JPH07507444A - 精製されたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の空胞形成毒素およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製されたＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　１ｌｙｌｏｒｉ由来の空胞形成毒素およ びその使用方法 光豆旦背五 本件はＸ９９２年２月２６日に出願した米国出願第８４１．６４４号の一部継続 出願である。

ｌ肚旦立野 本発明はＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　旺旦且の空胞形成毒素と、消化性潰瘍およ び胃の悪性疾患への素因に関する診断用試験；こお（１て毒素を使用する方法と 、Ｈ，旺包■感染に対する免疫学的防御を提供するワクチンとして毒素を使用す る方法と１こ関する。

１　′−の　な８日 ｔｌｅｌ　１ｃｏｂａｃｔｅｒ旺■葺はヒトの胃の中（こ通常存在してζ）る湾 曲したグラム陰性細菌であり、この生物は１ｒｊｅ獲得すると数年間または数十 年間存続する（Ｂｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　Ｊ、　１ｎｆｅｃｔ、 　Ｄｉｓ、１６１：６２６−６３３　）。多くの列挙される証拠より、Ｌ−に感 染するとほとんど全般的（こ慢性胃炎（こなることが示されている（Ｄｉｘｏｎ 、　Ｍ、Ｆ、　（１９９０）　Ｊ、　Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．　ａ厖Ｌ１ チ」工鄭工６・１２５−１３０）。Ｌ■旦ユに誘導される胃炎ζこ力）かってい るほとんどの人は無症状のままである力（、この状態は消化性潰瘍および胃腺癌 の両方を発病させる重要な危険因子である（Ｐｅｔｅｒｓａｎ、　Ｗ、Ｌ、　（ １９９１）　Ｎ、　Ｅｎ　Ｌ、　Ｊ　Ｍｄ、　３２４：１０４３−１０４８、な らびにＮｏｍｕｒａ、　Ａ、、　Ｓｔｅｍｍｅｒｍａｎｎ、　Ｇ、Ｎ、、　Ｃｈ ｙｏｕ、　Ｐ、−Ｈ，、Ｋａｔｏ、１．、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、Ｉ 、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ。

、Ｌ」泣Ｌ−Ｌ」ｌ虹１９９１；　３２５：１１３２−６）。

Ｈ，旺■ム感染の発生病理はまだよく分かつていない。生物による高レベルのウ レアーゼ産生（Ｄｕｎｎ、　Ｂ、　Ｅ、　、　Ｃａｍｐｂｅｌ　ｌ。

Ｇ、Ｐ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ 、Ｊ、（１９９０）　Ｌ」ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：９４６４−９４６９ ）は、冑感染の開始および維持に関して必須であると考えられる（Ｅａｔｏｎ、 　Ｋ、Ａ、、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ｒ、、Ｋｒａｋｏｗｋａ、　Ｓ、（１９８ ９）　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｎｕｎ、　５７：１１１９−１１２５）。

他の潜在毒性の決定要因は、真核細胞の空胞形成を誘導する毒素である（Ｃｏｖ ｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｈａｌｔｅｒ、　Ｓ、Ａ、、　Ｂｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、 　（１９９２）　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌ、　２３：１００４−１０１０）。

機能的１こ活性な毒素を、インビトロでＨ，ワ１立負−単離物の５０〜６０％が 産生する（Ｌｅｕｎｋ、　Ｒ，Ｄ、、Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｐ、Ｔ、、　Ｄａｖｉ ｄ、　Ｂ、Ｃ，、Ｋｒａｆｔ、　Ｗ、Ｇ、、およびＭｏｒｇａｎ、Ｄ、Ｒ，（１ ９８８）　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６：９３−９９ならび１こ Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒ、 　Ｍ、Ｊ、　ｂｂ±Ｌユ■且ｎ、　；　５８：６０３−６１０　（１９９０）） 。毒素活性を中和する抗体６月り旺旦ｎ感染者由来の血清中に存在し、そのこと より空胞形成毒素活性はインビボで関連があることが示唆される（　Ｌｅｕｎｋ 。

Ｒ，Ｄ、、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ｍ、Ａ、、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ｒ，、Ｌｏ ｗ、　Ｄ、Ｅ、、およびＳｉｍｏｒ、Ａ、Ｅ、（１９９０）　Ｊ、　Ｃｉｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２８：１１８１−１１８４ならびにＣｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ 、、　Ｃａｏ、、　Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒｌＭ、Ｊ、（１９９１）　Ｇａ■ 皿飢旦皿旦■ｉｏｏ：ＡＳ７０）。２つの研究で、毒素産生１１．　［ニ感染の 普及は、消化性潰瘍のＨ，ｕ■且感染患者の間のほうが胃炎のみの感染患者の間 より高いことが示唆された（Ｆｉｇｕｒａ、　Ｎ、、　ＧｕｇｌＬｅｌｍｅｔｔ ｉ、　Ｐ、、　Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ、　Ａ、、　Ｂａｒｂｅｒｉ、　Ａ。

、　Ｃｕ５ｉ、　Ｇ、、　Ｍｕｓｍａｎｎｏ、　Ｒ，、Ｒｕ５ｓｉ、　Ｍ、、お よびＱｕａｒａｎｔａ、　ｓ。

（１９８９）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７：２２５−２２ ６；　Ｇｏｏｓｅｎｓ、　Ｈ，、Ｖｌａｅｓ、　Ｌ、、　Ｌａ５ｂｅｒｔ、　Ｊ 、Ｐ、、　Ｇｌｕｐｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｙ、、　Ｂｕｒｅｔｔｅ、　Ａ、。

およびＢｕｔｚｌｅｒ、　Ｊ、Ｐ、（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｅｃｏｌ、　 １ｆｅａｌｔｈ　Ｄｉｓ、　４：１３０）。

以前の研究で、本発明者らは空胞形成毒素活性のあるブロス培養上清中には存在 するが、毒素活性の欠落した上清中には存在しないかまたはａ度が低い、いくつ かのＨ，ｕ■ユタンパク質の同定を行った（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　、　 Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、　、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　 Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５Ｂ＋６０３−６１０）。さらに、本発明者ら は空胞形成毒素がＨ，旺包■ウレアーゼとは異なることを示した（Ｃｏｖｅｒ、 　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ。

１１．およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ ｎ、５９：１２６４−１２７（ｌン。本出願で本発明者らはＨ，旺包ム由来の空 胞形成毒素の精製および特徴付けについて述べている。

良囲旦斐互 空胞形成毒素活性を有する実質的に純粋な抗原組成物を提供することが、本発明 の目的である。本抗原組成物は天然物または組換え産物のいずれかから精製され 得る。

組換え空胞形成毒素またはそのフラグメントを提供するために発現され得る遺伝 子を提供することが、本発明のさらなる目的である。上記遺伝子の部分的なりＮ Ａ配列を配列番号１に提示する。

毒素に対する抗体に特異的に結合する精製抗原組成物を提供することが、本発明 の目的である。

毒素産生Ｈ，旺包ユ感染の存在についての臨床診断用試験を提供し、それによっ て消化性潰瘍疾患または胃の悪性疾患の危険のある患者を特定することが本発明 の目的である。

Ｈ，ｊｕｔ旦」２毒素に対する高レベルの特異抗体を誘導し、そしテヒトニオイ てＨ，旺江ム自然感染に対して保護するタンパク質ワクチンを提供することが本 発明の目的である。

ＬｐＪｉ９ＬＬ毒素に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、およ び毒素の検出におけるそれらの使用または治療目的での方法を提供することが本 発明の他の目的である。

本明細書中で開示した抗原組成物、ワクチン、方法、抗血清または抗体、および キットを提供することにより、これらおよび他の実施態様が達成される。

本発明の１つの実施態様では、空胞形成毒素活性を有する精製抗原組成物（これ 以降ＣＢ抗原とする）は、！ＩＬＥＬＬＬ！；ＬＬＬのブロス培養上清から抽出 され、９７２．０００ダルトンより大きい分子量（非変性条件下でゲル濾過クロ マトグラフィーによって決定した）、および変性したときに８７．０００±３０ ０ダルトンの明確な分子量（還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＳＧＥ）で決定した）を有した。抗原は配列 番号２に示されるアミノ末端配列、配列番号１５〜１７に示される中間アミノ酸 配列を含有し得、そして加えて配列番号ｌに提示した核酸配列によってコードさ れるアミノ酸配列を含有し得る。ＣＢ抗原という用語は機能的に活性のある未変 性の空胞形成毒素として定義される；それに対して、Ｍｒ−８７，０００タンパ ク質はＣＢ抗原の機能的に不活性なサブユニットであり、変性条件下でのみ検出 される。ＣＢ抗原という用語は、ｔＬ旺包ムから得られるか、あるいは合成また は組換えによる生産で得られる完全体毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の抗原性のあ るフラグメントを含有する。ＣＢ抗原またはそのフラグメントと実質的に相同性 を有する抗原タンパク質もまた、本発明に従って使用され得る。さらに、ＣＢ抗 原アナログもまた期待される。

ＣＢ抗原に対して産生された抗血清またはモノクローナル抗体は、毒素の存在に 関する試験に使用され得る。試験サンプルヲそのような抗血清に接触させ、次い で試験サンプルの成分に結合する抗体を検出する。そのような結合が予め決定し ておいた陽性閾レベルを越えたところで、サンプルは毒素に対して陽性とする。

ＣＢ抗原は、無毒的な方法でヒトに投与したときに、Ｌｐ出且感染に対する感染 防御免疫を誘導し得る。それ故に、抗原は将来的なｔ（、旺包亘感染に対するワ クチンとして、適切なアジュバントと組み合わせて使用され得る。

本発明の１つの局面では、ＣＢ抗原は抗毒素抗体の検出のだめの方法に使用され る。精製した毒素を、抗毒素抗体を含むと疑われる体液のサンプルと接触させる 。そのような接触に次いで、公知の方法が、抗原−抗体複合体形成量を決定する ために使用される。複合体の形成が予め決定した陽性閾値を越えるときは、試験 は抗毒素抗体の存在に対して陽性とする。

抗原−抗体複合体の形成を検出するために好ましい技術は酵素免疫アッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）、間接免疫蛍光アッセイ、ラテックス凝集、およびリポソーム−ベー スアッセイを含むが、それらに限定されない。あるいは、ウェスタンプロット技 術を用い得て、その場合バンドが目視判定で検出され、そして濃いバンドの実質 的な出現が陽性の指標として得られ得る。陽性シグナル（すなわち、試験サンプ ルが毒素特異抗体を含むことを示す）と考えられる抗原／抗体複合体の量は、選 んだ検出方法によるが、一般的に他の全てのパラメーター（サンプルの希釈、イ ンキュベート時間、など）を一定にしておいて、陰性コントロール群由来のサン プルで観察された結果から、平均値プラス標準偏差の１区間より高い値として定 義され得る。より高い特異性が望まれるいくつかの実施態様においては、平均値 プラス２標準偏差または平均値プラス３標準偏差が利用され得る。陰性コントロ ール群は、Ｌ■Ｉｏｒｉ感染がないと知られている個体からなる。

本発明の１つの局面では、本発明の範囲内の抗原組成物を含み、そしてさらに上 記組成物中の抗原に結合し得る試験すンブル中に、何らかのイムノグロブリンが 存在することを検出する手段を含む牛、トが提供される。

さらに、Ｈ，旺肢■感染に関する診断用試験は、被検者の核酸サンプルの増幅を 導（プライマーに基づいて開発され得る。

さらに詳細には、配列番号ｌに提示した核酸がら選択した合成オリゴヌクレオチ ドは、Ｈ，圧抜ムの毒素を検出可能レベルにまで増幅するためのポリメラーゼチ ェイン反応で使用され得る。

区画ｍ敬■ 図１はＬ■１ｏｒｉ空胞形成毒素のカラムクロマトグラフィーを示す。カラムの 溶出物は２８０ナノメーターの吸光度（実線）に対してモニターした。そして塩 １度は点線で示す。画分の空胞形成毒素活性はニュートラルレッドアッセイを用 いてアッセイし、純光学濃度（ｎｅｔ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ）　（ 黒丸）として表わす。Ａ）硫酸アンモニウム沈澱させた上清中のタンパク質のＰ ＨＥＮＹＬＳｔｌＰＥＲＯＳＥ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー。

初期の画分（１ｍｌ−１５ｍ１容量）の緩衝液中の硫酸アンモニウム（０，５Ｍ ）の存在が、これらの画分によって誘導されるニュートラルレッドの取り込みに 貢献した（Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ −Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、　Ｂｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｎｎｕｎ、　５９：１２６４−７０）。Ｂ）Ａからの溶出ピークを５ ＵＰＥＲＯ３Ｅ　１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性 をボイド容量で検出した。Ｃ）　５ＵＰＥＲＯ５Ｅ　１２　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）カラムがら溶出した毒素活性を有する画分をＭＯＮＯＱ　（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）カラムに添加し、そして毒素活性をＮａＣｌの直線濃度勾配をかけて溶出 した。

図２はＨ，［包ユ毒素（ＣＢ抗原）の変性、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリ ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％アクリルアミド）を示す。レー ンは：ａ−Ｌネ」旦ｕ４６０１９０のブロス培養上清から、硫酸アンモニウムの ５０％飽和溶液で沈ａさせたタンパク質；ｂ５疎水性相互作用クロマトグラフィ ーで部分的に精製した毒素；ｃｌ　ゲル濾過クロマトグラフィーで部分的に精製 した毒素；ｄｌ　陰イオン交換クロマトグラフィーをかけた後、変性、還元条件 下でＭｒ＝　８７．０００のバンドとして視覚化された精製ＣＢ抗原。クロマト グラフィー条件はテキストに記載されている通りであった。既知の分子量（牛ロ ダルトン）のマーカータンパク質の移動度は左に示す。

