CN113397092B - 一种低敏性荞麦粉的制备方法 - Google Patents

一种低敏性荞麦粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低敏性荞麦粉的制备方法。本发明将荞麦、无菌水与种子液按照质量比为4:5:1制成荞麦面团。其中种子液是由Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalu活化培养后的菌液混合而成，再添加进荞麦面团中混合均匀。在30℃下恒温发酵16‑24h。发酵结束后，进行冷冻干燥，研磨成粉过80目筛，即得一种低变应原性荞麦粉。本发明的制备工艺简单，制备工艺可控性高，且生产得到的荞麦粉变应原性显著降低，通过免疫反应性测定，荞麦中的致敏性蛋白得到了有效的降解，尤其是分子量为15‑25kD的主要致敏性蛋白。

Description

一种低敏性荞麦粉的制备方法
技术领域
本发明涉及一种低敏性荞麦粉的制备方法，属于食品加工技术领域。
背景技术
荞麦是亚洲和中东欧洲的传统作物，但从上世纪开始，荞麦的种植面积开始下降，最近几年，荞麦作为一种健康绿色的食品广泛受到人们重视。荞麦中的蛋白质含量约占15-17％，富含18种氨基酸，其中人体所需的8种必需氨基酸组成合理、比例适宜。荞麦蛋白已经被证实在减肥、抗癌、抗衰老、抗疲劳等方面有良好的生理功能。但是，荞麦中部分蛋白能够引起人体免疫系统的过度免疫反应。根据2020年日本公布的荞麦过敏流行性调查，荞麦过敏率达到了2.2％，且常见于青少年。因此，荞麦过敏已经成为了公众关注的食品健康安全问题。荞麦中的过敏原主要为10-70kD之间的蛋白质，其致敏性不受限于患者的年龄、性别。而荞麦蛋白引起的过敏反应属于IgE介导的Ⅰ型变态反应，由相似或相同的IgE结合过敏表位引起。通常在接触过敏原2h内发生过敏发应，特定抗原的刺激淋巴细胞转化成浆细胞产生特异性IgE，特异性IgE能结合广泛分布在消化道黏膜、皮下结缔组织、呼吸道血管周围的效应细胞的受体，而后释放组胺、前列腺素D2、类胰蛋白酶等物质，从而引起人体呼吸道、皮肤、胃肠道等相应器官的过敏反应。主要临床症状包括口唇或面部肿胀，荨麻疹、咳嗽或哮喘、腹痛、呕吐或腹泻，严重时可引起喉头水肿或血压下降，危及患者生命。目前，通过免疫印迹反应已经识别出荞麦过敏原中的15种致敏蛋白，主要致敏蛋白主要分布在15-25kD之间，其中分子量为16kD蛋白与过敏性休克相关性。
由于荞麦过敏的问题，已经成为荞麦在食品加工领域中的潜在威胁。因此，需要制备一种低敏性荞麦粉以确保荞麦的安全性。荞麦过敏蛋白具有蛋白三维结构紧凑、抗蛋白酶水解，酸碱稳定性和热稳定性强等特点。研究表明机体内微生物失调是引起食物过敏反应的主要原因。发酵技术已被证明是降低食物变应原性的最佳方式之一，通过微生物代谢作用及自身酶系共同作用，降解过敏蛋白或破坏、掩盖、修饰过敏原表位，以降低食物的变应原性。同时，乳酸菌发酵不仅可以降低食物过敏原的变应原性，还可以通过调节肠道菌群的平衡，使其在宿主免疫系统的发育和调节中发挥作用，从而改变过敏性疾病的发病风险。目前，已有多种乳酸菌被应用与牛奶、小麦、花生等常见过敏原脱敏的研究中。但是利用乳酸菌协同酵母菌发酵以降低荞麦变应原性的研究则鲜有报道。
Weissella cibaria在河南酵子、新疆馕面团等多地酸面团中均有被鉴定分离，是谷物发酵中常见的优势乳酸菌之一。Weissella cibaria能够适应较为恶劣的生存环境并大量繁殖。随着发酵的进行Weissella cibaria能够产生大量有机酸降解发酵底物中的蛋白，并产生挥发性物质赋予发酵食品良好的风味。目前在许多常见的发酵食品中应用较为广泛，但是应用于发酵脱敏的研究则鲜有报道。
