JP2012240940A - ペプチド提示微粒子の製造方法 - Google Patents
ペプチド提示微粒子の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012240940A JP2012240940A JP2011110679A JP2011110679A JP2012240940A JP 2012240940 A JP2012240940 A JP 2012240940A JP 2011110679 A JP2011110679 A JP 2011110679A JP 2011110679 A JP2011110679 A JP 2011110679A JP 2012240940 A JP2012240940 A JP 2012240940A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- group
- malaria
- microparticles
- falciparum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 title abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 41
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 40
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 claims description 33
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 31
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 29
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 claims description 22
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 claims description 22
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000002476 Falciparum Malaria Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011336 Plasmodium falciparum malaria Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000355 1,3-benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 claims description 3
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical group C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 claims description 3
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 2
- 241000828395 Thermogemmatispora foliorum Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- -1 methacryloyl Chemical group 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N ethyl propionate Chemical compound CCOC(=O)CC FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XFCMNSHQOZQILR-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethoxy]ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOCCOC(=O)C(C)=C XFCMNSHQOZQILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N Gly-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- WUFYAPWIHCUMLL-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WUFYAPWIHCUMLL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N Phe-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- XZQYIJALMGEUJD-OEAJRASXSA-N Phe-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XZQYIJALMGEUJD-OEAJRASXSA-N 0.000 description 2
- GTMSCDVFQLNEOY-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N GTMSCDVFQLNEOY-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 2
- 101900260139 Plasmodium falciparum Enolase Proteins 0.000 description 2
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 2
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 2
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WWAQEUOYCYMGHB-FXQIFTODSA-N Pro-Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WWAQEUOYCYMGHB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N Pro-Asn-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N abcn Chemical compound C1CCCCC1(C#N)N=NC1(C#N)CCCCC1 KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- TUIWMHDSXJWXOH-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethylhexan-3-one Chemical compound CC(C)CC(=O)C(C)C TUIWMHDSXJWXOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- SDLXJEGFXLWNET-DKWTVANSSA-N 3-aminopropanoic acid;(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound NCCC(O)=O.SC[C@H](N)C(O)=O SDLXJEGFXLWNET-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169678 Histidine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 101001131829 Homo sapiens P protein Proteins 0.000 description 1
