JPS6261996A

JPS6261996A - 合成ペプチド、並びにそれを用いたエイズおよびプリ・エイズの検出方法

Info

Publication number: JPS6261996A
Application number: JP61099296A
Authority: JP
Inventors: チャン・ユイ・ワン; ジェームス・ジアン・グアン・ワン
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1985-09-11
Filing date: 1986-04-28
Publication date: 1987-03-18
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: ES8801839A1; DK198086D0; DE3689097D1; ES554592A0; DK198086A; DE214709T1; IL78696A; EP0214709B1; NO176798C; EP0214709A3; NO176798B; EP0214709A2; NO861697L; JP2702911B2; AU579467B2; AU5680386A; IL78696A0; HK95194A; DE3689097T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は１体液内のＨＴＬＶ−１［に対する抗体の検出
及びＡＩＤＳ　（後天性免疫不全症候群）、ＡＲＣ（Ａ
ＩＤＳ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌ＠ｘ）もしくはＰ
ｒｏ　−ＡＩＤＳの診断のために用いる合成ペプチドと
それを用いた診断方法及びＨＴＬＶ　−ＩＩ又はＬＡＶ
の感染防御のためにＨＴＬＶ　−ＩＩＩ　、　ＬＡＹに
対する抗体を産生させるワクチンに関するものである。

ペプチドのアミノ酸配列は、ＨＴＬＶ−Ｉ［［のエンベ
ロープ蛋白質、Ｐ４１のセグメントに一致し、またこの
ペプチドはＡＩＤＳ　。

ＡＲＣあるいはグリ−ＡＩＤＳ患者の血清内の抗体と特
異的に反応することが判明した。本発明のペプチドは２
１個のアミノ酸から構成されたペプチドとそのペプチド
を構成しているフラグメントよシ構成される近縁のペプ
チドをも含んでいる。本発明の検出方法はＥＬＩＳＡ　
（ｅｎｚｙｒｎ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｔｒｕｙｎｏａｏ
ｒｌ）ａｎｔａｓｓａｙ　）、ＩＲＭＡ　（ｉｍｍｎｏ
ｒａｄｉｏｍｓｔｒｉａ　ａｓｍａｙ　）　、　＝トロ
セルロース膜等？用いる酵素免疫プロッティング及び血
球凝集反応等の免疫測定法のいずれを用いてもよい、ま
た本発明のペプチドは適轟なキャリアーと結合させるこ
とにより　ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ　、　ＬＡＶに対するワ
クチンとして使用することができる。

［従来の技術および問題点］後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ　）患者は、最近、多
くの国で確認されている。７け者の同定と発症の原因物
質の究明に多くの努力が費やされ、疫学的データによる
と、ＡＩＤＳは感染性の物質が血液等の体液を媒体とし
て水平感染することが示唆されていた。

１９８３年Ｋ、パスツール研究所のバール−シナラン（
Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｇｉ　）らはＡＩＤＳ患者か
らＴ−リンパ球指向性レトロウィルスの単離に成功した
。

そのレトロウィルスは、人のＴ−細胞白血病ウィルス（
ＨＴＬＶ　）の一種と考えられていたが、そのウィルス
は公知のＨＴＬＶ　−Ｉ又はｆ（ＴＬＶ　−ｆ［とは異
なるものでｈりた（エフ・パール・シナラフ他、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２０．ＰＰ、８６８　１９
８３年５月）。

また、米国国立癌研究所のアール・シー・ガロ（Ｒ−Ｃ
，Ｇａ１ｌｏ　）のグループは多くのＡＩＤＳ及びＡＲ
Ｃ患者の血液とＨ９−Ｔ細胞株とを共に培養することに
より、類似のウィルスが単離されることを見いだし、こ
のウィルスｉ　ＨＴＬＶ　−［［と命名した（ポボビッ
ク（Ｐｏｐｏｖｉｃ）他、サイエンス、２２４ＰＰ４９
７（１９８４）：ガロ、他、サイエンス、２２４゜ＰＰ
５００（１９８４））。

・ゾ曹−ノア州、アトランタ所在の病理管理センターの
ブイ・ニス・カリアナラマン（Ｖ、Ｓ。

Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ）他は、ＡＩＤＳの患者のリ
ンパ腺症関連ウィルス（ＬＡＶ　）の単離及びＬＡＶの
核を構成している、Ｐ２５’ｉ使用する放射免疫沈降法
の開発を発表した。彼らの試験法は、リンパ球と共に培
養されたＬＡＶウィルス？単離した後、その核を構成し
ている蛋白質Ｐ２５ｉＩ　　で標識したものを抗原とし
て使用した。彼らは、加えた標識抗原の１５ｑ６が沈降
物として認められた時、陽性と判断している。

しかしながら、その結果はＡＩＤＳ、＠者の４１％に対
してだけが陽性で６．！！７．ｔたＡＲＣとして知られ
たリンツヤ腺症症候群（ＬＡＳ　）の患者に対しては７
２％が陽性でありた（グイ・ニス・カリアナラマン他、
サイエンス、２２５．ＰＰ３２１　（１９８４年７月）
）。これは、その方法が、　ＡＩＤＳウィルスに対する
抗体の検出に使用されるには感度的、精度的に十分では
ないことを意味している。

ＡＩＤＳ患者から単離されたＬＡＶ及びＨＴＩ、Ｖ　−
ＩＩＩはいくつかの重要な特徴を有している（７エリオ
ノ（Ｆｅｏｒｉｎｏ　）他、サイエンス、２２５．ＰＰ
６９（１９８４年）；レビー（Ｌｅｖｙ　）他、サイｘ
７ス。

２２５　、　ＰＰ、８４０　（１９８４年））。

これらは、生体内および生体外で０ＫＴ４　　ヒトＴ−
白血球細胞との応答性ヲ持ち、それらの白血球内で増殖
する（モンタグニール（Ｍｏｎｔａｇｎｉ・ｒ）他、ヒ
トＴ細胞白血病ウィルス（Ｈｕｍａｎ　’１’　Ｃｅ１
ＬＬ＠ｕｋ＠ｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　）、ＰＰ　３６３、
コールド・スゲリング・ハーバ−・う〆ラトリー（Ｃｏ
１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　）、１９８４　；ポポピツク他、前掲；クラララマ
ン（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ　）他、サイエンス・２２５Ｐ
Ｐ５９　（１９８４））。

また、これらＬＡＶ　、　ＨＴＬＡ　−Ｉ［はＡＩＤＳ
　、　ＡＢＣ患者の血清中の抗体により認識される（七
ンタグニール他、前掲；レピー他、前掲；ソーンガドノ
・ラン（Ｓｏｒｎｇａｄｈａｒａｎ　）他、サイエンス
、　２２４　ＰＰ５０５（１９８４年）；ソファイ（５
ｏｆａｉ　）他、ランセット（Ｌａｎａｅｔ）、ｌ　Ｐ
Ｐ１４３８（１９８４年）；プルンーペソネット（Ｂｒ
ｕｎ　−Ｖｅｚｌｎａｔ）他、ランセット、１゜ＰＰ、
１２５３　（１９８４年）；プルンーペソネット他、サ
イエンス、２２６．ＰＰ４５３（１９８４）；　　ゴー
ルドパート（Ｇｏｌｄｂ＠ｒｔ）他、ランセット１１゜
ＰＰ７１１（１９８４年）；及びａ　−ｖ　：ｙ　ス（
Ｌａｕｒｅｎｃｅ）他、二ニー・イングランド（Ｎ＠ｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　）　Ｊ　、Ｍｅｄ。

