JPS63500524A - マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含み、前記接種材料を哺乳動物宿主中へ 有効量導入すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の 生成を誘発できる接種材料。

３、ポリペプチドが担体に結合される。請求の範囲第２項記載の合成ポリペプチ ド接種材料。

４、　ポリペプチドが約１００μｇ〜約５００■毎用量の量で存在する単位投薬 形態にある、請求の範囲第２項記載の合成ポリペプチド接種材料。

５、合成免疫原に対して生起された抗体結合部位を含む受容体分子であって、合 成免疫原が約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端から カルボキシ末端の方向に書いて式： ％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含み、前記受容体が結核性マイコバクテ リウムに対して抗原と免疫反応する受容体分子。

６、結核性マイコバクテリウムの存在について検定するキット形態の診断装置で あって、 （１１）約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカ ルボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して生起され た受容体分子、および（ト））受容体分子の結核性マイコバクテリウムに対する 抗原との免疫反応を示す指示手段、 を含む診断装置。

７、全抗体が前記受容体分子である、請求の範囲第６項記載の診断装置。

８、受容体分子が溶液または液体形態で前記指示手段とは別のバフケージ中で提 供される、請求の範囲第６項記載の診断装置。

９、受容体分子が凍結乾燥形態で別のバフケージ中で提供される、請求の範囲第 ６項記載の診断装置。

ｌＯ０受容体分子が指示手段で標識される、請求の範囲第６項記載の診断装置。

１１、指示手段が増幅試薬と免疫反応する標識抗体である、請求の範囲第６項記 載の診断装置。

１２．４１１抗体が螢光色素染料で標識される、請求の範囲第１１項記載の診断 装置。

１３、標識抗体が螢光性イソチオシアネートで標識される、請求の範囲第１１項 記載の診断装置。

１４、標識抗体が酵素で標識される、請求の範囲第１１項記載の診断装置。

１５、体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体について検定する方法であっ て、 （ａ）　検定する体試料を提供する段階、山）　前記体試料を、約１３〜約４０ 個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書 いて、式： ％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドと混合する段階、 （Ｃ１前記混合物を、前記試料中に存在する抗結核性マイコバクテリウム抗体に 対する前記ポリペプチドとの免疫反応に十分な予定時間維持する段階、および ＋ｄ＋　前記免疫反応の存在を測定する段階、を含む方法。

１６、体試料が血液、血清および血漿からなる群から選ばれる、請求の範囲第１ ５項記載の方法。

１７、さらに、前記混合の前に前記ポリペプチドを固体支持体に結合させる段階 を含む、請求の範囲第１５項記載の方法。

１８、体成分中の結核性マイコバクテリウムの抗原に対する抗体の存在を検定す るキット形態の診断装置であって、（ａ）　約１３〜約４０個のアミノ酸残基を 含み、左から右へアミノ酸末端からカルボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチド、および 伽）　前記ポリペプチドの結核性マイコバクテリウムの抗原に対する抗体との免 疫反応を示す指示手段、を個々のパッケージ中に含む診断装置。

１９、さらに、前記ポリペプチドを結合できる固体マトリックスを含む、請求の 範囲第１８項記載の診断装置。

２０、合成ポリペプチドを前記固体マトリックスに結合させて固体支持体を特徴 する請求の範囲第１９項記載の診断装置。

２１、固体マトリックスがポリスチレン、ポリ塩化ビニル、およびニトロセルロ ースからなる群から選ばれる、請求の範囲第１９項記載の診断装置。

２２、固体マトリックスが、複数のウェルを含むマイクロタイターストリップで ある、請求の範囲第１９項記載の診断装置。

２３、指示手段がヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体と免疫反応できる標識抗 体である、請求の範囲第１８項記載の診断装置。

２４、標識抗体がアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β −Ｄ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼからなる酵素の群から選 ばれる酵素で標識される、請求の範囲第２３項記載の診断装置。

２５、体試料中の結核性マイコバクテリウムに対して抗原の存在を検定する方法 であって、 （ａ）　検定する体試料を提供する段階、世）　約１３〜約４０個のアミノ酸残 基を有し、左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して生起され た抗体結合部位を含む受容体分子を混合する段階、 前記ポリペプチドは担体に結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入すると前記 体試料中に存在する結核性マ・イコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗 体の生成を誘発できる、 および （ｄｌ　前記免疫反応の量を測定する段階、を含む方法。

２６、体試料がリンパ球および腫瘍ｍ織からなる群から選ばれる、請求の範囲第 ２５項記載の方法。

２７、約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して免疫結合 したヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体を含む免疫反応生成物。

２８、約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドであって、担体に 結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入すると結核性マイコバクテリウムに対 して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発することができ、またヒト抗結核性マ イコバクテリウム抗体と免疫反応することができる合成ポリペプチド。

２９、複数の結合した合成ポリペプチド繰返し単位を含む合成マルチマーであう で、前記繰返し単位が約１４〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミ ノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式： ％式％ により示されるアミノ酸残基配列を含む少くとも１つの合成ポリペプチドを含み 、 前記ポリペプチド繰返し単位が担体に結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入 すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発 することができる合成マルチマー。

３０、ポリペプチド繰返し単位がアミド結合またはジスルフィド結合により互い に結合される、請求の範囲第２９項記載のマルチマー。

３１、結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体を誘発するの に適し、複数の結合し”た合成ポリペプチド繰返し単位であって約１４〜約４０ 個のアミノ酸残基を含む少（とも１つの合成ポリペプチドを含む繰返し単位を含 む合成マルチマーを生理的に許容される希釈剤中に有効量溶解または分散して含 む合成接種材料であって、前記ポリペプチドが左から右ヘアミノ末端からカルボ キシ末端の方向に書いて式：％式％ により示されるアミノ酸残基配列を含み、前記接種材料が有効量を哺乳動物宿主 中へ導入すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生 成を誘発することができる接種材料。

３２、マルチマーが担体に結合される、請求の範囲第３１項記載の合成接種材料 。

３３、マルチマーが約１０μｇ〜約５００■毎用量の量で存在する単位投薬形態 にある、請求の範囲第３１項記載の合成接種材料。

３４、宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定する診断装置であっ て、左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって式： ％式％ からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する少くとも１つの合成ポリペプ チドを含み、前記合成ポリペプチドが、生理的に許容される希釈剤中で宿主に皮 内投与されると宿主中に胸腺誘導細胞の増殖を誘発することができ、前記増殖が 皮内投与の部位における紅斑および硬化により示される診断装置。

３５、生理的に許容される希釈剤が水、食塩水およびアジュバントからなる群の 一員である、請求の範囲第３４項記載の診断装置。

３６、合成ポリペプチドが担体に結合される、請求の範囲第３４項記載の診断装 置。

３７、担体がキーホールリンペットヘモシアニン、不完全フロインドアジュバン ト中のキーホールリンペットヘモシアニン、ミョウバン、キーホールリンペット ヘモシアニン−吸着ミＥウバン、キーホールリンペットヘモシアニン−吸着ミョ ウバン−百日咳、エデスチン、サイログロブリン、破傷風トキソイド、不完全７ ０インドアジユバント中の破傷風トキソイド、コレラトキソイドおよび不完全フ ロインドアジュバント中のコレラトキソイドからなる群から選ばれる、請求の範 囲第３６項記載の診断装置。

３８、結核性マイコバクテリウム抗原に対して前に免疫処置した宿主中の胸腺誘 導細胞の増殖を誘発させる方法であって、（ａ）　左から右ヘアミノ末端からカ ルボキシ末端の方向にとって式： ％式％ からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する合成ポリペプチドを提供し、 ら）　前記合成ポリペプチドの有効量を生理的に許容される希釈剤中で宿主に投 与する、 ことを含む方法。

３９、段階（ａ）の後で段階（ハ）の前に、前記ポリペプチドを担体に結合させ て接合体を形成する段階を含む、請求の範囲第３８項記載の方法。

４０、宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定する方法であって、 （ａ）　左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって式： ％式％ からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する合成ポリペプチドを提供し、 （ｂ）　生理的に許容される希釈剤中に溶解または分散した前記合成ポリペプチ ドの有効量を皮内投与して宿主中に胸腺誘導細胞の増殖を誘発させ、それにより 前記増殖および宿主中（７）結核性マイコバクテリウム抗原の存在が皮内投与の 部位における紅斑および硬化により示されることを含む方法。

明細書 マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド技術分野 本発明はマイコバクテリウム感染を含む疾患の検出、診断および治療に有用な免 疫原、抗原、接種材料、抗体、方法および装置に関する。

発明の背景 マイコバクテリウムは長い間ヒトの細菌病原体として認められ、殊に発展途上国 において破壊的疾病を生じ続けている。世界保健機関、ビュレチン・オブ・ザ・ ワールド・ヘルス・オーガニゼーシａ７（Ｂｕｌｌ、ＷＨＯ，６１，７７９（１ ９８３）。

結核症は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　） （Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　）で呼吸性感染により起され、現在世界中 で約３千万人が苦しみ、年間約３百万人が死亡する。

粗細菌抗原調製物が免疫診断および免疫予防目的に使用されてきた。１８８１年 にコツホ（Ｋｏｃｈ）により開発されたツベルクリン試験はヒトに使用された最 初の免疫診断試験であった。

ツベルクリン、複雑でしかし十分には規定されていない組成物の結核菌（Ｍ、　 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）濾液、は現在病原体に対する前暴露の検出に対する 遅延型皮膚過敏症（ＤＣＨ）または皮膚試験抗原として使用されている。セイバ ート（５ｅｉｂｅｒｔ）ほか、アメリカン・レビュー・オブ・ツペルクローシス （Ａｍ、　Ｒｅｖ、Ｔａｂｅｔｃ、）。

６９．５８５　（１９５４）。残念ながらツベルクリンの有用性はその特異性の 不足により、および活性疾患、結核菌（Ｍ。

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　）との接触による前感作、または他のマイコバクテ リウムに対する交差感受性の間を識別する能力のないことにより制限される。

カルメント・ゲラン菌（ＢＣＧ）、ウシ結核菌（、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕ ｍ　ｂｏｖｉｓ）ＣＭ、　ｂｏｖｉｓ　）の無毒性株、は現在生ワクチンとして ヒトにおける結核に対する保護に使用されている、カルメソト（Ｃａｌｍｅｔｔ ｅ、　Ａ、）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエーシ ョン（Ｊ、　Ａｓｈ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）＋　９６．　５８（１９３１ ）、ＢＣ（、は西欧において結核症の発生率の低下に有効であった〔メディカル ・リサーチ・カランセル（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　 ）＋ビュレチン・オブ・ザ・ワールド・ヘルス・オーガニゼーション（Ｂｕｌｌ 、　ＷＨＯ）、玉６．３７１（１９７２））けれども、インドにおける多くの試 験で有効でないことが最近認められた〔世界保健機関、ワールド・ヘルス・オー ガニゼーシコン・テクニカル・レポート・シリーズ（ＷＨｏＴｅｃｈ、　Ｒｅｐ 、　Ｓｅｒ、　）、６５１　（１９８０）　）。