- 241000511976 Hoya Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000224024 Plasmodium chabaudi Species 0.000 description 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 1
- 206010035503 Plasmodium vivax infection Diseases 0.000 description 1
- 201000009976 Plasmodium vivax malaria Diseases 0.000 description 1
- 241000223830 Plasmodium yoelii Species 0.000 description 1
- 206010037075 Protozoal infections Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 241000584036 Selenidium vivax Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010057179 Toxoplasma infections Diseases 0.000 description 1
- 208000005469 Vivax Malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011276 addition treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000047119 human OCA2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- VHRYZQNGTZXDNX-UHFFFAOYSA-N methacryloyl chloride Chemical compound CC(=C)C(Cl)=O VHRYZQNGTZXDNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
【課題】ペプチド結合物質の検出に使用可能なペプチドを表面に提示した微粒子を効率よく製造できる技術を提供すること。
【解決手段】下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法。
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYは、アルキル基、芳香族基、などを示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていても良い。
【選択図】図１２
【解決手段】下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法。
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYは、アルキル基、芳香族基、などを示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていても良い。
【選択図】図１２
Description
本発明は、ペプチド提示微粒子の製造方法、特に、試料中の抗体価を測定するためのペプチド抗原を提示した微粒子の製造方法に関する。より詳しくは、ヒトおよび他の動物の血液試料中のマラリア原虫に対する抗体に結合することができるペプチドを含んだ微粒子の製造方法に関する。
マラリアは地球上に於いて最も重大な原虫感染症の一つである。熱帯地域と亜熱帯地域の流行地域を中心に、毎年3億人の感染者と200万人以上の死亡者が報告されている。また近年は、地球規模での経済活動の拡大により人や物資の移動が盛んになってきている。これに伴い、日本人渡航者が流行地で感染する例や、流行地から日本への入国者が国内で発症する輸入マラリアの症例が、1980年代より急激に増えている。このためマラリア対策は、流行地のみならず日本に於いても緊急の課題となっている。
ヒトにマラリアを引き起こすPlasmodium属の寄生原虫は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、および一部のサルマラリア（Plasmodium knowlesiなど）の５種類である。原虫を媒介する蚊の刺咬により体内に入ったマラリア原虫は血中から速やかに肝細胞に侵入し（一次肝臓内ステージ）、肝細胞内で分裂・増殖してから血中に放出され、赤血球内に侵入して分裂増殖を繰り返し（赤血球内サイクル）、増殖した原虫は他の蚊によってさらに伝搬されてゆく。マラリアによる発熱の症状は赤血球内サイクルによって引き起こされる。特に熱帯熱マラリアは他の４種に比較して治療が遅れると重症化と死亡の危険をもたらす。
またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。流行地に於ける近年の感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告（1996 & 1998）によると地球温暖化の場合２℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。そのため、第二次大戦後にDDT散布と衛生対策によって根絶したはずの日本を含む温帯地域においても、マラリア再流行が懸念されている。
したがって、マラリア感染を検出したりマラリアワクチンの効果を確かめたりするための血清抗体価を簡便に測定できる試薬の開発が求められている。
したがって、マラリア感染を検出したりマラリアワクチンの効果を確かめたりするための血清抗体価を簡便に測定できる試薬の開発が求められている。
血液中の抗マラリア原虫抗体を検出する方法として、マラリア原虫破砕物を抗原として吸着させた微粒子を用いる方法がある。
従来のヒト血清中やヒト血漿中の抗体検出を行うための免疫検査を指向した抗原吸着微粒子の作製には、Poplanichら（非特許文献１）の報告にあるようにsoap-free polymerizationによって作製されたpoly(stylene-co-acrylic acid)微粒子への病原微生物の破砕溶液を物理吸着させる方法が用いられてきた。
そして、この方法を利用した抗体検出キットの市販例としては栄研化学のトキソプラズマ感染検査キット（ポリスチレン微粒子への吸着；非特許文献２〜４）が知られている。
従来のヒト血清中やヒト血漿中の抗体検出を行うための免疫検査を指向した抗原吸着微粒子の作製には、Poplanichら（非特許文献１）の報告にあるようにsoap-free polymerizationによって作製されたpoly(stylene-co-acrylic acid)微粒子への病原微生物の破砕溶液を物理吸着させる方法が用いられてきた。