図３は免疫ウサギ血清によるＭｒ＝　８７．　Ｇｏｏのタンパク質バンドのウェ スタンプロットの認識を示している。硫酸アンモニウム５０％飽和溶液により、 Ｈ，旺包■６０１９０のブロス培養物から沈澱させたタンパク質を１０％アクリ ルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース紙に移し、ウサギ血清の１：１０ ，０００希釈液とインキュベートし、抗原を分析した。レーンａ１　免疫前血清 。レーンｂ１精製したＭｒ＝　８７，０００の変性Ｈ，ｍタンパク質サブユニッ トに対して作製した抗血清。この抗血清ではＭｒ−８７，Ｇｏｏのバンドのみ認 識した。

図４は精製したＭｒ＝　８７．０００の変性タンパク質サブユニットに対して産 生された抗血清によるＬ■包ユの空胞形成毒素活性の中和を示す。免疫前血清、 および精製したＭｒ＝　８７．　ＧｏｏのＨ，旺且ムタンパク質サブユニットに 対して産生された抗血清を毒素中和活性について試験した。Ｈ，ｕ包ムロ０１９ ０由来の粗濃縮ブロス培養土清によって誘導されたニュートラルレッドの取り込 みを、点線で示す。１：６４希釈で、抗血清は完全に毒素活性を中和したが、免 疫前血清は毒素活性を中和しなかった。

図５はＬ旺旦且上清中の空胞形成毒素の検出を示す。８つのｔｏｘ″Ｈ，ｕ貝ム 株および８つのｔｏｗ−株由来の濃縮培養上清を炭酸緩衝液で１：１００に希釈 し、Ｍｒ＝　８７．０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清（１・ １０．０００希釈）との反応性についてＥＬＩＳＡで試験した。ｔｏｘ’上清は ｔｏｘ−上清よりかなり高い光学濃度値を示した（０．６１４±０．１１に対し ０．０４６±０．０１、Ｐく０．０００１）。

図６はヒト血清による精製ＬＸ２ＬＩｆｌｉ毒素（ＣＢ抗原）の血清学的な認識 を示す。２０人のＬ■■且感染者および２０人の未感染者由来の血清を１：１０ ０に希釈し、精製ＣＢ抗原（１５ｎｇ／マイクロタイターウェル）とのＩｇＧ反 応性についてＥｌ。

ＩＳＡで試験した。Ｌ［土虹ユ感染患者由来の血清は未感染者由来の血清より有 意に高く精製毒素を認識した（平均光学濃度はそれぞれ０．４２４±０．０６お よび０１８２±０．０２、ｐ＝０．０００９）　。

日の！　な！日および　のヅ 本発明は、ＬＰ！ＬＬ！２ＬＬの空胞形成毒素の等質性への最初の精製を示して いる。本毒素は硫酸アンモニウム沈澱、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィ ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーによ つてブロス培養上清より単離された。実質的に純粋という用語は、ＣＢ抗原が他 のＨ，旺泣ム産物に対して、Ｈ，ｕ抜■ブロス培養土清中より高い濃度で抗原組 成物中に存在することを意味する。

これらの手順により、非変性条件下で９７２，０００ダルトンを越える分子量を 有する、精製された、機能的に活性な毒素（ＣＢ抗原）が回収された。本タンパ ク質の精製により毒素の比活性は５０００倍より大きく増加した。変性、還元条 件下での５ＯＳ−ＰＡＧＥによる精製毒素（ＣＢ抗原）の分析により、８７．０ ００ダルトンに移動する１本のバンドの存在が示された。ＥＬＩＳＡで、Ｍｒ− １１７，０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清は、ｔｏｘ−Ｈ， 旺包ｎ上清よりもｔｏｘ″Ｈ，［旦■上清と有意に高い割合で反応した。さらに 、Ｍｒ＝　８７．０００の変性タンパク質サブユニットに対する抗血清は、Ｈ， 旺且且６０１９０の空胞形成毒素活性を、他のＬｐＬｍｉ株によって産生される 毒素と同様に中和した。要するに、本データは空胞形成毒素活性におけるＣＢ抗 原の役割を支持し、そして種々のＬｐｌ旦Ｕ２株により産生される毒素は抗原的 に関連があることを示す。

ウェスタンプロット分析は、Ｍｒ＝８７．０００の変性タンパク質すブユニット がｔｏｘ’　Ｈ，ｐＬＬＱＬＬ培養上浦の培養上着らの以前の分析において同定 したバンド（原文でＭｒ＝８２，０００と報告）に関連があると考えられること を明らかにした（Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、。

Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　ｂ ｂ」エユｖ旦工５８　：６０３−６１０）。本発明者らのｔｏｘ’　Ｈ，肛旦頁 上清に関する以前の研究で、Ｍｒ＝　１２８．０００のタンパク質もまた同定さ れた。そのタンパク質は潰瘍疾患を伴わないＬ■ｌｏｒ＋感染者より、消化性潰 瘍の患者由来の血清により多く認められた（　Ｃｏｖｅｒ、　ＴＬ、、　Ｄｏｏ ｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉ＊ｇｕｎ、　５８：６０３−．６１０；Ｃｒａｂｔｒｅｅ、Ｊ、Ｅ、 、　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｗｙａｔｔ、　Ｊ、１．、　Ｈｅａｔｌｅｙ 、　Ｒ，Ｖ、、　５ｈａｌｌｃｒｏｓｓ、　Ｔ、Ｍ、、　Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、　 Ｄ、Ｓ、、およびＲａｔｈｂｏｎｅ、　Ｂ、Ｊ、＜１９９１）　Ｌａｎｃｅｔ　 ３３８：３３２−３３５）。最近の研究で、Ｍｒ＝　１２８，０００のタンパク 質は空胞形成毒素活性の発現に要求されず、Ｍｒ＝８７，０００のタンパク質サ ブユニットと免疫学的に交差反応しないことが示されている。

抗体含有の疑いのあるいずれものサンプルが、本明細書中に記載の方法に従って 試験され得る。試験するサンプルは、好ましくは、血液、血清、尿、涙液、唾液 などのような体液である。ヒトのサンプルに加えて、サンプルは、ヒトではない 霊長類、馬、豚などのような哺乳類から採取され得る。記載の試験の感度によっ て、試験の前にサンプルを希釈し得る。

希釈は、サンプル、試験する抗体、および抗原組成物の各々に適合した溶液を加 えることによって行い得る。血清は、サンプルとして使用するとき、例えば、リ ン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，０〜７．４）　（これ以後ｒＰＢｓＪ）、Ｔｗｅ ｅｎ−２０を含むＰＢＳ　（これ以後ｒＰＢｓ　ＴＪ）、チメロサールを含むＰ ＢＳＴ（これ以後ｒＰＢｓ　ＴＴＪ）、ゼラチンを含むＰＢＳＴＴ（これ以後ｒ ＰＢＳ　ＴＴＧＪ）、およびウシγグロブリンを含むＰＢＳＴＴＧ（これ以後ｒ ＰＢｓ　ＴＴＧＧＪ）からなる群より選択される１つ以上の溶液で希釈され得る 。

希釈は、ＩｇＧ抗体について試験するとき、約１：１００がら約１：１０００の 比率程度であり得る。サンプルはＩｇＡおよびＩｇＭについても試験され得るが 、ＩｇＧ試験が好ましい。

好ましい希釈剤および希釈率は、試験されるサンプルに従って異なり得る。例え ば、尿は既にかなり希釈されていて、さらなる希釈は必要とされ得ない。しかし 、他のアッセイでしばしば必要であるように尿を濃縮する必要がないことがある 。試験の前に、好ましくは、尿のｐＨを、抗体機能にとって好ましいｐＨである 約７．０と７．４との間に調整する。

サンプルの希釈が要求されない一方、Ｈ，旺■ム特異抗体の非存在下で有意な抗 原／抗体複合体が形成される可能性は、希釈することで減少すると考えられる。

希釈範囲は、陽性シグナルと考えられる抗原／抗体複合体のレベル閾に合わせる ことを考慮にいれるべきである。

本開示により、寄託されたＨ、　肛旦■株由来の精製毒素（ＣＢ抗原）を得るた めの簡易な方法が提供される一方、この抗原は多くのＨ，旺包ユ株に共通である ことが強調される。寄託された株および本明細書の記載により、本抗原の簡易な 単離方法が提供される一方、本発明は抗原が得られる原料または方法（例えば組 換え生産による）に関わらず、抗原の利用を広く包含することが強調される。

試験サンプルを本発明に従って抗原化合物に接触させる前に、この抗原組成物を 従来の技術を用いて固定するのが好ましい（しかし必要ではない）。１つの選択 的な実施態様では、以下にさらに詳しく記載したようなリポソーム−ベースアッ セイが使用され得る。従来の固定については、例えばポリスチレンプレートを、 本発明に従って作製した抗原懸濁液とインキュベートし得る。あるいは、例えば 電気泳動ゲル上にタンパク質バンドとして単離された抗原を、既知の方法でニト ロセルロースンートに移し得る。Ｔｏｗｂｉｎら、肚史工」旦」工」ｃａｄ、Ｓ ｃｉ、、７６：４３５０−５４　（１９７９）：　Ｂｕｒｎｅｔｔｅら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、１１２：９５−２０３　（１９８１）膠原。当該分野において、抗 原を実質的に不活性な基質に結合させる多数の他の技術が知られている。

本発明に従って結合させた抗原を、好ましくは、Ｈ，ｍｌ上１に対する抗体の存 在について試験するサンプルを含む希釈液と接触させる。本抗原およびサンプル を、好ましくは、少なくとも５分間から１５分間インキュベートする。　インキ ュベーションはヒトの体温またはその付近（約３７℃）で行ウド、少すい時間で 済む。他の温度でのインキュベーション（例えば４°Ｃ）もまた適切だが、一般 的に追加のインキュベーション時間が必要である。３７°Ｃでの好ましいインキ ュベーション時間は、約５分間から約９０分間である。迅速アッセイもまた室温 で行われ得る。次いで、結合抗原をすすぎ、いずれもの非結合抗体（つまり抗原 に対して特異的ではない抗体）をも除く。好ましくは、すすぎはＰＢＳ　Ｔ、Ｐ ＢＳ　ＴＴ。

またはトリス／Ｔｗｅｅｎ／塩化ナトリウム／アザイドのような緩衝液で行う。

多数回のすすぎが好ましい。

インキュベーンコンの間、Ｈ，旺包葺特異抗体は固相抗原に結合し、抗原／抗体 複合体を作る。全ての非結合抗体は、実質的にすすぎ手順の間に除かれる。本発 明の抗原は高特異性のため、Ｈ，ｕ且ユに特異的でない抗体は実質的にすすぎで 除かれる。もちろん、もし試験サンプルがＨ，旺包■特異抗体を含まなかったら 、固相抗原は実質的にヒト抗体を結合せず、そして抗原／抗体複合体に対する次 の試験では、そのような複合体の実質的な存在は示されない。他方で、もし試験 サンプルにＬゎ１立口、特異抗体が豊富にあったら、これらの抗体は固相抗原に 結合し、次で検出される多量の抗原／抗体複合体を形成する。

抗原／抗体複合体の検出は、幅広い種類の既知の方法によって行われ得る。好ま しい方法には、酵素免疫アッセイ、ラテックス凝集、ウェスタンプロット技術、 または間接免疫蛍光アッセイが含まれるが、それらに限定されない。

一般的に、固相抗原に複合したＨ、　旺江且特異抗体は、標識、または他の方法 で検出可能な、試験される免疫グロブリンに特異的である第２抗体と接触させる ことによって検出される。

例えば、もし試験サンプルがヒト血清ならば、検出可能な第２抗体は、ヒト免疫 グロブリンに特異的である。標識した第２抗体はどのヒト抗体（好ましくはＩｇ ＧまたはＩｇＡ型、最も好ましくはＩ　ｇＧ）に対しても特異的であり得る。急 性セロコンバージョンが疑われるとき、ＩｇＭに特異的な標識第２抗体を使用す るＩｇＭ試験が適当であり得る。第２抗体は、好ましくは固相抗原と約２０″Ｃ から約３７°Ｃの温度において、約５分間から約２時間、好ましくは３ｏ分間か ら６０分間、インキユベートする。それから、全ての非結合標識抗体を除くため に、抗原を緩衝液で洗浄する（好ましくは多くの回数）。洗浄により、抗原上に 存在する免疫グロブリンに結合した抗体以外の、実質的に全ての標識抗体が除か れる。

もちろん、実質的には、この時点で存在するヒト免疫グロブリンのみがＬゎ＋１ ｏｒｉに特異的な抗体である。このため、Ｌ肛包口特異抗体の存在は、標識第２ 抗体の存在または非存在を決定することによって、間接的に測定され得る。

標識を検出するためには、多くの既知の技術があり、これは使用した標識の型で 異なる。例えば、フルオレセイン標識抗体は、フルオレセインの特定波長で発光 された光を走査することにより、検出され得る。あるいは、酵素標識は、適切な 基質とのインキュベーションおよび酵素活性、好ましくは色調変化になる活性、 の検出によって検出される。そのような活性は、目視判定により決定され得るか 、または適切な波長にセットした分光光度計によって機械的に読みとられ得る。