３１１　、ＰＰ　１２６９　（１９８４年１１月））。

１９８４年１１月にエル・ダブりニー・キッチン（Ｌ、
Ｗ、Ｋｉｔａｈｅｎ　）らは、Ｈ９／）ｉＴＬＶ　−ｍ
　と命名されたＨＴＬＶ−■の感染細胞株を用いて、血
友病患者のＡＩＤＳ診断金行な９ことを発表した。その
方法は、リン酸緩衝液内で２チのバラホルムアルデヒト
ヲ用いてウィルスの不活性化を行ない抗原として使用す
るものである。彼らは血友病患者が、過去の輸血によ、
９．　ＡＩＤＳウィルスに接触した機会の有無をチェッ
クした。血友病患者の血清検査結果は１、生命を維持す
るために輸血の必要比のある血友病患者がＡＩＤＳに感
染する危険性がますます増えることを示唆している（キ
ッチン他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１２．ＰＰ
、３６７（１９８４年１１月））。

血友病患者及び外科の７φ者のように輸血を受けなけれ
ばならない患者の間にＡＩＤＳの不注意な感染を防止す
るために高感度で簡便で信Ｂ性のあるＨＴＬＶ　−Ｉ［
１ウイルス汚染血液の検査法の早急な開発が望まれてい
る。

１９８４年１１月及び１９８５年１月に、米国国立癌研
究所のアール・シー・ガロのグループ及び他の協力者は
、ＨＴＬＶ　−ｌがＡＩＤＳの原因物質であるというこ
とヲ紹め、且っＨＴＬＶ　−ＩＩＩのヌレクレオチド配
列？発表した（ベアトリス・バーン（Ｂｅａｔｒｉｃ＠
Ｈａｈｎ　）他、ナイチ−？　　ｔ３１２＋ＰＰ、１６
６　（１９８４年１１月）；　ノ菅−ジ・エム・シｗ　
−（Ｇｅｏｒｇｅ　Ｍ−８ｈａｖ　）他、サイｘ７ス、
２２６ＰＰ、１１６５　（１９８４年１２月）；リー・
ラットナ−（Ｌｅｅ　Ｒａｔｎｓｒ　）他、ネイチャー
　、　３１３　、ＰＰ２７７（１９８５年１月））。

その間、他の３グループもまた。　ＡＩＤＳ　ウィルス
の完全なヌレクレオチド配列を発表した（ミーーシング
（Ｍｕｅｓｉｎｇ）他、ネイチャ、　３１３　、ＰＰ、
４５０（１９８５年２月）：サンチェスーベスヵドス（
５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｓ　）他、サイエンス
２２７ＰＰ４８４（１９８５年２月）、ウェインーホプ
ソン（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂａｏｎ　）他、セル（Ｃ＠ｌｌ
　）＊４ａｔ　ＰＰ　９（１９８５年１月））。

これらの発表は、遺伝子レベル及び翻訳された蛋白質レ
ベルの両方におけるＨＴＬＶ−１ｌｌの構造を明らかに
し、ＨＴＬＶ−ＩＩＩに関する異なったエピトープにつ
いての血清学的研究を可能にしている。

同時に、　ノ４スツール研究所のグループは、ＬＡｖが
ＡＩＤＳの原因物質として確認されたこと、及びそれが
ＨＴＬＶ　−ＩＩＩと同一であると見なされることを発
表した。このグループによυ使用された分析法もまた健
康な個人のＴ４　細胞内に繁殖するＬＡＶを使用するも
のである。そのウィルス曲抗原は、濃縮され、３７℃で
１５分間、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム溶液中で処
理することで不活性化された。

血清サンプルは、基質としてオルトフェニレンジアミン
（０，Ｐ、Ｄ、）を用いた酵素免疫分析法で試験された
。抗体の存在は、ＡＩＤＳ患者の６８％に、カポジ肉腫
の惣者の１００％にＰｒｏ　−ＡＩＤＳの患者の１００
％に確認された（ローレス他、前掲）。

最近、米国特許４，５２０．１１３がアール・シー・ガ
ロ他に対して発行された。が口らの特許は、ＥＩＪＳＡ
又は、ウェスタンブロッティング法モジくは間接免疫螢
光法に基づくストリッ７’　ＲｒＡにおける抗原として
、Ｈ９／ＨＴＬＶ　−ＩＩＩと命名された細胞の断片を
使用することによシ、ＡＩＤＳ及びＰｒｅ　−ＡＩＤＳ
患者の血清中の抗体を検出する方法を記述している。そ
の方法は、約８５％の精度である。

ガロらの特許は、さらに、ＨＴＬＶ　−ｍのＰ６５（Ｍ
Ｗ　６５．０００）　、　Ｐ２Ｏ（ＭＷ　６０．０００
　）　、　Ｐ　５５（ＭＷ　５５．０００　）、Ｐ２４
　（ＭＷ２４，０００）及びＰ４１（４１，０００）等
の抗原力ＡＺＤＳ　、＠者、同性愛者及びヘロイン常用
者の血清中の抗体と反応することが判明したと記述して
いる。これらについての、主要な免疫反応性又は特異性
は）ＩＴＬＶ　−Ｉ［［のエンベロープ抗原を構成する
蛋白質、Ｐ４１に対して向けられている。この特許はさ
らに、Ｐ４１のより純度の高い精製により、よシ高感度
なＥＬＩＳＡ分析が可能であろうと記述している。この
記述よシ、試薬として適当な抗原は、Ｈ９細胞株で培養
されるＨＴＬＶ−ＩＩＩに由来するＰ４１セグメントで
あると思われる。

さらに、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１　）の発現系を用いてＡ
ＩＤＳ患者の血清中の抗体と反応するＨＴＬＶ−１７）
上に表現されたペプチドと同一のペプチドを産生させる
ことに成功したことを発表している（ガロ他、サイエン
ス、２２８　、ＰＰ、９３　（１９８５年４月））。

クローン化された）ＩＴＬＶ−■の遺伝子は、いくつか
のフラグメントに切断され、発現ベクターに挿入され、
大腸菌に導入し、それから大腸菌形質転換で表現された
。

試験された３００９クローンのウチ、２ｏがＡＩＤＳ、
ｌｉｔ者からの血清に反応を示した。その２０のクロー
ンは、ＨＴＬＶ−Ｉ［１のＯＲＦセグメントのいくつか
のセグメント？含むことが分析確認され、クローン１７
５，１９１．１３，３１．１６２，１１３゜１２１及び
１２７であることが確認された。８つのクローンのうち
、ＯＲＦクローン１１３，１２１及び１２７がＨＴＬＶ
　−■感染細胞によシ産出されるｅｎｖ−ｆｏｒ領域の
一部を翻択してできた蛋白質が大部分のＡＩＤＳ患者の
血清中の抗体と反応することが確認された。

今までのＨＴＬＶ　−ＩＩＩに対する抗体を検知するた
め或いはＡＩＤＳ又はＰｒｏ　−ＡＩＤＳ　ｆ診断する
ための分析法は、ＨＴＬＶ−ｆｆｌ又はＬＡＶのウィル
スそのものの使用を伴なうものである。それらの方法は
、１００チの正確さはないため、血液銀行等における血
清のスクリーニングでの使用には耐えない。これは、汚
染された血清がスクリーニングで見のがされる可能性を
与えその結果輸血において、受血者に重い傷害を与える
であろう。さらに試薬としてＨＴＬＶ　−ＩＩ［の使用
は、試薬２作るための準備段階において、極度な警戒を
必要とする。健康な研究所作業員にとって非常に危険で
ある。さらに、たとえ不活性化されたウィルスを使用し
たとしても、不活性化されたウィルスへの接触は健康な
作業員の抗体産生の原因となりうるし、もし抗体が産生
された場合、彼らはＡＩＤＳ　、　ＡＢＣ６るいはＰｒ
ｏ　−ＡＩＤＳであると倶診断される恐れがある。さら
に、試薬におけるＨ９細胞又は大腸菌（Ｅ−Ｃｏｌｔ　
）の細胞内物質の存在は、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１ｔ　）又
はＨ９細胞に対する抗体を有する個人から、ＨＴＬＶ　
−１［１抗体スクリーニング試験において、まちがった
結果を引き出す可能性がある。これらまちがった陽性反
応は、健康な個人及びその家族に対する苛酷な心配をも
たらし、又ＡＩＤＳに感染しているとして誤って診断さ
れる可能比があり、それらの人は通常な社会的活動から
追放される恐れがある。

