JPH0762030B2 - マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド - Google Patents

マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド

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JPH0762030B2
JPH0762030B2 JP61504608A JP50460886A JPH0762030B2 JP H0762030 B2 JPH0762030 B2 JP H0762030B2 JP 61504608 A JP61504608 A JP 61504608A JP 50460886 A JP50460886 A JP 50460886A JP H0762030 B2 JPH0762030 B2 JP H0762030B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はマイコバクテリウム感染を含む疾患の検出、診
断および治療に有用な免疫原、抗原、接種材料、抗体、
方法および装置に関する。
発明の背景 マイコバクテリウムは長い間ヒトの細菌病原体として認
められ、殊に発展途上国において破壊的疾病を生じ続け
ている。世界保健機関，ビユレチン・オブ・ザ・ワール
ド・ヘルス・オーガニゼーション（Bull.WHO,61,779（1
983）。結核症は結核菌（Mycobacterium Tuberculosi
s）（M.tuberculosis）で呼吸性感染により起され、現
在世界中で約３千万人が苦しみ、年間約３百万人が死亡
する。
粗細菌抗原調製物が免疫診断および免疫予防目的に使用
されてきた。1881年にコッホ（Koch）により開発された
ツベルクリン試験はヒトに使用された最初の免疫診断試
験であった。ツベルクリン、複雑でしかし十分には規定
されていない組成物の結核菌（M.tuberculosis）濾液、
は現在病原体に対する前暴露の検出に対する遅延型皮膚
過敏症（DCH）または皮膚試験抗原として使用されてい
る。セイバート（Seibert）ほか、アメリカン・レビュ
ー・オブ・ツベルクローシス（Am.Rev.Tuberc.），69,5
85（1954）。残念ながらツベルクリンの有用性はその特
異性の不足により、および活性疾患、結核菌（M.tuberc
ulosis）との接触による前感作、または他のマイコバク
テリウムに対する交差感受性の間を識別する能力のない
ことにより制限される。
カルメット・ゲラン菌（BCG）、ウシ結核菌（Mycobacte
rium bovis）（M.bovis）の無毒性株、は現在生ワクチ
ンとしてヒトにおける結核に対する保護に使用されてい
る、カルメット（Calmette,A.），ジヤーナル・オブ・
ジ・アメリカン・メデイカル・アソシエーション（J.A
m.Med.Assoc.），96,58（1931）。BCGは西欧において結
核症の発生率の低下に有効であった〔メデイカル・リサ
ーチ・カウンセル（Medical Research Council），ビユ
レチン・オブ・ザ・ワールド・ヘルス・オーガニゼーシ
ョン（Bull.WHO），46,371（1972）〕けれども、インド
における多くの試験で有効でないことが最近認められた
〔世界保健機関，ワールド・ヘルス・オーガニゼーショ
ン・テクニカル・レポート・シリーズ（WHO Tech.Rep.S
er.）,651（1980）〕。
現在マイコバクテリウム感染の検出に使用されている粗
抗原調製物に関する基本的問題は抗原調製物がしばしば
若干の異なるマイコバクテリウム種と陽性に反応するこ
とである。これはもちろん、診断および適切な治療規制
の選択を複雑にする。個々のマイコバクテリウム種に対
して免疫応答を特異的に生ずる試薬はマイコバクテリウ
ム感染の診断および管理に有益であろう。
DCH反応において規定されたポリペプチド抗原を使用す
る利点は数多くある。例えばマイコバクテリウム感染の
場合に、ポリペプチドのアミノ酸残基配列が結核性マイ
コバクテリウム種中に特異的に発現されるタンパク質の
部分に相当すれば、該ポリペプチドは結核性マイコバク