あるいは、酵素標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼであり得、そして基質が、 Ｈ２Ｏ２と、酵素の存在下で生成され、４１４ｎｍｉこセントした分光光度計で 検出可能な化合物である２、２゛−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン− ６−スルポン酸）とであり得る。

ウェスタンブロッティングにおいて、陽性シグナルは、酵素が第２抗体とコンジ ュゲートするときに検出され得る。適切な基質とインキュベートすると、本プロ セスによって分析される抗原バンド前後に酵素により色素産物が生成される。

反応するバンドの存在は、目視判定で検出され得る。間接免疫蛍光アッセイ法に おいて、フルオレセイン標識第２抗体はフルオレセイン励起検出器または目視判 定で検出され得る。

リポソーム−ベースアッセイは表面にＨ，旺艮■抗原が発現されるリポソーム内 にフルオレセイン、酵素、または基質の存在を含み得る。これらのリポソームを 、試験する希釈体液サンプルとインキュベートし、そして充分に洗浄する。表面 に抗原／抗体複合体を形成する免疫グロブリンを有するいかなるリポソームもが 、リポソームを含むポリスチレンチューブの内壁上に、第２抗体く試験する免疫 グロブリンに特異的である）を付着させることによって認識され得る。表面に抗 体を結合させたリポソームは、チューブ壁に固定され、そして非固定リポソーム は洗浄除去される。リポソームは、例えば界面活性剤または補体で細胞溶解され 得、そして内部に存在していた酵素または基質が遊離し、チューブ内で溶液中の 相補的な基質（または酵素）と反応する。酵素活性（好ましくは色調変化反応） は、目視判定または分光光度計の色調測定により検出され得た。予め決定した陽 性間を越える酵素活性により、Ｈ，１旦り、特異抗体の存在が示される。

本発明に従った抗体検出の感度および特異性は、限定した集団のヒトから得られ る血清を使用して決定した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、精製毒素（ＣＢ抗原）に対 するＩｇＧ抗体が、Ｌ１工１感染者由来の血清中で同定された。およそ５０％の Ｌ■ｎム感染者由来の血清によって提示されたＥＬＩＳＡの光学濃度値は、非感 染者由来の血清によって提示された範囲を越えていた。

このことは、およそ５０％のＨ，旺包ム感染者が毒素を産生する１４＝　旺包ム 株に感染していることを示唆する。同様に、およそ５０％のＨ，ネ」２０１株が インビトロで毒素を産生する（　Ｌｅｕｎｋ。

Ｒ，Ｄ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｐ、Ｔ、、　Ｄａｖｉｄ、　Ｂ、Ｃ，、Ｋｒａ ｆｔ、　Ｗ、Ｇ、、およびＭＯｒｇａｎ、　Ｄ、Ｒ，（１９８８）　Ｊ、　Ｍｅ ｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、　２６：９３−９９；Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ１、、、　 Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　Ｉ ｎｆｅｃｔ、　Ｉｎ＋４Ｆ−５８：６０３−６１０）。

この出願では、結果を平均±ＳＥＭで表す。光学濃度値は独立変数に関するステ ニープントの両側を検定を用いて比較した。

さらに、体液または組織を含有する試料中の核酸の検出は、核酸の存在量が少量 であるため、あるいは試料中に異なった原料由来のＤＮＡまたはＲＮＡを含有す る他の干渉物質が存在するために困難であり得る。これらの限界は、ポリメラー ゼチーイン反応（ＰＣＲ）技術と呼ばれる分析方法を採用することにより、克服 され得る。この技術によって、特異ＤＮＡ配列の選択的富化が、標的配列の指数 関数的増幅により達成され得る。Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、１５５．３３５（１９８７）。ＬＵ旦且毒素を検出するための方法は、Ｈ，肛 艮且毒素を産生ずる核酸のサンプルを検出可能なレベルにまで増幅するために、 配列番号ｌに提示されるＤＮＡ配列から選択されるオリゴヌクレオチドの増幅を 導くプライマーの使用により提供される。

ＰＣＲ増幅を促進するために、ベアのオリゴヌクレオチドブライマーが、米国特 許第４．６８３．２０２号（本明細書中で参考として援用されている）に記載の ように採用され得る。このプライマーは標的ＤＮＡに隣接する配列にハイブリダ イズするように設計、する。インビトロ増幅に続いて、増幅した標的配列を、ハ イブリダイズプローブを用いて検出する。例えば、この分析手順は、Ｏｕら、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２３８．２９５−９７　（１９８ｇ）に記載されるように、Ｈ ＩＶ−１の直接検出のために使用されてきた。増幅サイクルは、５ａｉｋｉら、 欽第１並、　２３９．４８７−９１　（１９８８）によって記載されるように、 ９５°Ｃまでのインキュベーションで熱安定であるポリメラーゼを使用すること によって促進される。

本発明のある実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列をプライマーとして使 用した。これらの配列は、周知の化学的方法で調製され得、そして市販のＤＮＡ 合成機もまた使用され得る。例えば、必要とされる配列は、Ｂｅａｕｃａｇｅら 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９−６２　（１９８ １）に記載の合成方法で調製され得る。固相支持体上でのオリゴヌクレオチドの 合成のための他の方法は、米国特許第４．４５８．０６６号に記載されている。

自動ＤＮＡ合成装置はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＋ｓ社が発売してい るＤＮＡ合成機のようなものが用いられ得る。

さらに詳細には、プローブ配列のオリゴヌクレオチド配列は、ヌクレオチドが以 下に示される標準略語文字で表される：Ａはアデノンン、Ｔはチミジン、Ｇはグ アノシン、Ｃは／トシン、およびＮは不明。これらの鎖は、標準の５′プライム から３′プライム方向に表記されている。変性プライマー中に用いられる略語は 表３に示す。

実施例１ １稟至ＩＪｉｌ 以前に記載した毒素産生株のＬ■１ｏｒｉ　６０１９０　（ＡＴＣＣ４９５０３ ）を、毒素精製のための原料として用いた。Ｈ，圧抜ムロ０１９０を、５％ＣＯ ２を含む包囲環境中で、０．５％活性炭（未処理、粒径８〜２０メノンユ、Ｓｉ ｇｍａ）を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロス中で３７℃で４８時間培養した（Ｃｏｖ ｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−ＰｅｒｅＺ、　 Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍｌ、（１９９１，）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ ｍｕｎ、　５９１２６４−１２７０）。培養物を１０．０００ｇで２０分間遠心 分離し、そして上清に存在するタンパク質を硫酸アンモニウムの５０％飽和溶液 で沈澱させた。１０．０００ｇで１５分間遠心分離した後、ベレットを６０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）１７．７）に再懸濁した。

疎水性相互作用クロマトグラフィーを、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩおよび０． ５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７，７）を含む緩衝液を用いて、ＰＨＥＮＹＬＳＵ ＰＥＲＯＳＥ　ＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ。

ｇｙ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）で行い、そしてタンパク質 を６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　（ｐＨ７，７）で溶出した。サイズ排除クロマ トグラフィーを、６ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩおよび０．１Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７ ，７）を含む緩衝液を用いて、０．１２　ｍｌ／分の流速テ５ＵＰＥＲＯｓＥ　 １２　ＨＲ１６１５０カラム（Ｐｈａｒｌｌａｃｉａ）で行った。陰イオン交換 クロマトグラフィーを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，７）中で、ＭＯＮＯ−Ｑ 　）ＩＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行った。タンパク質は２Ｏ２Ｍ 　Ｔｒｉｓ中で１０ｍ１にわたって０３Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾 配をかけて溶出した。カラム溶出物を、　２８０ｎｓのＵ■吸光度に対してモニ ターした。

ＨｅＬａ細胞を、以前に記載したように、９６−ウェルプレート中で、１０％の ラン胎児血清を含むＥａｇｌｅの修正最小必須培地（ＭＥＭ−ＦＢＳ）で培養し た（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　、Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、　、およびＢｌ ａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５８：６ ０３−６１０）。毒素調製物をＭＥＭ−ＦＢＳで系列希釈し、そして９６−ウェ ルプレート中で、１０μｍ分注量を接着細胞および培養液９０μｌと３７℃で１ ８時間インキコベートした。その後、以前に記載したように、細胞の空胞形成を ニュートラルレッド取り込みアッセイを用いて分光光度計で定量した（Ｃｏｖｅ ｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ 、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍ＋ ｓｕｎ、　５９：１２６４−１２７０）。サンプル中の毒素活性の力価は、培養 液のみで提示される光学濃度の３ＳＤ以上の光学濃度が提示されるサンプルの最 大希釈率として定義した。サンプルの特異活性は、毒素の逆数力価のタンパク質 Ｈｒ！ｉ（＋ｇ／ｍｌ）に対する比率で定義した。比活性を決定するために、Ｍ ＥＭ−ＦＢＳに塩化アンモニウム（１０ｍＭ）を加えた。これは毒素活性を増強 することを以前に示した濃ｌｊｔ：　（Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅ ａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　 Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎ＋ｍｕｎ、　５９：１２６４−１ ２７０）　テアリ、Ｈ，ム」且０．感染したヒトの胃液中のアンモニウムイオン の濃度に近い（Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｂ、Ｊ、およびＬａｎｇｔｏｎ、　Ｓ、Ｒ （１９８６）　Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：９６５−９６６）。

タンパク質濃度は、サンプルの濃度によって、ＱＵＡＮＴ　ＩＧＯＬＤ試薬（Ｄ ｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｎｅｗｔｏｎ　Ｃｅｎｔｒｅ、　Ｍ Ａ）またはＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ、１ｌｌｌｎｏｉｓ）のいずれかを使用して測定し、標準としてアルブミ ンを使用した。５ＤＳ−ＰＡＧＥはＡｒａｅｓによって記載された（　Ａｍｅｓ 、　Ｇ、　Ｆ。

−Ｌ　（１９７４）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４９：６３４−６４４ ）ような、修正Ｌａｅ＋ａ＋ｎｌｉゲル系で行い、そしてタンパク質を０ａｋｌ ｅｙらの銀染色を用いてゲルで分析した（Ｏａｋｌｅｙ、　Ｂ、Ｒ，、Ｋｉｒｃ ｈ、　Ｄ、Ｒ，、およびＭ。

ｒｒｉｓ、　Ｎ、Ｒ，（１９８０）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０５： ３６１−３６３）。分子量標準は、ウサギ筋肉ホスホリラーゼｂ　（９７，４０ ０）、ウシ血清アルフミン（６６、２００）　、ニワトリ卵白オボアルブミン（ ４５，０００）、ラン炭酸脱水酵素（３１，０００）、および大豆トリプシンイ ンヒビター（２１，５００）　（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） 。

Ｈ，旺比旦の空胞形成毒素の精製は、ブロス培養土清中に存在するタンパク質の 硫酸アンモニウム沈澱を含み、続いて上記のように、疎水性相互作用、ゲル濾過 、陰イオン交換の一連のクロマトグラフィーを行った。変性条件下での５ＤＳ− ＰＡＧＥおよび銀染色で、Ｍｒ＝　８７．０００±３００のタンパク質サブユニ ットの等質性までの精製が示された（図２）。表１にまとめたように、精製プロ セスの各段階の比活性の分析で、毒素（ＣＢ抗原）は未濃縮ブロス培養上清から ５０００倍および硫酸アンモニウム沈澱物から２５倍を越える精製度であった。

このように、他のＨ，肛包■産物に比較して、Ｈ，旺包ムブロス培養土清中より 高濃度で存在する実質的に純粋な調製物が得られた。精製毒素の回収率は、培養 上清ｌリットルあたり８μｇで、これは原末濃縮上清中で存在する毒素活性の５ ％より少ない量に相当する。

上記精製方法に加えて、実質的に純粋な毒素は、５ＵＰＥＲＯＳＥ１２　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）カラムの代わりに５ＵＰＥＲＯＳＥ　６　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）カラムを用いることによって生成され得る。同様に、精製方法におけるその 他の修正も、当業者により採用され得る。例えば、ＰＭＳＦ、　ＤＴＴＳＥＤＴ Ａ、および１０％グリセロールのようなタンパク質変性を阻害するための添加物 が包含され得る。

（以下余白） 表ＬＨ，旺ｈユ株６０１９０由来の空胞形成細胞毒素活性の精製精製段階　比活 性　精製度（−倍） ブロス培養上清　４．ｓ±１．５１ 硫酸アンモニウム沈ｍ　９５０±５３０　２１１フエニルスーパーロース　２０ ００±３１０　４４４クロマトグラフイー ５ＵＰＥＲＯＳＥ　１２　１６．０００±５９００　３５５６クロマトグラフイ ー ＭＯＮＯＱ　２４，０００±５６００　５３Ｆ３１３回の精製結果を示す（平均 ±ＳＥＭ）。クロマトグラフィー条件はテキストの説明通りであった。比活性は 、タンパク質濃度（ｌＩ＋ｇ／＋ｌ）に対する毒素活性の逆数力価比率で定義し た。