Wickerhamomyces anomalus在河南酵子、山东老面等常见酸面团中均有被鉴定分离，是谷物发酵中常见的酵母菌之一。Wickerhamomyces anomalus多用于酿造酒曲的生产，并能够产生醇类、醛类等风味物质改善发酵风味。在发酵过程中Wickerhamomycesanomalus能够减缓有机酸的生成速率，以防止过度酸化造成Weissella cibaria生长收到抑制。同时避免了过度酸化造成发酵品质降低的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何获得一种低敏性荞麦面粉的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种低敏性荞麦粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：无菌条件下，将Weissella cibaria菌落接种于无菌MRS液体培养基中活化培养得到菌液A；同样地，在无菌条件下，将Wickerhamomyces anomalus菌落接种于YPD液体培养基中活化培养得到菌液B；取菌液A和菌液B混合后离心、洗涤，加入无菌水制备成种子液；
步骤2：将荞麦粉过筛后加入灭菌发酵罐中，在无菌条件下，加入无菌水与步骤1所得的种子液与荞麦粉混合均匀后，将发酵罐放置在恒温培养箱中发酵，得到发酵后的荞麦面团；
步骤3：将发酵后的荞麦面团进行冷冻干燥、制粉，得到低敏性荞麦粉。
优选地，所述步骤1中Weissella cibaria菌落的活化培养的条件为：在37℃下，100r/min的恒温摇床中培养24h；所述Wickerhamomyces anomalus菌落的活化培养的条件为：在28℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。
优选地，所述步骤1中菌液A和菌液B按照Weissella cibaria和Wickerhamomycesanomalus接种比例为1:1的比例进行混合；所述离心的转速为5000r/min，温度为4℃，时间为10min；所述的洗涤具体为：分别采用无菌生理盐水洗涤2次和无菌水洗涤1次。
优选地，所述步骤1中制备所得的种子液中菌体总浓度为108CFU/mL。
优选地，所述步骤2中的过筛为过80目筛，所述发酵罐中加入的荞麦粉、无菌水与步骤1所得的种子液的质量比为4:5：1。
优选地，所述步骤2中发酵的条件为：在30℃下连续发酵16-24h。
优选地，所述步骤3中冷冻干燥的具体过程为：将发酵后的荞麦面团平铺在平板中，厚度为2cm，表面覆盖一层保鲜膜后放入-30℃的冰箱中进行预冻处理，预冻结束后，放入冷阱温度为-70℃，真空度为10Pa的真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h。
优选地，所述步骤3中的制粉具体为：采用真空粉碎机粉碎后过80目。
本发明的技术原理：
本发明利用Weissella cibaria协同Wickerhamomyces anomalus发酵荞麦面团，其主要目的是利用Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalus自身的酶系以及发酵过程中所产生的相应的代谢产物，将荞麦中的蛋白降解为小分子的多肽和氨基酸。通过修饰、破坏、掩藏过敏原表位达到对荞麦脱敏的效果。尤其是发酵16h后，SDS-PAGE的结果显示15kD-25kD之间的蛋白有明显的降解。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明的低敏性荞麦粉的制备方法制备所得的荞麦粉，相较于普通荞麦粉，其低变应原性更适合广大人群食用；且荞麦中许多大分子蛋白被降解为小分子蛋白、多肽或氨基酸，更利于人体对营养物质的消化吸收，在一定程度上丰富了低敏性荞麦粉的营养性；本发明所得低敏性荞麦粉均接受免疫反应测试，证实变应原性降低，与未发酵的荞麦粉相比变应原性降低了19.31～24.65％；
2.本发明的制备方法在发酵体系中添加了Wickerhamomyces anomalus能够减缓发酵过程中的有机酸生成；以防止荞麦面团中过多有机酸形成使Weissella cibaria生长受到抑制；同时避免因过度酸化使得荞麦蛋白过度降解，引起发酵品质的降低。
附图说明