そして、この方法を利用した抗体検出キットの市販例としては栄研化学のトキソプラズマ感染検査キット（ポリスチレン微粒子への吸着；非特許文献２〜４）が知られている。
soap-free polymerizationによって重合した有機高分子微粒子ではなく、無機微粒子への病原微生物の破砕溶液を物理吸着させる方法もある。マラリアの感染検査ではないが、HOYAのデング熱感染検査キット（リン酸カルシウム微粒子への吸着；非特許文献５，６）が知られている。
しかし、従来の免疫検査を指向して抗原を物理吸着させた微粒子には、抗原に病原体そのものが必要であり低温保管の必要性や限られた感染症にしか適応できないこと、病原体破砕物という混合物を用いるため非特異反応（擬陽性反応）が起きやすいこと、微粒子と抗原の結合に物理吸着を用いているためpHの最適化を必要としpH変化や常温保管に弱く安定性が悪いこと、ソープフリー重合で作製したポリスチレンラテックスのため実際にはpoly(styrene-co-acrylic acid)と官能基を有しながら不安定な物理吸着のみ用いて化学結合を行っていないこと、リン酸カルシウム微粒子の場合はリン酸カルシウムの溶解しにくいpHや溶液組成においてのみ抗原を物理吸着することが可能であること、の点で問題があった。
一方、物理吸着ではなく化学結合によるペプチドや酵素を結合した微粒子の作製法が報告されている。一つは非特許文献７にあるよう抗原モノマー（抗原ペプチドのN端をmethacryloyl化）と微粒子形成モノマー（例えばDiethylene Glycol Dimethacrylate, 2G）を直接共重合する方法がある。しかし、従来の化学結合によってペプチドや酵素を結合させた微粒子は、抗原モノマーが重合反応時の溶媒（ethylpropionateやethylacetateなど疎水性有機溶媒が最適）に溶解できない場合は均質な球状微粒子が得られない、実際の免疫反応も患者と正常血清の判別する凝集像が得られないという問題があった。すなわち抗原ペプチドに一般的な、水溶性の高い側鎖を有するアミノ酸残基が多く含まれるペプチド配列を用いて直接抗原微粒子を重合させるのは困難であった。
これまでに、本発明者は、マラリア原虫由来の抗原を用いたマラリア感染診断材やマラリアワクチン（特許文献１）、マラリア抗原ペプチドの製造法（特許文献２）、マラリア抗原を内包させた微粒子の製造法（特許文献３）を報告している。
しかしながら、マラリア抗原を表面に化学的に結合した微粒子を用いてマラリア抗原に対する抗体を検出する技術については報告がない。
しかしながら、マラリア抗原を表面に化学的に結合した微粒子を用いてマラリア抗原に対する抗体を検出する技術については報告がない。
Anal. Chem. 2007, 79, 4690-4695
坪田宣之と小澤光 寄生虫学雑誌 1977, 26, 276-285
坪田宣之ら 寄生虫学雑誌 1977, 26, 286-290
小林昭夫ら 寄生虫学雑誌 1977, 26, 175-180
山本らJ. Clin. Virol. 2000, 19, 195-204
山本らJ. Virol. Methods 2002, 104, 195-201
Safranjら Radiat. Phys. Chem. 1995, Vol. 46, No. 2, pp. 203-206
本発明は、ペプチド結合物質の検出に使用可能なペプチドを表面に提示した微粒子を効率よく製造できる技術を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供し、得られた重合体にペプチドを導入することによりペプチド提示微粒子を効率よく製造することができ、得られたペプチド提示微粒子を用いることにより、ペプチドおよびこのペプチド配列を含む蛋白質に対する抗体を効率よく凝集反応により検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
[１]下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法。
[２]ペプチドが熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼ由来ペプチドである、[１]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[３]エノラーゼ由来ペプチドが配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列を含む、[２]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[４]微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリア、またはサルマラリアの診断薬である、[２]または[３]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[５]微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫に由来する抗原に対する抗体価検査材料である、[２]または[３]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[１]下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法。
[２]ペプチドが熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼ由来ペプチドである、[１]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[３]エノラーゼ由来ペプチドが配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列を含む、[２]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[４]微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリア、またはサルマラリアの診断薬である、[２]または[３]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
[５]微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫に由来する抗原に対する抗体価検査材料である、[２]または[３]に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
本発明の方法により、ペプチド提示微粒子を効率よく製造することができ、得られたペプチド提示微粒子を用いることにより、ペプチドおよびこのペプチド配列を含む蛋白質、アミノ酸残基が変異した相同性のあるペプチド配列を含む蛋白質に対する、抗体などのペプチド結合物質を効率よく検出することができる。
本発明の方法は、下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法である。
Xはハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）または-OYを示し、ここでYは、アルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）で置換されていても良い。