テリウム感染を特異的に検出し、それにより現在使用さ
れている皮膚試験抗原に関連する交差反応性の問題を回
避する有用な試薬であることができる。さらに、ポリペ
プチドは化学的に合成し、皮膚試験抗原の生成のために
病原性微生物の大培養を成長させる必要を排除すること
ができる。
ポリペプチドはまたマイコバクテリウム感染の検出また
は予防（予防接種）に使用することができる。事実、ポ
リペプチドを含む接種材料はヒトにおける結核症を検出
するDCHまたは皮膚試験において選択する抗原としてツ
ベルクリンまたはPPG（精製タンパク質誘導体）を置換
することができた。
合成抗原（免疫原）の製造およびそれを予定特異性の抗
体の誘発に使用する一般的概念が記載されたけれども、
この技術の予測可能性を拒み続けている大きい領域が残
っている。これには少くとも２つの理由がある。第１
に、合成抗原（免疫原）が必らずしもその自然環境中の
無傷タンパク質と免疫反応する抗体を誘発しない。第２
に、自然発生免疫原例えばウイルスタンパク質に対する
宿主の自然抗体がほとんど免疫原のアミノ酸残基配列の
短かい線状部分に相当するポリペプチドと免疫反応しな
い。この後者の現象は短かい線状ポリペプチドが必要な
二次および三次の配座構造を欠く結果であると思われ
る。
タンパク質に対して作られた抗体によるペプチドの結合
に関する多くの研究がベンジヤミニ（Benjamini,E.）ほ
か、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジ
ー・アンド・イムノロジー（Current Topics in Microb
iology and Immunology），58,85（1972）、による総説
に要約されている。抗体結合におけるペプチド構造の役
割はグッドマン（Goodman,J.W.），イムノケミストリー
（Immunochem.），６,139（1969）、により強調されて
いる。
抗体結合に関するペプチドの配列における変化の効果を
含む研究の多くは抗体結合部位の構造が主要役割を果た
すことを示すと解釈された。これらの研究における配列
および構造の変化の効果は混り合い、分離することは困
難である。これらの研究の若干は結合を行なう抗原中の
構造変化により同様によく説明することができる。
分子水準における抗体応答には規定配列（一次構造）お
よび規定配座（二次および三次構造）における抗原の結
合が含まれる。タンパク質抗原に対する免疫応答は伝統
的にタンパク質の一次、二次または三次構造を指向する
と解明された。
この分類図式は生理的温度および溶液において明確な全
体構造を有するタンパク質に対して若干の妥当性を有す
ることができる。しかし、その妥当性はより動的な構造
を有するペプチド抗原に対しては疑わしい。
発明の概要 本発明は結核性マイコバクテリウムの抗原と免疫反応す
る抗体の生成を誘発できる合成ポリペプチドを意図す
る。該ポリペプチドは約13〜約40個のアミノ酸残基を含
み、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向
に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIle により示されるアミノ酸残基配列を包含する。該ポリペ
プチドはアミノ末端およびカルボキシ末端の１方または
両方にシステイン（Cys）残基を含むことができる。
該ポリペプチドは、担体に結合して有効量を哺乳動物宿
主中へ導入すると結核性マイコバクテリウムの抗原と免
疫反応する抗体の生成を誘発することができる。本発明
にはまたポリペプチドの製剤に許容される塩および抗原
関連変異体が含まれる。
該ポリペプチドはまた結核性マイコバクテリウムの天然
抗原によって誘発されたヒト抗体と免疫反応することが
できる。
本発明はまた少くとも１つの繰返し単位が上記ポリペプ
チドである複数の結合した合成ポリペプチド繰返し単位
を含む合成マルチマーを意図する。ポリペプチド繰返し
単位はアミド結合により頭−尾のように結合することが
できる。あるいは、合成ポリペプチドモノマーはアミド
結合以外によって結合し、分子内、ポリペプチド間シス
テインジスルフイド結合の使用により高分子マルチマー
を形成することができる。