图1为实施例1所得荞麦粉、实施例2所得荞麦粉和实施例3所得荞麦粉25kD及其以下荞麦蛋白的SDS-PAGE图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
以下各实施例所用的Weissella cibaria菌株和Wickerhamomyces anomalus菌株均采购于日本千叶的日本微生物保藏中心(JCM)；其中Weissella cibaria菌株的保藏编号为12495；Wickerhamomyces anomalus菌株的保藏编号为3586。以下各实施例所得低敏性荞麦粉，都需要进行免疫反应检测以判断荞麦粉中变应原性的变化情况。采用日本日水株式会社生产的荞麦过敏原快速检测试剂盒对发酵后的荞麦粉进行变应原性进行检测。
以下各实施例对发酵冻干后的荞麦粉、未发酵的荞麦粉变应原性的测定方法：称取1g发酵后荞麦于50mL离心管中，并加入19mL蛋白抽提液。放置在水浴摇床中以水浴温度25℃，100次/min做往复运动，抽提12-20h。之后以3000g的离心速度在室温下离心20min。取上清液弃沉淀，并对上清液进行过滤。取0.1mL过滤后的上清液加入1.9mL的稀释缓冲液混匀。取稀释混匀后的样品100μL,加入抗体酶标板中。静置于室温中反应1h，丢弃酶标板中液体。每孔加入250μL洗涤液，洗涤5次。每孔再加入100μL生物素结合抗体，静置于室温中反应1h。丢弃酶标板中的液体，重复洗涤步骤。每孔加入100μL酶(过氧化物酶)-链霉亲和素结合物，静置于室温下反应30min。反应结束后，丢弃酶标板中的液体，每孔加入100μL的显色剂并避光反应20min。反应结束后，每孔加入100μL反应终止液，并在酶标仪上于450nm波长下测量吸光度。同时以未发酵的荞麦粉作为对照组。并利用试剂盒中提供的标准品等梯度稀释制作标准曲线，带入ELISA Calc分析软件中进行4参数Logistic分析拟合标准曲线，计算出样品中的蛋白含量。通过下列公式计算IgE结合能力变化：
Figure BDA0003107717700000041
其中，c1：未发酵荞麦粉所测得蛋白含量；c2：发酵后荞麦粉所测得蛋白含量。
以下各实施例对发酵冻干后的荞麦粉、未发酵的荞麦粉SDS-PAGE的测定方法：所用条件为分离胶浓度10％，浓缩胶浓度5％，进行垂直电泳，分离胶电压为120V，浓缩胶电压为80V。先将样品稀释至相同浓度，按照体积比4:1加入上样缓冲溶液，混合沸水浴5min。加入10μL制备好的样品，并加入同体积的分子量标准蛋白作为标准。用考马斯亮蓝R250染色以显现蛋白条带，并用凝胶成像仪进行成像分析15kD-25kD蛋白降解规律。
实施例1
一种低敏性荞麦粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalus的种子液制备：无菌条件下，将Weissella cibaria菌落接种于50mL无菌MRS液体培养基中，并在37℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。同样地，在无菌条件下，将Wickerhamomyces anomalus菌落接种于50mL无菌YPD液体培养基，并在28℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。然后，按照Weissellacibaria和Wickerhamomyces anomalus接种比例1:1分别吸取菌液加入离心管中，以转速5000r/min，离心温度4℃，离心10min，分别用无菌生理盐水洗涤2次，无菌水洗涤1次。洗涤结束后，加入无菌水制备成种子液，种子液中菌体总浓度为108CFU/mL。
步骤2：荞麦面团的制备与接种：将荞麦粉过80目筛，放入已灭菌的发酵罐中。在无菌条件下，荞麦粉、无菌水与种子液按照质量比4:5:1混合均匀。
步骤3：荞麦面团的发酵：将发酵罐放置在30℃下的恒温培养箱中，连续发酵16h。当测得发酵面团的pH值为5.09，可溶性蛋白含量为0.340mg/mL时，即为发酵终点。