前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基及びｓｅｃ−ブチル基などの基が挙げられ；前記芳香族基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基及び２−ナフチル基などの基が挙げられ；前記ピリジル基としては、例えば、２−ピリジル基、３−ピリジル基及び４−ピリジル基などの基が挙げられ；前記キノリル基としては、例えば、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基及び８−キノリル基などの基が挙げられ；前記ベンゾオキサゾール基としては、例えば、２−ベンゾオキサゾール基などが挙げられ；前記ベンゾチアゾール基としては、例えば、２−ベンゾチアゾール基などが挙げられ；前記ベンゾトリアゾール基としては、例えば、１−ベンゾトリアゾール基などが挙げられる。これらのうち、フェニル基、３−ピリジル基、８−キノリル基、スクシンイミド基（OSu基）、２−ベンゾチアゾール基、及び１−ベンゾトリアゾール基（OBt基）が、活性エステルの活性がより高いという点で好ましい。
重合方法は、通常のラジカル重合によって行うことができ、放射線（γ線）や重合開始剤を用いる方法が例示される。
重合開始剤としては、公知のラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、アゾビスイソブチロニトリル (AIBN)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)（ABCN）などを使用することができる。
重合開始剤としては、公知のラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、アゾビスイソブチロニトリル (AIBN)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)（ABCN）などを使用することができる。
溶媒は、各化合物を溶解し、重合反応を進行させうる溶媒であればよいが、例えば、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酢酸、プロピオン酸、アセトン、メチルエチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、およびこれらの混合溶媒などが例示される。
重合反応によって得られる微粒子の粒径は０．１〜１０μｍが好ましい。なお、化合物（I）、化合物（II）はそれぞれ複数種類重合に使用してもよい。
微粒子表面へのペプチドの導入は微粒子の活性エステル基の-OYとペプチドのアミノ基の反応により行うことができる。ペプチドのアミノ基は末端のアミノ基でもよいし、側鎖のアミノ基でもよい。また、ペプチドの末端にリンカーやキャリアーを付加し、リンカーやキャリアーのアミノ基と結合させてもよい。
微粒子へのペプチドの導入割合は好ましくは重量比として０．０５〜２％である。
微粒子へのペプチドの導入割合は好ましくは重量比として０．０５〜２％である。
抗原ペプチドの配列には、好ましくは５〜１５０残基のペプチドが好ましい。合成や精製の簡便さからは、より好ましくは５〜５０残基であり、さらに好ましくは８〜３０残基である。
その配列は特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができるが、標的分子に結合するペプチドの配列を含むことにより、微粒子を標的分子の検出に使用できるため好ましい。標的分子としては、受容体、酵素、抗体などが挙げられ、ペプチドとしてはリガンド、ホルモン、抗原ペプチドなどが挙げられる。
ペプチドは蛍光物質等で標識されたものでもよいし、非天然アミノ酸を含むものでもよい。
その配列は特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができるが、標的分子に結合するペプチドの配列を含むことにより、微粒子を標的分子の検出に使用できるため好ましい。標的分子としては、受容体、酵素、抗体などが挙げられ、ペプチドとしてはリガンド、ホルモン、抗原ペプチドなどが挙げられる。
ペプチドは蛍光物質等で標識されたものでもよいし、非天然アミノ酸を含むものでもよい。
抗原としては、熱帯熱マラリア原虫への感染診断や原虫抗原への抗体価測定を行うためには、熱帯熱マラリア原虫由来の部分ペプチドを含むペプチドとすることができる。
熱帯熱マラリア原虫由来の部分ペプチドとしては、熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼの部分ペプチドが例示される。熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に例示する（図１）。
熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼの部分ペプチドとしては特に制限されるものではないが、以下の３種類のペプチドが例示される。
GL16：Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu Leu（配列番号２）
AD22：Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp（配列番号３）
LN17：Leu Gly Asn Asn Ala Val Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Leu Gln Leu Asn（配列番号４）
熱帯熱マラリア原虫由来の部分ペプチドとしては、熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼの部分ペプチドが例示される。熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に例示する（図１）。
熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼの部分ペプチドとしては特に制限されるものではないが、以下の３種類のペプチドが例示される。
GL16：Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu Leu（配列番号２）
AD22：Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp（配列番号３）
LN17：Leu Gly Asn Asn Ala Val Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Leu Gln Leu Asn（配列番号４）
同様にしてhistidine rich protein II (HRP-2)の部分配列を用いたり、乳酸脱水素酵素(pLDH)の部分配列を用いたりすることによっても、熱帯熱マラリア原虫への感染診断や原虫抗原への抗体価測定は容易に実施が可能である。抗原の配列は類似しているので、さらに同様にして、その他のヒトに感染する三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、および一部のサルマラリアについても、感染診断や原虫抗原への抗体価測定は容易に実施が可能である。