他の態様において、本発明のポリペプチドの有効量を、
生理的に許容される希釈剤中で使用して結核性マイコバ
クテリウムの抗原と免疫反応する抗体を誘発することが
できる接種材料を形成する。抗体の生成に対する使用に
加えて、本発明の接種材料はマイコバクテリウム感染に
対する活性免疫を誘発する手段としてヒトにおけるワク
チンとして用いることができる。
なお他の態様において、結核性マイコバクテリウムの抗
原と免疫反応することができる抗体結合部を含む受容体
が意図される。該受容体は上記合成ポリペプチドを単独
にまたは接合体として含む合成免疫原に対して生起され
る。
また結核性マイコバクテリウムの抗原の存在について検
定する診断装置が意図される。該診断装置は前記受容体
分子および結核性マイコバクテリウムの抗原と結合する
部位の免疫反応を示す指示手段を含む。
さらに、体成分中の結核性マイコバクテリウムの抗原に
対する抗体分子の存在について検定する診断装置が意図
される。そのような診断装置は前記合成ポリペプチドお
よび結核性マイコバクテリウムの抗原に対する抗体分子
とのポリペプチドの免疫反応を示す指示手段を含む。よ
り好ましい態様において、該装置はまたポリペプチドを
結合させる固体マトリックスからなる固体担体を含む。
免疫反応した抗体分子のアイソタイプを確認する手段も
また装置中に含むことができる。
他の態様において、本発明には結核性マイコバクテリウ
ム抗原のアミノ酸配列に相当するアミノ酸残基配列を有
する前記合成ポリペプチドを含む宿主中の結核性マイコ
バクテリウム抗原に対する細胞仲介免疫応答性の存在を
測定する診断装置が含まれる。該ポリペプチドは、有効
量を生理的に許容される希釈剤中で宿主の皮内に投与す
ると宿主中の胸腺誘導細胞の増殖を誘発することができ
る。増殖は皮内投与の部位における紅斑（赤さ）および
硬化により示される。
結核性マイコバクテリウムに対し前に免疫処置された宿
主中の胸腺誘導細胞の増殖を誘発する方法および宿主中
の結核性マイコバクテリウム抗原の存在を測定する方法
もまた開示される。該方法には、後者の方法による論議
したポリペプチドを提供する段階および有効量のポリペ
プチドを生理的に許容される希釈剤中で宿主に皮内投与
する段階が含まれ、胸腺誘導細胞の増殖および宿主中の
結核性マイコバクテリウム抗原の存在は皮内投与の部位
における紅斑および硬化により示される。
本発明は若干の利点および利益を提供する。本発明の利
点の１つは合成ポリペプチドの使用が相当する無傷タン
パク質の存在の必要性を排除することである。ポリペプ
チド自体が疾患から宿主を保護するワクチンを提供する
ことができる。従って、細菌から有用量のウイルスタン
パク質を生成させることに関連する不純物例えば細胞の
破片および毒素が本発明の生成物に存在しない。
図面の簡単な説明 第１図はミンデン（Minden）ほか、インフエクション・
アンド・イミユニテイ（Infect.Immun.），46,519（198
4）により決定されたウシ結核菌（M.bovis）のBCG−ａ
タンパク質のアミノ末端部の20個のアミノ酸残基を示
す。BCG−ａタンパク質の初めの12個のアミノ酸残基を
含む合成ポリペプチドもまた示される。第１の例におい
て合成ポリペプチドはカルボキシ末端にシステイン残基
を包含する。第２の例において、合成ポリペプチドはア
ミノ末端およびカルボキシ末端の両方にシステイン残基
を包含する。
発明の詳細な説明 Ｉ 緒 結核性マイコバクテリウムに感染されたヒトはマイコバ
クテリウムに関連する抗原に対して抗体を生ずる。ヒト
における結核性マイコバクテリウムおよび抗結核性マイ
コバクテリウム抗体に対する検定に使用する伝統的臨床
技術は厄介である。さらに、細胞培養からの結核性マイ
コバクテリウムの抗原を精製する現在の操作は大量生産
に容易に適応できない。
本発明は現在の方法の問題の若干を克服する合成ポリペ
プチド技術の使用を意図する。比較的短かい合成ポリペ
プチドは天然タンパク質上の抗原決定基を免疫的に模倣
することができ、従って、天然タンパク質を認識する予
定特異性の抗体の生起に使用することができる。
「免疫的に模倣する」という語は、ここに本発明の免疫
原ポリペプチドが誘発ポリペプチドに、また無傷タンパ
ク質中の同種配列に結合する抗体の生成を誘発する意味