さらに、今日まで、ＨＴＬＶ−１ｌｌに対する防御のた
めの方法または実施可能なワクチンは見い出されていな
い。不活性化されたウィルスをワクチンとして使用する
ことは、その病気にかかる恐れがあるため、実施不可能
である。

同様に、哺乳動物を使用したＨＴＬＶ−１１に対するモ
ノクローナル及びポリクローナルな抗体の製造は、免疫
原としてＨＴＬＶ　−ＩＩＩの使用を避けられないため
、同様な危険性が存在する。

従って、本発明の目的は、試薬としてウィルス又はその
断片の使用を必要としない測定方法又は診断方法を開発
することにある。

さらに目的は、簡便、高感度且つ正確な試験方法を開発
することにある。

さらに少量のサンプルと少量な試薬？用いる安価な試験
を開発することにある。

また、体液内のＨＴＬＶ　−Ｉ［［に対する抗体の存在
を検出するため、或いはＡＩＤＳ　、　ＡＢＣもしくは
Ｐｒ・−ＡＩＤＳ　ｉ診断するための試験がＨＴＬＶ−
１１１ｉ利用したもので鉱なく、化学的手段によシ試薬
を開発することにある。これによシ、ウィルス又はその
セグメントへの接触の危険及びウィルスの不必要な増殖
の危険を避けることである。

もう１つの目的は、人間を含む健康な哺乳動物・に投与
された際にＨＴＬＶ　−ＤＩ又はＬＡＹによる感染を防
御するため、ＨＴＬＶ　−Ｉ［１に対する抗体の産生を
誘発するワクチンを開発することにある。

さらに目的は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ’を使用せずに、哺乳
動物におけるＨＴＬＶ　−ＩＩＩに対するモノクローナ
ル及びポリクローナル抗体を製造するために使用されう
る免疫原を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］本発明では、特殊な順序に配列されたアミノ酸を持つペ
プチドを、固相ペプチド合成法にょシ作製した。本発明
のペプチドを用いて血清及び体液内のＨＴＬＶ−１ｌｌ
に対する抗体の検出及びＡＩＤＳ　。

ＡＲＣ又はＰｒの−ＡＩＤＳの診断のための高感度な測
定方法が開発された。そのペプチドは又、Ｂａ１ｂ／ａ
マウスのような健康な哺乳動物におけるＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ又はＬＡＶに対する抗体の産生を誘発するのに有用で
あることが見い出された。

本発明の血清又は体液内の、ＨＴＬＶ　−ＩＩＩに対す
る抗体の検出及びＡＩＤＳ　、　ＡＲＣもしくはＰｒｅ
　−ＡＩＤＳの診断のために有用なペプチドは、以下の
配列式を有するペプチド及びその類似体よシ選択される
。

なお、この明細書中に記載されているアミノ酸配列式は
すべて、左端のアミノ酸がペプチドのＮ−末端を、右端
のアミノ酸がペプチドのＣ−末端を表わすものとする。

Ａ　ｒ　ｇ−Ｉ　１＠−Ｌｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｖ　ｍ
ｌ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ｌｙｓ　
−Ａａｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌ＠ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｉ　ｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙａ−８ｅｒ　。

上記式においてＡｌａ　＝アラニンＡｒｇ　＝アルギニンＡ！ＩＰ　＝アスパラギン酸Ｇｉｎ　＝グルタミンＧｌｕ　＝グルタミン酸Ｌｅｕ＝ロイシンＬｙｓ　＝リジンＧｕｙ　＝グリシン１１ｅ＝インロイシンＳｅｔ　＝セリンＴｒｐ＝）　　リ　ア２　ト　７　ア　ンＴｙｒ　＝チ
ロシンＶａｌ＝バリンおよびＣｙｓ　＝システィンである。

体液内のＨＴＬＶ　−ＩＩＩに対する抗体の検出及びＡ
ＩＤＳ　、　ＡＲＣもしくはＰｒｅ　−ＡＩＤＳの診断
についての高感度な測定方法は以下の段階からなる二人
。以下の配列式を有するペプチドおよびその類似体より
選択されたペプチドを準備すること。

Ａ　ｒｇ　−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ　−Ａ　１ａ−Ｖａｌ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ−Ｔ　ｒｒ−Ｌａｕ−Ｌｙｉ　
−Ａ　ｓｐ　−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｉ　１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−８＠ｒここで
、Ａ１為＝アラニンＡｒｇ　＝アルギニンＡｓｐ　＝アスパラギン酸Ｇ１ｎ＝グルタミンＧｌｕ　＝グルタミン酸Ｌｅｕ＝ロイシンＬｙｅ　＝リジンＧ１７　＝グリシンＩＩ・＝インロイシンＳ＠ｒ＝セリンＴｒｐ＝）リグトファンＴｙｒ　＝チロシンＶａｌ＝バリンＣｙｓ　＝システィンＢ、免疫分析方法における抗原として試験毎に一約７〜
１０の緩衝液中で約０．１〜２０μｇのペプチドを使用
すること。

さらに本発明では、ペプチドが、蛋白質又はポリマー等
のキャリアーに結合された時、ヒ）ｋ含む哨乳動物でＨ
ＴＬＶ　−Ｉ［１又はＬＡＶに対する抗体の産生を誘発
することができる。その方法は、腹腔内又は皮下注射に
より　ＦＩＮ乳動物の体内へ前記キャリアー結合ペグチ
ドを投与することからなる。

本発明のベプチｒＶｉ、化学合成によって得られるもの
であり、体液中のＨＴＬＶ　−ＩＩ［抗体の検出、ＡＩ
ＤＳ。

ＡＲＣ及びＰｒｅ　−ＡＩＤＳの診断、哺乳動物におけ
るＨＴＬＶ　−１７（又はＬＡＶ抗体の産生誘発、そし
て哺乳動物におけるＨＴＬＶ　−ＩＩＩへのモノクロー
ナル及びポリクローナル抗体の製造のために利用できる
ものである。

そのぺｆチドは、以下の配列式を有するペプチド及びそ
の類似体より選択される。

Ａｒｇ−ＩＩｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａａｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−８ｅｒ（式中Ａｒｇはアルギニン、Ａｌａ
はアラニン、Ｖａｌはバリン、　Ｇｌｕはグルタミン酸
、Ｔｙｒはチロシン、ＬｙＩＩはりシン、Ａｓｐはアス
パラギン酸、Ｇｉｎはグルタミン、ＬｅｕＨロイシン、
ｃｔｙＨグリシン、ＩＩｓ　ｌｉイソロイシン、Ｔｒｐ
　ｉｊ　）リプトファン、５ｅｒｉｔセリヂン、モして
Ｃｙｓはシスティンである）。

該ペプチドは、上記配列のターミナルアミノ酸、−Ａｒ
ｇ−又は一５ｅｒ−にアミノ酸及び他の物質を付加させ
、或いはいずれかのターミナルから数個のアミノ酸を削
除することにより得られるペプチド鎖から構成された被
デチド類似体をも含むものである。

優位なＨＴＬＶ　−ＩＩＩ抗体と反応する三次元構造が
維持される限り、本発明のペプチドは、上記配列式のア
ミノ酸類似物から成っていてもよいし、又は、どちらか
のターミナルにアミノ酸及び他の物質を付加してもよい
。或いは、ターミナルアミノ酸の幾つかを削除して構成
するアミノ酸を約１５個位まで減少させてもよい。

さらに本発明のペプチドの重合体を用いてＨＴＬＶ−■
に対する抗体を産生ずることができる。

体液中ノＨＴＬＶ−Ｉｌｌ抗体の検出及びＡＩＤＳ、　
ＡＲＣ及びｐｒａ　−ＡＩＤＳの診断用試薬として有用
な本発明のペプチドの基本となるアミノ酸配列は、ＨＴ
ＬＶ−［［を構成する蛋白質のアミノ酸配列の一部のセ
グメントに一致し、そのセグメントはＰ１２０の一部で
あるＰ４１であり、ＨＴＬＶ−ＩＩＩのエンベロープ蛋
白質を定めるＬＯＲ（ｌｏｎｇ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｌ
ｎｇ）の一部である。