また、微粒子に導入するペプチドは複数の配列が直線状または分岐鎖状に連結されたものでもよい。ペプチド配列の連結に使用し得るキャリアー分子の一例として、破傷風トキソイド、オボアルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニン等のような天然タンパク質が挙げられる。キャリアーがヘモシアニンである場合は、例えばBoquetらの方法（P. Boquet et al, Molecular Immunology (1988) vol. 19，pp. 1441-1549）によって、ペプチドおよびキャリヤーそれぞれのアミノ基同士をグルタールアルデヒドで結合させることもできる。例えばMAP（multiple antigenic peptide）またはリジンデンドリマーと呼ばれる合成高分子キャリアーも使用可能である。
MAPまたはリジンデンドリマーと呼ばれる合成高分子キャリアーを用いた多量体ペプチドの合成は、例えばTam の方法が挙げられる（James P. Tam., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) vol. 85、 5409-5413）。公知の合成法により、βアラニン-システイン（S-アセトアミドメチル）のジペプチドを固定した樹脂にリジンをステップワイズに反応結合させることにより目的とする架橋体を調製することができる。すなわち、ジペプチドにリジンひとつの結合体は2量体の分岐ペプチドとして、さらにリジンを反応させて得られるリジン3残基の結合体は4量体の分岐ペプチドとして、さらにリジンを反応させて得られるリジン7残基の結合体は8量体の架橋体として使用することができる。また8量体はシステイン残基のアセトアミドメチル基をヨウ素で酸化的に脱保護し、ジスルフィド結合を形成させることでも得ることができる。これら架橋体に目的とするペプチドの構成アミノ酸を通常の方法により順次反応結合させることにより多量体ペプチドを合成することができる。
本発明の微粒子を用いることにより、試料中のペプチド結合物質を検出することができる。
例えば、ペプチドを熱帯熱マラリアのエノラーゼ部分ペプチドとすることにより、被験者の血液試料中の抗エノラーゼ抗体を検出でき、マラリアの診断・感染履歴の調査やワクチン投与後の抗体価維持の確認を検査する材料として利用することができる。
例えば、ペプチドを熱帯熱マラリアのエノラーゼ部分ペプチドとすることにより、被験者の血液試料中の抗エノラーゼ抗体を検出でき、マラリアの診断・感染履歴の調査やワクチン投与後の抗体価維持の確認を検査する材料として利用することができる。
検出方法は結合反応を検出する方法である限り特に制限されないが、ELISA法、凝集反応によるアッセイ、蛍光検出法、発光検出法、可視紫外吸光検出法、電気化学的検出法などが挙げられる。この中では凝集反応によるアッセイが好ましい。
凝集反応によるアッセイの原理を図６に示す。ペプチド抗原が抗体と反応することにより微粒子が凝集し、目視により抗体の検出が可能である。
凝集反応によるアッセイの原理を図６に示す。ペプチド抗原が抗体と反応することにより微粒子が凝集し、目視により抗体の検出が可能である。
検出できる抗体は、微粒子に導入されたペプチド配列への抗体（抗ペプチド抗体、例えば抗AD22抗体）、またはこのペプチド配列を含む蛋白質（抗蛋白質抗体、例えばAD22配列を認識する抗Plasmodium falciparumエノラーゼ抗体）、さらにまたはアミノ酸残基が変異した相同性のあるペプチド配列や蛋白質（近縁種の蛋白質やペプチド配列から作成された抗体、例えばAD22配列を認識する抗Plasmodium bergheiエノラーゼ抗体）に対する抗体が挙げられる。
アミノ酸残基が変異した相同性のあるペプチド配列の例としては、例えば近縁種の蛋白質に由来する配列、突然変異した蛋白質に由来する配列、相同性の高い（アミノ酸の相同性＞６０％）蛋白質に由来するアミノ酸配列が挙げられる。近縁種のエノラーゼの配列例をGL16、AD22、LN17に対してそれぞれ図３、４、５に示す。例えば、微粒子に導入されたPlasmodium falciparumのエノラーゼに由来するAD22ペプチド配列によって、Plasmodium bergheiへの抗体（抗Pb エノラーゼ抗体）を検出することなどが可能である。
＜ポリマーの重合＞
下記化合物（i）（市販品、中村化学製）０．４ｇと化合物（ii）（メタクリル酸クロリドとHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）の反応生成物を使用）を０．１ｇを溶媒プロピオン酸エチル１０ｍＬ中、室温２５℃で３時間γ線照射下（３０ｋＧｙ）で反応させ、重合反応を行った。
下記化合物（i）（市販品、中村化学製）０．４ｇと化合物（ii）（メタクリル酸クロリドとHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）の反応生成物を使用）を０．１ｇを溶媒プロピオン酸エチル１０ｍＬ中、室温２５℃で３時間γ線照射下（３０ｋＧｙ）で反応させ、重合反応を行った。
微粒子表面に結合させるペプチドは以下のものを用いた。
GL16（分子量0.17 kD）Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu
Leu（配列番号２）
LN17G（分子量0.19 kD）Leu Gly Asn Asn Ala Val Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Leu Gln Leu Asn Gly（配列番号５）
AD22（MAP化した分子量として1.4 kD）Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp（配列番号３）
これらの抗原ペプチドは手動合成装置を用いて合成し、SepPack（waters社製の使い捨てＯＤＳカラム）にて精製した。
(AD22)4-MAP (MAP = multiple antigenic peptide)）（分子量1.4kD）（図２）は抗原ペプチドと同様に合成と精製を行った。
GL16（分子量0.17 kD）Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Asn Ala Asn Glu Ala Leu Asp Leu
Leu（配列番号２）
LN17G（分子量0.19 kD）Leu Gly Asn Asn Ala Val Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Leu Gln Leu Asn Gly（配列番号５）
AD22（MAP化した分子量として1.4 kD）Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp（配列番号３）
これらの抗原ペプチドは手動合成装置を用いて合成し、SepPack（waters社製の使い捨てＯＤＳカラム）にて精製した。
(AD22)4-MAP (MAP = multiple antigenic peptide)）（分子量1.4kD）（図２）は抗原ペプチドと同様に合成と精製を行った。
＜ペプチドの導入＞
続いて、活性エステル基（スクシンイミド基）を介して300mgの微粒子表面に熱帯熱マラリア原虫の抗原ペプチド（実施例１：LN17G、実施例２：(AD22)4-MAP）3mgを化学結合させた検査材料を作製した。
このとき化学結合には３７℃４時間、さらに物理吸着に３７℃２０時間の条件にて反応させた。