に使用される。この現象は実験的および臨床的の両方に
使用できる。
実験的には合成ポリペプチドに対する抗体はDNA解読わ
く、従って臨床的に重要なタンパク質例えばウシ結核菌
（M.bovis）のBCG−ａタンパク質のアミノ酸残基配列の
確立に使用できる。臨床的には、合成ポリペプチドに対
して生起される予定特異性の抗体を診断および治療目的
に使用できる。
アミノ酸残基配列が結核性マイコバクテリウム抗原のそ
れに実質的に相当する比較的短かいポリペプチドが合成
された。
特定的には、本発明にはウシ結核菌（Mycobacterium bo
vis）株BCGのBCG−ａタンパク質のアミノ酸残基配列の
部分に実質的に相当するアミノ酸残基配列を有する合成
ポリペプチドが含まれる。このタンパク質はミンデン
（Minden）ほか、インフエクション・アンド・イミユニ
テイ（Infect.Immun.），46,519（1984）により結核性
マイコバクテリウム〔ウシ結核菌（M.bovis）および結
核菌（M.tuberculosis）〕により特異的に発現されるタ
ンパク質として確認された。上記刊行物に報告されたよ
うに、ミンデン（Minden）ほかはこのタンパク質のアミ
ノ末端20残基の配列を決定した（第１図の第１アミノ酸
残基配列参照）。
本発明によれば、BCG−ａタンパク質の残基１〜12に相
当するアミノ酸残基配列を有しカルボキシ末端において
システインを有するポリペプチドが合成され（第１図の
第２アミノ酸残基配列参照）、ウシ結核菌（M.bovis）
株BCGの音波抽出物で免疫処置したモルモットに対し遅
延皮膚過敏症反応を誘発することが示された。
さらに、前記のように免疫処置したモルモットにおいて
BCG−ａタンパク質の残基１〜12に相当するが、しかし
アミノ末端およびカルボキシ末端の両方にシステイン
（Cys）残基を含むアミノ酸残基配列を有するポリペプ
チドにより一層著しい遅延型皮膚過敏症反応が誘発され
た（第１図の第３アミノ酸残基配列参照）。
これらの結果は、このポリペプチドがヒトにおける結核
性マイコバクテリウム感作を特異的に検出する皮膚試験
に使用できることを示す。該ポリペプチドはまた現在使
用される遅延型皮膚過敏症抗原に関連する交差反応の問
題の回避に使用できる。本ポリペプチドはヒトにおける
結核症を検出するDCH試験において選択される抗原とし
てツベルクリンまたはPPDを置換することができる。
A.合成ポリペプチド 1.配列 この研究に用いた比較的小さい合成ポリペプチド（長さ
13〜20個のアミノ酸残基）はメリフイールド（Merrifie
ld）ほか、ジヤーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエテイ（J.Am.Chem.Soc.），85,2149（196
3）の固相法を用いて合成した。
用いた「合成」という語はポリペプチド分子またはポリ
ペプチド繰返し単位が、生物学的方法による例えば遺伝
子工学技術によるよりもむしろ化学的方法により作られ
た、すなわち化学的に合成されたことを意味する。従っ
て、本発明を具体化する合成ポリペプチドは天然産出タ
ンパク質およびそのフラグメントを含まない。
従って、化学合成ポリペプチドはまたタンパク質上のブ
ロモシアンの作用により製造される天然産出タンパク質
の分解生成物とは異なる。ブロックしたアミノ酸残基を
連続的に追加して所望のポリペプチドを得る周知の固相
化学合成は好ましい合成法であり、後により詳細に論議
される。
ここに確認されるすべてのアミノ酸残基は天然またはＬ
−配置にある。標準ポリペプチド命名法に一致させたア
ミノ酸残基の略語は次のとおりである： 本発明は約13〜約40個のアミノ酸残基を含み、左から右
へアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により規定される配列を包含する合成ペプチドを意図す
る。該ポリペプチドは担体に結合させて哺乳動物宿主中
へ有効量を導入すると結核性マイコバクテリウムの抗原
と免疫反応する抗体の生成を誘発することができる。
本発明の合成ポリペプチドは、しばしば単に「ポリペプ
チド」として、または「合成ポリペプチド」として示さ
れる。その使用は簡潔にするためである。