現在マイコバクテリウム感染の検出に使用されている粗抗原調製物に関する基本 的問題は抗原調製物がしばしば若干の異なるマイコバクテリウム種と陽性に反応 することである。これはもちろん、診断および適切な治療規制の選択を複雑にす る。個々のマイコバクテリウム種に対して免疫応答を特異的に生ずる試薬はマイ コバクテリウム感染の診断および管理に有益であろう。

ＤＣＨ反応において規定されたポリペプチド抗原を使用する利点は数多（ある０ 例えばマイコバクテリウム感染の場合に、ポリペプチドのアミノ酸残基配列が結 核性マイコバクテリウム種中に特異的に発現されるタンパク質の部分に相当すれ ば、該ポリペプチドは結核性マイコバクテリウム感染を特異的に検出し、それに より現在使用されている皮膚試験抗原に関連する交差反応性の問題を回避する有 用な試薬であることができる。さらに、ポリペプチドは化学的に合成し、皮膚試 験抗原の生成のために病原性微生物の大培養を成長させる必要を排除することが できる。

ポリペプチドはまたマイコバクテリウム感染の検出または予防（予防接種）に使 用することができる。事実、ポリペプチドを含む接種材料はヒトにおける結核症 を検出するＤＣＨまたは皮膚試験において選択する抗原としてツベルクリンまた はＰＰＧ（精製タンパク質誘導体）を置換することができた。

合成抗原（免疫原）の製造およびそれを予定特異性の抗体の誘発に使用する一般 的概念が記載されたけれども、この技術の予測可能性を拒み続けている大きい領 域が残っている。これには少くとも２つの理由がある。第１に、合成抗原（免疫 原）が必らずしもその自然環境中の無傷タンパク質と免疫反応する抗体を誘発し ない、第２に、自然発生免疫原例えばウィルスタンパク質に対する宿主の自然抗 体がほとんど免疫原のアミノ酸残基配列の短かい線状部分に相当するポリペプチ ドと免疫反応しない、この後者の現象は短かい線状ポリペプチドが必要な二次お よび三次の配座構造を欠く結果であると思われる。

タンパク質に対して作られた抗体によるペプチドの結合に関する多くの研究がベ ンジャミニ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、　Ｅ、）ほか、カレント・トピックス・イン ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃ ｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩ＋＊ｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、５ ８．　８５　（１９７２）　、による総説に要約されている。抗体結合における ペプチド構造の役割はグツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｊ、　Ｗ、　Ｌイムノケ ミストリー（Ｉｓｍｕｎｏｃｈｅｍ、　）　＋１．１３９　（１９６９）、によ り強調されている。

抗体結合に関するペプチドの配列における変化の効果を含む研究の多くは抗体結 合部位の構造が主要役割を果たすことを示すと解釈された。これらの研究におけ る配列および構造の変化の効果は混り合い、分離することは困難である。これら の研究の若干は結合を行なう抗原中の構造変化により同様によく説明することが できる。

分子水準における抗体応答には規定配列（−次構造）および規定配座（二次およ び三次構造）における抗原の結合が含まれる。タンパク質抗原に対する免疫応答 は伝統的にタンノくり質の一次、二次または三次構造を指向すると解明された。

この分類図式は生理的温度および溶液において明確な全体構造を有するタンパク 質に対して若干の妥当性を有することができる。しかし、その妥当性はより動的 な構造を有するペプチド抗原に対しては疑わしい。

発明の概要 本発明は結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘 発できる合成ポリペプチドを意図する。該ポリペプチドは約１３〜約４０個のア ミノ酸残基を含み、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて 式：％式％ により示されるアミノ酸残基配列を包含する。該ポリペプチドはアミノ末端およ びカルボキシ末端の１方または両方にシスティン（Ｃｙｓ）残基を含むことがで きる。

該ポリペプチドは、担体に結合して有効量を哺乳動物宿主中へ導入すると結核性 マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発することがで きる０本発明にはまたポリペプチドの製剤に許容される塩および抗原関連変異体 が含まれる。

該ポリペプチドはまた結核性マイコバクテリウムに対して天然抗原によって誘発 されたヒト抗体と免疫反応することができる。

本発明はまた少くとも１つの繰返し単位が上記ポリペプチドである複数の結合し た合成ポリペプチド繰返し単位を含む合成マルチマーを意図する。ポリペプチド 繰返し単位はアミド結合により頭−尾のように結合することができる。あるいは 、合成ポリペプチドモノマーはアミド結合以外によって結合し、分子内、ポリペ プチド間システィンジスルフィド結合の使用により高分子マルチマーを形成する ことができる。

他の態様において、本発明のポリペプチドの有効量を、生理的に許容される希釈 剤中で使用して結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体を誘 発することができる接種材料を形成する。抗体の生成に対する使用に加えて、本 発明の接種材料はマイコバクテリウム感染に対する活性免疫を誘発する手段とし てヒトにおけるワクチンとして用いることができる。

なお他の態様において、結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する ことができる抗体結合部を含む受容体が意図される。該受容体は上記合成ポリペ プチドを単独にまたは接合体として含む合成免疫原に対して生起される。

また結核性マイコバクテリウムに対して抗原の存在について検定する診断装置が 意図される。該診断装置は前記受容体分子および結核性マイコバクテリウムに対 して抗原と結合する部位の免疫反応を示す指示手段を含む。

さらに、体成分中の結核性マイコバクテリウムに対して抗原に対する抗体分子の 存在について検定する診断装置が意図される。そのような診断装置は前記合成ポ リペプチドおよび結核性マイコバクテリウムに対して抗原に対する抗体分子との ポリペプチドの免疫反応を示す指示手段を含む、より好ましい態様において、該 装置はまたポリペプチドを結合させる固体マトリックスからなる固体担体を含む 、免疫反応した抗体分子のアイソタイプを確認する手段もまた装置中に含むこと ができる。

他の態様において、本発明には結核性マイコバクテリウム抗原のアミノ酸配列に 相当するアミノ酸残基配列を有する前記合成ポリペプチドを含む宿主中の結核性 マイコバクテリウム抗原に対する細胞仲介免疫応答性の存在を測定する診断装置 が含まれる。該ポリペプチドは、有効量を生理的に許容される希釈剤中で宿主の 皮肉に投与すると宿主中の胸腺誘導細胞の増殖を誘発することができる。増殖は 皮肉投与の部位における紅斑（赤さ）および硬化により示される。

結核性マイコバクテリウムに対し前に免疫処置された宿主中の胸腺誘導細胞の増 殖を誘発する方法および宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定す る方法もまた開示される。

該方法には、後者の方法による論議したポリペプチドを提供する段階および有効 量のポリペプチドを生理的に許容される希釈剤中で宿主に皮肉投与する段階が含 まれ、胸腺誘導細胞の増殖および宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在 は皮肉投与の部位における紅斑および硬化により示される。

本発明は若干の利点および利益を提供する０本発明の利点の１つは合成ポリペプ チドの使用が相当する無傷タンパク質の存在の必要性を排除することである。ポ リペプチド自体が疾患から宿主を保護するワクチンを提供することができる。従 って、細菌から有用量のウィルスタンパク質を生成させることに関連する不純物 例えば細胞の破片および毒素が本発明の生成物に存在しない。

図面の簡単な説明 第１図はミンデン（Ｍｉｎｄｅｎ）ほか、インフェクシッン・アンド・イミユニ ティ（Ｉｎｆｅｃｔ、ｌ５ｓｕｎ、）　＋±６．　５１９　（１９８４）により 決定されたウシ結核菌（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ　）のＢＣＧ−ａタンパク質のアミノ 末端部の２０個のアミノ酸残基を示す、ＢＣＧ−ａタンパク質の初めの１２個の アミノ酸残基を含む合成ポリペプチドもまた示される。第１の例において合成ポ リペプチドはカルボキシ末端にシスティン残基を包含する。第２の例において、 合成ポリペプチドはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方にシスティン残基を 包含する。

発明の詳細な説明 ■　緒 結核性マイコバクテリウムに感染されたヒトはマイコバクテリウムに関連する抗 原に対して抗体を生ずる。ヒトにおける結核性マイコバクテリウムおよび抗結核 性マイコバクテリウム抗体に対する検定に使用する伝統的臨床技術は厄介である 。さらに、細胞培養からの結核性マイコバクテリウムに対する抗原を精製する現 在の操作は大量生産に容易に適応できない。

本発明は現在の方法の問題の若干を克服する合成ポリペプチド技術の使用を意図 する。比較的短かい合成ポリペプチドは天然タンパク質上の抗原決定基を免疫的 に模倣することができ、従って、天然タンパク質を認識する予定特異性の抗体の 生起に使用することができる。

「免疫的に模倣する」という語は、ここに本発明の免疫原ポリペプチドが誘発ポ リペプチドに、また無傷タンパク質中の同種配列に結合する抗体の生成を誘発す る意味に使用される。この現象は実験的および臨床的の両方に使用できる。

実験的には合成ポリペプチドに対する抗体はＤＮＡ解読わく、従って臨床的に重 要なタンパク質例えばウシ結核菌＜Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）のＢＣＧ−ａタンパク質 のアミノ酸残基配列の確立に使用できる。臨床的には、合成ポリペプチドに対し て生起される予定特異性の抗体を診断および治療目的に使用できる。

アミノ酸残基配列が結核性マイコバクテリウム抗原のそれに実質的に相当する比 較的短かいポリペプチドが合成された。

特定的には、本発明にはウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ ）株ＢＣＧのＢＣＧ−ａタンパク質のアミノ酸残基配列の部分に実質的に相当す るアミノ酸残基配列を有する合成ポリペプチドが含まれる。このタンパク質はミ ンデン（Ｍｉｎｄｅｎ　）ほか、インフエクション・アンド・イミユニティ（Ｉ ｎｆｅｃｔ、　ｒｍｍｕｎ、　）　。

４６．５１９　（１９８４＞により結核性マイコバクテリウム〔ウシ結核菌（Ｍ 、ｂｏｖｉｓ）および結核菌（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　］により特 異的に発現されるタンパク質として確認された。上記刊行物に報告されたように 、ミンデン（Ｍｉｎｄｅｎ　）ほかはこのタンパク質のアミノ末端２０残基の配 列を決定した（第１図の第１アミノ酸残基配列参照）。

本発明によれば、ＢＣＧ−ａタンパク質の残基１〜１２に相当するアミノ酸残基 配列を有しカルボキシ末端においてシスティンを有するポリペプチドが合成され （第１図の第２アミノ酸残基配列参照）、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）株ＢＣ Ｇの音波抽出物で免疫処置したモルモットに対し遅延皮膚過敏症反応を誘発する ことが示された。