続いて、活性エステル基（スクシンイミド基）を介して300mgの微粒子表面に熱帯熱マラリア原虫の抗原ペプチド（実施例１：LN17G、実施例２：(AD22)4-MAP）3mgを化学結合させた検査材料を作製した。
このとき化学結合には３７℃４時間、さらに物理吸着に３７℃２０時間の条件にて反応させた。
＜ペプチドが導入されたことの確認＞
上記ペプチドの化学結合に伴って遊離するHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）量をHPLCによってモニターすることで、微粒子表面への飽和化学結合量（０−４時間）と飽和物理吸着（０−２４時間）を判断した。結果を図１０，１１に示す。その結果、エノラーゼ全長の場合（比較例２：図８）と異なりペプチドは安定性が比較的高く、さらに直鎖構造よりもMAPによる分岐構造の方が安定性が比較的高く、３７℃２４時間の条件でも免疫活性を失わないことがわかった。
上記ペプチドの化学結合に伴って遊離するHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）量をHPLCによってモニターすることで、微粒子表面への飽和化学結合量（０−４時間）と飽和物理吸着（０−２４時間）を判断した。結果を図１０，１１に示す。その結果、エノラーゼ全長の場合（比較例２：図８）と異なりペプチドは安定性が比較的高く、さらに直鎖構造よりもMAPによる分岐構造の方が安定性が比較的高く、３７℃２４時間の条件でも免疫活性を失わないことがわかった。
＜比較例１＞
化合物（ii）の活性エステル基にGL16を結合させて得られたモノマーと化合物（i）を共重合させて抗原提示微粒子を得た。しかし、抗原モノマーは溶媒にとけにくかったため、得られた微粒子は均質な球状微粒子とはならなかった（データは示さず）。
化合物（ii）の活性エステル基にGL16を結合させて得られたモノマーと化合物（i）を共重合させて抗原提示微粒子を得た。しかし、抗原モノマーは溶媒にとけにくかったため、得られた微粒子は均質な球状微粒子とはならなかった（データは示さず）。
＜比較例２＞
ペプチドの代わりに、組み替えエノラーゼ全長（分子量４７ｋD）を微粒子100mg当たり0.6mg加え、３７℃４時間、４℃２０時間の条件にて反応させて微粒子の表面にエノラーゼ全長を化学結合させた。このときHPLCによってHOSu量をモニターすることで微粒子表面への結合の飽和を判断した（図８）。
ペプチドの代わりに、組み替えエノラーゼ全長（分子量４７ｋD）を微粒子100mg当たり0.6mg加え、３７℃４時間、４℃２０時間の条件にて反応させて微粒子の表面にエノラーゼ全長を化学結合させた。このときHPLCによってHOSu量をモニターすることで微粒子表面への結合の飽和を判断した（図８）。
＜凝集試験＞
ウサギ抗エノラーゼ血清（ウサギへ組み換え体の熱帯熱マラリア原虫エノラーゼを免疫後、採血して調製した血清）およびウサギプレ免疫血清（同じウサギで免疫前に採血して調整した血清）を判別する凝集試験を行った。
９６穴プレートに、８個のウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１６〜２０４８倍希釈したウサギ抗エノラーゼ血清またはウサギプレ血清を５０μＬずつ、および１個のウェルにリン酸緩衝液のコントロールを５０μＬを加え、最後に上記微粒子を２５μＬ（0.1mg/mL）ずつ加えた。９６穴プレートを１分間振動撹拌後に、室温で８時間静置して反応させることで、凝集反応を検出した。
結果を図７（比較例１），図９（比較例２），図１２（実施例１，２）に示す。
ウサギ抗エノラーゼ血清（ウサギへ組み換え体の熱帯熱マラリア原虫エノラーゼを免疫後、採血して調製した血清）およびウサギプレ免疫血清（同じウサギで免疫前に採血して調整した血清）を判別する凝集試験を行った。
９６穴プレートに、８個のウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１６〜２０４８倍希釈したウサギ抗エノラーゼ血清またはウサギプレ血清を５０μＬずつ、および１個のウェルにリン酸緩衝液のコントロールを５０μＬを加え、最後に上記微粒子を２５μＬ（0.1mg/mL）ずつ加えた。９６穴プレートを１分間振動撹拌後に、室温で８時間静置して反応させることで、凝集反応を検出した。
結果を図７（比較例１），図９（比較例２），図１２（実施例１，２）に示す。
その結果、実施例１，２では抗血清とプレ血清を明瞭に区別する陽性凝集像と陰性凝集像を得ることに成功できた（実施例３）。
一方、比較例１では１６倍希釈で凝集反応は見られたものの、マラリア患者と健常者を区別できなかった。また、比較例２でも陽性と陰性を明確に区別できる凝集像が得られなかった。
一方、比較例１では１６倍希釈で凝集反応は見られたものの、マラリア患者と健常者を区別できなかった。また、比較例２でも陽性と陰性を明確に区別できる凝集像が得られなかった。
引き続いて国立国際医療研究センター研究所において保管されている熱帯熱マラリア患者血漿（Pf患者）、正常なボランティア血漿（正常）、熱発患者としてマラリア疑い採血を受けたが抗原検出迅速診断キットと顕微鏡によるスメアー観察から陰性と診断された患者血漿（熱発患者）を用いて凝集試験を行った。
陽性凝集像と陰性凝集像の判断はウサギ血清を用いた場合と同様に行った。
その結果、図１３に示すように、Pf患者と正常、Pf患者と熱発患者について一定の違いを表す陽性凝集像と陰性凝集像を得ることに成功した。ただし、目視による本方法の限界として、ウサギプレ血清の場合と異なり、正常血漿には希釈率の低いところにおいて擬陽性凝集像が観察されることがわかった。ヒト血漿試料において擬陽性を示した原因は、採血時に用いる真空採血管は内部にEDTAを用いることで採血時の凝固反応を抑えているため、フィブリンが９６穴プレートに吸着して擬陽性を生じたためと考えられる。その他にも血液中の脂肪成分が吸着して擬陽性を生じたためと考えられる。これらの問題は容易に改善することが可能である。すなわち血漿はカルシウム添加処理やガラスビーズ処理することでフィブリンを除去することが可能であり、擬陽性を抑制できることが容易に推測される。またすなわち、食事前の採血を行うことで脂肪含有量の抑制や希釈後の遠心分離処理で脂肪成分を除去することが可能であり、擬陽性を抑制できることが容易に推測される。
陽性凝集像と陰性凝集像の判断はウサギ血清を用いた場合と同様に行った。
その結果、図１３に示すように、Pf患者と正常、Pf患者と熱発患者について一定の違いを表す陽性凝集像と陰性凝集像を得ることに成功した。ただし、目視による本方法の限界として、ウサギプレ血清の場合と異なり、正常血漿には希釈率の低いところにおいて擬陽性凝集像が観察されることがわかった。ヒト血漿試料において擬陽性を示した原因は、採血時に用いる真空採血管は内部にEDTAを用いることで採血時の凝固反応を抑えているため、フィブリンが９６穴プレートに吸着して擬陽性を生じたためと考えられる。その他にも血液中の脂肪成分が吸着して擬陽性を生じたためと考えられる。これらの問題は容易に改善することが可能である。すなわち血漿はカルシウム添加処理やガラスビーズ処理することでフィブリンを除去することが可能であり、擬陽性を抑制できることが容易に推測される。またすなわち、食事前の採血を行うことで脂肪含有量の抑制や希釈後の遠心分離処理で脂肪成分を除去することが可能であり、擬陽性を抑制できることが容易に推測される。