「抗原関連変異体」という語は１つの抗原決定基の少く
とも１部を共有し、従って免疫交差反応性である全アミ
ノ酸残基配列とは異なるポリペプチドを示すために用い
られている。
用いた「抗原決定基」という語は同一または関連の抗原
または免疫原により誘出された相当する抗体（免疫グロ
ブリン）分子との特異的相互作用の原因である分子の構
造成分を示す。
用いた「免疫原決定基」という語は、抗原として用いた
ときに免疫原と結合する抗体結合部位（イデイオタイ
プ）を含む抗体の宿主内誘発の原因である分子の構造成
分を示す。
用いた「抗原」という語は抗体により結合されるエンテ
イテイーを意味する。
用いた「免疫原」という語は宿主動物中で抗体生成を誘
発するエンテイテイーを示す。若干の場合に抗原と免疫
原は同一のエンテイテイーであるが、他の場合には２つ
のエンテイテイーは異なる。
例えば後記のように、ポリペプチドはモルモット中の抗
体の生成の誘発に使用され、従って免疫原として使用さ
れた。そのように誘発された抗体は抗原として用いると
ポリペプチドに結合する。従ってポリペプチドは免疫原
および抗原の両方であった。抗結核性マイコバクテリウ
ム抗体は結核性マイコバクテリウム抗原に免疫原および
抗原の両方として、並びにポリペプチドに抗原として結
合する。
本発明の好ましい態様はここに記載する合成ポリペプチ
ド、その製剤に許容される塩、およびその抗原関連変異
体である。これらのポリペプチドはそれぞれ前記のよう
に結核性マイコバクテリウムの抗原に結合する抗体を誘
発することができる。
アミノ酸残基配列の初めまたは終りにおけるダッシュ
は、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端における
基例えばＨまたはOHに対する結合、あるいはポリペプチ
ド鎖中の合計40個までのアミノ酸残基の１つまたはそれ
以上の他のアミノ酸残基の配列を示すことに言及され
る。
用いた「製剤に許容される塩」という語は製剤工業に使
用されるよく知られた方法により製造されるナトリウ
ム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムお
よびアンモニウム塩などを含む無毒性のアルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩およびアンモニウム塩を示す。
その語にはまた本発明の化合物と適当な有機酸または無
機酸との反応により一般に製造される無毒性酸付加塩が
含まれる。代表的な塩には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸
塩、硫酸水素塩、酢酸塩、シユウ酸塩、吉草酸塩、オレ
イン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸
塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸
塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩などが含まれ
る。
B.マルチマー 本発明はまた少くとも１つの繰返し単位がここに記載す
るポリペプチドである複数の結合した合成ポリペプチド
繰返し単位を含む合成マルチマーを意図する。
本発明のマルチマーは単独にまたは担体に結合させて有
効量を哺乳動物宿主中へ導入すると結核性マイコバクテ
リウムの抗原に結合する抗体の生成を誘発することがで
きる。本発明の殊に好ましい合成ポリペプチドを含むマ
ルチマーはまた結核性マイコバクテリウムの抗原により
誘発されるヒト抗体を結合することができる。
従って本発明のマルチマーはポリペプチドと同様に免疫
原であり、ヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体にの抗
原である。これらのマルチマーは従って後記の診断法お
よび装置に有用である抗結核性マイコバクテリウム抗体
の生成の誘発に使用することができ、適当な診断方法お
よび装置に抗原として使用することができる。
全マルチマー中に約35個より少ないアミノ酸残基を含む
マルチマーは典型的には免疫原としての使用に対し担体
に結合させる。合計約35個以上のアミノ酸残基を含むマ