本発明のペプチドは、次の式のとおり固相にデチド合成
のメリフィールド原法により合成された〇！エ　　　　　　　　　　　Ｑ上記式に従い、Ｂｏａアミノ酸を下記に示す順序でレジ
ンに付加し、本発明のペプチドを調製した。

１、　Ｂｏａ−８ｅｒ　　　８．　Ｂｏａ　−Ｌａｕ　
　　　１５．　ＢｏＣ−Ａｒｇ２、　Ｂｏａ　−Ｃｙｓ
　　　９゜ＢｏＣ−Ｇｉｎ　　　　１６．　Ｂｏｃ−Ｇ
ｌｎ３、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　　１０．Ｂｏｃ−Ｇｌｎ　　
　　１７．Ｂｏｃ−Ｖａ１４、Ｂｏｅ　−Ｔｒｐ　　１
１．Ｂｏｃ　−Ａ＠ｐ　　　　１Ｂ、Ｂｏｃ−ＡＩ＆５
、Ｂｏｃ−１１ｓ　　１２．Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ　　　　
１９．Ｂｏｃ−Ｌａｕ６、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　　１３．Ｂ
ｏｃ　−Ｌｅｕ　　　　２０．Ｂｏｃ−１１ｅ７、Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ　　１４．Ｂｏｅ−Ｔｙｒ　　　　２１．Ｂ
ｏｃ−Ａｒｇ本発明ペプチドは、所望のＢｏａアミノ酸
を追加するか又は削除することにより、配列を変えて調
製することができる。なお本発明のペプチドは、上述し
た２１個のアミノ酸を持つペプチド（以下：２１　ｍａ
ｒ・ベプチｒと称する）またはその類似体であり、類似
体は２１　ｍａｒペプチドからＮ個（Ｎは自然数）のア
ミノ酸を削除したもの、または２１ｍｅｒ中のアミノ酸
残基を置換したペプチド、または２１　ｍａｒペプチド
にＮ個のアミノ酸を付加したもの、または、２１　ｍａ
ｒペプチドに他の物質を結合したものを含む。

所望のブロックされたペプチドをレジン上で結合させる
ことを完了してから、ペゾチドーレジンを無水フッ化水
素酸で処理して、ベンジルエステル結合を切断すること
でペプチドを７ジンより遊離させた。アミノ酸の側鎖官
能基をブロックしているベンジル誘導体のブロッキング
グループは、同時にペプチドから切断された。得られた
ペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によって精製され、そしてアミノ酸分析により、配
列式の確認が行なわれた。

本発明のベデチｒは、次の式による４−メチルベンズハ
イトリルアミン樹脂を使用して合成することもできる。

上記方法により合成されたペプチドは、ＨＴＬＶ　−■
抗体に対し、高い反応性を有し、ＨＴＬＶ−［抗体検出
用の高感度で特異的な免疫吸着剤として使用できる。

本発明によるペプチドを使用した検出方法は、米国特許
第４，５２０，１１３号に記載されたＨＴＬＶ−■の断
片を用いる検出方法よりも体液中のＨＴＬＶ　−■抗体
に高感度かつ特異的な結果を示した。表■参照。

本発明のペプチドはＨＴＬＶ−１抗体に対し、高い免疫
特異性を有するためＡＩＤＳ、　ＡＲＣｌ又はｐｒｅ　
−ＡＩＤＳ用のワクチン、哺乳動物のＨＴＬＶ　−［［
に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体製造の
ための免疫原として有用である。

本発明のペプチドは、それ自体、またはそれ自体の重合
体、又は蛋白質かポリマー等のキャリアーと結合させて
、正常な動物に導入して、ＨＴＬＶ−■に対する抗体の
産生を誘発する。また、健康人におけるＨＴＬＶ　−Ｉ
ＩＩ又はＬＡＶによる感染を防御することもできる。本
発明のペプチドは、）ＩＴＬＶ　−ＩＩＩ由来のペプチ
ドでないため、正常動物に投与しても何ら危険性はない
。

キャリア蛋白質としてのヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ　
）に結合させた本発明のペプチドを、健康なりａｌｂ／
ｃ　　マウスの腹腔内又は皮下への注射により、ＨＴＬ
Ｖ　−Ｉ［［と反応する本発明ペプチドに対する抗体が
、そのＢａ１ｂ／ｃマウスに産生された。このことが実
施例７に記載されている。

実施例７で得られた結果に基づき、本発明ペプチドは、
唾乳動物のＨＴＬＶ　−ＩＩＩに対するモノクローナル
及びポリクローナル抗体の製造のための免疫原として使
用できる。

［発明の効果］本発明のペプチドは以下の利点を有する。

本ペプチドは、化学的に合成される。このことは、試薬
又はワクチンの製造工程中いかなる時もＨＴＬＶ　−Ｉ
ＩＩを使用しないということを意味する。

それはワクチンの製造中又はワクチン化プロセス中、製
造労働者や衛生業の人やワクチン注射をした人をＨＴＬ
Ｖ−１７にさらす危険がないことを意味する。同様に、
哺乳動物のＨＴＬＶ　−ｍに対するモノクローナル又は
Ｉリフローナル抗体の製造において。

本発明のペプチドの使用ＶｉＨＴＬＶ　−Ｉ［［に感染
する危険を防止する。更に、本発明のペプチドを用いれ
ば、試薬からの感染はないので、ＨＴＬＶ　−［［に対
する抗体検出テストでは、テストする血清又は体液のサ
ンプルを３０分間５６℃で加熱することにより、存在す
るかもしれないＨＴＬＶ　−１［１を不活性にする予防
手段を講じるだけで、研究所で働く者がＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉにさらされる危険を完全に防止することができる。

本発明の方法は、ＨＴＬＶ　−（［を培養するために用
いるＨ７細胞株、又ＶｉＥ　−Ｃｏｉ　ｉ産生蛋白質か
ら生じる物質より起因する偽陽性反応を解消した。

ある正常人が、Ｅ、ｃｏｌｉ又はヒト白血球抗原（ＨＬ
Ａ）に対する抗体を有する時、そのＨＬＡ抗体は、Ｈ７
細胞株から生じる抗原物質と反応するため、これらの正
常人から採取した血清サンプルは、たとえそれがＨＴＬ
Ｖ　−［［１にさらされていなくても、ＥＬＩＳＡ又は
ＩＲＭＡテストにおいて陽性反応を呈する可能性がある
。ある人がこの種の偽陽性反応によって、ＡＩＤＳに感
染したかもしれないという診断を受けることは、本人は
もとより、その者の家族に対し重大な不安を起こさせ、
本人は通常の社会活動ができなくなる恐れがある。これ
らの問題は、全て本発明のペプチドを試薬として使用す
ることにより、回避できる。

更に、適当なアミノ酸類似置換物を持つ、本発明のペプ
チドをペースとした種々のＯデチト誘導ｉｈ、ＨＴＬＶ
　−Ｉｆｆ抗体スクリーニング法に有用すｅ性を持つ。

本発明の４ゾチド、及び本発明のペプチドとＡＩＤＳ及
びＡＲＣ患者の血清中に存するＨＴＬＶ　−ＩＩ［抗体
との反応性が、実施例８と衆■に記載されている。

ＥＬＩＳＡテストにおける各ペプチドの反応性は２１ｍ
ｅｒｎデチドの反応性を１００％として表わした。

その結果によれば、本発明の２１　ｒｎｅｒ　ペプチド
は、その規模と配列が次の点でユニークであることがわ
かった。それはＮ末端のＡｒｇおよびＮ末端から２番目
のＩＩｓ　、或いＶｉｃ末端からのＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃ
ｙｓ−８ｅｒの削除、又はＬｙｅとＡｓｐとの間で切断
して１０個と１１個のアミノ酸より構成される全てのペ
プチドは、２４ｍａｒベゾチドペプチド抗体との反応性
が劇的に低下したことである。