さらに、前記のように免疫処置したモルモットにおいてＢＣＧ−ａタンパク質の 残基１〜１２に相当するが、しかしアミノ末端およびカルボキシ末端の両方にシ スティン（Ｃｙｓ）残基を含むアミノ酸残基配列を有するポリペプチドにより一 層著しい遅延型皮膚過敏症反応が誘発された（第１図の第３アミノ酸残基配列参 照）。

これらの結果は、このポリペプチドがヒトにおける結核性マイコバクテリウム感 作を特異的に検出する皮膚試験に使用できることを示す、該ポリペプチドはまた 現在使用される遅延型皮膚過敏症抗原に関連する交差反応の問題の回避に使用で きる。

本ポリペプチドはヒトにおける結核症を検出するＤＣＨ試験において選択される 抗原としてツベルクリンまたはＰＰＤを置換することができる。

Ａ１合成ポリペプチド １、配列 この研究に用いた比較的小さい合成ポリペプチド（長さ１３〜２０個のアミノ酸 残基）はメリフィールド（ＭｅｒｒＨ３ｅｌｄ　）ほか、ジャーナル・オブ・ジ ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ　（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｉ＋、　Ｓｏ ｃ、　）、８５．　２１４９　（１９６３）の固相法を用いて合成した。

用いた「合成」という語はポリペプチド分子またはポリペプチド繰返し単位が、 生物学的方法による例えば遺伝子工学技術によるよりもむしろ化学的方法により 作られた、すなわち化学的に合成されたことを意味する。従って、本発明を具体 化する合成ポリペプチドは天然産出タンパク質およびそのフラグメントを含まな い。

従うて・化学合成ポリペプチドはまたタンパク賃上のブロモシアンの作用により 製造される天然産出タンパク質の分解生成物とは異なる。ブロックしたアミノ酸 残基を連続的に追加して所望のポリペプチドを得る周知の固相化学合成は好まし い合成法であり、後により詳細に論議される。

ここに確認されるすべてのアミノ酸残基は天然またはＬ−配置にある。標準ポリ ペプチド命名法に一致させたアミノ酸残基の略語は次のとおりであるニ ーー起−−豆−−アミノ Ｓ　Ｓｅｒ　Ｌ−セリン ｒ　Ｉｌｅ　Ｌ−インロイシン Ｌ　Ｌｅｕ　Ｌ−ロイシン ＨＨｉｓ　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　Ｇｉｎ　Ｌ−グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 Ｚ　Ｇｌｘ　Ｌ−グルタミン酸 または　Ｌ−グルタミン Ｗ　Ｔ　ｒ　ｐ　Ｌ　−）リプトファンＲＡｒｇ　Ｌ−アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　ｌ、−アスパラギン酸 Ｎ　Ａ　ｓ　ｎ　ｌ、−アスパラギン Ｂ　Ａ３Ｘ　Ｌ−アスパラギン酸 または　Ｌ−アスパラギン ＣＣｙｓ　Ｌ−システィン 本発明は約１３〜約４０個のアミノ酸残基な含み、左から右ヘアミノ末端からカ ルボキシ末端の方向に書いて式：％式％ により規定される配列を包含する合成ペプチドを意図する。該ポリペプチドは担 体に結合させて哺乳動物宿主中へ有効量を導入すると結核性マイコバクテリウム に対して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発することができる。

本発明の合成ポリペプチドは、しばしば単に「ポリペプチド」として、または「 合成ポリペプチド」として示される。その使用はＮ潔にするためである。

「抗原関連変異体」という語は１つの抗原決定基の少くとも１部を共有し、従っ て免疫交差反応性である全アミノ酸残基配列とは異なるポリペプチドを示すため に用いられている。

用いた「抗原決定基」という語は同一または関連の抗原または免疫原により誘出 された相当する抗体（免疫グロブリン）分子との特異的相互作用の原因である分 子の構造成分を示す。

用いた「免疫原決定基」という語は、抗原として用いたときに免疫原と結合する 抗体結合部位（イディオタイプ）を含む抗体の宿主内誘発の原因である分子の構 造成分を示す。

用いた「抗原」という語は抗体により結合されるエンテイテイーを意味する。

用いた「免疫原」という語は宿主動物中で抗体生成を誘発するエンテイテイーを 示す、若干の場合に抗原と免疫原は同一のエンテイテイーであるが、他の場合に は２つのエンテイテイーは異なる。

例えば後記のように、ポリペプチドはモルモット中の抗体の生成の誘発に使用さ れ、従って免疫原として使用された。そのように誘発された抗体は抗原として用 いるとポリペプチドに結合する。従ってポリペプチドは免疫原および抗原の両方 であった。抗結核性マイコバクテリウム抗体は結核性マイコバクテリウム抗原に 免疫原および抗原の両方として、並びにポリペプチドに抗原として結合する。

本発明の好ましい態様はここに記載する合成ポリペプチド、その製剤に許容され る塩、およびその抗原関連変異体である。

これらのポリペプチドはそれぞれ前記のように結核性マイコバクテリウムに対し て抗原に結合する抗体を誘発することができる。

アミノ酸残基配列の初めまたは終りにおけるダンシュは、それぞれアミノ末端お よびカルボキシ末端における基例えばＨまたはＯＨに対する結合、あるいはポリ ペプチド鎖中の合計４０個までのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上の他のアミ ノ酸残基の配列を示すことに言及される。

用いた「製剤に許容される塩」という語は製剤工業に使用されるよく知られた方 法により製造されるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウ ムおよびアンモニウム塩などを含む無毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属 塩およびアンモニウム塩を示す、その語にはまた本発明の化合物と適当な有機酸 または無機酸との反応により一般に製造される無毒性硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸 塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸 塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、 コハク酸塩、酒石酸塩などが含まれる。

Ｂ、マルチマ一 本発明はまた少くとも１つの繰返し単位がここに記載するポリペプチドである複 数の結合した合成ポリペプチド繰返し単位を含む合成マルチマーを意図する。

本発明のマルチマーは単独にまたは担体に結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ 導入すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原に結合する抗体の生成を誘発 することができる０本発明の殊に好ましい合成ポリペプチドを含むマルチマーは また結核性マイコバクテリウムに対して抗原により誘発されるヒト抗体を結合す ることができる。

従って本発明のマルチマーはポリペプチドと同様に免疫原であり、ヒト抗結核性 マイコバクテリウム抗体に対する抗原である。これらのマルチマーは従って後記 の診断法および装置に有用である抗結核性マイコバクテリウム抗体の生成の誘発 に使用することができ、適当な診断方法および装置に抗原として使用することが できる。

全マルチマー中に約３５個より少ないアミノ酸残基を含むマルチマーは典型的に は免疫原としての使用に対し担体に結合させる０合計約３５個以上のアミノ酸残 基を含むマルチマーは典型的には担体なしで使用される十分な免疫原である。

ポリペプチドマルチマーは前記固相法を用いて合成ポリペプチドモノマーを頭− 尾のように互いに結合させることにより製造することができ、すなわち１つの完 全なポリペプチド配列を樹脂上に、次に１つまたはそれ以上の同一かまたは異な るポリペプチド配列を合成し、その後全マルチマ一単位を樹脂から開裂してここ に記載するように使用することができる。そのような頭−尾ポリペプチドマルチ マーは好ましくは約２〜約４個のポリペプチド繰返し単位を含む。

あるいは、モノマーとして使用するポリペプチドのポリマーとしてマルチマーを 製造することができる。用いた「ポリマー」という語は、文字どおり種々の形態 で、ペプチド結合以外により互いに結合した複数の合成ランダムコポリマーポリ ペプチド繰返し単位を含む型のマルチマーと規定される。

本発明のポリマーの好例はアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に付加したシ スティン残基を含む本発明のポリペプチド（ジＣｙｓポリペプチド）を用いて合 成することができる。ジＣｙｓポリペプチドは酸化操作を用いて分子内、ポリペ プチド間システィンジスルフィド結合により互いに結合させて免疫原性抗原性ポ リマーを形成することができる。そのように調製されたポリマーは複数の本発明 の合成ポリペプチドを繰返し単位として含む、これらの繰返し単位は前記の酸化 されたシスティン（シスチン）残基により互いに結合している。

ポリペプチドを担体に結合させるため、またはポリマーを製造するための本発明 のポリペプチド中の１つまたは２つの末端Ｃｙｓの存在が本発明のポリペプチド 繰返し単位のアミノ酸配列を改変すると解すべきではない。

Ｃ０接種材料 他の観点において本発明のポリペプチドを製剤に許容される希釈剤中に使用し、 有効量を投与したときに結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する 抗体を誘発することができる接種材料またはワクチンを形成させる。

「接種材料」という語はその文字通り種々の形態で本発明のポリペプチドを結核 性マイコバクテリウムに対する抗体の製造に用いる活性成分として含む組成物を 記載するために使用されている。ポリペプチドを抗体の誘発に使用するとき、ポ リペプチドは単独に、担体と結合させて、またはマルチマーとして使用すること ができるが、しかし表現を容易にするために以下にこれらの代替が常に示されて いるとは限らないことを理解すべきである。

約３５個末端のアミノ酸残基を含むポリペプチドには抗体の生成を誘発するため に担体を用いることが好ましい、担体に結合または連結したポリペプチドは抗体 を調製する場合に例示的に使用される。接種材料を用いて結核性マイコバクテリ ウムに対して抗原を検出する診断検定に使用する抗体を生成させることができる 。

「ワクチン」という語はその文字通り種々の形態において、本発明のポリペプチ ドを宿主哺乳動物中の活性免疫の誘発に使用する活性成分として含む型の接種材 料を記載するために使用されている。活性免疫には抗体の生成が含まれるので、 従ってワクチンまたは接種材料は等しい成分を含むことができるが、しかしその 用法は異なる。多くの場合に動物において使用できるアジュバントの多くがヒト において使用できないのでワクチンと接種材料との成分は異なる。

この接種材料またはワクチンは有効量の本発明のポリペプチドをマルチマー例え ば酸化されたポリペプチド末端システィン残基により互いに結合した個々のポリ ペプチドのポリマーとして、または担体に結合した接合体として含む、しかし、 表現を容易にするために本発明の種々の態様のポリペプチドおよびその文字どお り種々の形態が「ポリペプチド」という語により総括的に示されている。

単位用量当りのポリペプチドの有効量はよく知られているように、とりわけ接種 動物の種、動物の体重および選ばれる接種用法に依存する。接種材料およびワク チンは、典型的には接種（用量）当り約１００μｇ〜約５００■のポリペプチド 濃度を含む、上記量のポリペプチドは担体を用いるときに担体の重量を含まない ポリペプチドの重量を示す、特定の好例接種材料は後に担体プラスポリペプチド （接合体）の重量で示して記載される。

「単位量」という語は動物に対する１回の投薬に適する物理的に分離された単位 を示し、各単位は所要希釈剤、すなわち担体、またはビヒクルに関連して所望の 治療効果を生ずるように計算された予定量の活性物質を含む０本発明の新規な単 位量に対する仕様は、明細書に詳細に記載されるように、（ａ）活性物質の特を の特性および達成させる個々の治療効果、および伽）動物における治療用にその ような活性物質を配合する技術に固有の制限により指令され、それらに直接依存 し、これらは本発明の特徴である。

接種材料は、典型的には乾燥固体ポリペプチド接合体またはポリペプチドポリマ ーからポリペプチド接合体またはポリペプチドポリマーを生理的に許容（容認） される希釈剤例えば水、食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水中に懸濁することによ り製造される。

接種材料はまたアジュバントを含むことができる。アジュバント例えば完全フロ インドアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）およ びミョウバンはよく知られた物質であり若干の出所から市販されている。

Ｄ、受容体 本発明のポリペプチドに対して生起（誘発）された抗体および実質的な全抗体、 並びにそのような抗体から調製された抗体結合部位は本発明のなお他の態様を構 成する。これらの分子は本明細書に受容体として総括的に示される。受容体は哺 乳動物宿主例えばマウス、モルモット、ウサギ、ウマなど中に前記接種材料を用 いる免疫処置により生起される。

適当な単クローン性受容体、典型的には全抗体、はまたニマン（Ｎｉｍａｎ　） ほか、プロシーディング・オフ゛・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、）、８０．　４９４９　（１９８３）により記載され たハイブリドーマ技術を使用して調製することができ、その記載は参照によりこ こに加入される。？Ｊ単に記載すれば、単クローン性受容体を生ずるハイブリド ーマを形成するために骨髄腫または他の無限継続細胞系を、本発明のポリペプチ ドで高度免疫処置した哺乳動物の１１１１！臓から得られるリンパ球と融合させ る。

骨髄腫細胞系がリンパ球と同種であることが好ましい、典型的には株ＢＡＬＢ／ Ｃのマウスが好ましい哺乳動物である０本発明における使用に適する適当なマウ ス骨髄腫にはヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン−感受性（ＨＡＴ）細 胞系Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬｉ５８０）およびＳｐ２１ ０−Ａｇ１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）が含まれる。

牌細胞は典型的には骨髄腫細胞と、ポリエチレングリコール例えばＰＥＧ１５０ ０またはＰＥＧ６０００を用いて融合させる。融合したハイブリッドはそのＨＡ Ｔに対する感受性により選択される０本発明の受容体分子を生ずるハイブリドー マは、後に物質および方法のセクションに記載する酵素結合抗体免疫吸着検定（ ＢＬＩＳＡ）を用いて確認される。

単クローン性受容体はハイブリドーマ上澄みから得る必要があるだけでなく、ま た一般に所望のハイブリドーマを導入された哺乳動物の腹水液から−Ｎ濃厚な形 態で得ることができる。

腹水液を用いる単クローン性抗体の生成はよく知られ、それ以上ここに扱わない 。

本発明の受容体は、それが生起されたポリペプチドに結合し、また本発明のポリ ペプチドが免疫的に模倣する相当する結核性マイコバクテリウム抗原決定基に結 合する。従って、本発明のポリペプチドは免疫原および抗原の両方であることが できる。

本発明の受容体は、それが無傷結核性マイコバクテリウム抗原分子のエピトープ に比較して比較的少いエピトープを有する免疫原に対して生起されるので、天然 産出多クローン性抗体に比較してオリゴマー性であると説明することができる。

従って、本発明の受容体はポリペプチドのエピトープに結合するが、結核性マイ コバクテリウム抗原に対して生じた天然産出抗体は結核性マイコバクテリウム抗 原分子全体のエピトープに結合する。

Ｅ１診断検定装置および方法 ポリペプチド、抗体および前記ポリペプチドに対して生起された抗体結合部位（ 受容体）、並びに本発明の方法はまた診断試験例えば免疫検定に使用することが できる。そのような診断技術には例えば、酵素免疫検定、酵素多重免疫検定技術 （ＥＭＩＴ）、酵素結合抗体免吸着検定（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、放射免疫検定（ ＲＩＡ）、螢光免疫検定、単独または二重抗体技術、および受容体または抗原を 若干の検出可能なタグまたは指示手段で標識する他の技術が含まれる。一般には マギオ（Ｍａｇｇｉｏ　）　、酵素免疫検定（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉ＋ａｍｕｎｏａ ｓｓａｙ　）、　ＣＲＣブレス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ＋Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　、　 ０ｂｔｏ　）、（１９８１）　；ボルドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ。

Ｍ、）螢光抗体法（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ ）、アカデミツク・プレス（＾ｃａｄｅｌｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　＋　Ｎ、　Ｌ）　（１９８０）参照、そのような検定法およびこれらの方 法の実施に有用な装置の特定の例は次に記載される。

１、結核性マイコバクテリウムに対する検定体試料中の結核性マイコバクテリウ ムに対して抗原の存在を検定する方法もまたここに意図される。−触法において 、検定する体試料を提供し、本発明の合成ポリペプチドに対して生起した抗体結 合部位を含む受容体分子と混合する。混合物を受容体分子が体試料中に存在する 結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する十分な予定時間維持する ０次いでその免疫反応の量を測定して結核性マイコバクテリウム抗原が検定体試 料中に存在したかまたはしなかったかを測定する。

体試料のアリコート中に存在する結核性マイコバクテリウム抗原の検出に有用で ある本発明の１観点を具体化するキット形態の例示診断装置には本発明の受容体 分子例えば本発明のポリペプチドに対して生起された抗体、実質的な全抗体、ま たは抗体結合部位例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ抗体部分が１パフケージ中 で含まれる。この装置はまた、受容体と抗原との間の免疫反応の存在を示す指示 手段を含む。

典型的な指示手段には放射性同位元素例えば１ｚｓｌおよび＋３１１、酵素例え ばアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト シダーゼおよびグルコースオキシダーゼ、並びに螢光色素染料例えばフルオレセ インおよびローダミンが含まれる。指示手段は本発明の受容体に直接結合させる ことができる。指示手段はまた別の分子に、例えば第２抗体に、抗体結合部位に 、または本発明の受容体と反応（結合）するスタヒロコッカス・アウレウス（５ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ　）（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　）プロテ ィンＡに結合させることができる。そのような別分子指示手段の特定例はｌ！Ｊ 標識スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　）プロティンＡである 。

指示手段は免疫反応生成物の検出を可能になし、本発明の受容体に直接結合しな いときには受容体とは別にパンケージされる０体細胞例えばアセトン固定末梢血 液リンパ球（ＰＢＬ）塗抹と混合すると受容体分子は結核性マイコバクテリウム 抗原と免疫反応して免疫反応物を形成し、従って、存在する指示手段が免疫反応 生成物の形成を示す。

結核性マイコバクテリウム抗原に対する診断方法のＩＢ様は増幅試薬を含む免疫 螢光検定である。そのような検定ではＰＢＬ塗抹は平担顕微鏡スライドにアセト ン固定される０本発明により生起された、例えばウサギまたはモルモット中に生 起された抗体のアリコート、一般に約１００μｇ〜約５００μｇ、を周知技術を 用いてスライドに接触させる。

本発明の非免疫反応抗体を洗浄した後、望むならばスライド上の非特異性結合部 位を典型的にはタンパク質例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする ０次いで第２試薬（増幅試薬）例えば補体、または抗免疫グロブリン抗体、例え ばモルモット補体を試験スライド上でインキュベートすることができる。

この第２のインキュベーション後、未反応の増幅試薬を洗浄により除去し、検定 スライド上の初めにあげた抗体に結合したもののみを残す、第３の試薬（指示手 段）例えば抗体例えばヤギ抗モルモット補体を次いで試験スライド上でインキュ ベートする。第３試薬は螢光色素染料例えばフルオレセインイソチオシアネート （ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルロ ーダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）　、４．４’−ジイソチオシアノス チルベン−２，２′−二スルホン酸（ＤＩＤＣ）などに、よく知られているよう に結合させることにより標識する。

この第３のインキュベーション後に未反応第３試薬を洗浄し、試験スライド上の 補体に結合したＦＩＴＣ標識ヤ標識ヤギ上モルモット補体抗体、ＦＩＴＣｔ！識 第３試薬の存在を螢光顕微鏡を用いて検出し、それによりマイコバクテリウム感 染の存在を示すことができる。

上記検定法の実施に有用な好ましい診断装置は、好ましくはキット形態で、個々 のパンケージ中に、（ａ）結核性マイコバクテリウム抗原と免疫反応する本発明 の受容体（抗体）、伽）受容体と反応する第２の増幅試薬例えば補体例えばモル モット補体、抗免疫グロブリン抗体またはスタヒロコンカス・アウレウス（ｓ、 　ａｕｒｅｕｓ　）プロティンＡ１および（Ｃ１増幅手段に直接結合できるか、 または増幅試薬と反応する別の分子例えば抗体または抗体部分であることができ る指示手段、を含む、指示手段は受容体分子と結核性マイコバクテリウム抗原と の免疫反応を増幅試薬の仲介により示す。

ここに記載した診断装置の受容体分子および別の指示手段、並びに前記増幅試薬 は溶液で、液体分散体として、または実質的な乾燥粉末として例えば凍結乾燥形 態で提供することができる。指示手段が増幅試薬とは別の分子である場合に、指 示手段を別にパッケージすることが好ましい、指示手段が酵素である場合に、酵 素の基質もまた装置の別のパッケージ中で与えることができる。固体支持体例え ば前記顕微鏡スライド、１種またはそれ以上の緩衝液およびアセトンもまたこの 診断検出装置中に個々のパフケージ要素として包含することができる。

診断装置に関してここに論議したパフケージは診断装置中に普通に使用されるも のである。そのようなパンケージにはガラスおよびプラスチック（例えばポリエ チレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）ボトル、バイアル、プラスチ ックおよびプラスチック−箔積層封筒などが含まれる。

全、無傷生物活性抗体の使用は多くの診断装置例えば前記免疫螢光検定に必須で はない、むしろ抗体分子の免疫活性、イディオタイプ含有、抗原結合および認識 受容体部位、すなわち抗体結合部位のみを用いることができる。そのような抗体 結合部位の例は、よく知られているように、パパインおよびペプシンを用いるタ ンパク質加水分解によりそれぞれ製造されるＦａｂおよびｐ（ａｂ’）＊抗体部 分として知られているものである。

２、　抗結核性マイコバクテリウムの抗体に対する検定本発明の他の診断方法は 体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体（例えば抗ＢＧＧ−ａ抗体）を検出 するＥＬ　Ｉ　ＳＡである。ここに、本発明のポリペプチドは抗原として使用さ れ、好ましくは固体マトリックス、例えばファルマシア・ファイン拳ケミカルズ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａ ｙ　。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）から商標セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）のもとて 入手できる架橋デキストラン、アガロース、ガラスのビーズ、ポリ塩化ビニル、 ポリスチレン、架橋アクリルアミド、・ニトロセルロース、あるいはマイクロタ イタープレートのウェルに結合（吸着）または他の方法で結合して固体支持体を 形成させる。

ポリペプチドは検定する提供体試料と混合される。混合物は体試料中に存在する 抗結核性マイコバクテリウム抗体に対するポリペプチドとの免疫反応に十分な予 定時間維持する０次いでその免疫反応の存在を、指示手段で検定体試料中の抗結 核性マイコバクテリウム抗体の存在を示させて測定する。

上記方法を用いるＥＬＩ　ＳＡの好例はポリスチレンまたはポリ塩化ビニルで作 られた１２または９６ウエルマイクロタイタープレートのウェルを含む固体マト リックス上に吸着された本発明のポリペプチドを含む固体支持体を用いる。その 後マイクロタイターウェル壁上の非特異性結合部位をタンパク質例えばウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。未結合ポリペプチドおよびＢＳＡを例え ば洗浄によりマイクロタイターウェルから除去する。

体試料了りコート例えばヒト血清、血液または血漿を上記ポリペプチド結合固体 支持体と混合して固体および液体の相を含む混合物を形成させる。固−液相混合 物を体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体に対するポリペプチド抗原との 免疫反応に十分な時間維持する。その後固体および液体の相を分離する。

次に初めにあげた抗体と反応する第２の標識した指示手段を含む抗体、抗体結合 部位またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　）プロティン Ａの溶液を固相と混合し、他の固体液体相混合物を形成させる。第２抗体の好例 は初めにあげた抗体がヒト体試料である場合にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト Ｉｇ抗体である。他の有用な酵素標識にはアルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ− ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが含まれる。固相と第２標識抗 体溶液とから形成された混合物は、初めにあげた抗体と指示試剤との間の反応物 の形成、例えば２抗体間の免疫反応、に十分な予定時間（例えば３０分）維持（ インキュベート）する、その後固体および液体の相を分離する。

上記第２抗体はまたこの種の免疫グロブリン（例えばＩｇＧ。

ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ）の１つのみに対し特異性で、それと免疫 反応することができる。そのような抗体は体試料中に存在する抗結核性マイコバ クテリウム抗体の免疫グロブリン種を確認する能力を提供することができる。さ らに、第２の抗体または抗体結合部位は２つの型の免疫グロブリンＬ鎖（例えば におよびλ）の１つのみと特異的で、それと免疫反応することができる。これら の抗体は体試料中に存在する免疫グロブリン分子のアイソタイプを確認する能力 を提供することができる。

その後酵素標識に対する基質例えばペルオキシダーゼに対する過酸化水素および アルカリ性ホスファターゼに対する発色染料前駆物質例えば０−フェニレンジア ミン、またはリン酸ｐ　−ニトロフェニルを含む溶液を固相と混合する０次１、 で予めｉｆした波長（例えばそれぞれ４９０ｔ＋−または４０５ｎｍ）における 光学濃度を予定時間（例えば６０分）経過後に測定し、対照の光学濃度と比較し て抗結核性マイコバクテリウム抗体が体試料中に存在したかどうかを決定するこ とができる。

本発明の他の態様には、固体マトリックス例えばポリスチレン１２ウエルマイク ロタイターストリツプおよび固体マトリックスに吸着（結合）または他の方法で 結合して固体マトリックスを形成した本発明のポリペプチドからなる固体支持体 を含むキット形態の診断装置が含まれる。この装置はまた好ましくは結合指示手 段を有する別にパフケージした抗ヒＨｇ抗体例えばペルオキシダーゼ標識ヤギ抗 ヒＨｇ抗体を含み、また結合標識手段に対する基質例えば過酸化水素および着色 染料前駆物質例えばＯ−フェニレンジアミンをさらに個々のパフケージ中で含む ことができる。過酸化水素はそれが比較的不安定であるため、典型的にはキ７） 中に含まれず、典型的には最終使用者により供給される。この装置を用いる検定 に有用な緩衝塩もまた乾燥または液体形態で１つまたはそれ以上の個々のパンケ ージ中で含まれることができる。ヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体および抗 結核性マイコバクテリウム抗体を含まないヒト抗体（正常ヒト抗体）を含む個々 のパッケージもまたそれぞれ陽性および陰性対照として含めることができる０体 試料例えば血清中の抗結核性マイコバクテリウム抗体の存在に対する検定は上記 方法を用いてこの診断装置で行なうことができる。

■、方法および物質 Ａ、ポリペプチドの合成 本発明のポリペプチドはメリフィールド（ＭｅｒｒｉＨｅｌｄ）ほか、ジャーナ ル゛オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ−（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ ＠、Ｓｏｃ、）、８５．２１４９　（１９６３）およびホーテン（）Ｉｏｕｇｈ ｔｅｎ）ほか、インタナショナル゛ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロ ティン・リサーチ（Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、）、１６．　３１１　（１９８０）に 記載された固相法により化学的に合成した。ポリペプチド合成の固相法はベック マン・インスッルメント社（Ｂｅｃｋｗｉａｎ　１ｎｓｔｒｕ＋ｍｅｎｔＣｏ、 　、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ　）から市販されるベックマン・モデル９９０ Ｂペリペプチド・シンセサイザーを用いて行なった。

接種材料中に用いた３５個未満の残基を有するポリペプチドには、システィン残 基をカルボキシ末端またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加させ、後記 タンパク質担体への結合を援助した。全ポリペプチドの組成はアミノ酸分析によ り確認した。

前記固相法による本発明のポリペプチドの製造において、アミノ酸残基をカルボ キシ末端残基のエステル結合により樹脂（固相）へ結合させる。ポリペプチドを Ｃｙｓ残基により担体に結合させ、または末端Ｃｙｓ残基により重合させるとき にそのＣｙｓ残基を樹脂にエステル結合させるカルボキシ末端残基として用いる ことが便利である。

各付加アミノ酸のα−アミノ基は、典型的にはアミノ酸を成長ポリペプチド鎖中 へ付加させる前にｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）により保護する０次に ｔ−ＢＯＣ基は成長ポリペプチド鎖に次のアミノ酸を付加させる前に除去する。

反応性アミノ酸側鎖もまたポリペプチドの合成中保護される。

通常の側鎖保護基は次のように： チロシンに対し０−（ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル）；トレオニン、セ リン、アスパラギン酸およびグルタミン酸に対しＯ−ベンジル；システィンに対 しＳ−メトキシベンジル、ヒスチジンに対しジニトロフェニル；リシンに対し２ −クロロベンゾキシカルボニルおよびアルギニンに対しトシルを、残留アミノ酸 残基に対して使用した。

保護アミノ酸を適当な溶媒から再結晶して薄層クロマトグラフィーにより単一ス ボ、トを示した。カップリングは典型的には初期Ｎ末端アミノ酸のミリ当量より ともに１０倍モル過剰の保護アミノ酸およびジシクロへキシルカルボジイミドを 用いて行なった０両試薬の２モル過剰もまた使用できる。アスパラギンには等モ ル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールを保護アミノ酸に加え、ジメチルホ ルムアミドを溶媒として用いた。

全カンプリング反応はギシン（Ｇｉｓｉｎ）、アナリチカ・シミ力・アクタ（Ａ ｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ、　）　５８．　２４８　（１９７２）のピク リン酸試験により９９％以上完全であった。

所望のポリペプチドの製造後、生じた保護ポリペプチド（約Ｉｇ）をアニソール ’ｌ　＠ｌで処理し、無水フン化水素約２０ｍＡ！を反応容器中へドライアイス 温度で凝縮させた。生じた混合物を約４℃で約１時間かくはんして保護基を開裂 させ、ポリペプチドを樹脂から離した。フン化水素を４℃の温度でＮｚ流で蒸発 させた後、残留物を無水ジエチルエーテルで３回抽出してアニソールを除き、残 留物を真空で乾燥した。

真空乾燥した物質を５％水性酢酸（５０ｗＪで３回）抽出して遊離ポリペプチド を樹脂から分離する。抽出物含有溶液を凍結乾燥するとモノマーの未酸化ポリペ プチドが得ら、れる。

生じた合成ポリペプチドを酵素結合抗体免疫吸着検定（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）に用い て抗結核性マイコバクテリウム抗体を検出できる６合成ポリペプチドはまた、後 記のように、通常それを担体に結合させて接合体を形成させ、次いで接合体の有 効量を生理的に許容される希釈剤中に分散させることにより接種材料を製造する のに用いることができる。

本発明の合成マルチマーは１つのポリペプチドのカルボキシ末端残基と第２のポ リペプチドのアミノ末端残基との間のアミド結合により互いに端一端（頭−尾） 結合した複数の本発明のポリペプチドの固相合成により製造できることもまた認 めるべきである。そのような合成マルチマーは、好ましくは単−長ポリペプチド マルチマーとして合成されるが、しかしまた、それらの個々の合成後に、水中で カルボジイミド試薬例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル− カルボジイミド塩酸塩を用いて互いに結合させる個々のポリペプチドとして製造 することができる。単一ポリペプチド鎖として製造されたマルチマー中に含まれ るアミノ酸残基の全数は好ましくは約５０個未満であり、本発明の約８個までの ポリペプチドを、単一ポリペプチドとして合成される単−頭一尾マルチマー鎖に 結合させることができる０合成頭−尾マルチマーは、より好ましくは本発明の、 合計約４０個未満のアミノ酸残基の結合した合成ランダムコポリマーポリペプチ ドの２〜約４ブロツクを含む。

Ｂ、ポリマーの製造 本発明のポリペプチドを互いに連結して複数のポリペプチド繰返し単位を含む抗 原性および（または）免疫原性ポリマー（合成マルチマー）を形成することがで きる。そのようなポリマーは典型的には高い免疫原性および抗原性の利点を有す る。

さらに、ポリマー免疫原を用いるときに典型的には担体が必要でない、異なるポ リペプチドモノマーを用いてポリマーを作る場合に若干の結核性マイコバクテリ ウム抗原決定基に対する抗体と免疫反応する能力が得られる。なお他の利点は接 種材料中に用いたときのそのようなポリマーの、結核性マイコバクテリウム抗原 の若干の抗原決定基と免疫反応する抗体を誘発する能力である。

本発明のポリマーは上記のようにポリペプチドを合成し、アミノ末端およびカル ボキシ末端の両方にシスティン残基を含めて「ジＣｙｓ末端」ポリペプチドを形 成させることにより製造することができる０合成後、典型的な研究室製造におい てジＣｙｓポリペプチド（システィン残基を非酸化形態で含む＞１０■を０．１ モル（Ｍ）炭酸水素アンモニウム緩衝液２５０ｍｊ！に溶解する０次いで生じた 溶液を空気中で約１８時間、またはエルマン（Ｅ１１ａ＋ａｎ　）試験により遊 離メルカプタンが検出されなくなるまで、穏やかにかくはんすることにより溶解 したジＣｙｓ末端ポリペプチドを空気酸化する。〔エルマン（Ｅｌｌｍａｎ　） 、アルチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフイジンクス（Ａ ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、８２．７０　Ｃ１９５９） 参照〕。

ランダムコポリマーポリペプチド繰返し単位を含む、そのようなポリマーは典型 的には頭−尾のように、並びに頭−頭および尾−尾のように互いに結合したそれ らのポリペプチド繰返し単位を含み、すなわち２つのポリペプチド繰返し単位の アミノ末端は、両ポリペプチド末端の結合基が同一であるので２つのカルボキシ ル末端と同様に単一シスチン残基を通して互いに結合できる。

Ｃ０担体に対するカンプリング 合成ポリペプチドはリウ（Ｌｊｕ）ほか、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、）、８０．　６９０　（１９７９）に記載された方法により・担体としてのキ ーホールリンベットヘモシアニンにカンプルさせた。簡単に記載すると、担体４ ミリグラム（■）をｍ　−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル０．５１■で活性化し、次にポリペプチド５■とアミノ末端またはカ ルボキシ末端のシスティンにより反応させて約１０〜約３５重量％のポリペプチ ドを含む接合体を与えた。

１個またはそれ以上の他のアミノ酸残基を合成ポリペプチドのアミノ末端または カルボキシ末端に付加させて担体に対するポリペプチドの結合を援助することが できる。前記のように、合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に 付加したシスティン残基はジスルフィド結合によるポリマーの形成に殊にを用で あると認められた。しかし、接合体の製造によく知られた他の方法もまた使用す ることができる。他の結合操作の好適にはマイクル（Ｍｔｃｈａｅｌ　）付加反 応生成物、ジアルデヒド例えばグルタルアルデヒドの使用、クリブスティン（Ｋ ｌ　１ｐｓｔｅｉｎ）ほか、ジャーナル・オブ・インフェクシアス・ディジーシ ス（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　）、　１４７．３１８　（１９８３）な ど、あるいは合成マルチマーを形成する複数のポリペプチドの相互の結合につい て前に記載したように、担体に対するアミド結合を生ずるための水溶性カルボジ イミドの使用のようなカルボジイミド技術の使用が含まれる。

有用な担体はよく知られ、一般にはタンパク質自体である。

そのような担体の好例はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデス チン、サイログロブリン、アルブミン例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）また はヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）、赤血球例えばヒツジ赤血清（ＳＲＢＣ）、破 傷風トキソイド、コレラトキソイド並びにポリアミノ酸例えばポリ（Ｄ−リシン ；Ｄ−グルタミン酸）などである。

またよく知られているように、合成ポリペプチドをその担体に中間結合基により 結合させることがしばしば有利である。上記のようにグルタルアルデヒドは結合 基の１つである。しかし、システィンを用いたときに中間結合基は好ましくはこ こに用いたようにｍ−マレイミドベンゾイル　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ ＭＢＳ）である。

さらにＭＢＳはリウ（Ｌｉｕ）ほか、前掲、により開示されたようにエステル− アミド交換反応により担体に初めに付加させることができる。その後、付加の後 にブロックしたメルカプト基例えばチオール酢酸（ＣＨ，Ｃ０３Ｈ）をマレイミ ドニ重結合を横切って付加させることができる。アシル保護基の開裂後、ジスル フィド結合を脱ブロツク結合基メルカプタンと合成ポリペプチドの付加システィ ン残基のメルカプタンとの間に形成させる。

担体の選択は免疫原の決定基部分よりも一層免疫原の最終用法に依存し、また本 発明に特定的に含まれない基準に基（０例えば接種材料が動物に使用されるなら ば、個々の動物に不適当な反応を生じない担体を選ぶべきである。

Ｄ、ＥＬＩＳＡ 抗ポリペプチド抗体結合および抑制研究は下記のように酵素結合抗体免疫吸着検 定（ＥＬＩＳＡ）により準備することができる。

簡単に記載すると、マイクロタイターウェル〔コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ＋　＃　 ３５９０　、　Ｃａｍｂｒｉ、ｄｇ、　ＭＡ）　）に、ポリペプチドを１０　μ ｇ毎ｍｌ　（μｇ／　ｍＡ）（７）濃度で含むＢＢＳ（１０ミリモル（−Ｍ）ホ ウ酸ナトリウム（ｐＨ８，３）　、１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ）１００μβを加える ことにより、抗原として個々のポリペプチドで被覆する。ウェルと抗原含有溶液 との間の接触は予定時間、典型的には１５分間、２０℃で維持して抗原被覆固相 を形成させる。固体および液体の相を分離し、ウェルをＢＢＳで３回洗浄する。

非特異的結合部位は、各ウェル中に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μ ｌを混合して他の固体液体相混合物を形成し、その固体液体相混合物を３０分間 ２０℃で維持することによりブロックする。相を分離し、過剰の非結合ＢＳＡを ＢＢＳで３回洗浄することにより除去する。

ウサギ（またはモルモット）およびヒト血清（体試料アリコート）は、ＢＢＳ中 にｌ：２０に希釈した血清ｉｏｏμｌを毎ウェルに添加し、固体／液体相組成物 を形成することにより抗ポリペプチド活性について検定する。希釈血清と抗原被 覆固体相トの間の接触を予定時間例えば１時間、２０℃で維持して免疫反応物を 形成させる。固体および液体の相を分離し、固体相、すなわち抗原被覆免疫反応 物含有ウェル、を次にＢＢＳで３回洗浄する。

吸着ポリペプチドと免疫反応するヒト血清中の抗体はアルカリ性ホスファターゼ 接合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体〔タボ（Ｔａｇｏ。

Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ　＋ＣＡ）　］を含む指示手段を用いて検出することがで きる。吸着ポリペプチドと免疫反応するウサギ血清中の抗体はアルカリ性ホスフ ァターゼ接合ヤギ抗つサギＩｇ抗体〔キルケガード・アンド・ベリ・ラボラトリ ーズ社（Ｋｉｒｋｅｇａｒｄ　＆　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ ｎｃ、＋　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋　ＭＤ）　）を含む指示手段を用いて検 出することができる。どの場合も、ＢＢＳ中に１＝３００に希釈した指示抗体１ ００μｌを毎ウェルに加えてさらに固体−液体相組成物を形成する。この固体液 体相組成物を同相に結合したヒト抗体と指示手段との間の反応生成物の形成に予 定した時間、１時間、２０℃で維持する。相を分離し、固相をＢＢＳで３時間洗 浄する。

ポリペプチド特異性抗体に結合したアルカリ性ホスファターゼ接合抗体はリン酸 ｐ−ニトロフェニルのｐ−ニトロフェノールへの酵素加水分解を分光測光的に測 定することにより検出することができる。簡単に記載すると、リン酸ｐ−ニトロ フェニル（２ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ９，８）　、５０ｍＭ炭酸ナトリウム 中１■／　ＩＩ／）　１００μｌを各ウェルに加える。酵素反応を１時間進行さ せ、次いで４０５ｎ−における光学密度をフロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｇｌｅｗｏｏｄ　、　ＣＡ）から人手できる タイターチク（ＴＩＴＥＲＴＥＫ）分光光度計中で測定する。

Ｅ、免疫処置 本発明の受容体分子は哺乳動物に前記ポリペプチドおよび（または）マルチマー を含む接種材料で免疫処置することによりそれに生じた全抗体を包含する。ポリ ペプチドおよびマルチマーはともに単独の、または担体タンパク質例えばキーホ ールリンベットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に接合した接種材料中に含めて用い ることができる。しかし、ポリペプチドは好ましくは接合体として使用され、マ ルチマーは好ましくは単独で使用される。

完全ソロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に接合体１．０■を含む接種材料でウ サギを免疫処置し、１月後に不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ、）中の接 合体１．０■で追加刺激することができる。各免疫処置は背臀部上の１皮下注射 から構成した。

追加刺激後１月および２月に採血した。

次いで免疫活性抗体を含む血清をよく知られている方法により採血から生成させ た。これらの抗体は１種またはそれ以上の本発明のポリペプチドおよび結核性マ イコバクテリウム抗原決定基と免疫反応した。従って、それを装置に用いてマイ コバクテリウム感染の存在を決定することができる。

個々の接種材料はＣＦＡまたはＩＦＡで次のように調製される：毎接種に所望量 のポリペプチドを与える量の接合体（例えば１■）をＰＢＳ　（約０．５ｍｊり にｐＨ７，２で溶解する０次いで水と油状物質との比が１：１であった接合体、 水およびアジュバントを含む接種材料を得るために等容積のＣＦＡまたは１ＦＡ を接合体に混合する。その後混合物を均質化して接種材料を与える。そのように 調製した接種材料の容積は典型的には１−２以上であり、若干の接合体、ＰＢＳ およびアジュバントが乳化中に失なわれることができる０回収できる実質的にす べての乳濁液を注射器中に入れ、次いで前記のようにウサギに導入する。

ウサギに導入する接種材料の量は乳化段階前に存在したものの少くとも約９０％ であるべきである。

上記接種材料保存溶液は本発明の接種材料の例示である。ここに示したように、 それを用いて結核性マイコバクテリウム抗原と免疫反応する受容体分子を生成さ せることができる。

Ｆ、遅延型過敏症反応（皮膚反応試験）前記の診断装置および検定は試験管内検 定に基く、検定の特定の段階を生体内で行なうことができるけれども、真の免疫 応答は＆Ｉ織培養で測定される。しかし本発明はまたＴ細胞応答の生体内測定を 含む診断装置に適用できる。そのような装置の１例は遅延型皮膚過敏症（Ｄ　Ｃ Ｈ）反応、または皮膚反応試験として一層普通に知られたものである。

ＤＣＨ反応は前に所与抗原に暴露（感作）した個体中でのみ生ずることができる 。抗原に対する個体の最初の暴露は可視変化を生じないが、しかし個体の免疫状 態は、その抗原に対する新たな暴露に対して過敏症を生ずるように改変される。

従って抗原（好ましくは緩衝食塩溶液中）の皮内または皮下注射で特徴的な皮膚 障害−最初の抗原暴露後に生じない障害−が注射部位に生ずる。第２（または攻 撃）抗原接種材料に対する応答が典型的には２４〜４８時間遅れるので反応は遅 延型過敏症として示される。

ヒトにおいて、感作抗原に対する暴露は疾患の原因である微生物〔例えば結核菌 （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｗ　Ｔａｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのツベルクリ ン、サルモネラ・チフィ　（Ｓａｌ■ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ　）からのチホ イジンおよびプルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ）から のアポルチン〕との接触で起り、感作は長期感染の結果として生ずる。動物にお いて、感作は水、食塩水またはアジュバント中に乳化した抗原の接種により達成 することができる。

ヒトおよび動物の両方において、過敏症は生理的に許容される希釈剤例えば食塩 溶液中に溶菌した抗原の皮Ｊ！（皮内または皮下）中の注射により生体内で試験 される。ＤＣＨは通常抗原に対して生した抗体の量の決定または測定よりも一層 鋭敏な診断検定である０例えば、単に少量のタンパク質（数百μｇ）がマウスの ＤＣＨ感作に必要であるが、抗体生成の誘発にはより大きい用量が必要である。