本発明によって作製されたペプチド提示微粒子は、医療、診断、研究などの分野で有用である。特に、ペプチドに熱帯熱マラリア原虫に由来するペプチドを用いることにより、熱帯熱マラリアの診断やワクチン効果の判定に使用することができる。
Claims (5)
- 下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応に供する工程、得られた重合体にペプチドを導入する工程を含む、ペプチド提示微粒子の製造方法。
- ペプチドが熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼ由来ペプチドである、請求項１に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
- エノラーゼ由来ペプチドが配列番号２〜４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
- 微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリア、四日熱マラリア、サルマラリアの診断薬である、請求項２または３に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
- 微粒子がヒトに感染する熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫に由来する抗原の抗体価検査材料である、請求項２または３に記載のペプチド提示微粒子の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011110679A JP5899548B2 (ja) | 2011-05-17 | 2011-05-17 | ペプチド提示微粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011110679A JP5899548B2 (ja) | 2011-05-17 | 2011-05-17 | ペプチド提示微粒子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012240940A true JP2012240940A (ja) | 2012-12-10 |
| JP5899548B2 JP5899548B2 (ja) | 2016-04-06 |
Family
ID=47463017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011110679A Active JP5899548B2 (ja) | 2011-05-17 | 2011-05-17 | ペプチド提示微粒子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5899548B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015156329A1 (ja) * | 2014-04-09 | 2015-10-15 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫感染症の検査及び診断薬、並びに検査及び診断キット |
| WO2016084944A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼタンパク質の部分配列を用いた人工抗原とその製造方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6433111A (en) * | 1987-07-30 | 1989-02-03 | Japan Atomic Energy Res Inst | Production of microparticulate polymer having active functional group |
| JPH01207308A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-08-21 | Japan Atom Energy Res Inst | 刺激応答性機能を持つ重合体を製造する方法 |
| JP2002371098A (ja) * | 2001-06-11 | 2002-12-26 | Japan Atom Energy Res Inst | マラリア感染診断材及びマラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原 |
| JP2009256324A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-11-05 | Gunma Univ | 微粒子およびその製造方法 |
-
2011
- 2011-05-17 JP JP2011110679A patent/JP5899548B2/ja active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6433111A (en) * | 1987-07-30 | 1989-02-03 | Japan Atomic Energy Res Inst | Production of microparticulate polymer having active functional group |
| JPH01207308A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-08-21 | Japan Atom Energy Res Inst | 刺激応答性機能を持つ重合体を製造する方法 |
| JP2002371098A (ja) * | 2001-06-11 | 2002-12-26 | Japan Atom Energy Res Inst | マラリア感染診断材及びマラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原 |
| JP2009256324A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-11-05 | Gunma Univ | 微粒子およびその製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6015028332; Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ （１９８７） Ｖｏｌ．２６５， Ｎｏ．１０， ｐｐ．９１６-９２１ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015156329A1 (ja) * | 2014-04-09 | 2015-10-15 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫感染症の検査及び診断薬、並びに検査及び診断キット |
| WO2016084944A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 国立大学法人 群馬大学 | 熱帯熱マラリア原虫のエノラーゼタンパク質の部分配列を用いた人工抗原とその製造方法 |
| CN107001435A (zh) * | 2014-11-28 | 2017-08-01 | 国立研究开发法人日本医疗研究开发机构 | 使用了恶性疟原虫的烯醇化酶蛋白质的部分序列的人工抗原及其制造方法 |