更に、上記１１ｍｏｒペプチドにＬｙｓを付加すること
が抗原性を顕著に復元するということから、Ｃ末端から
１２番目の位置のＬｙｅの重要性が示唆されている。本
発明のペプチドは合成的に作られるため、品質管理が容
易であり、一定した品質の試薬の供給により、テスト結
果の再現性の向上が期待できる。各テストに必要なペデ
チｒのｔは極く少量でよく、そして該ペプチドの製造コ
ストが低額であるため、ＨＴＬＶ−Ｉｌｌの抗体やＡＩ
ＤＳ％ＡＲＣ又はｐｒｅ−ＡＩＤＳの診断のための体液
をスクリーニングする費用やワクチン製造の費用は、低
減される。

・　本発明に従って作られたペプチドは、それをＥＬＩ
ＳＡ　、酵素免疫ドツト法、血球凝集法文はＩＲＭＡ試
薬として使用することにより、ＨＴＬＶ−［［１の感染
を検出し、ＡＩＤＳ　、　ＡＢＣ及びｐｒｅ−ＡＩＤＳ
を診断するために使用できる。ＥＬＩＳＡの技術は実施
例に記載されていて、ｒＲＭＡ技術は実施例３に、血球
凝集法は実施例３Ａと５Ａにそれぞれ記載されている。

以下の実施例において、コーティング緩衝液に０、２５
　（ｗ／ｖ）　％のグルタルアルデビドを添加すること
により、ペプチドをプレートやビーズ上に共有結合させ
ることもできる。更に、西洋わさびベルメツダーゼ標識
マウス抗ヒ）　ＩｇＧモノクローナル抗体（ＰＯＤ−Ｍ
、α、ＨＩｇＧ　）　Ｖｉ、第２抗体として西洋わさび
ペルオキシダーゼ標識（ＰＯＤ−Ｇ、α、ＨＩｇＧ　）
の代りに使用してもよい。

［実施例コ実施例１ＥＬＩＳＡＫよルＨＬＴＶ　−［［抗体の検出９６−穴
プレートのウェルを４℃で一晩（又は室温で３時間）　
−９，５の１０ｍＭＮａＨＣＤ３緩衝液１００μＡ中で
、前述のように調製された０、５μｇ／ウェルの２１ｍ
ａｒペプチドでコーティングした、そのウェルは生理食
塩リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、それから１時
間３７℃で３（ｗ／ｖ）％ゼラチンＰＢＳ溶液２５０μ
ｌを注入しインキ−ベートし、非特異的結合部をブロッ
クした。続いて０．０５　（Ｙ／Ｖ　）チＴｖｅｅｎ　
２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。テスト用血清（患者又
は正常人から摂取した血液）を２０（ｖ／ｖ　）％正常
やぎ血清と１（ｗ／ｖ）％ゼラチンと０．０５　（ｖ／
ｖ　）％’ｐｗｅｅｎ　２０とを含有するＰＢＳで稀釈
した。その稀釈比（体積比）は■：２０と１：２００で
ある。２００μｌの前述稀釈血清を各ウェルに添加し３
７℃で１時間反応させた。それから、そのウェルを３回
０．０５（ｖ／ｖ）％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ
で洗浄して未結合ＩｇＧを除去した。ＰＯＤ　−Ｇ、α
、ＨＩｇＧを第２抗体として使用し陽性ウェル中で形成
されたＨＴＬＶ　−ＩＩＩ抗体−ペデチド複合物と結合
させるためｌ（ｖ／ｖ）％正常やぎ血清０．０５　（ｖ
／ｖ　）％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳでＰＯＤ　
−Ｇ、α、ＨＩｇＧを１：３０００に稀釈した溶液ｌＯ
Ｏμｌを各ウェルに添加し３７℃で更に１時間インキュ
ベートした。

該ウェルを０．０５　（ｖ／　ｖ　）　％　Ｔｗｅｓｎ
　２０を含むＰＢＳで５回洗浄し未結合抗体を除去し、
そして０．０４（ｖｒ／ｖ）％のオルトフェニレンジア
ミン（ＯＰＤ）と０．０１２（ｖ／ｖ）チの過酸化水素
を含有する−５、０のクエン酸ナトリウム緩衝液ｌＯＯ
μｌ　を添加した後、発色反応をさせた。この溶液は着
色生成物を形成することによりペルオキシダーゼを検出
するために用いられた。その後、２．５モルのＨ２ＳＯ
４溶液を５０μｌ添加し反応を停止した。そして着色生
成物量はＥＬＩＳＡ　リーダーを使って４９２ｎｍで測
定した。測定は上述した２種類の血清稀釈比（それぞれ
１：２０と１　：　２００　）で行なわれた。

正常血清を陰性のコントロールとして使用した。

９０の正常サンプルの平均吸光度４ＳＤ　（標準偏旦よ
り大きい吸光度を陽性とした。その結果を表Ｉに示す。

く表Ｉ〉固相免疫吸着剤として２１　ｍａｒペプチドを使用する
１、　ＡＩＤＳ患者　　　９８／１００　　　９８．０
％２、　ＡＲＣ患者　　　９０／１０５　　８５．７％
３、健康なホモセクシャル　　１７：／　　６５　　　
　　２６．２％４、肝癌患者　０／２０チ５、自己免疫疾患患者　　　０／　　５１　　　　　０
チ＋６、初期免疫不全患者　　　　２／１２３　　　　　１
．６％７、リンパ腺白血病患者　　　　Ｏ／　　２　　
　　　０％８、正常被験者　０／　９０　　　０チ＊分
析は緩衝液により１　：　２０　（ｖ／ｖ）に稀釈され
た血清を用いて行なわれた。

＋このグループの陽性の２つの血清はデーグーライン近
辺の反応を示した。

注：ＡＩＤＳ　、　ＡＲＣ、初期免疫不全、白血病／リンパ
腫患者及び正常人の血清はアービンのカリフォルニア大
学のニス・グデタ（Ｓ、Ｇｕｐｔａ）博士；ニューヨー
クのスローン・ケタリング記念筋センター血液銀行のニ
ス・カニンガム・ランデルス（Ｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ
ｍ−Ｒｕｎｄｅｌｇ）博士；ニューヨークのスローンー
ケタリング記念癌センター感染性疾患部のジェイ・ゴー
ルド（Ｊ、Ｇｏｌｄ）博士によって支給された。リウマ
チ様関節炎、狼癌紅斑、アレルギーを含む自己免疫疾患
患者の血清はニューヨークのロックフェラー大学病院の
エヌ藝チオエツジ（Ｎ、ｃｈｔｏｅｚｚｔ）ｆｔＪ十に
よって支給された。肝癌患者の血清は国立台湾病院のキ
ング−テン・チャン（Ｋｉｎｇ−Ｔｅｎ　Ｃｈａｎｇ）
博士によって支給された。表■の結果は５３４の血清サ
ンプルで試験した本発明のＥＬＩＳＡは非常に正確で高
い特異性を有することを示している。正常被験者又１−
１　ＡＩＤＳもしくはＡＲＣに感染していないと認めら
れる患者においては免疫反応は見られなかった。

血液銀行からウィルスに犯された血液を排除するための
スクリーニングテストにおいて、陽性反応と確定するた
めの基準をより厳重にできる。例えば、正常血清サンプ
ルの平均吸光度＋４８Ｄを陽性と見做す代りに、正常血
清サンプルの平均吸光度＋２８Ｄを有するサンプルを陽
性と見做す事ができる。

実施例２実施例２は実施例１の手順と同様に実施されＧａ　１１
　ｓらの米国特許４，５２０，１１３に示す。熱不活性
化されＮＰ４０で可溶化されたＨＴＬＶ　−［１でコー
ティングされプレートを用いて、実施例Ｉと同じ血清サ
ンプルを使用してくり返された。結果を表■に示す。

実施例■で得た結果と比較すると、この方法は正確さで
劣り、従って信頼性が劣る。

９６穴軟性塩化ポリビニール（ｐｖｃ　）プレートのウ
ェル浸４℃で一晩（又は室温で３時間）、−９，５の１
０　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３援衝液、１００　ｔｔｌｌで、
前述のように調製された０、５μｇ／ウェルの２１ｍｅ
ｒＪデチドでコーティングする。ウェルは生理食塩リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）で３度洗浄され、非特異的結合部を
ブロックするために３７℃１時間、３　（ｗ　／　ｖ　
）％ゼラチンを含むＰＢＳ２５０μｌを注入しインキュ
ベートされ、０．０５（ｗ／ｖ）％’Ｉ’ｗｅｅｎ　２
０を含むＰＢＳで３度洗浄される。検査する血清、ｌ（
Ｗ／ｖ）％ゼラチン及びＱ、Ｑ　５　（ｖ　／ｖ　）　
％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ’ｔ’ｌ：２０と１
：２００に稀釈される。稀釈された血清２００μｌは各
ウェルに加えられ、３７℃で１時間反応させる。それか
ら、未結合のＩｇＧを除去するためにウェルは０．０５
　（ｖ／ｖ　）　％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用
いて３度洗浄される。アフィニイティー精製された■　
標識のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｅ）抗体が陽性ウェル内で
形成される抗体抗原複合物と結合する第２抗体として使
用される。５０，０００−２０．ＯＯＯｃｐｍの工１２
５標識抗ヒトＩｇＧを含む１（ｖ／ｖ）％正常ヤギ血清
と０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ
１００μｌがウェルに加えられ、３７℃でもう１時間イ
ンキュベートされる。

ウェルは未結合の第２抗体を除去するために０．０５　
（ｖ／ｖ　）％Ｔｗａｅｎ　２０を含むＰＢＳで５度洗
浄され乾燥される。プレートはウェル毎に切断され、ガ
ンマ−シンチレーションカウンターによっテ測定される
。分析Ｖｉ２つの血清稀釈比ｌ：２０及び１：２００で
各々２度行なわれる。陰性コントロールとしての正常血
清サンプルも同時にテストされる。正常血清サンプルの
平均ＣＰＭ　＋　４ＳＤよりも大きいＣＰＭは陽性とさ
れる。

実施例３Ａ同相免疫吸着剤として２１　ｍａｒ　＜プチドでコーテ
ィングされたゼラチン粒子、ヒツジ赤血球又はラテック
ス粒子を用いる血球凝集法によるＨＴＬＶ　−ＩＩＩに
対する抗体の検出徹底的に洗浄されたヒツジ赤血球、ゼ
ラチン粒子又はポリスチレンラテックス粒子等の微粒子
は５ｔｔｌ／ｍｌから１〜／ｍｌの範囲の濃度の２１　
ｍａｒ　＜デチドでコーティングされる。２１ｍｅｒ″
′−２ブチｒでコーティングされた微粒子ｆ″１９６穴
Ｕ底マイクロプレートにおいて段階的に薄められた血清
サンプルと共にインキュベートされる。室温で１時間程
放置した後、底部の凝集パターンが判読され、陽性反応
を示す最大の稀釈比が記録される。本法はワンステップ
法であり、血清又は体液等の検体に含まれる抗ＨＴＬＶ
　−Ｉｎ抗体の定性及び定量分析に使用できる。

実施例４この実施例はＨＴＬＶ　−■抗体検出用ＡＩＤＳ　、　
ＡＲＣ。

ｐｒｅ　−ＡＩＤＳ診断のためのテストキットに関する
ものである。本実施例のテストキットは１ウェル当り本
発明のペプチド０．５μＩを含むｐｌ（９，５１０ｍＭ
ＮａＨＣＯｓ緩衝液１００μｌを用いて本発明のペプチ
ドでコーティングされた９６穴プレートを備えている。

さらにテストキットは以下の物を備えている：（１）正
常ヒト血清（陰性コントロール）；（２）熱不活性化さ
れＮＰ４０で可溶化されたＡＩＤＳ患者血清（陽性コン
トロール）　ｊ　（３）正常ヤギ血清；（４）ベルオキ
シターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　ｐ　（５）オルトフェ
ニレノンアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素を含むクエン
酸リン酸緩衝液からなる発色試薬。本テストキットは実
施例１に記述された手順で用いられる。

上記のテストキットでは本発明のベデチＰでコーティン
グされた９６穴プレートを固相免疫吸着剤として使用し
ているが、固相はこれに限定されるものではなく、例え
ばミニカラムに充填されているガラスや合成樹脂ビーズ
又はニトロセルロース膜ストリップ等も使用できる。

実施例５この実施例はＩＲＭＡを用いる抗体検出用のテストキッ
トに関するものである。本実施例のテストキットはｌウ
ェル当り２１　ｍｓｒペプチド０．５μｇを含むｐ）（
９，５１０ｍｌ’ｖｉ　ＮａＨＣＯｓ緩衝液１００　μ
ｌＪを用いて２１　ｍｏｒペプチドをコーティングした
９６大の切４シ断可能な塩化珍キビニール（ＰＶＣ）プレート及び以下
のものを備える。：（１）正常ヒト血清（陰性コントロ
ール）　；　（２）熱不活性化されＮＰ４０で可溶化さ
れたＡＩＤＳ患者血清（陽性コントロール）　；　（３
）正常ヤギ血清、　（４）　Ｉ　　標識ヤギ抗ヒ）Ｉｇ
Ｇｏ本テストキットは実施ｆｌＪ　３に記述された手順
で用いられる。

上記のテストキットでは、本発明のペプチドでコーティ
ングされた９６穴ＰＶＣプレートを固相免疫吸着剤とし
て使用しているが、固相としてこれに限定されるもので
はなく、例えば、ガラスピーズ、ポリスチレンビーズ、
ニトロセルロース膜ストリップ等も固相として使用でき
る。

実施例５Ａこの実施例は血液凝集法を用いるＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体
検出用のテストキットに関するものである。本実施例の
テストキットは９６穴Ｕ底マイクロプレート及び以下の
ものを備える。：　（１）２１　ｍｅｒ　＜プチドでコ
ーティングされたヒツジ赤血球、又はゼラチン粒子、又
はポリスチレンラテックス粒子；（２）正常ヒト血清（
陰性コントロール）　；　（３）熱不活性化されＮＰ４
０で可溶化されたＡＩＤＳ患者血清（陽性コントロール
）。

本テストキットは実施例３Ａに記述された手順で用いら
れる。

実施例にの実施例では、実施例１の方法を用いたＡＩＤＳスクリ
ーニング結果と、米国特許４．５２０．１１３による熱
不活性化されＮＰ４０で可溶化されたＨＴＬＶ−■を用
いたＡＩＤＳスクリーニング結果との比較検討を行なっ
た。正常血清、Ａよりｓ　、　ＡＲＣ患者の血清Ｈｌ　
：　２．０及び１　：　２０００に稀釈された。各稀釈
血清サンプルに対して本発明の被デチドを用いたテスト
及び米国特許によるＨＴＬＶ　−Ｉｎを用いたテストを
行なった。正常ヒト血清を陰性コントロールとして用い
、また、熱不活性化ＨＴＬＶ　−Ｉｎと反応するＡｒＤ
ｓ患者血清サンプルを陽性コントロールとして用いた。

その結果を第■に示す。

０囚ｃｖ＞　　　ｍ　　　Ｃ’Ｑ　　　＋’Ｑ　　　ｍ　　
　＋？）　　　（’ｌ’）　　　（Ｙ）　　　ｍ　　　
＋’Ｑ　　　（Ｑ　　　ｍ　　ＣＱｆｉ［ｌの結果は本発明の測定方法が高感度である事を
示している。ＡＩＤＳ患者血清を用いた測定結果では、
本発明の被デチドを用いた吸光度は不活性化されたＨＴ
ＬＶ　−Ｉｌｌを用いた吸光度と較べ非常に高い値とな
ることが判明した。

また、サンプルＮ［Ｌ　３３５　、３３６　、３４０　
、３４５　。

３４７　、３５７及び３６１の吸光度を見ると不活性化
されたＨＴＬＶ　−ＩＩＩを用いた結果は陰性と判断さ
れ得るが、本発明のペプチド９を用いた方法が高い特異
性と感度を有していることが証明された。

実施例７この実施例は免疫原及びワク４匹の健康なり＆ｌｂ／ｃマウスから採血し、実施例１
および２の方法によりその血清を試験した。その結果、
Ｂａ１ｂ／ｃマウスは、表■に示すように、ＨＴＬＶ　
−Ｉ［１および２１　ｍａｒペプチドの双方に対する抗
体を有しないことが明らかとなった。次に４匹のマウス
をＡおよびＢの２群に分け、次の方法で免疫した。

Ａ群蔗糖密度勾配法で精製されたＨＴＬＶ　−Ｉｎに同量の
完全フロインドアツユバンドを混合したもの２０μｇ　
／　０．：１７！を２匹のＢａ１ｂ／ａマウスに、腹腔
内および皮下の双方に注射した。次の日程に従い、免疫
を行なった。

第１回免疫　　　　０日第２回免疫　　　１４日後第３回免疫　　　２１日後第４回免疫　　　２８日後第５回免疫　　　３５日後第６回免疫　　　４２日後Ｂ群上記と同様に、２匹のＢ　ａ　１　ｂ　／ｃ　マウスに
、キャリアとしてのヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）に結
合した２　１　ｍａｒペプチドを２０　μｇ／２０１ｔ
ｌｌ　Ｈ８Ａ　ｔ　０．２ｍＡ’注射した。免疫日程も
Ａ群のそれと同様とした。

第６回免疫後、ＡおよびＢの両群から採血し、西洋わさ
び被ルオキシダーゼ標識やキ抗マウスＩｇＧを第２抗体
として使用し、実施例１および２の方法で血清を測定し
た。その結果を表■に示す。

その結果によれば、ＨＴＬＶ　−Ｉ［１で免疫されたマ
ウスから得られ念血清は２１　ｍａｒペプチドに対スる
高力価抗体とともにＨＴＬＶ　−Ｉｌｌに対する高力価
抗体を含むので、２１　ｍｏｒペプチドはＨＴＬＶ　−
ＩＩＩに存在する高免疫原エピトープを表現することが
明らかとなった。さらに、キャリアとしてのヒト血清ア
ルブミンに結合した２　１　ｍａｒペプチドで免疫され
たマウスから得た血清中のＨＴＬＶ　−１［１に対する
高力価抗体の存在によって、本発明のペプチドは健康な
晴乳動物におけるＨＴＬＶ−Ｉ［１に対する抗体の産生
を誘発する有力な免疫原であることが実証された。

加えて、本発明のペプチドの重合体もＨＴＬＶ　−ＩＩ
Ｉに対する抗体産生を誘発するために使用されうる。

合成ペプチドはウィルスの表面に存在する抗原性あるい
は、免疫性部位の代用として使用され、さらにワクチン
としても使用され得る。大きなウィルスの微小部位を表
す構造の一部を模倣させ、中和力または防御力を持つ抗
体を準備できることは非常に重要なことである。合成ワ
クチンの利点は、費用および安全性にあり、なおかつ容
易に実現できるものである。本発明ペプチドＶ′１ＨＴ
ＬＶ　−Ｉｎの優位なエピトープを表現することが判明
しているため、本発明の（デチドをキャリアと結合させ
た複合物および本発明の被プチドの重合体はＨＴＬＶ　
−ＩＩＩに対する高力価の抗体を誘発することができる
。従って本発明のペプチドは防御の目的のためにＨＴＬ
Ｖ　−Ｉ［１に対する抗体を誘発させる合成ワクチンと
して使用できる最良の候補である。

実施例８この実施例は本発明ペプチドおよび、それらとＨＴＬＶ　−Ｉｔ抗体の反応性に上述のＭｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ原法により２１ｍａｒペプチド（Ｎ［Ｌ
６）と１０個の類似ペプチド（随ｌ〜５．Ｎα７〜ｌｌ
）を調整した。各ペプチドのアミノ酸配列を表■に示す
。

ＡＩＤＳと診断され、ＨＴＬＶ　−ＩＩに対する抗体を
もつ患者から血清サンプルを得た。上記ＡＩＤＳ血清サ
ンプルに対してコーティング抗原として各イブチドを用
いて、実施例１によるＥＬＩＳＡテストを行った。

各ペプチドの反応性は、２１　ｍａｒ−″２デチド（随
６）の結果を１００俤として衣わした。その結果を衣■
に示す。

黛１　・　〜Ｑ　　　　　　寸ロ　　　　　　ロ

【図面の簡単な説明】

第１図は、（４）本発明のにデチドと（Ｂ）不活性ＨＴ
ＬＶ　−ＩＩＩでマイクロプレートのウェル内をコーテ
ィングしたマイクロプレートを用いたＥＩＪＳＡ法を使
用してＡＩＤＳ患者の血清を検査した際のデータと（ａ
）本発明のペプチドと（ｂ）不活性ＨＴＬＶ−Ｉｎウィ
ルスを使ってＥＬＩＳＡ法で正常な血清を検査した際の
データとを比較したグラフ図である。出願人代理人　升埋士　鈴　江　武　彦