本発明のポリペプチドが、本発明のポリペプチドによる免疫処Ｗ、（感作）後の モルモソｌ−Ｔ細胞の増殖を刺激するので、皮膚反応試験を攻撃抗原として１種 またはそれ以上の本合成ポリペプチドを用いて開発した。

詳しくは、遅延型皮膚過敏症反応が本発明の合成ポリペプチドをウシ結核菌（Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）　Ｂ　ＣＧ感作および結核菌（Ｍｙｃ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株Ｂ３７Ｒｖ感作モルモッ トに皮肉投与したときに認められた。

ここに記載した細菌はスクリップス・クリニック・アンド・リサーチ・ファウン デーシッン（５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕ ｎｄａｔｉｏｎ　）の培養コレクションから入手し、ミンデン（Ｍｉｎｄｅｎ　 ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　１７６　、　５７（１９７２）およ びミンデン（Ｍｉｎｄｅｎ）ほか、インフエクシ町７−’７７ド拳イミユニティ （Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、　）、６．　５７４（１９７２）に記載された ように成長させた、それらの刊行物は参照によりここに示される。

詳しくは熟年活性化ＢＣＧ含有またはＨ３７Ｒｖ含有細胞音波処理物で約６週前 に免疫処置したモルモットが合成ポリペプチド約２５０μｇの皮肉感染で遅延型 皮膚過敏症（Ｄ　ＣＨ）反応を示した。ポリペプチドは典型的にはｏ、ｏｏｓ％ のツイーン２０を含むリン酸塩緩衝食塩水（ｐ）１７．０）約１００μβ中で投 与した。

従来の実施において、ＤＣ）１反応は抗原の注射後２４〜４８時間に探索される 。抗体の皮肉注射後２４〜４８時間に生ずる炎症性浸潤物（主に単核細胞からな る）および付随浮腫が皮膚の硬化を生ずる。紅斑の共存領域もまた生ずることが できる。

この硬化の直径は皮膚過敏症の指数であり、約５＋ｍ■またはそれ以上の直径の 硬化が陽性ＤＣＨ反応の一般に許容される基準である。

本発明のポリペプチドは注射部位周囲に直径少くとも１０ｍｍの紅斑領域および 硬化を誘出した。非免疫処置動物はポリペプチドの皮肉注射でＤＣＨ反応を示さ なかった。非結核性マイコバクテリウムの細胞抽出物で免疫処置した動物はポリ ペプチドに対し辺縁ＤＣＨ（約５１ｍ１１未満の紅斑および硬化）を示した。

最も顕著なりＣＨ反応を誘出したポリペプチドはアミノ末端およびカルボキシ末 端におけるシスティン残基により重合された。第１図の３行に示されるジＣｙｓ ポリペプチド参照、そのポリペプチドを用いたＤＣＨ試験の結果は表Ｉに示され る。

表　■ ウシ結核菌（Ｍ、　Ｂｏｖｉｓ）株ＢＣＧ　７／７’　７／７結核菌０４．　ｔ ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株　４／４　４／４３７Ｒｖ マイコバクテリウム・フォーチｌイタム　０／４　４／４（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔ ｕｍ） マイコバクテリウム・カンサシイ　Ｏ／３　３／３（Ｍ、ｋａｎｓａｓｉｉ） マイコバクテリウム・イントラセルラーレ　２／４　４／４（Ｍ、１ｎｔｒａｃ ｅｌｌｕｌａｒｅ）ポリペプチド（ジＣｙｓ末端）（注３参照＞　５１５　０１ ５非免疫処置動物　０１５　０１５ １、　ミンデン（Ｍｊｎｄｅｎ）ほか、インフエクション・アンド・イミ！−ニ チイ　（Ｉｎｆｅｃｔ、ｌｍ５ｕｎ、　）、４６．　５１９　（１９８４）に記 載のように調製して免疫処置した、その刊行物は参照によりここに示される。

２、遅延型皮膚過敏症 ３、アミノ酸残基配列 −ＣｙｓＡｌａＬｙｓＶａｌＡｓｎｌｌｅＬｙｓＰｒｏＬｅｕＧｌｎＡｓｐＬｙ ｓｌｌｅＣｙｓを有するポリペプチド（第１図３行に示されるポリペプチド）２ ５０μｇを、ツイーン２０　（ＩＣＩアメリカス社（ＩＣＩＡｍｅｒｉｃａｓ　 ＩｎＣ０＋　Ｗｉｌ＊ｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ　）約０．００５％を含むリン酸塩緩 衝食塩水（ｐＨ７，０）約１００μ！に溶解した。

４、各列中の初めの数字は陽性ＤＣＨ反応の数を示し、２番目の数字は試験の全 数を示す。

５、　コノート・ラボラトリーズ社（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓＬＴＤ、、　Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ、　Ｃａｎａｄａ）から入手したＰＰ Ｄ　（精製タンパク質誘導体）を約２５０ツベルクリン単位に等しい１００μｉ 量で投与した。

表■について説明するとウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）株ＢＣＧまたは結核菌（ Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　Ｈ３７Ｒｖ株の細胞音波処理物で免疫処置 したモルモットはポリペプチドおよびＰＰＤ　（精製タンパク質誘導体）に対し 強いＤＣＨ反応を生じた。

非結核性マイコバクテリウム〔マイコバクテリウム・フオーチュイタム（Ｍ、　 ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ、　Ｋａｎｓａ ｓｉｉ　）　、およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ、　１ｎｔ ｒａｃｅｌｌｕｆａｒｅ））で免疫処置した動物はポリペプチドに対して反応し なかった（それぞれ表１参照）が、しかしＰＰＤに対して強いＤＣＨ反応を示し た。

ジＣｙｓ末端ポリペプチドで免疫処置した動物はポリペプチドに対してＤＣＨ反 応を示したが、しかしＰＰＤには示さなかった。

非免疫処置正常動物はポリペプチドまたはＰＰＤに対してＤＣＨ反応を生じなか った。

本ポリペプチドの免疫原性もまたポリペプチドを抗体の誘出に用いて調べた。特 異性および結合特性は生じた抗体をここに記載したように酵素結合抗体免疫吸着 検定（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）で測定した。

強い抗ポリペプチド応答がポリペプチド（第１図２行に示される）をタンパク質 担体（キーホールリンベットへモジアニン）にカップリングさせ、不完全フロイ ンドアジュバントとともにウサギに注射した。ポリペプチドに対して生じた抗血 清の力価はポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェル中にポリペプチド １μｇを固定化し、次いで結合したポリペプチドを系列希釈の抗血清と反応させ ることにより測定した。抗体力価はＥＬＩＳＡで５０％の最大結合を生ずる抗体 の希釈の逆数として示される。抗血清は１２５０〜２５−００の抗ポリベブチド 力価を有した。

ポリペプチド誘出抗体の種々のマイコバクテリウム種の抽出物との反応性を、「 Ｓ抗原」調製物をポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中に固定化し たＥＬＩＳＡで測定した。

（ｒＳ抗原」は、参照によりここに示されるミンデン（Ｍｉｎｄｅｎ）ほか、イ ンフエクション・アンド・イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｏ＋ｕｎ、）、４６，５１９　（１９８４）に記載されたように音波処理に より分裂させた細菌懸濁液を１００，０００　Ｘ　ｇで遠心分離した後の上澄み 画分中に存在する抗原である）。

ＢＣＧ−ａタンパク質の残基１〜１２に相当するアミノ酸残基配列を有しカルボ キシ末端にシスティンを有するポリペプチドの場合に、抗ポリペプチド抗体はポ リペプチド（力価＝　１２５０）、精製ＢＣＧ−ａタンパク質（１２５０）並び にウシ結核菌（Ｍ。

ｂｏｖｉｓ）株ＢＣＧ（６７５）および結核菌（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ）株Ｈ３７Ｒｖ　（６７５）の可溶性音波処理抽出物と強く反応した。マイコ バクテリウム・フオーチュイタム（Ｍ、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（５０）、？イ コバクテリウム・カンサシイＣＩＡ、　ｋａｎｓａｓｉｉ）（２５）およびマイ コバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ。

１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）　＜　２５　）の音波処理抽出物に対して単に 辺縁結合が認められた。この種の辺縁結合はまた免疫前ウサギ血清でみられ、ウ サギ抗体がこれらのマイコバクテリウムに非特異的につくことができたことを示 唆した。大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１　）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉ５ ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　）、サルモネラ・エピデルミス（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　）、す）Ｌｔ％ネラ・チフイムリウ ム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ＋ｉｕｒｉｕｍ　）またはシュードモナ ス・スブ（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｓｐ）の「Ｓ抗原」に対して結合がなかっ た（力価１０未満）、これらのデータは該ポリペプチドが主に結核性マイコバク テリウム種中に発現される免疫原エピトープを含むことを示す。

ポリペプチドの抗原性を２つの方法で測定した。第１に体液抗体との反応性を測 定するために、ポリペプチドをマイクロタイタープレートのウェル上に固定化し 、種々の抗体調製物と反応させた。ＢＣＧ−ａタンパク質の残基１〜１２に相当 するアミノ酸残基配列を有しカルボキシ末端にシスティンを有するポリペプチド の場合に、ポリペプチド（力価−１２５０）　、ＢＣＧ−ａタンパク質（６２５ ）およびウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）　Ｂ　ＣＧの全音波処理抽出物（６２５ ）を指向する抗体によりポリペプチドに対しかなりの結合があった。マイコバク テリウム・カンサシイ　（Ｍ、ｋａｎｓａｓｉｉ）　（２５）およびマイコバク テリウム・フオーチュイタム（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　（５）の抽出物によ り誘出された抗体により単に辺縁結合があった。大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）、リ ステリア・モノサイトゲネス（Ｌ、　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）・サルモネ ラ・エビデルミス（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒ＋ａｉｓ）　％サルモネラ・チフイムリ ウム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはシュードモナス・スブ（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ　）の抽出物により誘出された抗血清に対して検出可能な 結合がなかった。再びデータは、このエピトープが主に結核性種によって発現さ れ、あるとしても試験した２つの非定型株〔マイコバクテリウム・カンサシイ　 （Ｍ、　Ｋａｎｓａｓｊｉ　）およびマイコバクテリウム・フオーチュイタム（ Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ））には貧弱であることを示唆する。

ＤＣＨ反応の結果は本発明の合成ポリペプチドを結核性マイコバクテリウム抗原 に対する細胞仲介免疫応答の存在に対する生体内診断装置に使用できることを示 す。

前記ポリペプチドの安全性および有効性が動物研究において示されるので該ポリ ペプチドを結核性マイコバクテリウムワクチンの受容体に対してヒト皮膚反応試 験における攻撃抗原として使用することができる。該ポリペプチドは前記のよう に合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）技術により精製し、滅 菌し、発熱物質試験される。

ヒト結核性マイコバクテリウムワクチン受容体のＴ１１ｌ胞増殖応答がポリペプ チド特異性に関連して完全に変動できるので、ワクチン受容体および非接種対照 として作用させる個体を一連のポリペプチドで攻撃する。速度論および最適抗原 用量は動物研究の結果を指針として使用してワクチン受容体群中に決定すること ができる。