（以下余白） 実施例２ ＣＢ　ンバク　の　・（ 疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより部 分的に精製した後、毒素調製物を変性条件下の７％アクリルアミドゲル上で電気 泳動した。Ｍｒ＝　８７．０００バンドを切り出し、ゲルから溶出し、そして０ ．７Ｍ炭酸水素アンモニウムを加えた。次いで溶液をＰＨＥＮＹＬＳＵＰＥＲＯ ＳＥ　ＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流し、蒸留水で溶出した。ア ミノ末端アミノ酸配列決定を既に記載されているようにして行い（Ｐｅｔ、　Ｚ 、、　Ｅｌｌｉｓｏｎ、　Ｒ，Ｔ、、　ＩＩＩ、　Ｌｅｖｉｓ、　Ｒ，Ｖ、、お よびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９８８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　 ２６３：６４１６−６４２０）、そしてＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏ＋＊ｅｄｉｃ ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　５ｗ１ｓｓ−Ｐｒｏ ｔデータベースで既知のタンパク質との潜在的な相同について検索したＯ　アミ ノ酸組成分析を、Ｊｏｎｅｓ　（Ｊｏｎｅｓ、　Ｂ、Ｎ、（１９８１）Ｊ、　Ｌ ｉ　、　Ｃｈｒｏｍａｔ　ｒ、　４：５６５：５８６）の記載のようにして行っ た。

精製したＭｒ＝８７，０００の変性タンパク質サブユニットのアミノ酸組成は以 下のようであった（モル％で示す）　：　Ａｓｘ　１４．８、　Ｇｌｘ　９．６ ．　Ｓｅｒ　９．３．　Ｈｉｓ　１．５．　Ｇｌｙ　１３．０．　Ｔｈｒ　６． ７．　Ａｒｇ　３゜５、　Ａｌａ　８．１．　Ｔｙｒ　３．８．　Ｍｅｔ　２． ３．　Ｖａｌ　６．７．　Ｐｈｅ　４．６．　ｌｉｅ　６゜７、　Ｌｅｕ　９． ３　（Ｌｙｓ、　Ｔｒｐ、　Ｐｒｏ、およびＣｙｓは未決定）。２回の測定に基 づき２３個のＮ末端アミノ酸の配列は、表２に示すようである（配列番号２）。

Ｎ末端配列は疎水性アミノ酸に富み、非荷電性であり、そして推定される等電点 が５．８３である。

Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ構造予測は、この部分の配列が１００％伸長構造 （ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関連していることを示す。

Ｍｒ＝　８７．０００タンパク質サブユニツトおよび他の既知のタンパク質のＮ 末端配列間の比較では、強い相同性はないことが示された。しかし、Ｍｒ＝　８ ７．０００タンパク質サブユニツトのＮ末端配列と多数の他の既知のタンパク質 の中間配列との間には、部分的な相同性があった。これらの既知のタンパク質の 多くは、輸送過程に関わっていた（表２）　（Ｓａｌｋｏｆｆ、　Ｌ、、　Ｂｕ ｔｌｅｒ、　Ａ、、　５ｃａｖａｒｄａ、　Ｎ、、およびＷｅｔ、　Ａ、（１９ ８７）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：８５６９−７２；　Ｒｏ ｇａｒｔ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｃｒ１ｂｂｓ、　Ｌ、Ｌ、、　Ｍｕｇｌｉａ、　Ｌ、 に、、　Ｋｅｐｈａｒｔ、　Ｄ、Ｄ、、およびＫａｉｓｅｒ、　Ｍ、Ｗ、（１９ ８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：８１ ７０−７４；　Ｔａｋｅｙａｓｕ、　Ｋ、、　ＴａＩｌｌＨＢｌｏＭ、Ｍ、、　 Ｒｅｎａｕｄ、　ＫＪ、、およびＦａｍｂｒｏｕｇｈ、　Ｄ、Ｍ、（１９８Ｂ） 　！、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６３：４３４７−５４；　Ｈｅ５ｓｅ、 　Ｊ、Ｅ、、　Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ、　Ｌ、。

Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ、に、、　Ｒｅ１ｃｉｎ、　Ａ、Ｓ、、　Ｄｏｒｕｓ、　Ｅ 、、およびＥｐｓｔｅｉｎ、　Ｗ、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：４７４６−５０；　Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ 、、　ＭｏｒｉｙａＩｌａ、　Ｙ、、　Ｈｕｌｍｅｓ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｐａｎ、 　Ｙ−Ｃ，Ｅ、　Ｎｅ１ｓｏｎ、　Ｈ，、およびＮｅ１ｓｏｎ、　Ｎ、（１９８ ８）　ｏｃ、ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ’。

ユＳＡ　８５：５５２１−２４；　Ｈｉｌｅｓ、　１．Ｄ、、　Ｇａｌｌａｇｈ ｅｒ、　Ｍ、Ｐ、、　Ｊａｍｉｅｓ。

ｎ、　Ｄ、　Ｊ、　、　および旧ｇｇｉｎｓ、　Ｃ，Ｆ、（１９ｇ？）　Ｊ、　 Ｍｏ　、　Ｂｉｏｌ、１９５：１２５−４２；　および５ｚｋｕｔｎｉｃｋａ、 　Ｋ、、　Ｔｓｃｈｏｐｐ、　Ｊ、Ｆ、、　Ａｎｄｒｅｖｓ。

Ｌｌ、およびＣｒ１ｌｌｏ、　ｖ、Ｐ、＜１９８９）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ　１７１：４４８６−９３；　Ｈａｖｋｉｎｓ、　Ａ、Ｒ，、Ｌａｍｂ、　Ｈ ｏに、、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、、　Ｋｅｙｔｅ、　Ｊ、Ｗ、。

およびＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｃ，Ｆ、（１９８８）　Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ ｅｔ、　２１４：２２４−２３１；　Ｇｏｌｄｒｉｃｋ、　Ｄ、、　Ｙｕ、　Ｇ 、−Ｑ、、　Ｊｉａｎｇ、　Ｓ、Ｑ、、およびＨｏｎｇ、　Ｊ、−Ｓ、　（１９ ８８）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０：３４２１−３４２６）。水治療法 プロット分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｐｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｅｓ）に基づく と、Ｌｕ±■ｉ　Ｍｒ＝　８７．０００タンパク質サブユニツトに相同な配列は 、しばしば疎水性の膜に広がっているセグメントであった。表２に挙げたタンパ ク質に加えて、ブタ由来のカルシウムチャンネル放出タンパク質（Ｈａｒｂｉｔ ｚ、　１．、　Ｃｈｏｗｄｈａｒｙ、　Ｂ、、　Ｔｈｏｍｓｅｎ。

Ｐ、Ｄ、、Ｄａｖｉｅｓ、Ｗ、、Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｗ、、Ｋｒａｎ、Ｓ、、Ｇ ｕｓｔａｖｓｓｏｎ。

１、、　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｋ、、　およびＨａｕｇｅ、　Ｊ、Ｇ、（ １９９０）　し■ｌ罰ｓ　８：２４３−２４８）　、う／ト由来のカイニン酸ゲ ートイオンチャンネル前駆体（Ｈｏｌｌｍａｎｎ、　Ｍ、、　Ｏ’５ｈｅａ−Ｇ ｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、　Ａ、　Ｒｏｇｅｒｓ、ＳＪ、、およびＨｅ１ｎｅｓａｎ ｎ、　Ｓ、（１９８９）　■…Ｌ３４２：６４３−８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　 ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の一般アミノ酸（ａ＋＊ｉｎｏ　ａｉｄ）パ ーミアーゼ（Ｊａｕｎｉｚｕｘ、　Ｊ、−Ｃ，、およびＧｒｅｎｓｏｎ、　Ｍ、 （１９９０）Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　１９０：３９−４４）　、 Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアルギニンパーミアーゼ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ 、　Ｗ、　（１９８５）　Ｌ−ｌシ土、　Ｃｈｅｌｌ、　２　。

６０：１１８３１−７）、Ｌゴ立■由来のラクトースパーミアーゼ（Ｄ、Ｅ、、 　Ｇｒｏｎｅｂｏｒｎ、　Ｂ、、およびＭｕｌｌｅｒ−■ｉｌｌ、　Ｂ、　（１ ９８Ｇ）　■凰Ｂ２Ｂ５：５４１−５４５）、およびＥ、　ｃｏｌｔ由来のマン ノースパーミアーゼＥｌｌ−Ｐ　ＭＡＮセグメント（Ｅｒｎｉ、　Ｂ、、　Ｚａ ｎｏｌａｒｉ、　Ｂ、、およびＸｏｃｈｅｒ、　Ｈ，Ｐ、　（１９８７）　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６２：５２３８−４７）と部分的な相同性があ った。Ｍｒ＝　８７．０００タンパク質サブユニツトのＮ末端と、複数のファミ リーのイオンチャンネルおよび輸送タンパク質の異なる領域との間の部分相同性 は、この関係が注目に値することを示唆している。

２４１　Ａ　Ｆ　Ｆ　５　Ｔ　−Ｎ　Ｃ−Ｖ　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｖ　Ｇ　Ｉ　Ｖ 　工　Ｓ　Ｔ　Ｇ　Ｄ　ＲＴ　２６コＨ十−輸送ＡＴＰアーゼプロテオリビド鎖 ：ウシ　（配列番号７）５０　ＥＭ　工　ＭＫ−５Ｉ−ＩＰＶＶＭＡにＩＩＡＩ ＹＧＬＶＶ　７２２０日　Ｌ　Ｆ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　−Ｎ　Ｘ　−Ａ　Ａ　Ｇ　Ｋ　 Ａ　Ｌ　（１；　工　Ｖ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｖ　Ｓ　Ｔ　２］０非変性毒素（Ｃ Ｂ抗原）の分子量の測定を、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１Ｍ　Ｎａ Ｃ１（ｐＨ７，７＞を含有する緩衝液を用いて、５ＵＰＥＲＯＳＥ　６　ＨＲ１ ０／３０カラム（Ｐｈａｒ＋ｉａｃ　ｉａ）で行った。標準物質（Ｓｉｇ＋ｓａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）は、サケ精子ＤＮＡ　（ボイド容量）、ブル ーデキストラン（２，０００，０００）、ウシチログロブリン（６６９，０００ ）、ウマ牌臓アポフェリチン（４４３，０００）、サツマイモ由来β−アミラー ゼ（Ｚｏｏ、０００）　、ウシ血清アルブミン（６６，０００）、およびウシ赤 血球由来カルボニックアンヒドラーゼ（２９，０００）を含む。この分析に用い られた毒素調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマ トグラフィーにより部分精製を行い、次いで５ＵＰＥＲＯＳＥ　（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）　６　ＨＲ１０／３０カラムにかけた。空胞形成毒素活性（細胞培養で 検出されるような）および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されたＭｒ＝　８７．０ ００バンドはいくつかの画分に存在し、９７２．　Ｇｏｏよりも大きなＭｒを有 する各画分は凝集によるものと考えられる。凝集が精製に用いられる処理から生 じるかどうかを決定するために、Ｈ，肛旦葺６０１９０由来の濃縮していないブ ロス培養上清を同じカラムを通して継代培養し、Ｍｒ＝８７，０００タンパク質 サブユニ、トに対する抗血清との反応性について、画分をＥＬＩＳＡで分析した 。１００．０００よりも大きい推定分子量のタンノくり質を含む複数の画分が抗 血清により認識され、Ｍｒ＝　８７．０００タン／ｆり質サブユニットの凝集が 未処理の上清においても生じていることが示された。

精製毒素のｐｉを等電点電気泳動により測定した。等電点電気泳動は、５Ｍ尿素 および２．５％アンフオライト（ｐＨ範囲３．５〜９５）を含む５％アクリルア ミドゲル（ＬＫＢ、　Ｂｒｏ＋ａｍａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）用いるＲｅ５ｏｌｖｅ 　Ａｌｐｈａ水平電気泳動ユニット（Ｉｓｏｌａｂ、１ｎｃ、、　Ａｋｒｏｎ、 　ＯＨ）で行った。標準物質（Ｓｉｇｍａ）は、トリプシンインヒビター（４， ６）、β−ラクトグロブリンＡ　（５，１３）、ウシ炭酸脱水酵素１ｔ（Ｂ）　 （５，９）、およびヒト炭酸脱水酵素Ｂ（６，６）であった。精製されたＨ、　 凶」旦ｄ１のＭｒ＝８７．０００の変性タンパク質サブユニットおよび等電点電 気泳動標準物質を、１時間エレクトロブロッティングすることによりニトロセル ロース紙上に移した。標準物質は、クマシーブルーでの染色により分析し、そし てＬゎ」且」、タンパク質は、以下に記載の方法を用い、特異抗血清でのイムノ ブロッティングにより分析した。非変性毒素は１％アガロースゲル（ｌｓｏｌａ ｂ、　Ａｋｒｏｎ。

０ｈｉｏ）で移動しなかった。おそらくそのサイズが大きいごとによる。従って 、Ｍｒ＝　８７，０００タンパク質サブユニツトを、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルフラ グメントから溶出し、５Ｍ尿素を含む５％アクリルアミドゲルで等電点電気泳動 し、ｐｌは約６．１ヲ示シタ。

実施例３ ′・をコード　るＤＮＡ　１のＰＣＲ−および　のクローニング 中間アミノ酸配列を決定するために、Ｌ」９立ｄ６０１９０由来ＣＢ抗原を、Ｃ ｏｖｅｒら、「肚且ｃｏｂａｃｔ旦＝匠ｍ旦由来空胞形成毒素の精製および特徴 付け」、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６７：１０５７０−５７５　（１９ ９２）の記載のようにカラムクロマトグラフィーにより精製した。　クロマトグ ラフィーについては実施例１を参照のこと。

精製した８７ｋＤａバンドをＰＶＤＦ紙に固定化し、切り出した。アミドブラッ ク染色し切り出したタンパク質バンドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１回洗浄し、０．５ ｍｌの２００７ｚ　Ｍ　Ｎａ０）Ｉ／　２０％アセトニトリルで１分間脱色し、 次いでＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１回洗浄した。残っている非特異的タンパク質結合部 位を０．５ｍｌの０．２％ＰＶＰ−４０／メタノール（ｗ／ｖ）で室温で３０分 間、次いで０．５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えてブロックした。サンプルを１ １のＭｉｌ　１ｉ−Ｑ水で６〜１０回洗浄して過剰のＰＶＰ−４０を除去し、約 １　ｘ　１−＋ａｍ平方に裁断し、同じＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに戻した。

５０マイクロリツトルの１％ＲＴＸ−１００／　ｔｏ％アセトニトリル／　１０ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　（ｐＨ８，０）をストリップに加え、次いで５μｌ のＡｒｇ−Ｃプロテアーゼを加えた。最良の結果は、５０μｍ未満の体積の消化 緩衝液で得られた。消化は、３７°Ｃで２４時間行った。消化緩衝液中に０．０ ０１％より多いＳＤＳを使用する実験では、ヘプタン／イソアミルアルコール（ ４：ｌ、Ｖ　／　Ｖ　）での抽出をＨＰＬＣ分析の前に行った。

Ｆｒａｎｋ、　Ｒ，Ｗ、　、　およびＢｏｓｓｅｒｈｏｆｆ、　Ａ、　（１９８ ８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌ　 ｓｉｓ　（Ｗｉｔｔ＋＊ａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ、　Ｂ、、編）、　ｐｐ、　２ ７３−２７９．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ　Ｈｅｉｄ ｅｌｂｅｒｇｏ消化後、サンプルを５分間超音波処理にかけ、次いで１７００ｒ ｐｍで５分間遠心分離し、そして上清をＨＰＬＣ注入バイアル（Ｈｅ冒１ｅｔｔ −Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。引続き５０μｌの消化緩衝１ｆｆｌ（ＩＸ）およ び５Ｏμｌの１．１％ＴＦＡ（２Ｘ）での洗浄を、超音波処理および遠心分離に かけて上記のようにして行った。すべての上清を全部で２００μｌになるようプ ールした。サンプルをすぐにＨＰＬＣで分析しない場合は、２μＩの１％ＤＦＰ ／エタノール（Ｖ　／　Ｖ　）をプールした上演に加えて消化を停止させ、バイ アルを−２゜°Ｃで保存した。

ペプチドの単離は、二溶媒デリバリ−システム、ダイオード線検出器、容量可変 インジェクター、およびオートサンプラーを備えた１０９０Ｍ　ＨＰＬＣ（Ｈｅ ｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、　Ａｖｏｎｄａｌｅ、　ＰＡ）で行った。７０− セルからの放出を、死容ｊｌ（ｄｅａｄ　ｖｏｌｕｍｅ）が９μｍである牛ヤピ ラリーによりフラクションコレクターに直接連結した。データは、Ｈｅｖｌｅｔ ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　７９９９５Ａ　Ｃｈｅｗ−Ｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを 用いて集めた。ペプチドを注入（２００μｍ）Ｌ、Ｖｙｄａｃ　Ｃｐｓカラム（ ２，１×２５０１１ＩＩ１１）で、流速１５０μｍ　７分で、室温で分離した。

クロマトグラフィー条件は、Ｓ　ｔｏｎｅらの記載のようにした。５ｔｏｎｅ、 　Ｋ、Ｉ、、、　ＬｏＰｒｅｓｔｉ、　Ｍ、Ｂ、、　ＷｉｌｌｉａＩｌｓ、　Ｎ 、Ｄ、、　Ｃｒａｗｆｏｒｄ、　Ｊ、Ｗ、、　ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ、　Ｒ，、お よびＷｉｌｌｉａｍｓ、　Ｋ、Ｒ，（１９８９）　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　ｉｎ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　（Ｈｕｇｌｉ、Ｔ、Ｅ、、り　、３７？ −３９０頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｏ　簡単に述 べると、濃度勾配は、１．６〜２９．６％Ｂ（０〜６３分）、２９．６〜６０％ Ｂ（６３〜９５分）、６０〜８０％Ｂ（９５〜１０５分）であり、そして用いた 緩衝液は、Ａ＝０．１％ＴＦＡ／　Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水およびＢ緩衝液＝　０．０ ８％ＴＦＡ／アセトニトリルであった。次いでカラムを、８０％Ｂで１２分間、 １５０μｌ／分で洗浄し、１６％Ｂで５０分間、３００μｌ／分で再び平衡化し た。ペプチド溶出を２２０ナノメーターでモニターした。画分を０．５分ごとに 集め（７５μｌ／画分）、配列分析を行うまで一２０℃で保存した。次いで、中 間ペプチドのミクロ配列決定をＦｅｒｎａｎｄｅｚ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｔ　１９９２：２０１　：２５５−２６４）に記載のようにして行った。

３つのペプチドのミクロ配列決定により、以下のアミノ酸配列が得られた（括弧 は不明瞭な残基を示す）；（Ｌ）ＧＱＦＮＧＮ　（Ｓ）ＦＴ　（Ｓ）ＹＫＤＸＡ Ｄ配列番号１５ （Ｎ）　工ＫＮＶＥ工ＴＲ 配列番号１６ （Ｔ）ＲＶ／より　Ｆ　Ｎ　Ａ　Ｋ　Ｎ　Ｘ　Ｌ　Ｘ　Ｄ　Ｎ　Ｆ　Ｌ　Ｅ　Ｘ 　Ｎ　Ｎ　Ｒ配列番号１７ この情報を用いて、配列番号２のアミノ酸残基番号２から８、および配列番号１ ７に既に示されている中間ペプチドのアミノ酸残基番号１３から２０に相当する 、変性オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。

５’ＴＴＹＴＴＹＡＣＮＡＣＮＧＴＮＡＴＨＡＴ３’配列番号１８ ５’ＧＡＹＡＡＹＴＴＹＹＴＮＧＡＲＡＴＨＡＡＹＡＡｌ’３’　ＣＴ　ＲＴ　 Ｔ　ＲＡ　Ａ　ＲＲＡ　Ｎ　ＣＴ　Ｙ　Ｔ　Ａ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　ＲＴ　Ｔ　５’配 列番号２゜ 表３ Ｒ＝Ａ、Ｇ　Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃでり、ｔ、Ｇｔ’＋ｓイＪＸＩＹ＝Ｃ，ＣＢ＝ｃ、 ’ｒ、ｃテｉ、１．　Ａｔ”＋＞ｑｔ。

Ｍ＝Ａ、ＣＶ＝Ｇ、Ａ、ｃで１５７ｔ、Ｔｔ−ｔｚ９．ｔＫ＝Ｇ、Ｔ　Ｄ＝Ｇ、 Ａ、Ｔｉ”ｉ、ｉｏＣ１”＋１４Ｊ　Ｌ　ｌ５＝Ｇ、ＣＮ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ’ 変性プライマー中に用いられている記号を表３に示す。

変性オリゴヌクレオチドブライマーは、ＤＮＡシンセサイザーで標準ホスホルア ミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｉｔｅ）化学を用いて合成した。これ らの変性オリゴヌクレオチド（配列番号１８および２０）をポリメラーゼ連鎖反 応におけるプライマーとして用いた。このプライマーは、毒素遺伝子の介在配列 を増幅するように設計した。Ｌ−Ｌ」Ａｕ４６０１９０細胞を蒸留水中に血液寒 天プレートから採取し、１ｏｏ″Ｃで５サイクルボイルし、遠心分離にかけてデ ブリを除去した。この上清を、ＰＣＨのＤＮＡテンプレートとして用いた。

ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ熱すイクラ−を用いて、製造 者の指示に従って行った。ＰＣＲは、温度９４℃で１．５分間、３７°Ｃで２分 間、および７２°Ｃで２分間のサイクルで５サイクル、次いで、温度９４℃で１ ．５分間、４１℃で２分間、および７２℃で２分間のサイクルで４５サイクル行 った。増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析し、有力なバンドが ０．５ｋｂに移動したことが分かった。

０．５ｋｂの増幅されたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから切り出し、精 製し、そしてｐＴ７ｂｌｕｅ　Ｔ−ベクターキット（Ｎ。

ｖａｇｅｎ）を用いてＮ０ＶＡＢＬＵＥ　（Ｎｏｖａｇｅｎ）細胞にクローニン グした。プラスミドＤＮＡを形質転換体から精製し、そしてＰｓｔ　１およびＢ ａｒ旧で消化することにより、０．５ｋｂ挿入断片の存在を確認した。λＺＡＰ ベクタープライマーを用いる挿入断片のジデオキシヌクレオチド配列決定は、標 準法により行った。Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　７１：１３４２−４６　（１９７７）、およびＭａｎｉａｔｉｓ、 ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ　Ｍａ　ｕ ａＬ堕ユ」肛止しム■二、　ＮＹ、　１９８９゜増幅産物の核酸配列を配列番号 ｌに示す（５′から３′方向、２４から４９５塩基）。この配列の部分は、配列 番号２．１５、および１７のアミノ酸配列を正確にコードしていたので、毒素遺 伝子の一部が首尾よくクローニングされたことが分かる。詳細には、配列番号１ ５は、配列番号ｌの４００から４５０塩基によりフードされていた。

完全な毒素遺伝子をクローニングするために、Ｌ上山且６０１９０由来の染色体 ＤＮＡを超音波処理により剪断し、得られたフラグメントを０．７％アガロース ゲル上で電気泳動した。２〜１０ｋｂの大きさの範囲の７ラグメントを切り出し 、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し平滑末端を得、ホスホリル化ＥｃｏＲ１オ クタマーリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結した。Ｄ ＮＡをＥｃｏＲＩ切断し、λＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏ Ｒ１アームに連結した。連結混合物をＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩパッケージングミ ックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に加え、ＸＬＩ−ｂｌｕｅ細胞で滴定した。上 記の毒素遺伝子のクローン化０．５ｋｂフラグメントをランダムへ牛サマーを用 いるプライマー伸長により放射標識し、ゲノムライブラリーをスクリーニングす るのに用いた。８つの反応性クローンから組換えファージミド（ｐｈａｇｅｍｔ ｄ）を切り出し、ＸＬｌ−ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。これらのクローンに由 来するプラスミドＤＮＡは、１．２ｋｂ、　１．１ｋｂ、または２．２ｋｂのＤ ＮＡ挿入断片であることを示した。このような大きさの挿入断片を含む３つの代 表的なりローンを、それぞれさらなる研究に用いた（ｐｌＡｌ、ｐ３Ａ１、およ びｐ３Ｃ）。これらの組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ処理により、 ｐｌＡｌと９３Ａ１との間には重複がないことが示された。

１）ＩＡＩおよびｐ３Ａ１の部分配列を、順方向および逆方向ベクタープライマ ーの両方を用いて決定した。毒素のＮ末端アミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列は ｐ３Ａ１中で同定され、配列番号１５および１７に示される中間アミノ酸配列に 相当する配列はｐｌＡｌ中で同定された。ｐ３Ａ１の１．１ｋｂ挿入断片は、■ 列番号１の１から１７７塩基に相当する配列、および約０．９ｋｂの上流配列を 含んでいた。ｐｌＡＬの１．２ｋｂ挿入断片は、配列番号ｌに示された配列の１ ７８から１４１２塩基に相当する配列を含んでいた。

Ｅ、　Ｃｏ１１での　え　の クローン３Ａ１は、毒素遺伝子の１７７塩基（Ｎ末端アミノ配列を含む）、リー ダー配列、有望なプロモーター、および約０゜８ｋｂの上流配列を含んでいた。

クローンＩＡ１は、１．２ｋｂの中間毒素遺伝子（配列！７７−１４１２）を含 んでおり、そして３Ａ１の下流末端にあるＥｃｏＲ１部位に隣接している。毒素 を組換え発現させる１つのアプローチは、プライマーとして配列番号１の１から ２０塩基および１３９２から１４１２塩基を用いて、毒素遺伝子の１４１２塩基 対フラグメントをＰＣＲ増幅することである。次いで、この配列をＥ、　ｃｏｌ ｉ　ＸＬＩＢｌｕｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし得、組換え 毒素を発現させ得る。あるいは、３Ａ１およびＩＡＩのＤＮＡ挿入断片をｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｌ）ｔプラスミドから切り出し得、ゲル精製し得る。挿入３Ａ１を 中間制限部位でカットし、３Ａ１のフラグメントをゲル精製する。毒素遺伝子の 所望の部位（プロモーター、リーダー配列、およびｌから１７７塩基）を含む３ Ａ１のフラグメントを挿入断片ＩＡＩに連結し、ｐ［１ｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサ ブクローニングし得る。両場合ともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔによる組換え毒 素の生産は、ＩＰＴＧにより誘導され得る。組換え毒素がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔで発現されない場合は、融合タンパク質の生産を含む改変発現ベクター（例え ば、ｐＧＥＸ２Ｔ）が用いられ得る。

本実施例で議論されるように、約５５％の毒素遺伝子がクローニングされ、配列 決定された；しかじ、毒素遺伝子の残りの部分の配列をクローニングおよび配列 決定するために、既知の配列の下流部分をプローブとして用い、λＺＡＰ　Ｉ＋ ライブラリーを再スクリーニングし得る。次いで、完全な遺伝子をコードする配 列の構築を上記の方法と類似の方法を用いて行い、そして完全組換え毒素をＥ、 　ｃｏｌｔで発現させ得る。