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、プリ−ＡＩＤＳの診断および
ＨＴＬＶ−IIIに対する抗体を検出するためのペプチド
であって以下のアミノ酸配列式で特定されるペプチドお
よびその類似体から選択されたペプチド。【アミノ酸配列があります】（ここでＡｌａ＝アラニン、Ａｒｇ＝アルギニン、Ａｓｐ＝アス
パラギン酸、Ｃｙｓ＝システィン、Ｇｌｎ＝グルタミン
、Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｇ１ｙ＝グリシン、Ｉｌｅ＝
イソロイシン、Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｌｙｓ＝リジン、Ｓ
ｅｒ＝セリン、Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｔｙｒ＝チロ
キシン、およびＶａｌ＝バリン）。
（２）ＨＴＬＶ−IIIに対する抗体の検出およびＡＩＤ
Ｓ、ＡＲＣまたはＰｒｅ−ＡＩＤＳの診断のための方法
であって、次のことを具備したもの。ａ、アミノ酸配列式【アミノ酸配列があります】で特定
されるペプチドおよびその類似体から選択されたペプチ
ドを準備することここで、Ａｌａ＝アラニンＡｒｇ＝アルギニンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｃｙｓ＝システィンＧｌｎ＝グルタミンＧｌｕ＝グルタミン酸Ｇ１ｙ＝グリシンＩｌｅ＝イソロイシンＬｅｕ＝ロイシンＬｙｓ＝リジンＳｅｒ＝セリンＴｒｐ＝トリプトファンＴｙｒ＝チロシン、およびＶａｌ＝バリンｂ、免疫測定法でＨＴＬＶ−IIIに対する抗体を検出す
るため、適量の前記ペプチドを抗原として使用すること
。
（３）免疫測定法がＥＬＩＳＡである特許請求の範囲第
２項記載の方法。
（４）免疫測定法がＩＲＡＭＡである特許請求の範囲第
２項記載の方法。
（５）各試験につき、ｐＨ約７〜１０の緩衝液中で約０
．１〜２０μｇのペプチドを抗原として使用する特許請
求の範囲第３項記載の方法。
（６）各試験につき、ｐＨ約７〜１０の緩衝液中で約１
μｇのペプチドを抗原として使用する特許請求の範囲第
３項記載の方法。
（７）緩和液がｐＨ約９〜１０の１０ｍＭ重炭酸塩緩衝
液である特許請求の範囲第５項記載の方法。
（８）緩衝液がｐＨ約９．５の１０ｍＭ重炭酸塩緩衝液
である特許請求の範囲第６項記載の方法。
（９）緩衝液がｐＨ約７〜８の５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝
液である特許請求の範囲第５項記載の方法。
（１０）緩衝液がｐＨ約７．５の５０ｍＭのＴＲＩＳ緩
衝液である特許請求の範囲第５項記載の方法。
（１１）各試験につき、ｐＨ約７〜１０の緩衝液中で約
０．１〜２０μｇのペプチドを抗原として使用する特許
請求の範囲第４項記載の方法。
（１２）各試験につき、ｐＨ約７〜１０の緩衝液中で約
１μｇのペプチドを抗原として使用する特許請求の範囲
第４項記載の方法。
（１３）緩衝液がｐＨ約９．５の１０ｍＭ重炭酸塩緩衝
液である特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１４）緩衝液がｐＨ約９．５の１０ｍＭ重炭酸塩緩衝
液である特許請求の範囲第１２項記載の方法。
（１５）緩衝液がｐＨ約７〜８の５０ｍＭのＴＲＩＳ緩
衝液である特許請求の範囲第１３項記載の方法。
（１６）緩衝液がｐＨ約７．５の５０ｍＭのＴＲＩＳ緩
衝液である特許請求の範囲第１４項記載の方法。
（１７）ＨＴＬＶ−IIIに対する抗体の検出ならびにＡ
ＩＤＳ、ＡＲＣおよびｐｒｅ−ＡＩＤＳの診断のための
試験キットであって免疫吸着剤として以下のアミノ酸配
列式で特定されるペプチドおよびその類似体から選択さ
れたペプチドを具備するもの。【アミノ酸配列があります】ここで、Ａｌａ＝アラニンＡｒｇ＝アルギニンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｃｙｓ＝システィンＧｌｎ＝グルタミンＧｌｕ＝グルタミン酸Ｇｌｙ＝グリシンＩｌｅ＝イソロイシンＬｅｕ＝ロイシンＬｙｓ＝リジンＳｅｒ＝セリンＴｒｐ＝トリプトファンＴｙｒ＝チロシン、およびＶａｌ＝バリン
（１８）哺乳動物におけるＨＴＬＶ−IIIに対する抗体
の産生を誘発するためのワクチンであって、以下のアミ
ノ酸方式【アミノ酸配列があります】で特定されるペプチドまたはその類似体より構成される
もの。Ａｌａ＝アラニンＡｒｇ＝アルギニンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｃｙｓ＝システィンＧｌｎ＝グルタミンＧｌｕ＝グルタミン酸Ｇｌｙ＝グリシンＩｌｅ＝イソロイシンＬｅｕ＝ロイシンＬｙｓ＝リジンＳｅｒ＝セリンＴｒｐ＝トリプトファンＴｙｒ＝チロシンおよびＶａｌ＝バリン
（１９）前記ペプチドが蛋白質に結合している特許請求
の範囲第１８項記載のワクチン。
（２０）前記ペプチドがヒト血清アルブミンに結合して
いる特許請求の範囲第１９項記載のワクチン。
（２１）前記ペプチドがポリマーに結合している特許請
求の範囲第１８項記載のワクチン。
（２２）免疫測定法に血球凝集法である特許請求の範囲
第２項記載の方法。
（２３）免疫測定法が酵素免疫ドット法である特許請求
の範囲第２項記載の方法。
（２４）以下のアミノ酸配列式【アミノ酸配列があります】で特定されるペプチドまたはその類似体を使用すること
による、哺乳動物におけるＨＴＬＶ−IIIに対するモノ
クローナル抗体の製造のための免疫源。ここで、Ａｌａ＝アラニンＡｒｇ＝アルギニンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｃｙｓ＝システィンＧｌｎ＝グルタミンＧｌｕ＝グルタミン酸Ｇｌｙ＝グリシンＩｌｅ＝イソロイシンＬｅｕ＝ロイシンＬｙｓ＝リジンＳｅｒ＝セリンＴｒｐ＝トリプトファンＴｙｒ＝チロシン、およびＶａｌ＝バリン
（２５）前記ペプチドが蛋白質に結合している特許請求
の範囲第２４項記載の免疫原。
（２６）前記ペプチドがヒト血清アルブミンに結合して
いる特許請求の範囲第２４項記載の免疫原。
（２７）前記ペプチドがポリマーに結合している特許請
求の範囲第２４項記載の免疫原。
（２８）アミノ酸配列式【アミノ酸配列があります】で
特定されるペプチドまたは、その類似体を使用することによる、哺乳動物におけるＨ
ＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体の製造のため
の免疫原。Ａｌａ＝アラニンＡｒｇ＝アルギニンＡｓｐ＝アスパラギン酸Ｃｙｓ＝システィンＧｌｎ＝グルタミンＧｌｕ＝グルタミン酸Ｇｌｙ＝グリシンＩｌｅ＝イソロイシンＬｅｕ＝ロイシンＬｙｓ＝リジンＳｅｒ＝セリンＴｒｐ＝トリプトファンＴｙｒ＝チロシン、およびＶａｌ＝バリン
（２９）前記ペプチドが蛋白質に結合している特許請求
の範囲第２８項記載の免疫原。
（３０）前記ペプチドがヒト血清アルブミンに結合して
いる特許請求の範囲第２８項記載の免疫原。
（３１）前記ペプチドがポリマーに結合している特許請
求の範囲第２８項記載の免疫原。
（３２）特許請求の範囲第２４項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するモノクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３３）特許請求の範囲第２５項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するモノクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３４）特許請求の範囲第２６項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するモノクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３５）特許請求の範囲第２７項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するモノクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３６）特許請求の範囲第２８項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するポリクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３７）特許請求の範囲第２９項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するポリクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３８）特許請求の範囲第３０項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するポリクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（３９）特許請求の範囲第３１項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するポリクロ
ーナル抗体を産出するための方法。
（４０）前記ペプチドの重合体である特許請求の範囲第
１８項記載のワクチン。
（４１）前記ペプチドの重合体である特許請求の範囲第
２４項記載の免疫原。
（４２）前記ペプチドの重合体である特許請求の範囲第
２８項記載の免疫原。
（４３）特許請求の範囲第４１項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するモノクロ
ーナル抗体を産出する方法。
（４４）特許請求の範囲第４２項記載の免疫原を使用し
て、哺乳動物においてＨＴＬＶ−IIIに対するポリクロ
ーナル抗体を産出する方法。
（４５）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質中に存
在するエピトープに一致するアミノ酸配列を有する生体
外で合成されたペプチド。
（４６）以下のアミノ酸配列式（ａ）【アミノ酸配列があります】（ｂ）【アミノ酸配列があります】（ｃ）【アミノ酸配列があります】（ここで、Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｇｌｙ＝グリシン
、Ｃｙｓ＝システィン、Ｓｅｒ＝セリン、Ａｓｐ＝アス
パラギン酸、Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ａｌａ＝アラニン、Ｖａｌ＝バ
リン、Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ａｒｇ＝アルギニン、Ｔ
ｙｒ＝チロシン、およびＬｙｓ＝リジン）から選択され
たアミノ酸配列式によって表されるペプチドを少なくと
もその一部に有する特許請求の範囲第４５項記載のペプ
チド。
（４７）前記類似体は前記アミノ酸配列式の端部からｎ
個（ｎ＝１、２…）のアミノ酸の消除である特許請求の
範囲第１項記載のペプチド。
（４８）前記類似体は少なくとも１５個のアミノ酸を有
する特許請求の範囲第４７項記載のペプチド。
（４９）特許請求の範囲第３２項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するモノクローナル抗体。
（５０）特許請求の範囲第３３項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するモノクローナル抗体。
（５１）特許請求の範囲第３４項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するモノクローナル抗体。
（５２）特許請求の範囲第３５項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するモノクローナル抗体。
（５３）特許請求の範囲第４３項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するモノクローナル抗体。
（５４）特許請求の範囲第３６項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体。
（５５）特許請求の範囲第３７項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体。
（５６）特許請求の範囲第３８項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体。
（５７）特許請求の範囲第３９項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体。
（５８）特許請求の範囲第４４項の方法により調製され
たＨＴＬＶ−IIIに対するポリクローナル抗体。