| US10583184B2 (en) | 2014-11-28 | 2020-03-10 | Shigeyuki Kano | Artificial antigen produced using partial sequence of enolase protein originated from plasmodium falciparum, and method for producing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5899548B2 (ja) | 2016-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Plassmeyer et al. | Structure of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein, a leading malaria vaccine candidate | |
| AU633007B2 (en) | Heterofunctional cellular immunological reagents, vaccines containing same and methods for the use of same | |
| Fibriansah et al. | The development of therapeutic antibodies against dengue virus | |
| Yandar et al. | Immunological profile of a Plasmodium vivax AMA-1 N-terminus peptide-carbon nanotube conjugate in an infected Plasmodium berghei mouse model | |
| Abbady et al. | Chaperonin GroEL a Brucella immunodominant antigen identified using Nanobody and MALDI-TOF-MS technologies | |
| JPS6261996A (ja) | 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法 | |
| JPS63500524A (ja) | マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド | |
| Gatkowska et al. | Toxoplasma gondii: an evaluation of diagnostic value of recombinant antigens in a murine model | |
| Marsh et al. | Parasite-infected-cell-agglutination and indirect immunofluorescence assays for detection of human serum antibodies bound to antigens on Plasmodium falciparum-infected erythrocytes | |
| CN102495215B (zh) | 一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒 | |
| JP5647599B2 (ja) | 生物学的試料中の物質を検出する方法 | |
| WO2022182872A2 (en) | Compositions and methods for identification of cross-reactive allergenic proteins and treatment of allergies | |
| JP6192018B2 (ja) | 三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料 | |
| JP5899548B2 (ja) | ペプチド提示微粒子の製造方法 | |
| Ma et al. | Design and synthesis of HLA-A* 02-restricted Hantaan virus multiple-antigenic peptide for CD8+ T cells | |
| JP2002537783A (ja) | Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための、化合物および方法 | |
| Oliveira et al. | Evaluation of the acquired immune responses to Plasmodium vivax VIR variant antigens in individuals living in malaria-endemic areas of Brazil | |
| JP2018173334A (ja) | 免疫学的測定方法及びそれに用いる試薬キット | |
| CN103267842A (zh) | 检测中成药违法添加双氯芬酸的免疫胶体金方法 | |
| CN102236016A (zh) | 用于检测干燥综合症α-胞衬蛋白抗体的胶体金检测卡 | |
| JP2002508506A (ja) | Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための化合物および方法 | |
| CN113845577A (zh) | SARS-CoV-2特异性多肽及其应用 | |
| WO2015156329A1 (ja) | 熱帯熱マラリア原虫感染症の検査及び診断薬、並びに検査及び診断キット | |
| KR102002104B1 (ko) | 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 | |
| TW201815819A (zh) | 新穎胜肽、其抗體及以其評估口腔癌風險之方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140515 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140804 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150714 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150911 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160119 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20160209 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160209 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160209 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5899548 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |