能够快速、简便地检测人外周血中胶质纤维酸性蛋白的含量，而提供的一种操作简便、能为创伤性脑损伤提供辅助诊断的体外诊断试剂盒及其制备方法和使用。本试剂盒是一种采用磁微粒化学发光法定量分析人外周血胶质纤维酸性蛋白的水平，用于创伤性脑损伤等神经系统疾病的辅助诊断。本发明在原有发明基础上进行了改进，增加了“链霉亲和素-生物素”信号放大体系，增加了试剂盒的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本。

术语：

GFAP：胶质纤维酸性蛋白。

ALP：碱性磷酸酶。

本发明中生物素指维生素H，又称辅酶R，是水溶性维生素。

一方面，本发明提供了一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒。

具体地，所述的试剂盒中包括两种能与胶质纤维酸性蛋白结合的抗体1和抗体2，所述的抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列。

进一步具体地，所述的重链可变区和轻链可变区通过SEQ ID NO:6所示的柔性连接肽连接。

进一步具体地，所述的抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

进一步具体地，所述的试剂盒中还包括碱性磷酸酶、链霉亲和素和生物素。

优选地，所述的两种能与胶质纤维酸性蛋白结合的抗体与碱性磷酸酶或生物素偶联后使用。

所述的试剂盒中还包括：校准品和质控品。

所述的质控品为不同浓度的胶质纤维酸性蛋白抗原和缓冲液。

另一方面，本发明提供了前述用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒的制备方法。

所述的制备方法中包括：碱性磷酸酶和抗胶质纤维酸性蛋白抗体1的偶联；生物素和抗胶质纤维酸性蛋白抗体2的偶联；链霉亲和素标记磁微粒。

优选地，所述的抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列。

所述的抗体1与ALP质量比1:2-1:1；所述的生物素与抗体2的摩尔比为2:1-20:1。

所述的磁微粒与链霉亲和素质量比100:1-100:10。

所述的生物素间隔臂大于13埃。

本发明的有益效果：

本发明在原有工艺基础上加入了信号放大体系。原有的待测物结构“碱性磷酸酶-抗体1-抗原-抗体2-磁微粒”是一种单一的线性结构，一个抗原对应一个磁微粒。由于每个链霉亲和素都可以和4个生物素相连接，因此，新的待测物“碱性磷酸酶-抗体1＝抗原＝抗体2-生物素-链霉亲和素-磁微粒”是一种树状结构。这种结构在磁微粒数量不变的情况下可以使信号值放大4倍；在信号值相同的情况下可以使磁微粒和抗体2用量减小4倍，节省大量生产成本。在实际应用中会采用折中的方法，一般可以使信号值提高1-2倍、灵敏度提高30％-50％、生产成本下降5％-15％。本发明生物素-亲和素信号放大体系示意图见图4。

附图说明

图1为GFAP检测试剂条示意图。

图2为本发明的反应流程图(反应原理)。

图3为本发明的工艺流程图。

图4为生物素-亲和素信号放大体系示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基础实施例：胶质纤维酸性蛋白GFAP抗体制备

1.免疫动物

选择BALB/c小鼠作为宿主动物进行免疫，将1-5mg/mL的抗原(所述的抗原为胶质纤维酸性蛋白GFAP，所述的GFAP蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示)与弗氏完全佐剂(购自sigma，货号F5881)按体积比1:1混合后进行腹腔注射。在第14天、第35天将1-5mg/mL的抗原溶液与弗氏不完全佐剂(购自sigma，货号F5506)按体积比1:1混合后进行第二次、第三次免疫，在第56天左右将1-5mg/mL抗原溶于PBS进行第四次免疫。第61天左右即可进行细胞融合。期间，在第21天、42天分别进行两次滴度测试，观察免疫效果。

2.细胞融合及培养

将提取的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按计数比1:3混合。混合后加入RPMI1640培养基(购自sigma，货号R8758)定容至40mL，1500rpm离心5分钟后去上清。在37℃水浴融合，期间加入1mL等温的融合剂(购自sigma，货号11363735001)，静置1分钟后，加入缓慢加入2mL等温的RPMI 1640培养基。混匀后，1500rpm离心5分钟后去上清。将融合的细胞液放入有饲养细胞的培养盘中，在5％浓度的CO₂培养箱中37℃培养。