ルチマーは典型的には担体なしで使用される十分な免疫
原である。
ポリペプチドマルチマーは前記固相法を用いて合成ポリ
ペプチドモノマーを頭−尾のように互いに結合させるこ
とにより製造することができ、すなわち１つの完全なポ
リペプチド配列を樹脂上に、次に１つまたはそれ以上の
同一かまたは異なるポリペプチド配列を合成し、その後
全マルチマー単位を樹脂から開裂してここに記載するよ
うに使用することができる。そのような頭−尾ポリペプ
チドマルチマーは好ましくは約２〜約４個のポリペプチ
ド繰返し単位を含む。
あるいは、モノマーとして使用するポリペプチドのポリ
マーとしてマルチマーを製造することができる。用いた
「ポリマー」という語は、文字どおり種々の形態で、ペ
プチド結合以外により互いに結合した複数の合成ランダ
ムコポリマーポリペプチド繰返し単位を含む型のマルチ
マーと規定される。
本発明のポリマーの好例はアミノ末端およびカルボキシ
末端の両方に付加したシステイン残基を含む本発明のポ
リペプチド（ジCys ポリペプチド）を用いて合成する
ことができる。ジCysポリペプチドは酸化操作を用いて
分子内、ポリペプチド間システインジスルフイド結合に
より互いに結合させて免疫原性抗原性ポリマーを形成す
ることができる。そのように調製されたポリマーは複数
の本発明の合成ポリペプチドを繰返し単位として含む。
これらの繰返し単位は前記の酸化されたシステイン（シ
スチン）残基により互いに結合している。
ポリペプチドを担体に結合させるため、またはポリマー
を製造するための本発明のポリペプチド中の１つまたは
２つの末端Cysの存在が本発明のポリペプチド繰返し単
位のアミノ酸配列を改変すると解すべきではない。
C.接種材料 他の観点において本発明のポリペプチドを製剤に許容さ
れる希釈剤中に使用し、有効量を投与したときに結核性
マイコバクテリウムの抗原と免疫反応する抗体を誘発す
ることができる接種材料またはワクチンを形成させる。
「接種材料」という語はその文字通り種々の形態で本発
明のポリペプチドを結核性マイコバクテリウムに対する
抗体の製造に用いる活性成分として含む組成物を記載す
るために使用されている。ポリペプチドを抗体の誘発に
使用するとき、ポリペプチドは単独に、担体と結合させ
て、またはマルチマーとして使用することができるが、
しかし表現を容易にするために以下にこれらの代替が常
に示されているとは限らないことを理解すべきである。
約35個末端のアミノ酸残基を含むポリペプチドには抗体
の生成を誘発するために担体を用いることが好ましい。
担体に結合または連結したポリペプチドは抗体を調製す
る場合に例示的に使用される。接種材料を用いて結核性
マイコバクテリウムの抗原を検出する診断検定に使用す
る抗体を生成させることができる。
「ワクチン」という語はその文字通り種々の形態におい
て、本発明のポリペプチドを宿主哺乳動物中の活性免疫
の誘発に使用する活性成分として含む型の接種材料を記
載するために使用されている。活性免疫には抗体の生成
が含まれるので、従ってワクチンまたは接種材料は等し
い成分を含むことができるが、しかしその用法は異な
る。多くの場合に動物において使用できるアジュバント
の多くがヒトにおいて使用できないのでワクチンと接種
材料との成分は異なる。
この接種材料またはワクチンは有効量の本発明のポリペ
プチドをマルチマー例えば酸化されたポリペプチド末端
システイン残基により互いに結合した個々のポリペプチ
ドのポリマーとして、または担体に結合した接合体とし
て含む。しかし、表現を容易にするために本発明の種々
の態様のポリペプチドおよびその文字どおり種々の形態
が「ポリペプチド」という語により総括的に示されてい
る。
単位用量当りのポリペプチドの有効量はよく知られてい
るように、とりわけ接種動物の種、動物の体重および選
ばれる接種用法に依存する。接種材料およびワクチン
は、典型的には接種（容量）当り約100μｇ〜約500mgの
ポリペプチド濃度を含む。上記量のポリペプチドは担体
を用いるときに担体の重量を含まないポリペプチドの重
量を示す。特定の好例接種材料は後に担体プラスポリペ
プチド（接合体）の重量で示して記載される。
「単位量」という語は動物に対する１回の投薬に適する
物理的に分離された単位を示し、各単位は所要希釈剤、