步骤4：荞麦面团的冷冻干燥、制粉：将发酵结束后的面团平铺在平板中，厚度为2cm，表面覆盖一层保鲜膜后放入-30℃的冰箱中进行预冻处理。预冻结束后，放入冷阱温度为-70℃，真空度为10Pa的真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。直至24h样品完全干燥后取出，采用真空粉碎机粉碎，并过80目筛后密封保存。
对上述制备所得的发酵荞麦粉进行变应原性测定，与未发酵荞麦粉相比，发酵16h后的荞麦变应原性降低了19.31％。
实施例2
一种低敏性荞麦粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalus的种子液制备：无菌条件下，将Weissella cibaria菌落接种于50mL无菌MRS液体培养基中，并在37℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。同样地，在无菌条件下，将Wickerhamomyces anomalus菌落接种于50mL无菌YPD液体培养基，并在28℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。然后，按照Weissellacibaria和Wickerhamomyces anomalus接种比例1:1分别吸取菌液加入离心管中，以转速5000r/min，离心温度4℃，离心10min，分别用无菌生理盐水洗涤2次，无菌水洗涤1次。洗涤结束后，加入无菌水制备成种子液，种子液中菌体总浓度为108CFU/mL。
步骤2：荞麦面团的制备与接种：将荞麦粉过80目筛，放入已灭菌的发酵罐中。在无菌条件下，荞麦粉、无菌水与种子液按照质量比4:5:1混合均匀。
步骤3：荞麦面团的发酵：将发酵罐放置在30℃下的恒温培养箱中，连续发酵20h。当测得发酵面团的pH值为4.55，可溶性蛋白含量为0.298mg/mL时，即为发酵终点。
步骤4：荞麦面团的冷冻干燥、制粉：将发酵结束后的面团平铺在平板中，厚度为2cm，表面覆盖一层保鲜膜后放入-30℃的冰箱中进行预冻处理。预冻结束后，放入冷阱温度为-70℃，真空度为10Pa的真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。直至24h样品完全干燥后取出，采用真空粉碎机粉碎，并过80目筛后密封保存。
对上述制备所得的发酵荞麦粉进行变应原性测定，与未发酵荞麦粉相比，发酵16h后的荞麦变应原性降低了20.4％。
实施例3
一种低敏性荞麦粉的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalus的种子液制备：无菌条件下，将Weissella cibaria菌落接种于50mL无菌MRS液体培养基中，并在37℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。同样地，在无菌条件下，将Wickerhamomyces anomalus菌落接种于50mL无菌YPD液体培养基，并在28℃下，100r/min恒温摇床中培养24h。然后，按照Weissellacibaria和Wickerhamomyces anomalus接种比例1:1分别吸取菌液加入离心管中，以转速5000r/min，离心温度4℃，离心10min，分别用无菌生理盐水洗涤2次，无菌水洗涤1次。洗涤结束后，加入无菌水制备成种子液，种子液中菌体总浓度为108CFU/mL。
步骤2：荞麦面团的制备与接种：将荞麦粉过80目筛，放入已灭菌的发酵罐中。在无菌条件下，荞麦粉、无菌水与种子液按照质量比4:5:1混合均匀。
步骤3：荞麦面团的发酵：将发酵罐放置在30℃下的恒温培养箱中，连续发酵24h。当测得发酵面团的pH值为3.95，可溶性蛋白含量为0.271mg/mL时，即为发酵终点。
步骤4：荞麦面团的冷冻干燥、制粉：将发酵结束后的面团平铺在平板中，厚度为2cm，表面覆盖一层保鲜膜后放入-30℃的冰箱中进行预冻处理。预冻结束后，放入冷阱温度为-70℃，真空度为10Pa的真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。直至24h样品完全干燥后取出，采用真空粉碎机粉碎，并过80目筛后密封保存。