実施例４ ポリメラーゼチェイン　口またはプローブバイブ暫　゛イゼーシヲンによるＨｌ Ｏｒｉ　のＬ」工ｌロ感染の診断用試験はサンプルの増幅に関するプライマーに 基づいて開発され得る。より詳細には、配列番号１に示したヌクレオチドから選 択される合成オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼチェイン反応において用い、 検出可能なレベルにまでＬ」ｆ立口毒素を増幅し得る。この検査では、非変性プ ライマー配列をＰＣＨに用いる。これらの非変性プライマー配列は、配列番号１ に示される核酸から選択される。

より詳細には、それらは以下を含み得る：５’ＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧ ＡＴＣＡＴ］’　配列番ｑ２１〕’　ＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＴ ＴＡＴＴ　５　’　配列番号２２これらのプライマーを用いることにより、実施 例３に示したようにして、０．５ｋｂの増幅産物を生成する。あるいは、臨床サ ンプルを、放射標識した配列番号１またはその一部分と／Ｓイブリダイズするこ とにより、毒素遺伝子を検出し得る。

実施例５ ＣＢ　の　および　旧こお（る に・　る　゛の Ｍｒ＝　８７．０００タンパク質サブユニツトに対する抗血清は、雌シロニュー シーラントウサギにおいて産生させた。これは、既に記載されたレジンに従って 行った（　Ｇｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　、　Ｄｏｏｌｅｙ、　ｃ、ｐ、、および Ｂｌａｓｅｒ、　Ｍｌ、（１９９０＞　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍａ＋ｕｎ、５８二６ ０３−６１０）。まず、ウサギを、Ｍｒ−８７，０００の変性タン／ｆり質サブ ユニットを含むクマ／−ブルー染色アクリルアミドゲルフラグメントで免疫した 。続けて、そのウサギを、非染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから蒸留水で溶出し、上 記のように疎水性相互作用クロマトグラフィーにより濃縮したＭｒ＝　８７．０ ００の変性タンｉ４り質サブユニットで免疫した。

免疫前血清および免疫血清をウェスタンプロ・ット分析（こより評価した。５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより分離した後、Ｈ，旺ｍム培養土清中のタンパク質を、１アン ペアで１時間のエレクトロブロッティンクによりニトロセルロース紙上に移した 。二）０セルロ一ス紙ストリップを血清とインキュベートし、洗浄し、アルカリ ホスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）または抗ウサギＩｇＧ　（Ｔａｇｏ、　 Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）とインキュベートし、そしてＢｌａｋｅら（Ｂ ｌａｋｅ、　Ｍ、Ｓ、。

Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｋ、Ｈ，、Ｒｕ５ｓｅｔ−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、１．、　お よびＧｏｔｓｃｈｌｌｃｈ。

Ｅ、Ｃ，（１９８４）　Ａｎａ！、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３６：１７５−１７ ９）の記載のようにして呈色（ｄｅｖｅｌｏｐ）　した。精製されたＭｒ＝　８ ７．０００タンパク質サブユニツトに対して産生された抗血清は、Ｍｒ＝　８７ ．０００タンパク質バンドを認識し、池のＨ，旺ｍ口成分は認識しなかったく図 ３）。

免疫前ウサギ血清および免疫ウサギ血清はまた、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより評価した 。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターウェル当り１５ｎｇの精製ＣＢ抗原で行い、 方法は既に記載されている通りであった（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、！、 、　Ｄｖｏｒｋｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｃｈｏｄｏｓ、Ｊ、Ｅ、、　およびＢｌａ ｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　１０ ９：４６５−４７１　本明細書中に参考として援用されている）。ペルオキシダ ーゼ結合抗ヒトＩｇＧ　（Ｔａｇｏ）または抗ウサギＩｇＧ　（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をコンジュゲートとして用いた。ウサギ血清の力価 を、０２より大きい光学濃度を生じる最高希釈の逆数として定義した。この方法 を用いると、抗血清の力価は１：５１２，０００であり、一方免疫前血清の力価 は１：２００未満であった。

＋　の　中和アッセイに用いる毒素調 製物を、既に記載のようにして、Ｈ，旺包■６０１９０を４８時間、５％ウシ胎 児血清を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにおいて培養し、培養物を遠心し、そして 限外濾過により上清を濃縮することにより調製した（Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、 　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、！０．およびＢ ｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋ｕ＋ｕｎ、　５９： １２６４−１２７０）。血清を５６℃で３０分間加熱し、組織培養液中で希釈し 、そして等量の濃縮Ｈ，ＰＪ１９ＬＬＬ上清と１時間インキュベートした。

これは既に記載されているようにして行った（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　。

Ｃａｏ、　Ｐ、、　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ、に、、５ｉｐｐｌｅ、Ｍ、Ｓ、、および Ｂｌａｓｅｒ。

Ｍ、Ｊ、　（１９９２）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　９０：９１３− ９１８）。空胞形成毒素活性における血清の中和効果は、ニュートラルレッド取 り込みアッセイ（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　ｕｐｔａｋｅ　ａｓｓａｙ）を用い て定量した（Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅ ｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、　（１９９１） 　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５９：１２６４−１２７０）。用いたアッセ イ条件下では、抗血清は、１：６４希釈でＨ，旺独且６０１９０由来の上清の空 胞形成毒素活性を完全に中和したが、一方免疫前血清は中和活性を有していなか った（図４）。抗血清はまた、２つの他の毒素産生Ｈ，旺旦■株に由来の培養上 清に存在する毒素活性をも完全に中和し、種々のＨ，ｄ亘単離株により産生され る空胞形成毒素は抗原的に関連があることが示された。

（以下余白） 表４　本研究で用いたヒト由来Ｉ１．　麿単離株８５−４５６　ＮＴＣＣ１１６ コ８　＋　４０８逆数の毒素力価は、記載に従って、培養液のみで誘導される取 り込みより、３ＳＤより大きいＩＩｅＬａ細胞ニュートラルレッド取り込みが誘 導される最大希釈として定義した（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　Ｐｕｒｙｅａ ｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　 Ｍ、Ｊ（１９９＋）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５９：１２６４−１２７０ ）。

Ｈ１１ｏｒｉ立　゛　（こおする　≦）次の実験は、空胞形成毒素活性とＨ，ｕ Ｈ坦培養上清中のＣＢ抗原の存在との間に関係があるかどうかを決定することを 目的とした。濃縮Ｈ，旺ｍ■培養上清の採取物から、８つのｔｏｘ’株および８ つのｔａｘ−株の上清を選択した（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　。

Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ，Ｐ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９０）　１ ｎｆｅｃｌ　Ｉｍｍｕｎ。

５８　：６０３−６１０）。

これらのＨ，旺包■株（表４）を５％ウシ胎児血清を含む旦ｒｕｃｅｌ　ｌａブ ロスにおいて培養し、培養上清を、既に記載のようにして、限外濾過により濃縮 した（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、　、　Ｄｏｏｌｅｙ、　Ｃ３Ｐ４．および旧 ａｓｅｔ、　Ｍ、Ｊ、　（１９９０）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｕｎ、　５８：６０ ３−６１０）。

空胞形成毒素活性を定量するために、これらの上清の各希釈物を、ニュートラル レッドアッセイを用いて検査した（Ｃ。

ｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｐｕｒｙｅａｒ、　Ｗ、、　Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、 　Ｇ、１．、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ ｍｍｕｎ、５９：１２６４−１２７０）。１コ２０よりも希釈した場合に、各ｔ ｏｘ”上清は、培養液のみより２倍より大きい、細胞による純ニュートラルレッ ド取り込みを誘導したが、一方各ｔｏｘ−上清は、１：１０に希釈したときに有 意なニュートラルレッド取り込みを誘導しなかった。ＣＢ抗原を検出するために 、１６種の上清を、Ｍｒ＝　１１７，０００タンパク質サブユニツトに対する抗 血清の１　：　１０．０００希釈を用いてＥＬＩＳＡにより検査した（図５）。

ｔａｘ’株由来の上清は、ｔａｘ−株由来の上清よりも有意の高い光学濃度値を 生じた（　０．６１４±０．１０５に対し０．０４６±０．００９、ｐ＜０．０ ００１）。ウェスタンプロット研究により、各ｔａｘ’上清中のＭｒ＝　８７． ０００バンドの存在を確認し、これが変性条件下でのＣＢ抗原の形態であること が示された。これらの２つのグループの上清の間で重複がないことは、ＣＢ抗原 が、Ｈ，旺包ム上清中での空胞形成毒素活性を媒介する主要な置換体であること を示している。

実施例６ Ｈ９ｌ０ｒｉ　ヒ　ト　の　の　の 今までの研究により、全てのＨ，ｕ包ム感染者に由来するわけではないが、　い （人かのＨ，ｕ且■感染者に由来する血清は、毒素中和抗体を含んでいることが 実証されている（　Ｌｅｕｎｋ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、　Ｍ、Ａ、 、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｄ、Ｒ，、Ｌｏｗ、　Ｄ、Ｅ、、およびＳｉｍａｒ、　Ａ 、Ｅ、（１９９０）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２８：１１８ １−１１ｇ４；Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、、　Ｃａｏ、　Ｐ、、　Ｍｕｒｔｈｙ　 Ｕ、に、、　５ｉｐｐｌｅ、　Ｍ、Ｓ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、（１ ９９２）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　９０：９１３−９１８）。そこで 、本発明者らは、Ｈ，ｕ抜頁感染者および非感染者由来の血清中にある、精製Ｃ Ｂ抗抗原タンパクセ対する抗体の普及率を測定することを試みた。

ヒト血清を、以前にｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ａｎｄ 　ｔｈｅ　Ｖｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ 　Ｃｅｎｔｅｒ、５ｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹで胃十二指腸内視鏡検査をうけた、症 状のある患者から選択された４０人の患者から得た。これらの患者の胃生検標本 の分析および血清学的評価に基づくと、２０人はＬ旺旦ユに感染しており、２０ 人は非感染であった。これらの患者の特徴およびこれらの血清の毒素中和活性は 既に記載されている（　Ｃｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｌ、、　Ｃａｏ、　Ｐ、、　Ｍｕ ｒｔｈｙ　Ｕ、！ｆ、、　５ｉｐｐｌｅ、　Ｍ、Ｓ、、およびＢｌａｓｅｒ、　 Ｍ、Ｊ、（１９９２）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　９０：９１３−９１ ８）。これらの４０の血清を、ＥＬＩＳＡにおいて精製ＣＢ抗原との１ｇ０反応 性について試験した（図６）。

ＥＬＩＳＡは、マイクロタイターウェル当り１５ｎｇの精製ＣＢ抗原で行い、方 法は、既に記載の通りであった（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、　Ｇ、１．、　Ｄｖ ｏｒｋｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｃｈｏｄｏｓ、　Ｊ、Ｅ、、およびＢｌａｓｅｒ、 　Ｍ、Ｊ、（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　１０９＋４６ ５−４７１　本明細書中に参考として援用されている）。ペルオキシダーゼ結合 抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ）または抗ウサギＩｇＧ　（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｌｍ）をコンジ一ゲートとして用いた。Ｈ，旺■且感染者由来の血清 によるＣＢ抗原の平均の認Ｈａ度は、非感染者由来の血清によるよりも顕著に強 かった（ｐ＝　０．０００９）。およそ半分の）１．　ｕ包ム感染者に由来の血 清は、非感染者と重複した光学濃度値を生じたが、−万能のＬ■ｆｏｒｔ感染者 に由来の血清は、重複しない光学濃度値を生じた。このことは、２つの集団が存 在し得ることを示唆し、Ｌ■釦且株の５０％〜６０％がインビトロで毒素産生性 であるという観察結果と一致する。本発明者らは、次いで、ＥＬＩＳＡによるＣ Ｂ抗原の認識と、細胞培養アッセイ（Ｃｏｖｅｒ。

Ｔ、Ｌ、、　Ｃａｏ、　Ｐ、、　Ｍｕｒｔｈｙ　Ｕ、に、、　５ｉｐｐｌｅ、　 Ｍ、Ｓ、、およびＢｌａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、　（１９９２）　Ｊ、　Ｃ’ｎ、Ｉ ｎｖｅｓｔ、　９０：９１３−９１８）において既に測定された毒素中和活性と の間に関係があるかどうかを決定した。Ｈ，旺ｍユ感染者由来の血清について、 ＣＢ抗原のＥＬＩＳＡ認識は、毒素中和活性と有意に関連していた（ｐ＝　０． ０１９、ｒ＝ｏ、ｓｔｇ、直線回帰分析による）。対して、非感染者由来の血清 については、これらの変数は有意に関連していなかった（ｐ＝０゜９７３、ｒ＝ 　０．００８）。

実施例７ ヒトを　む　への　のための　ロワクチンの−１本発明者らは、Ｈ，旺艮ｎ感染 に対するワクチンの開発におけるＣ８２７８２貫の使用の可能な適用を考慮した 。ワクチン調製物における胃酸およびタンパク質分解酵素の効果を制限するには 、全体のＣＢタンパク質またはそれらの一部分が腸被覆ゼラチンカプセル中にパ ッケージされ得るか、または炭酸水素ナトリウムと共に投与され得る（Ｂｌａｃ ｋら、「炭酸水素ナトリウムと共にまたは腸被覆カプセル中で投与されたＴｙ２ １ａ弱毒化Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｕ回辻の免疫原性」、Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、 　５ｔａｎｄ、　５３＋０．１９８３）。このワクチンにおいて用いられる抗原 が組換えにより生産され得ることは注目すべきことである。成人の投与量は、好 ましくは、本発明の抗原の５．０〜５０．０ｍｇである。