長期感染固体もまた合成ポリペプチドを皮膚反応試験のための抗原として用いて 結核性マイコバクテリウム特異性Ｔ細胞感作について調べることができる。

各事例において、攻撃抗原は個々のポリペプチドの生理的に許容される溶液中で （約１　ｍｌ）前腕手２表面中に皮肉注射により投与される。２５または２７ゲ ージ針の使用は通常抗原の皮下投与よりもむしろ皮肉投与を保証する。皮下注射 は組織中で抗原の希釈を生ずることができ、疑陰性試験を生ずることができる０ 次いで注射部位を紅斑（皮膚の赤らみ）および硬化（ｌｌ化）について攻撃後４ 時間、２４時間および４８時間に観察する。

前記は本発明の例示として意図され、限定ではない、多くの変更および変形を本 発明の新規な概念の真の精神および範囲から逸脱することなく行なうことができ る０本明細書に例示した特定のポリペプチド、抗体、その組成物および使用に関 して何ら限定が意図されず、または限定を推論すべきでないことを理解すべきで ある。

９　六 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　昭和６２年１２月１日国際調査報告 ＋ｌ″ｗ″″’　”’Ｐ−／ｅｓ３６１０１６８７ｌｍｙｎｍ・ｐＨ＾＊ｌｉ− ＋ａｂｓｌ軸ｐ（）／１ｌｓ１１６＃１１＜１１７ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ　Ｔｏ 　Ｆ’ＯＲＭ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．Ｐａｒｔ　Ｖ工。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ来端からカルボ キシ末端の方向に書いて式：【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドであり、担体に結 合させて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバクテリウムに対して 抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発できるポリペプチド。 ２．約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含む合成ポリペプチドを製剤に許容され る希釈剤中に有効量溶解または分散して含む結核性マイコバクテリウムに対して 抗原と免疫反応する抗体の誘発に適する合成ポリペプチド接種材料であって、前 記ポリペプチドが左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式： 【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含み、前記接種材料を哺乳動物宿主中へ 有効量導入すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の 生成を誘発できる接種材料。 ３．ポリペプチドが担体に結合される。請求の範囲第２項記載の合成ポリペプチ ド接種材料。 ４．ポリペプチドが約１００μｇ〜約５００ｍｇ毎用量の量で存在する単位投薬 形態にある、請求の範囲第２項記載の合成ポリペプチド接種材料。 ５．合成免疫原に対して生起された抗体結合部位を含む受容体分子であって、合 成免疫原が約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ未端から カルボキシ未端の方向に書いて式： 【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含み、前記受容体が結核性マイコバクテ リウムに対して抗原と免疫反応する受容体分子。 ６．結核性マイコバクテリウムの存在について検定するキット形態の診断装置で あって、 （ａ）約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向に書いて式：【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して生超され た受容体分子、および（ｂ）受容体分子の結核性マイコバクテリウムに対する抗 原との免疫反応を示す指示手段、 を含む診断装置。 ７．全抗体が前記受容体分子である、請求の範囲第６項記載の診断装置。 ８．受容体分子が溶液または液体形態で前記指示手段とは別のパッケージ中で提 供される、請求の範囲第６項記載の診断装置。 ９．受容体分子が凍結乾燥形態で別のパッケージ中で提供される、請求の範囲第 ６項記載の診断装置。 １０．受容体分子が指示手段で標識される、請求の範囲第６項記載の診断装置。 １１．指示手段が増幅試薬と免疫反応する標識抗体である、請求の範囲第６項記 載の診断装置。 １２．標識抗体が螢光色素染料で標識される、請求の範囲第１１項記載の診断装 置。 １３．標識抗体が螢光性イソチオシアネートで標識される、請求の範囲第１１項 記載の診断装置。 １４．標識抗体が酵素で標識される、請求の範囲第１１項記載の診断装置。 １５．体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体について検定する方法であっ て、 （ａ）検定する体試料を提供する段階、（ｂ）前記体試料を、約１３〜約４０個 のアミノ酸残基を含み、左から右へアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書い て、式： 【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドと混合する段階、 （ｃ）前記混合物を、前記試料中に存在する抗結核性マイコバクテリウム抗体に 対する前記ポリペプチドとの免疫反応に十分な予定時間維持する段階、および （ｄ）前記免疫反応の存在を測定する段階、を含む方法。 １６．体試料が血液、血清および血漿からなる群から選ばれる、請求の範囲第１ ５項記載の方法。 １７．さらに、前記混合の前に前記ポリペプチドを固体支持体に結合させる段階 を含む、請求の範囲第１５項記載の方法。 １８．体成分中の結核性マイコバクテリウムの抗原に対する抗体の存在を検定す るキット形態の診断装置であって、（ａ）約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含 み、左から右ヘァミノ酸末端からカルボキシ末端の方向に書いて式：【配列があ ります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリぺプチド、および （ｂ）前記ポリペプチドの結核性マイコバクテリウムの抗原に対する抗体との免 疫反応を示す指示手段、を個々のバッケージ中に含む診断装置。 １９．さらに、前記ポリペプチドを結合できる固体マトリックスを含む、請求の 範囲第１８項記載の診断装置。 ２０．合成ポリペプチドを前記固体マトリックスに結合させて固体支持体を形成 する、請求の範囲第１９項記載の診断装置。 ２１．固体マトリックスがポリスチレン、ポリ塩化ビニル、およびニトロセルロ ースからなる群から選ばれる、請求の範囲第１９項記載の診断装置。 ２２．固体マトリックスが、複数のウエルを含むマイクロタイターストリップで ある、請求の範囲第１９項記載の診断装置。 ２３．指示手段がヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体と免疫反応できる標識抗 体である、請求の範囲第１８項記載の診断装置。 ２４．標識抗体がアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β −Ｄ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼからなる酵素の群から選 ばれる酵素で標識される、請求の範囲第２３項記載の診断装置。 ２５．体試料中の結核性マイコバクテリウムに対して抗原の存在を検定する方法 であって、 （ａ）検定する体試料を提供する段階、（ｂ）約１３〜約４０個のアミノ酸残基 を有し、左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式：【配列が あります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して生起され た抗体結合部位を含む受容体分子を混合する段階、 前記ポリペプチドは担体に結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入すると前記 体試料中に存在する結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体 の生成を誘発できる、 および （ｄ）前記免疫反応の量を測定する段階、を含む方法。 ２６．体試料がリンパ球および腫瘍組織からなる群から選ばれる、請求の範囲第 ２５項記載の方法。 ２７．約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向に書いて式：【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドに対して免疫結合 したヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体を含む免疫反応生成物。 ２８．約１３〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向に書いて式：【配列があります】 により示される１３アミノ酸残基配列を含む合成ポリペプチドであって、担体に 結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入すると結核性マイコバクテリウムに対 して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発することができ、またヒト抗結核性マ イコバクテリウム抗体と免疫反応することができる合成ポリペプチド。 ２９．複数の結合した合成ポリペプチド操返し単位を含む合成マルチマーであっ て、前記繰返し単位が約１４〜約４０個のアミノ酸残基を含み、左から右ヘアミ ノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式： 【配列があります】 および【配列があります】 により示されるアミノ酸残基配列を含む少くとも１つの合成ポリペプチドを含み 、 前記ポリペプチド操返し単位が担体に結合させて有効量を哺乳動物宿主中へ導入 すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発 することができる合成マルチマー。 ３０．ポリペプチド操返し単位がアミド結合またはジスルフィド結合により互い に結合される、請求の範囲第２９項記載のマルチマー。 ３１．結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体を誘発するの に適し、複数の結合した合成ポリペプチド操返し単位であって約１４〜約４０個 のアミノ酸残基を含む少くとも１つの合成ポリペプチドを含む繰返し単位を含む 合成マルチマーを生理的に許容される希釈剤中に有効量溶解または分散して含む 合成接種材料であって、前記ポリペプチドが左から右ヘアミノ未端からカルボキ シ未端の方向に書いて式：【配列があります】 により示されるアミノ酸残基配列を含み、前記接種材料が有効量を哺乳動物宿主 中へ導入すると結核性マイコバクテリウムに対して抗原と免疫反応する抗体の生 成を誘発することができる接種材料。 ３２．マルチマーが担体に結合される、請求の範囲第３１項記載の合成接種材料 。 ３３．マルチマーが約１０μｇ〜約５００ｍｇ毎用量の量で存在する単位投薬形 態にある、請求の範囲第３１項記載の合成接種材料。 ３４．宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定する診断装置であっ て、左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって式： 【配列があります】 および【配列があります】 からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する少くとも１つの合成ポリペプ チドを含み、前記合成ポリペプチドが、生理的に許容される希釈剤中で宿主に皮 内投与されると宿主中に胸腺高率細胞の増殖を誘発することができ、前記増殖が 皮内投与の部位における紅斑および硬化により示される診断装置。 ３５．生理的に許容される希釈剤が水、食塩水およびアジュバントからなる群の 一員である、請求の範囲第３４項記載の診断装置。 ３６．合成ポリペプチドが担体に結合される、請求の範囲第３４項記載の診断装 置。 ３７、担体がキーホールリンベットヘモシァニン、不完全フロィンドアジュバン ト中のキーホールリンベットヘモシアニン、ミョウバン、キーホールリンベット ヘモシアニン−吸着ミョウバン、キーホールリンベットヘモシァニン−吸着ミヨ ウバン−百日咳、エデスチン、サイログロブリン、破傷風トキソイド、不完全フ ロインドアジュバント中の破傷風トキソイド、コレラトキソイドおよび不完全フ ロインドアジュバント中のコレラトキソイドからなる群から選ばれる、請求の範 囲第３６項記載の診断装置。 ３８．結核性マイコバクテリウム抗原に対して前に免疫処置した宿主中の胸腺誘 導細胞の増殖を誘発させる方法であって、（ａ）左から右ヘアミノ末端からカル ボキシ末端の方向にとって式： 【配列があります】 および【配列があります】 からなる群から進ばれるアミノ酸残基配列を有する合成ポリペプチドを提供し、 （ｂ）前記合成ポリペプチドの有効量を生理的に許容される希釈剤中で宿主に投 与する、 ことを含む方法。 ３９、段階（ａ）の後で段階（ｂ）の前に、前記ポリペプチドを担体に結合させ て接合体を形成する段階を含む、請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定する方法であって、 （ａ）左から右ヘアミノ宋端からカルボキシ末端の方向にとって式： 【配列があります】 および【配列があります】 からなる群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する合成ポリペプチドを提供し、 （ｂ）生理的に許容される希釈剤中に溶解または分散した前記合成ポリペプチド の有効量を皮内投与して宿主中に胸腺誘導細胞の増殖を誘発させ、それにより前 記増殖および宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原の存在が皮内投与の部位に おける紅斑および硬化により示されることを含む方法。