CN115015228A - 一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测血液中p‑tau181蛋白的化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的p‑tau181抗体、碱性磷酸酶标记的p‑tau181抗体、p‑tau181定标品。另外，本发明还公开了一种检测血液中p‑tau181蛋白的化学发光试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒具有反应时间短，操作方便，灵敏度高等优点。

Description

一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备 方法
技术领域
本发明属于检测领域，涉及一种生物诊断试剂，具体来说是一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法。
背景技术
2018年国际阿尔兹海默病协会发布的报告指出，全球有将近5000万的痴呆患者。痴呆的治疗目前尚无特效药物，早发现、早干预从而减慢痴呆进程具有重要临床意义。
AD典型的病理特征为老年斑的形成及神经细胞内神经纤维缠结，神经元或轴突的凋亡造成神经纤维缠结。生物学上，阿尔兹海默症患者神经元或轴突的凋亡是由于tau蛋白磷酸化造成的，因此磷酸化的tau蛋白直接与神经元或轴突的变性相关。Juan Lantero-Rodriguez等人报道，磷酸化的tau蛋白指标，例如p-tau181，p-tau217和p-tau231，不仅能在脑脊液和血清中检出，而且这些指标在AD的早期阶段就开始升高。同时Che-Chuan Yang等人报道，p-Tau181 水平与早期 AD 病人疾病严重程度的相关，正常组和阿尔兹海默症组完全不同，利用p-Tau181提高了AD诊断的灵敏度和特异性。Xue Wu等人利用SIMOA平台，对中国阿尔兹海默病患者血浆中的指标（p-tau181，Aβ42，Aβ40等）进行检测，证实了p-tau181在区分AD患者和正常人群比其他指标更具有诊断价值。
目前正电子发射型计算机断层显像(positron emission tomography，PET)和检测脑脊液中的标志物，成为诊断AD常用的技术手段。血液中AD标志物的含量要远低于脑脊液中的含量，所以在血液中检测AD标志物需要更灵敏的检测方法。血液中标志物的检测也有使用SIMOA单分子检测平台和Merck SMCxPRO单分子免疫检测平台进行检测。然而脑脊液的检查是一种有创检查，其他平台的检测费用高，操作复杂，限制了这些方法的大规模使用。由此，本发明的主要目的在于提供一种检测成本低，取样简单，灵敏度高，可以定量，操作简单和快速检测血液中p-tau181的化学发光试剂盒及其制备方法。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法，所述的这种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒及其制备方法要解决现有技术中在血液中检测AD标志物的灵敏度不高的技术问题。
本发明提供了一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的p-tau181抗体、碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体、p-tau181定标品。
进一步的，所述的血液为血清或血浆。
进一步的，所述的链霉亲和素包被的磁微粒为甲苯磺酰基磁微粒、羧基磁微粒或者醛基磁微粒中的任意一种，粒径为0.5-3um。
进一步的，所述的生物素标记的p-tau181抗体为识别p-tau181蛋白的单抗。
进一步的，所述的碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体为识别p-tau181蛋白的单抗。
进一步的，所述的p-tau181定标品为用定标品缓冲液将p-tau181抗原配制成一系列浓度。
本发明还提供了上述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）链霉亲和素包被磁珠的制备：
取羧基磁珠，用MES缓冲液清洗磁珠，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化30min，活化后MES缓冲液清洗三次，加入链霉亲和素，室温下反应16~24h，反应后，封闭液清洗三次，加入封闭液，室温反应2h，封闭后，用缓冲液清洗三次，再用缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到0.2mg/mL~0.8mg/mL作为R1；
MES缓冲液的浓度为10-100mM，pH5.5；
2）生物素标记的p-tau181抗体的制备：
配制生物素溶液，识别p-tau181蛋白的抗体储存溶液置换成PBS，在抗体溶液中加入配制好的生物素溶液，抗体：生物素的摩尔比为1:10~1:30，室温反应30min，反应结束后，脱盐柱去除未反应的biotin，测试蛋白浓度，再用缓冲液把生物素标记的p-tau181抗体稀释到0.2-5ug/mL作为R2；