ＣＢタンパク質の胃腸の免疫系への送達を高めるために、タンパク質［またはタ ンパク質のフラグメントコを化学結合させずに、２３０μｍの大きさの５〜１０ 個の経口摂取される生分解性ミクロスフェアに取り込み得る（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ ら、［生分解性ミクロスフェア：経口免疫のためのワクチン送達システム）Ｊ　 Ｃｕｒｒ、Ｔｏ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．　１４６：５９ ．　１９８９）　。　ミ　クロスフェアは、グリコール酸および乳酸のコポリマ ーで構成される。これらは加水分解により元の成分に分解される。コポリマー内 でのグリコール酸と乳酸との比を調整することにより、加水分解速度は数時間か ら数カ月まで変動する。従って、速効性および遅効性のミクロスフェアの両方が 作製され得る。速効性および遅効性のミクロスフェアの混合物の使用は、１回の 経口免疫で、−次および二次免疫応答の両方を誘導させるために用いられる。

実施例８ ヒトを　む　への　のための　ロワクチンの−胃腸の病原体に対しては経口投与 ワクチンが好ましいと思われるが、他のい（つかの感染因子に対しては非経口ワ クチンが効果を示す。細菌Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　！ＵｉＬの成分（腸チフスの 原因である）は精製され、非経口投与ワクチンとして使用されている。この成分 、Ｖｉ莢膜多糖、ほかなり有効である（Ｋｌｕｇｍａｎ　ＫＰ、ら、「腸チフス に対するＶｊ莢膜多糖ワクチンの防御活性Ｊ　Ｌａｎｃｅｔ　１９８７；２：１ ６５−６９）。ポリオのソータワクチンを非経口的に投与すると、ポリオウィル スへの感染にはほとんどまたは全く効果がないが、ポリオの疾患を予防する。非 経口ワクチンはまた、限定的ではあるが、コレラの予防にも有効である。

ＬｐＬｌｉ！２ｆｉに対して、非経口ワクチンはＣＢタンパク質またはそれらの フラグメントを含み得た。トキソイド調製物もまたジフテリアまたは破傷風トキ ソイドの用途に類似して調製され得た。タンパク質またはそのフラグメントは、 アジュバントと共に、または適切な緩衝液中で単独で投与され得た。

アジユバントは、限定はされないが、ムラミルジペプチド、コンカナバリンＡ、 　ＤＥＡＥデキストラン、脂質多価陽イオン、または炭水化物（例えばへ牛すデ カン）を包含する。

Ｈ，旺江且ワクチンは、ヒトに対し、ｌ論ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７， ４）中１．０＠ｇ（０，５〜５．　ｈｇ範囲）の抗原（ＣＢタンパク質）として 供与され得る。適切な抗原であれば、１回のみの投与が必要とされ得るが、アジ ユバントを加えたまたは加えない複数投与は考慮され得る。

実施例９ ＨｌＯｒｌ　にり・　る　の　および Ｈ３ｌＯｒｌ　の　のための　牛ノド いくつかの異なる検出法を用いて抗体を検出するために、特定の検査キットが構 成される。抗体検出のための１つの検査キットは、複数のウェル、ＣＢタンパク 質またはその抗原性フラグメントで使用する前にコーティングされたプレート、 ならびにベルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびｏ、　ｏｏｓ％過酸化水 素を含むマノキルベン緩衝液中のＡＢＴＳからなる変色指示薬からなる酵素検出 のためのＥＬＩＳＡ材料を含む区画された容器（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｅｄ　 ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）で構成される０アツセイにおいて用いられる抗原は組換え により生産され得ることは注目すべきことである。もちろん、他の酵素および呈 色剤もまた用いられ得る。例えば、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇ Ｇは、ジェタノールアミンおよび塩化マグネシウム緩ＩｉＭ中でｐ−ニトロフェ ニルホスフェートと組み合わせて用いられ得る。

ウェスタンプロット法を用いる抗体検出のための第２の検査キットは、容器、カ バー、ニトロセルロースシート、および、ドデシル硫酸ナトリウムが存在してい るポリアクリルアミドスラブゲル、界面活性剤、ｐＨ調整剤、乾燥脱脂乳、およ び過酸化水素を加えたＴｒｉｓ中のＤＡＢからなる変色指示薬を含む酵素検出の ための材料で構成される。このウェスタンプロット分析キットはまた、ペルオキ シダーゼ標識ヤギまたはウサギ抗ヒト免疫グロブリン、およびＣＢタンパク質ま たはその抗原性フラグメントの原料を含む。

間接免疫蛍光アッセイを用いる抗体検出のための別のＨ，ｐＨム旦ｄ特異検査キ ットは、抗原としてＣＢタンパク質またはその抗原性フラグメントを加えた区画 された容器、ヒト試験血清、リン酸緩衝生理食塩水、およびフルオレセイン結合 ヤギ抗ヒトＩｇＧを含み得る。

最後に、抗体検出のための別のＨ，凶１立ロ、特異検査キットは、リポソームを 用い、容器、ヒト試験血清、蛍光マーカー（または酵素または基質）充填リポソ ーム（表面に抗原を有する）、および界面活性剤を含む。このアッセイでは、こ の容器は、ヤギ抗ヒトＩｇＧを有する予めコーティングされたチューブまたはウ ェルであり得る。

Ｈ，旺包葺特異検査キットは、いくつかの異なる検出法を用いて１１．肛圏ム毒 素を検出するために構成される。１．　ｕ包百毒素検出のための１つのキットは 、複数のウェル、試験されるサンプルでコーティングされたプレート、ＣＢタン パク質またはその抗原性フラグメントに対する過免疫抗血清（またはモノクロー ナル抗体）、抗ウサギ免疫グロブリン、および本実施例で上述されているような 適切なＥＬＩＳＡ材料を含む区画された容器を含む。

ウェスタンプロット法を用いるＨ、　肛江■毒素検出のための第２の検査キット は、容器、カバー、ニトロセルロースシート、および、ドデシル硫酸ナトリウム が存在しているポリアクリルアミドスラブゲル、界面活性剤、ｐＨ調整剤、乾燥 脱脂乳、および過酸化水素を加えたＴｒｉｓ中のＤＡＢからなる変色指示薬を含 む酵素検出のための材料で構成される。このウェスタンプロット分析キットはま た、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、およびＣＢタンパク質またはその抗原性フラ グメントに対する過免疫抗血清の原料を含む。

ラテックス凝集アッセイを用いるＨ、　肛包ム毒素検出のための別の特異検査キ ットは、区画された容器、ラテ・ノクスビーズにコンジュゲートしたＣＢタン、 ＜り質またはその抗原性フラグメントに対する過免疫血清、およびリン酸緩衝生 理食塩水または水を含み得る。

実施例１０ ｂａｆｉｌｏｍ　ｃｉｎ　ＡｔによるＨ、　１ｏｒｉ　’　のＬｐ！ＬＬＱＬＬ 空胞形成毒素に応答して形成する細胞空胞は酸性のｐＨである（Ｃｏｖｅｒ　Ｔ Ｌ、　Ｈａｌｔｅｒ　ＳＡ、　ＭＪ　Ｂｌａｓｅｒ、　１９９２．　ｒ［ユ山且 プロス培養上清により誘導されたＨｅＬａ細胞空胞の特徴付けＪ　Ｈｕｍａｎ　 Ｐａｔｈｏｌｏ　２３＋１００４−１０１０）。真核細胞の区分（ｃｏｍｐａｒ ｔｍｅｎｔ）内のｐＨ濃度勾配の維持は、典型的には空胞型プロトン輸送ＡＴＰ アーゼの活性に依存している（Ｍｅｌｌｍａｎ　Ｉ、　Ｐｕｃｈｓ　Ｒ，および Ａ　Ｈｅ１ｅｎｉｕｓ、　１９１１６．　ｒエンドサイト−シスおよびエキソサ イト−シス経路の酸性化Ｊ　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

５５：６６３−７００）。本発明者らは、真核細胞の空胞ＡＴＰアーゼがＬ」Ｌ ｌ己毒素に誘導された空胞の形成および維持に重要であり得るという仮説をたて た。そこで、Ｌ」Ｌｌは毒素誘導細胞空胞形成における空胞ＡＴＰアーゼインヒ ビターの効果を試験した。

イオン輸送ＡＴＰアーゼの９つの種々のインヒビター（ｂａｆｌｌｏｍｙｃｉｎ 　Ａｌ、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、７−クロロ−４−二トロベンズ２− オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤクロライド）、Ｎ、　Ｎ’ジシクロへキシ ルカルボジイミドペンタクロロフェノール複合体（ＤＣＣＤ）、硝酸ナトリウム 、ウワバイン、ジゴキシン、オルトバナジン酸ナトリウム、オメプラゾール、お よびオリゴマイシン（ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ））の存在下で、ＨｅＬａ細胞をＬ 」ｆ旦己毒素とインキュベートした。

より詳細には、Ｌｌ」且６０１９０　（空胞形成毒素を産生ずる非常に特徴付け られた株である）を、５％ウシ胎児血清を加えたＢｒｕｃｅ１１ａブロス中で、 ５％ＣＯ２環境で３７℃で４８時間培養した。培養物を遠心分離にかけた後、上 清を超遠心分離により３０倍に濃縮し、０．２ミクロンのフィルターに通した。

上清は組織培養アッセイで試験する前に−７０，０″Ｃで保存した。精製毒素は 、ゲル濾過クロマトグラフィーを５ＵＰＥＲＯＳＥ　１２ＨＲ１０／Ｓｏカラム （Ｐｈａｒｍａｅｉａ）の代わりに５ＵＰＥＲＯＳＥ　６　ＨＲ１Ｇ１５０カラ ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で行ったこと以外は、既に記載のようにして、■２１ ム立ｒｉ　６０１９０から調製した。

ＨｅＬａ細胞を、１０％０％ウシ胎清および２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７，２）を含むアール（Ｅａｒｌｅ’　ｓ）塩を加えたイーグル修正最小必須培 地で、５％ＣＯ２環境下で培養した。精製し」Ｌｌ己毒素を包含する実験におい て、培地を１０ｍＭ塩化アンモニウムで補足し、活性を強めた。細胞をＡＴＰア ーゼインヒビターと予め１時間インキュベートさせた後、濃縮した培養上清また は精製したＬ」工ｌ己６０１９０由来毒素を加え、細胞を３７℃でさらに１８時 間インキュベートした。空胞形成は、倒立光学顕微鏡（２００×倍率）により視 覚的に評価し、またはニュートラルレッド取り込みアッセイを用いて定量した。

　（Ｃｏｖｅｒら％ｍ工１ｍｗ＋ｕｎ、５９：１２６４−１２７０　（１９９１ ））。顕微鏡アツセイでは、Ｌｄ且空胞形成毒素活性の阻害を、細胞の１０％未 満に空胞が認められるストリンジェント基準により定義した。

おもに空胞型ＡＴＰアーゼのインヒビターは、Ｌ」Ｌｌ己毒素に反応して空胞の 形成を阻害し、そして毒素により誘導される空胞形成をくつがえした。試験した 空胞ＡＴＰアーゼインヒビターのうちｂａｆｉｌｏＢｃｉｎ　Ａｌが毒素で誘導 される空胞形成の最も有効なインヒビターであった（最小阻害濃度＝　２ＳｎＭ ）。他の空胞ＡＴＰアーゼインヒビター（Ｎ−エチルマレイミド、７−クロロ− ４−二トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキ シルカルボジイミド、および硝酸ナトリウムを含む）は、より高い濃度で空胞形 成毒素活性を阻害した。それに対して、Ｆ＋Ｆθ型またはＰ型ＡＴＰアーゼイン ヒビターは毒素活性を阻害しなかった。（表５を参照のこと）。

（以下余白） 要約すると、空胞型ＡＴＰアーゼのインヒビクー（ｂａｆ　ｉ　ｌｏｍｙｅｉｎ 　Ａｌで例示される）は、Ｌ肛包且空胞形成毒素により誘導される細胞傷害のイ ンヒビターであり、Ｌ■■ム関連胃十二指腸疾患の治療において有用な治療薬で あり得る。

本発明は特定のおよび好ましい実施態様に関連しておもに記載されているが、本 発明の範囲から逸脱しない改変を行い得ることが理解される。以下の請求の範囲 は、一般には本発明の原則に従い、そして本発明の属する分野において既知のま たは慣例の実施内にあるような、または当業者に明らかであるような本発明の開 示からの変更を包含する、本発明のすべての変形、使用、または適用をカバーす ることが意図されている。

（以下余白） 配列表 （１）一般的情報： （＋）出願人：カバー、ティモアー　エル。

（ｉｉ［）配列数＝２２ （１ｖ）連絡住所： （Ｄ）州：イリノイ （Ｖ）コンビニーター読み出し形管＝ （＾）媒体型：フロ／ピーディスク （Ｂ）コンビニーター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換（Ｃ）　ＯＳ　：　ＰＣ−ＤＯＳ／ ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリースＳｔ、Ｏ，バージ１ン ＄１．２５（ｖｌ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ 〈８）出願口・ （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：フェノトレス、スーザン　ピー。