3.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

培养7天后，用HAT培养基(购自sigma，货号H0262)置换培养液，继续进行培养，14天后进行第二次筛选。第二次筛选采用有限稀释法对细胞进行3-4次稀释，选择阳性值最高的细胞进行克隆化，以得到合适的细胞株。

4.单克隆抗体制备

选择BALB/c小鼠作为宿主，每只小鼠进行0.5-1mL降植烷腹腔注射。在每只小鼠腹腔内接种2mL细胞浓度在200-300细胞/mL以内的对数期杂交瘤细胞。在14天后开始抽取小鼠腹水，每次抽取腹水应间隔3天，直至无腹水产生或小鼠转状态不良。使用盐析法及亲合法将小鼠腹水纯化为单克隆抗体。

本发明制备得到的抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。其中，抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列，所述的重链可变区和轻链可变区通过SEQID NO:6所示的柔性连接肽连接。

5.抗体亲和力检测

使用ForteBio Octet QKe生物分子相互作用分析仪，通过生物层干涉测量法检测上述抗体与抗原(所述的抗原为GFAP蛋白，所述的GFAP蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示)的亲和力(步骤详见说明书或参照Tobias等人，Biomolecular Binding Kinetic Assays inthe Octet Platform,Application Note 14,ForteBio,Div.of Pall Life Sciences,2013)。通过检测可知，本申请所述的抗体1的K_D(M)值为2.42E^-11，所述的抗体2的K_D(M)值为2.59E^-11。

实施例1一种胶质纤维酸性蛋白检测试剂盒

本试剂盒采用双抗体夹心法测定GFAP的含量。样本中GFAP和试剂A中的抗体1及试剂B中的GFAP抗体2结合，形成“三明治”夹心结构。加入过量的试剂C，试剂C中的链霉亲和素与试剂B中的生物素反应，生成“碱性磷酸酶-抗体1-GFAP-抗体2-生物素-链霉亲和素-磁微粒”复合物(图4)。经洗涤，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中GFAP的浓度成正相关。

1、试剂盒组分包括：检测试剂条、校准品、质控品、二维码，其中：

检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；

校准品由含有两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；

质控品由含有两个浓度的GFAP抗原和缓冲液配制而成；

二维码中录入了当批次的标准曲线。

具体如下：

2、试剂条组分

检测试剂条由试剂A、试剂B、试剂C、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。

试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的GFAP抗体溶液；

试剂B为含一定浓度生物素标记的GFAP抗体溶液；

试剂C为含一定浓度链霉亲和素标记的磁微粒；

清洗液用于反应过程的清洗；

发光底物为ALP催化的发光底物；

测读孔用于最终的检测读值。

GFAP检测试剂条示意图见图1，对应孔位主要组分见下表：

位置	检测试剂条组分	装量/数量
			1	【无】样本孔位	/
2	吸头	1个
			3	洗脱套	1个
4	清洗液	2.0mL
			5	发光底物	180μL
6	试剂B	60μL
			7	试剂C	60μL
8	试剂A	80μL
			9	【无】	/
10	【无】	/
			11	【无】反应孔位	/
12	【无】清洗孔位	/
			13	【无】清洗孔位	/
14	【无】清洗孔位	/
			15	测读孔	1个

3、生产工艺

3.1校准品、质控品的生产

将GFAP重组蛋白(序列如SEQ ID NO:1所示)作为校准品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度为20pg/mL、160pg/mL。

将GFAP重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合配制成质控品。浓度为40pg/mL。

缓冲液7的配方如下：

3.2试剂A的生产

以缓冲液8将酶标记GFAP抗体1偶联物充分混匀配制成试剂A，酶标记GFAP抗体1偶联物终浓度为0.8μg/mL，缓冲液8如下：

酶标记GFAP抗体1偶联物制备方法如下：

(1)抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体1摩尔比15:1-30:1的比例(即：1mg抗体1加入10-20μL 2IT溶液)将2IT溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5-20μL缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体1。

缓冲液1的配方如下：

缓冲液2的配方如下：

(2)碱性磷酸酶的活化

ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。ALP购自Sigma，货号为P0114。称取2-4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1-60:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5-34.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入10-50μL缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。

(3)抗体和ALP的连接

活化后的抗体1和活化后的ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与ALP质量比1:2-1:1的比例在抗体1溶液中的加入ALP溶液(即：1.0mg抗体1加入1.0-2.0mgALP)。震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时。