对上述制备所得的发酵荞麦粉进行变应原性测定，与未发酵荞麦粉相比，发酵24h后的荞麦变应原性降低了24.65％。
未发酵荞麦粉、实施例1～3分别发酵16h、20h、24h所得的地敏性荞麦粉的SDS-PAGE结果如图1所示，从图1中可以看出未发酵的荞麦粉在15-25kD之间有大量的蛋白聚集，条带较宽，颜色较深。当发酵16h后，条带痕迹与未发酵荞麦粉相比条带颜色变浅，表明部分蛋白已被降解。发酵至第20h时，15-25kD条带颜色更浅，10-15kD蛋白条带颜色逐渐变深，表明该分子段的蛋白含量逐渐升高。当发酵24h时，15-25kD的蛋白条带几乎肉眼不可见，而10-15kD的蛋白条带颜色较发酵20h样品更深，表明该分子段蛋白含量进一步增加。
综上所述，本发明的一种低敏性荞麦粉，相较于普通荞麦粉，其低变应原性更适合广大人群食用。且荞麦中许多大分子蛋白被降解为小分子蛋白、多肽或氨基酸，更利于人体对营养物质的消化吸收，在一定程度上丰富了低敏性荞麦粉的营养性。本发明所得低敏性荞麦粉均接受免疫反应测试，证实变应原性降低。与未发酵的荞麦粉相比变应原性降低了19.31～24.65％。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：无菌条件下，将Weissella cibaria菌落接种于无菌 MRS 液体培养基中活化培养得到菌液A；同样地，在无菌条件下，将Wickerhamomyces anomalus菌落接种于 YPD 液体培养基中活化培养得到菌液B；取菌液A和菌液B按照Weissella cibaria和Wickerhamomyces anomalus接种比例 1:1的比例混合后离心、洗涤，加入无菌水制备成种子液；
步骤2：将荞麦粉过筛后加入灭菌发酵罐中，在无菌条件下，加入无菌水与步骤1所得的种子液与荞麦粉混合均匀后，将发酵罐放置在恒温培养箱中发酵，得到发酵后的荞麦面团；
步骤3：将发酵后的荞麦面团进行冷冻干燥、制粉，得到低敏性荞麦粉。
2.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中Weissella cibaria菌落的活化培养的条件为：在 37℃下，100r/min 的恒温摇床中培养 24h；所述Wickerhamomyces anomalus菌落的活化培养的条件为：在28℃下，100r/min 恒温摇床中培养 24h。
3.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中离心的转速为 5000r/min，温度为 4℃，时间为 10min；所述的洗涤为：分别采用无菌生理盐水洗涤2 次和无菌水洗涤 1 次。
4.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤 1 中制备所得的种子液中菌体总浓度为 108CFU/mL。
5.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤 2 中的过筛为过 80 目筛，所述发酵罐中加入的荞麦粉、无菌水与步骤1所得的种子液的质量比为4:5：1。
6.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤 2 中发酵的条件为：在 30℃下连续发酵 16-24h。
7.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤 3 中冷冻干燥的具体过程为：将发酵后的荞麦面团平铺在平板中，厚度为 2cm，表面覆盖一层保鲜膜后放入-30℃的冰箱中进行预冻处理，预冻结束后，放入冷阱温度为-70℃，真空度为 10Pa 的真空冷冻干燥机中冷冻干燥 24h。
8.如权利要求1所述的低敏性荞麦粉的制备方法，其特征在于，所述步骤 3 中的制粉具体为：采用真空粉碎机粉碎后过 80 目。
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