3）碱性磷酸酶标记p-tau181抗体的制备：
识别p-tau181蛋白的抗体与活化剂1反应30min，引入巯基；碱性磷酸酶与活化剂2反应15min，引入马来酰亚胺基团；把带有巯基的p-tau181抗体和带有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶按照摩尔比为1:1混合，混合反应16~24h，得到碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体，用缓冲液把碱性磷酸酶标记p-tau181抗体稀释到0.1ug/mL~3ug/mL，作为试剂R3；p-tau181定标品的制备：
把p-tau181抗原用定标品稀释液配制成浓度为S1（0pg/mL）), S2（1.6pg/mL）, S3（3.1pg/mL）, S4（6.3pg/mL）, S5（12.5pg/mL）, S6（25pg/mL）,S7（62.5pg/mL）, S8（110pg/mL），分装，-20℃保存。
本发明首先制备化学发光试剂盒，主要包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素包被的识别p-tau181的抗体、碱性磷酸酶标记的识别p-tau181的抗体、p-tau181定标品的制备。然后利用全自动化学发光仪对p-tau181的定标品进行检测，绘制标准曲线，测试实际样本，计算实际样本p-tau181的浓度。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明所述试剂盒具有反应时间短，操作方便，灵敏度高等优点。
附图说明
图1 为实施例2得到的p-tau181的标准曲线图。
图2 为实施例3得到的p-tau181 化学发光免疫检测方法和酶联免疫检测方法测定结果的灵敏度比对图。
图3为实施例4得到的血清中AD组和正常人组p-tau181的箱式图。
具体实施方式
实施例1：检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒的制备方法。
1）链霉亲和素包被磁珠的制备：
取10mg羧基磁珠，用MES缓冲液清洗磁珠，加入0.5mL 10mg/mL1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和0.5mL 10mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺，活化30min，活化后MES缓冲液清洗三次。加入1mL 0.5mg/mL链霉亲和素，室温下反应18h。反应后，封闭液清洗三次，加入封闭液，室温反应2h。封闭后，用缓冲液清洗三次，再用缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到0.4 mg/mL作为R1。
MES缓冲液的浓度为10mM，pH5.5；
封闭液为常用的封闭溶液：BSA，pH 7.4。
2）生物素标记的p-tau181抗体的制备：
配制0.01M/L的生物素溶液，识别p-tau181蛋白一个位点的抗体储存溶液置换成PBS，在抗体溶液中加入配制好的生物素溶液，抗体：生物素的摩尔比为1:20，室温反应30min。反应结束后，脱盐柱去除未反应的biotin，测试蛋白浓度。再用缓冲液把生物素标记的p-tau181抗体稀释到1ug/mL作为R2。
3）碱性磷酸酶标记p-tau181抗体的制备：
识别p-tau181蛋白一个位点的抗体与2-亚氨基硫烷盐酸盐反应30min，引入巯基；碱性磷酸酶与Sulfo-SMCC反应15min，引入马来酰亚胺基团；把带有巯基的p-tau181抗体和带有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶按照摩尔比为1:1混合，反应18h，得到碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体。用缓冲液把碱性磷酸酶标记p-tau181抗体稀释到1ug/mL，作为试剂R3。
4） p-tau181定标品的制备
把p-tau181抗原用定标品稀释液稀释成S1（0pg/mL）), S2（1.6pg/mL）, S3（3.1pg/mL）, S4（6.3pg/mL）, S5（12.5pg/mL）, S6（25pg/mL）,S7（62.5pg/mL）, S8（110pg/mL）。分装，-20℃保存。
实施例2： p-tau181 化学发光免疫检测方法：
本发明以全自动化学发光分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50uL样品、50uL试剂R2，50uL试剂R1和50uL试剂R3，反应20min，磁分离清洗后，加入200uL底物，记录发光强度，测试p-tau181定标品，用发光值作为纵坐标，p-tau181浓度作为横坐标，绘制出标准曲线（见图1）。
实施例3：p-tau181 化学发光免疫检测方法和酶联免疫检测方法比对：
本发明以全自动化学发光分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50uL样品、50uL试剂R2，50uL试剂R1和50uL试剂R3，反应20min，磁分离清洗后，加入200uL底物，记录发光强度，测试p-tau181定标品，用发光值作为纵坐标，p-tau181浓度作为横坐标，绘制出标准曲线（见图2）。