(4)抗体1偶联物的终止和纯化

抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL的马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入4-20μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体1加入10-50μL 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5-2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体即为酶标抗体1偶联物。

3.3试剂B的生产

以缓冲液8将酶标记GFAP抗体2偶联物充分混匀配制成试剂B，酶标记GFAP抗体2偶联物的终浓度为0.6μg/mL。

酶标记GFAP抗体2偶联物的制备方法如下：

(1)抗体2的除盐

抗体2使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。缓冲液10的配方如下：

将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10-20分钟。

(2)抗体2连接生物素

称取一定量的间隔臂大于13埃

的生物素，用缓冲液2溶解至5-20mM。按生物素与抗体2摩尔比2:1-20:1的比例(即：1mg抗体加入8-80μg生物素)，将生物素加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应30分钟。

(3)生物素抗体2连接物的纯化

使用缓冲液10作为PD10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15mL缓冲液10清洗PD10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的生物素抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6mL。当柱内液体完全进入柱料时，加入3mL缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6mL)。

将除盐后的生物素抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/mL，即酶标记GFAP抗体2偶联物。

3.4试剂C的生产

将链霉亲和素标记磁微粒作为试剂C的原料。以缓冲液9将其充分混匀配制成试剂C，缓冲液9的配方如下：

链霉亲和素连接磁微粒及纯化方法如下：

(1)磁微粒的清洗

选择0.5-3μm，脑核磁化强度60-100emu/g的磁微粒原料(购自BioMag，货号为BMS)充分混匀0.5-1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为5-10mg/mL。缓冲液11的配方如下：

将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用Sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。

一共重复三次重悬、分离步骤。

(2)磁微粒的重悬

使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/mL。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。

(3)链霉亲和素连接磁微粒

将一定量的链霉亲和素用缓冲液11溶解至1-5mg/mL。按磁微粒与链霉亲和素质量比100:1-100:10的比例(即1mg磁微粒加入10-100μg链霉亲和素)，将链霉亲和素加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀20分钟。

将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用缓冲液11溶解至4-15mg/mL。按磁微粒与EDC质量比100:15-100:50的比例(即1mg磁微粒加入150-500μgEDC)，将EDC加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀1.5小时。

(4)磁微粒的重悬

(5)链霉亲和素磁微粒连接物的封闭

在偶联反应完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/mL。缓冲液12的配方如下：

将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。

(6)链霉亲和素磁微粒连接物的清洗

在封闭完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/mL，缓冲液13的配方如下：

将清洗后的连接物充分混匀10分钟。

一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。

(7)在清洗完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/mL，混匀5分钟。再加入总体积1/20-1/50的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃-8℃环境中保存。缓冲液14的配方如下：

制备工艺流程图参考图3。

4、检测方法

采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：

免疫反应：如图1所示的检测试剂条，将30μL样本、50μL试剂B、50μL试剂A、50μL试剂C依次加入11号孔位，在37℃条件下反应20min。

磁分离及清洗：在12号孔位加入300μL清洗液(包括1.3-2.2g三羟甲基氨基甲烷、8.5-13.2g NaCl、0.7-1mL吐温20，定容至1000mL)，将含磁微粒的混合物(11号孔位内混合物)用磁力吸出11号孔位，在12号孔位脱磁。清洗2min后。在13、14号孔位分别进行1次磁分离及清洗。

读值：在15号孔位加入150uL发光底物(购自Sigma，货号为69086)，将含磁微粒的混合物(14号孔位内混合物)用磁力吸出14号孔位，在15号孔位脱磁。碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。

根据检测的校准品数值可获得一条GFAP浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。

样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。

反应流程图参考图2。

5、检测指标

5.1准确度

将浓度约为800pg/mL(允许偏差±10％)的GFAP液(A)加入到浓度范围0pg/mL-20pg/mL的样本B(人源外周血血清)中，所加入GFAP抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率R，其回收率在90％-110％范围内。

式中：

R—回收率；

V—样品A液的体积；

V0—血清样品B液的体积；

C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；

C0—血清样品B液的3次测量平均值；

CS—样品A液的浓度。

5.2空白限

将不含任何分析物的人源外周血血清样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值

和标准差(SD)。平均值

即为空白限，结果≤5pg/mL。

5.3线性区间

将接近线性区间上限的高值样本(300pg/mL的人源外周血血清)与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本(人源外周血血清)混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(y_i)。以稀释浓度(x_i)为自变量，以测定结果均值(y_i)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，在10-320pg/mL的线性区间内，相关系数r≥0.990。