（Ｂ）登録番号：　３１．３２７ （Ｃ）Ｎ会／記録番号：　９２１０４　ＣＩＰ（ｉＸ）ｉ！話回線情報： （２）配列番号、ｌの情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１４１２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：　ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｘｉ）　配列：配列番号 ＝ｌ： ＴＧＧＡＧＧＴＴＧＧ　２４０ ＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡ　ＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧ　ＡＴＣＡ ＡＡＧＧＣＧ　ＧＧＣＡＡＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡ　３００ ＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡ　ＡＡＧＡＣＧＣＴＧＴ　ＡＧＧＧＡＣＴＴＡＴ　ＡＡＡ ＣＴＣＴＣＡＧ　ＧＧＣＴＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＧＴ　３６０ ＧＧＧＧＡＴＴｒＡＧ　ＡＴＧＴＣＡＡＴＡＴ　ＧＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴ ＴＧＣＧＣＴ　ＴＧＧＧＣＣＡＡＴＴＣＭＴＧＧＣＡＡＴ　４２０ ＴＣＴＴ’ｒＣＡＣＡＡ　ＧＣＴＡＴＭＧＧＡ　ＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴ　ＣＧＣ ＡＣＣＡＣＭ　ＧＡＧＴＧＧＡＴ’ｌ’ｒＣＭＣＧＣＴＡＡＡ　４８０ ＡＡＴＡＴＣＴＴＡＡ　ＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴ　ＴＴＴＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＡ ＡＴＣＧＴＧ　ＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧ　５４０ ＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴ　ＣＴＡＣＧＧＴＴｒＴ　ＧＡＣＴＴＴＧＣＭ　ＧＣＴＴ ＣＡＧＡＡＧ　ＧＧＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴ　６００ ＧｃＴ’ｃＡＭＴＴＴ’　ＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡ　ＴＧＧＣＧｃＴＡＣＧ　ＣＴ ＣＡＡＴＴＴＧＧ　ＣＴｒＣＡＡＡＣＡＧＣＧＴＴＡＭＴＴＡ　６６０ ＡＡＴＧＧＣＡＡＴＧ　ＴＧＴＧＧＡＴＧＧＧ　ＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡ　ＴＡＣ ＧＴＧＧＧＡＧ　ＣＧＴＡＴＴｒＧＧＣＣＣＣＴｒＣＡＴＡＣ７２０ ＡＧＣＡＣＧＡＴＡＡ　ＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡ　ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＧ　ＧＡＡ ＧＴＧＡＡＴＴ　ＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣ７８０ ＧＡＴＣＡＣＡＡＣＧ　ＣＣＧＣＴＣＭＧＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＧＴ ＡＡＣＡ　ＡＧＡＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧ　８４０ ＧＴＧＡＡＴＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧ　ＣＴＡＴＧＣＴｒＴＧ　ＧＣＡＧ ＧＡＴＣＡＡ　ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡＡＧ　１コ２０ ＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴ　ＴＡＡＡＧＧＴＧＧＡ　ＴＧＣＴＣＡＴＡＣＡ　ＧＧ（ ２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・不明 （Ｄ）トポロン−二不明 （ｉｉ）配列のｉｉ類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号２： （２）配列番号３の情報２ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｏ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の橿ｗ４：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号３： （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号４： （２）配列番号５の情報： （＋）配列の特色： （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トボロノー二不明 （ｉｉ）配列の種類、タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：５： Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　 Ａｒｇ　Ｔｈｒ（２）配列番号＝６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄントポａジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号、６： （２）配列番号・７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トボロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号７： （２）配列番号８の情報； （Ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）盟二アミノ酸 （Ｃ１鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｆ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号８： （２）配列番号＝９の情報： （＋＞配列の特色： （Ａ）長さ＝２３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）　ｆｆｌの数：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｔ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：９： （２）配列番号：ｌＯの情報： （＋）配列の特色： （＾）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）盟二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄントポａジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号・１ｏ： （２）配列番号：１１の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ：２３アミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉ　ｉ）配列の橿′Ｈ：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号１１： （２）配列番号１２の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トボロジー：不明 （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号１２； （２）配列番号・１３の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ＝２３アミノ酸 （ＢＪ型コ二アミノ 酸Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号：１３： （２＋配列番号・Ｉ４の情報： （ｉ）配列の特色； （＾）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）　１１の数：不明 くＤ）トポロジー；不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号・１４： （２）配列番号：１５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （１１）配列の種類・タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号、１５： Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｈｉ　Ａｓｎ　（ｌｉｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈ ＠Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｙｒｌ　５　１０ （２）配列番号、１６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロノー二不明 （１１）配列のｆ！類：タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号・１６： Ａｓｎ工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ（２） 配列番号１７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）配列の種類、タンパク質 （ｉｘ）配列の特？１１： （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：改変部位（Ｂ）位１１ｊ：３ （ｘｉ）配列・配列番号１７： （２）配列番号１８の情報： （ｉ）配列の特色； （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロノー：不明 （１１）配列の種類：　ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（夏ｉ）配列：配列番号・ １８： ＴＴＹＴＴＹＡＣＮＡ　ＣＮＧＴＮＡＴＨＡＴ（２〉配列番号：１９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｌｉ）配列の種類：　ｇｅｎｏｓｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｘｉ）配列：配列番号・ １９： ＧＡＹＡＡＹＴＴＹＹ　ＴＮＧＡＲＡＴＨＡＡ　ＹＡＡ（２）配列番号、２０の 情報： （＋）配列の特色： （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （１１）配列の種類：　ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｘｌ）配列：配列番号２ ｏ： ＣＴＲＴＴＲＡＡＲＲＡＮＣＴＹＴＡＤＴｒ　ＲＴＴ２コ （２）配列番号２１の情報： （＋）配列の特色： 純光学濃度　（５４０ｎｍ） 吸光度　（２８０ｎｍ） 容量　（ｍｌ） ＦＩＧ、　２ ｂｃｄ ＦＩＧ、　：３ Ｆｉｇ、４ 逆数血清希釈 Δ　免疹前 ム　免瘉 Ｆｉｇ、　５ Ｆｉｇ、　６ ｉｎ　＝　２０１　（ｎ　＝　２０１ 補正書の写しく翻訳文）を是出苫（特許法第１８４条の８）平成６年８月２３日 ｉｍｌ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．真核細胞の空胞形成を特異的に誘導する抗原を含む、実質的に純粋な抗原組 成物（ＣＢ抗原）。
2. ２．前記抗原が９７２，０００より大きい分子量で特徴付けられる、請求項１に 記載の組成物。
3. ３．前記抗原が配列番号１に示されるアミノ末端配列と、配列番号１５、１６ま たは１７に示されるアミノ酸配列からなる群より選択される中間アミノ酸配列と を含有する、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記抗原が、変性させたときに約８７，０００（還元条件下でドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した）の分子量で特徴付 けられる、請求項１に記載の組成物。
5. ５．前記抗原が、約６．１の等電点を有する、請求項４に記載の組成物。
6. ６．前記抗原が、ブロス培養上清中より５０００倍を越える高純度である、請求 項１に記載の組成物。
7. ７．前記抗原が、配列番号１に提示したヌクレオチド配列によりコードされるア ミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
8. ８．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素をコードするＤＮＡ配列を含む、遺伝子また はそのフラグメント。
9. ９．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素に特 異的に結合する抗体：変性または未変性のＣＢ抗原に対する抗血清を産生する工 程。
10. １０．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素に 特異的に結合する抗体：変性または未変性のＣＢ抗原に対するモノクローナル抗 体を産生する工程。
11. １１．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素に 特異的に結合する抗体：請求項１に記載の抗原組成物に対する抗血清を産生する 工程。
12. １２．以下の工程を包含するプロセスによって作られるＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素に 特異的に結合する抗体：請求項１に記載の抗原組成物に対するモノクローナル抗 体を産生する工程。
13. １３．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対するワクチンであって、該ワクチンが、薬学的 に容認される担体を有する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する防御抗体の産生を誘 導するのに効果的な量のＣＢ抗原を含む、ワクチン。
14. １４．前記ＣＢ抗原が、９７２，０００より大きい分子量（未変性条件下でのゲ ル濾過クロマトグラフィーによって測定される）および変性したときに約８７， ０００の分子量（還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電 気泳動で決定される）および約６．１の等電点で特徴づけられる、請求項１３に 記載のワクチン。
15. １５．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染を検出するための診断用検査キットであって、該検 査キットが以下を包含する、キット：（ａ）ＣＢ抗原を含む固定化抗原組成物； （ｂ）該固定化抗原組成物に、試験されるヒトまたは動物から採取した体液を通 過させるための手段；および、（ｃ）該固定化抗原組成物に結合した該体液から 免疫グロブリンを検出するための手段。
16. １６．ヒトまたは動物由来のサンプル中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素を検出するため の診断用検査キットであって、該検査キットが以下を含む、キット； （ａ）細胞空胞形成を誘導する毒素に特異的に結合する抗体（ｂ）該サンプルを 該抗体に接触させるための手段；および（ｃ）該抗体に結合した該体液由来の毒 素を検出するための手段。
17. １７．サンプルが体液、組織、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養上清、または他のＨ．ｐｙ ｌｏｒｉ調製物である、請求項１６に記載のキット。
18. １８．サンプル中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ毒素の核酸を検出するための診断用検査キ ットであって、該検査キットが以下を含む、キット： （ａ）配列番号１に提示される核酸から選択される２つの−本鎖オリゴヌクレオ チド； （ｂ）ＰＣＲ反応を行うための手段；および（ｃ）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ毒素の核酸 を検出するための手段。
19. １９．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ空胞形成毒素核酸の検出において有用である、配列番号 ２１および２２で提示されるＤＮＡ配列で表される合成オリゴヌクレオチド。
20. ２０．増幅を導くプライマーによってヒト被検体由来のサンプル中のＨ．ｐｙｌ ｏｒｉ空胞形成毒素の核酸を検出する方法であって、ここで、該サンプルは請求 項８に提示した群から選択される２つの１本鎖オリゴヌクレオチドからなる２重 のプライマーで増幅されており、そして該増幅後、該増幅産物に１本鎖オリゴヌ クレオチドプローブをハイプリダイズさせ、そしてハイブリダイズした該プロー ブを検出する、方法。
21. ２１．ヒトまたは動物から採取した体液サンプル中の抗毒素抗体を検出する方法 であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）固相に結合した請求項１に記載の精製した組成物と該サンプルとを接触さ せる工程； （ｂ）工程（Ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合精製組成物に 結合させる工程；および（ｃ）該結合抗毒素抗体を検出する工程。
22. ２２．結合したサンプル中の真核細胞の空胞形成を誘導する毒素を検出する方法 であって、以下の工程を包含する方法： （ａ）ＣＢ抗原に対する抗体を該結合サンプルに接触させる、工程； （ｂ）工程（Ａ）の該接触物をインキュベートし、抗原抗体複合体を形成させる 、工程； （ｃ）該抗原抗体複合体を検出する工程。
23. ２３．前記サンプルが体液、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ培養上清、または他のＨ．ｐｙｌ ｏｒｉ調製物からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
24. ２４．毒素産生Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株によって患者において引き起こされる感染を 検出する方法であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）固相に結合した請求項１に記載の組成物を該患者由来の体液サンプルと接 触させる工程； （ｂ）工程（Ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合組成物に結合 させる、工程； （ｃ）該結合抗毒素抗体を検出する工程；（ｄ）検出された抗毒素抗体量を標準 と比較し、毒素産生Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株によって引き起こされる感染を検出する 、工程。
25. ２５．患者中のに抗毒素抗体を検出し、そしてそれにより消化性潰瘍疾患、胃ガ ン、または他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果を発病させる患者の感受性を決 定する方法であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）固相に結合した請求項１に記載の組成物を該患者由来の体液サンプルに接 触させる工程； （ｂ）工程（Ａ）の該接触物をインキュベートし、該抗体を該結合組成物に結合 させる、工程； （ｃ）核結合抗毒素抗体を検出する工程；（ｄ）検出した抗毒素抗体量を標準と 比較し、消化性潰瘍疾患、胃ガン、または他のＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染の臨床結果 を発病させる患者の感受性を決定する、工程。
26. ２６．ヒトを含む動物中でのＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗体の産生を誘導す る方法であって、該方法はＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染に対する感染防御免疫が望まし い動物に、薬学的に容認される担体上の有効量のＣＢ抗原を含む有効量のワクチ ンを投与する工程を包含する、方法。
27. ２７．前記ワクチンが、経腸的に投与される、請求項２５に記載の方法。
28. ２８．前記ワクチンが、非経口的に投与される、請求項２５に記載の方法。
29. ２９．患者の真核細胞の空胞形成を誘導する毒素を中和するための治療法であっ て、以下の工程を包含する、方法：（ａ）薬学的に容認される担体上の請求項９ から１２に記載の組成物を該患者に投与する工程。
30. ３０．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの空胞形成毒素活性を阻害する方法であって、以下の工 程を包含する、方法： （ａ）適切な担体上の充分量の空胞ＡＴＰアーゼインヒビターを投与し、Ｈ．ｐ ｙｌｏｒｉ空胞形成毒素を阻害する工程。
31. ３１．前記空胞ＡＴＰアーゼインヒビターがｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎである、請 求項２９に記載の方法。
32. ３２．配列番号１に提示されるＤＮＡ配列の全体または一部を発現させることに よって、組換え空胞形成毒素またはそのフラグメントを産生する方法。