按照酶联免疫测定试剂盒操作步骤，加入50uL标准品，标准品浓度为S1（0pg/mL）、S2（15.6pg/mL）、S3（31.2pg/mL）、S4（62.5pg/mL）、S5（125pg/mL）；再加入50uL pT181检测抗体，4℃反应18h。清洗，加入100uL 抗兔IgG-HRP反应30min，清洗，加入100uL 底物液，反应30min，再加入100uL 终止液，检测吸光度。以浓度值对应的吸光度或发光值与空白浓度对应的吸光度或发光值的比值为纵坐标，即Sn/S1，浓度值为横坐标，结果见图2。
从图中明显可以看出本发明的化学发光试剂盒的灵敏度明显高于酶联免疫测定试剂盒，且操作步骤简单，反应时间短。
实施例4：AD组和正常人血液中p-tau181 检测方法：
仪器依次加入50uL样品、50uL试剂R2，50uL试剂R1和50uL试剂R3，反应20min，磁分离清洗后，加入200uL底物，记录发光强度，测试p-tau181定标品，用发光值作为纵坐标，p-tau181浓度作为横坐标，绘制出标准曲线，测试12例AD血清样本和6例正常人血清样本，利用标准曲线计算出被测样本的p-tau181浓度，比较AD组和正常组结果的差别（见图3）。
结果显示，血清中AD组p-tau181的浓度明显高于正常组。

Claims (8)

1.一种检测血液中p-tau181蛋白的化学发光试剂盒，其特征在于包括：链霉亲和素包被的磁微粒、生物素标记的p-tau181抗体、碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体、p-tau181定标品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的血液为血清或血浆。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素包被的磁微粒为甲苯磺酰基磁微粒、羧基磁微粒或者醛基磁微粒中的任意一种，粒径为0.5-3um。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的生物素标记的p-tau181抗体为识别p-tau181蛋白的单抗。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体为识别p-tau181蛋白的单抗。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的p-tau181定标品为用定标品缓冲液将p-tau181抗原配制成一系列浓度。
7.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
链霉亲和素包被磁珠的制备：
取甲苯磺酰基磁珠、羧基磁珠或者醛基磁珠，用MES缓冲液清洗磁珠，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，活化30min，活化后采用MES缓冲液清洗三次，加入链霉亲和素，室温下反应16~24h，反应后，封闭液清洗三次，加入封闭液，室温反应2h，封闭后，用缓冲液清洗三次，再用缓冲液把链霉亲和素磁微粒稀释到0.2mg/mL~0.8mg/mL作为R1；
MES缓冲液的浓度为10-100mM，pH5.5；
2）生物素标记的p-tau181抗体的制备：
配制生物素溶液，识别p-tau181蛋白的抗体储存溶液置换成PBS，在抗体溶液中加入配制好的生物素溶液，抗体：生物素的摩尔比为1:10~1:30，室温反应30min，反应结束后，脱盐柱去除未反应的biotin，测试蛋白浓度，再用缓冲液把生物素标记的p-tau181抗体稀释到0.2-5ug/mL作为R2；
3）碱性磷酸酶标记p-tau181抗体的制备：
识别p-tau181蛋白的抗体与活化剂1反应30min，引入巯基；碱性磷酸酶与活化剂2反应15min，引入马来酰亚胺基团；把带有巯基的p-tau181抗体和带有马来酰亚胺基团的碱性磷酸酶按照摩尔比为1:1混合，混合反应16~24h，得到碱性磷酸酶标记的p-tau181抗体，用缓冲液把碱性磷酸酶标记p-tau181抗体稀释到0.1ug/mL~3ug/mL，作为试剂R3；
活化剂1为 2-亚氨基硫烷盐酸盐、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰巯基乙酸酯、2-巯基乙胺盐酸盐中的任意一种；
活化剂2为Sulfo-SMCC、 SM(PEG)12、 SM(PEG)24中的任意一种；
4）p-tau181定标品的制备：
把p-tau181抗原用定标品稀释液配制成浓度为S1——0pg/mL , S2 —— 1.6pg/mL,S3——3.1pg/mL , S4 ——6.3pg/mL , S5——12.5pg/mL , S6——25pg/mL , S7——62.5pg/mL , S8——110pg/mL，分装，-20℃保存。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的封闭液为BSA或者甘氨酸，pH7.0-7.6。
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