式中：

r为相关系数；x_i为稀释比例；y_i为各个样本测定结果均值；

为稀释比例的均值；

为样本测定结果总均值。

5.4重复性

同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值

和标准差SD。按公式(3)计算变异系数(CV)，结果CV≤8％。

式中：s为样本测试值的标准差；

为样本测试值的平均值。

5.5批间差

用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值

和标准差SD，根据公式(3)得出变异系数(CV)，结果CV≤12％。

5.6特异性

在不含任何分析物的样本中加入200ng/mL的s-100β(苏州精密医疗科技有限公司，DCM19)，测3次取均值，按公式(4)计算结果，交叉反应率小于5％

RCR＝M/C×100％ (4)

式中：

RCR——交叉反应率；

M——交叉反应物测定结果均值；

C——交叉反应物标示值。

5.7校准品和质控品瓶间差

检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次，按公式(5)计算，测定结果的均值

与标准差(S1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次，计算结果的均值

和标准差(S2)，按照公式(6)、(7)计算瓶间重复性CV％，测量结果CV＜10％。

(说明：当S1<S2时，CV瓶间＝0)

式中：S为标准差。

实施例2.准确度检测

参照实施例1的方法，检测其准确度，检测结果如下表：

实施例3.空白限检测

参照实施例1的方法，检测其空白限，最终确定其空白限为4.28pg/mL，检测结果如下表：

实施例4.线性区间检测

参照实施例1的方法，检测其线性区间，检测结果如下表：

实施例5.重复性检测

参照实施例1的方法，检测其重复性，检测结果如下表：

实施例6.批间差检测

参照实施例1的方法，检测其批间差，检测结果如下表：

实施例7.特异性检测

参照实施例1的方法，检测其特异性，检测结果如下表：

实施例8.校准品和质控品瓶间差

参照实施例1的方法，检测校准品和质控品瓶间差，检测结果如下：

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京美联泰科生物技术有限公司

<120> 一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒

<130> 20220314

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

Met Glu Arg Arg Arg Ile Thr Ser Ala Ala Arg Arg Ser Tyr Val Ser

1 5 10 15

Ser Gly Glu Met Met Val Gly Gly Leu Ala Pro Gly Arg Arg Leu Gly

20 25 30

Pro Gly Thr Arg Leu Ser Leu Ala Arg Met Pro Pro Pro Leu Pro Thr

35 40 45

Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly Ala Leu Asn Ala Gly Phe Lys Glu

50 55 60

Thr Arg Ala Ser Glu Arg Ala Glu Met Met Glu Leu Asn Asp Arg Phe

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Ile Glu Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ala

85 90 95

Leu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Leu Arg Ala Lys Glu Pro Thr Lys Leu

100 105 110

Ala Asp Val Tyr Gln Ala Glu Leu Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Asp

115 120 125

Gln Leu Thr Ala Asn Ser Ala Arg Leu Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu

130 135 140

Ala Gln Asp Leu Ala Thr Val Arg Gln Lys Leu Gln Asp Glu Thr Asn

145 150 155 160

Leu Arg Leu Glu Ala Glu Asn Asn Leu Ala Ala Tyr Arg Gln Glu Ala

165 170 175

Asp Glu Ala Thr Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Ile Glu Ser

180 185 190

Leu Glu Glu Glu Ile Arg Phe Leu Arg Lys Ile His Glu Glu Glu Val

195 200 205

Arg Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Arg Gln Gln Val His Val Glu Leu

210 215 220

Asp Val Ala Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Lys Glu Ile Arg Thr

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Ala Met Ala Ser Ser Asn Met His Glu Ala Glu Glu Trp

245 250 255

Tyr Arg Ser Lys Phe Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ala Ala Arg Asn Ala

260 265 270

Glu Leu Leu Arg Gln Ala Lys His Glu Ala Asn Asp Tyr Arg Arg Gln

275 280 285

Leu Gln Ser Leu Thr Cys Asp Leu Glu Ser Leu Arg Gly Thr Asn Glu

290 295 300

Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Gln Glu Glu Arg His Val Arg Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Arg Leu Glu Glu Glu Gly Gln

325 330 335

Ser Leu Lys Asp Glu Met Ala Arg His Leu Gln Glu Tyr Gln Asp Leu

340 345 350

Leu Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys

355 360 365

Leu Leu Glu Gly Glu Glu Asn Arg Ile Thr Ile Pro Val Gln Thr Phe

370 375 380

Ser Asn Leu Gln Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Val Ser

385 390 395 400

Glu Gly His Leu Lys Arg Asn Ile Val Val Lys Thr Val Glu Met Arg

405 410 415

Asp Gly Glu Val Ile Lys Glu Ser Lys Gln Glu His Lys Asp Val Met

420 425 430

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

Glu Val His Leu Asp Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ile Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Val

20 25 30

Glu Met Lys Trp Val Lys Gln Arg Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Pro Cys Tyr Glu His Asn Ser Lys Thr Asn Trp Gln Gly Lys Ala

50 55 60

Arg Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Thr Ala Tyr Met Asp Leu Asn

65 70 75 80

Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Ile

85 90 95

Leu Ser Phe Ala Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

Glu Val His Leu Leu Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ile Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Val

20 25 30

Trp Met Lys Trp Glu Lys Gln Arg Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Pro Ile Tyr Glu His Asn Arg Lys Thr Arg Trp Gln Gly Lys Ala

50 55 60

Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser

65 70 75 80

Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Gln Val

85 90 95

Leu Ser Phe Ala Tyr Val Asp Phe Trp Ala Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Gly Ile Ser Arg Thr Ile Val His Pro

20 25 30

Ala Tyr Asn Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Cys Ser Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ile Ser Gly Asn Thr Leu Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg

65 70 75 80

Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Val Tyr Cys Arg Ser Gly Ser Asp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Gly Ile Ser Arg Thr Lys Gln His Pro

20 25 30

Ala Tyr Asn Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Cys Ser Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ser Gly Glu Thr Leu Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

Phe Ile Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Val Val Tyr Cys Arg Ser Gly Ser Asp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

100 105

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

Glu Val His Leu Asp Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ile Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Val

20 25 30

Glu Met Lys Trp Val Lys Gln Arg Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Pro Cys Tyr Glu His Asn Ser Lys Thr Asn Trp Gln Gly Lys Ala

50 55 60

Arg Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Thr Ala Tyr Met Asp Leu Asn

65 70 75 80

Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Ile

85 90 95

Leu Ser Phe Ala Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Gly Ile Ser Arg Thr Ile Val

145 150 155 160

His Pro Ala Tyr Asn Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Cys Ser Pro

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Val Tyr Cys Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

225 230 235

<210> 8

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

Glu Val His Leu Leu Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ile Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Val

20 25 30

Trp Met Lys Trp Glu Lys Gln Arg Pro Thr Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Pro Ile Tyr Glu His Asn Arg Lys Thr Arg Trp Gln Gly Lys Ala

50 55 60

Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Gly Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser

65 70 75 80

Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Gln Val

85 90 95

Leu Ser Phe Ala Tyr Val Asp Phe Trp Ala Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser

130 135 140

Leu Gly Asp Gln Ala Ser Val Ser Cys Gly Ile Ser Arg Thr Lys Gln

145 150 155 160

His Pro Ala Tyr Asn Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Cys Ser Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Gly Glu Thr Leu Phe Ser Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Val Val Tyr Cys Arg Ser Gly

210 215 220

Ser Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys

225 230 235

Claims

1.一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括两种能与胶质纤维酸性蛋白结合的抗体1和抗体2，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1包括SEQ IDNO:2所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区序列，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列；

所述的重链可变区和轻链可变区通过SEQ ID NO:6所示的柔性连接肽连接；

所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

所述的试剂盒中还包括碱性磷酸酶、链霉亲和素和生物素。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1或抗体2与碱性磷酸酶或生物素偶联后使用。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：校准品和质控品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品包括胶质纤维酸性蛋白抗原，由胶质纤维酸性蛋白抗原与缓冲液配制而成。

5.一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中包括：碱性磷酸酶和胶质纤维酸性蛋白抗体1的偶联；生物素和胶质纤维酸性蛋白抗体2的偶联；链霉亲和素连接磁微粒；

所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1包括SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列和SEQ IDNO:4所示的轻链可变区序列，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体2包括SEQ ID NO:3所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列；

所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1的序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体2的序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的胶质纤维酸性蛋白抗体1与碱性磷酸酶的质量比1:2-1:1；所述的生物素与抗体2的摩尔比为2:1-20:1；所述的磁微粒与链霉亲和素质量比100:1-100:10。