すなわち担体、またはビヒクルに関連して所望の治療効
果を生ずるように計算された予定量の活性物質を含む。
本発明の新規な単位量に対する仕様は、明細書に詳細に
記載されるように、（ａ）活性物質の特有の特性および
達成させる個々の治療効果、および（ｂ）動物における
治療用にそのような活性物質を配合する技術に固有の制
限により指令され、それらに直接依存し、これらは本発
明の特徴である。
接種材料は、典型的には乾燥固体ポリペプチド接合体ま
たはポリペプチドポリマーからポリペプチド接合体また
はポリペプチドポリマーを生理的に許容（容認）される
希釈剤例えば水、食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水中に
懸濁することにより製造される。
接種材料はまたアジュバントを含むことができる。アジ
ュバント例えば完全フロインドアジュバント（CFA）、
不完全フロインドアジュバント（IFA）およびミヨウバ
ンはよく知られた物質であり若干の出所から市販されて
いる。
D.受容体 本発明のポリペプチドに対して生起（誘発）された抗体
および実質的な全抗体、並びにそのような抗体から調製
された抗体結合部位は本発明のなお他の態様を構成す
る。これらの分子は本明細書に受容体として総括的に示
される。受容体は哺乳動物宿主例えばマウス、モルモッ
ト、ウサギ、ウマなど中に前記接種材料を用いる免疫処
置により生起される。
適当な単クローン性受容体、典型的には全抗体、はまた
ニマン（Niman）ほか、プロシーデイング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci,U.S.A.），80,4949（1983）により記載され
たハイブリドーマ技術を使用して調製することができ、
その記載は参照によりここに加入される。簡単に記載す
れば、単クローン性受容体を生ずるハイブリドーマを形
成するために骨髄腫または他の無限継続細胞系を、本発
明のポリペプチドで高度免疫処置した哺乳動物の脾臓か
ら得られるリンパ球と融合させる。
骨髄腫細胞系がリンパ球と同種であることが好ましい。
典型的には株BALB/cのマウスが好ましい哺乳動物であ
る。本発明における使用に適する適当なマウス骨髄腫に
はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン−感受性
（HAT）細胞系P3×63−Ag8.653（ATCC CRL1580）および
Sp2/0−Ag14（ATCC CRL1581）が含まれる。
脾細胞には典型的には骨髄腫細胞と、ポリエチレングリ
コール例えばPEG1500またはPEG6000を用いて融合させ
る。融合したハイブリッドはそのHATに対する感受性に
より選択される。本発明の受容体分子を生ずるハイブリ
ドーマは、後に物質および方法のセクションに記載する
酵素結合抗体免疫吸着検定（ELISA）を用いて確認され
る。
単クローン性受容体はハイブリドーマ上澄みから得る必
要があるだけでなく、また一般に所望のハイブリドーマ
を導入された哺乳動物の腹水液から一層濃厚な形態で得
ることができる。腹水液を用いる単クローン性抗体の生
成はよく知られ、それ以上ここに扱わない。
本発明の受容体は、それが生起されたポリペプチドに結
合し、また本発明のポリペプチドが免疫的に模倣する相
当する結核性マイコバクテリウム抗原決定基に結合す
る。従って、本発明のポリペプチドは免疫原および抗原
の両方であることができる。
本発明の受容体は、それが無傷結核性マイコバクテリウ
ム抗原分子のエピトープに比較して比較的少いエピトー
プを有する免疫原に対して生起されるので、天然産出多
クローン性抗体に比較してオリゴマー性であると説明す
ることができる。従って、本発明の受容体はポリペプチ
ドのエピトープに結合するが、結核性マイコバクテリウ
ム抗原に対して生じた天然産出抗体は結核性マイコバク
テリウム抗原分子全体のエピトープに結合する。
E.診断検定装置および方法 ポリペプチド、抗体および前記ポリペプチドに対して生
起された抗体結合部位（受容体）、並びに本発明の方法
はまた診断試験例えば免疫検定に使用することができ
る。そのような診断技術には例えば、酵素免疫検定、酵
素多重免疫検定技術（EMIT）、酵素結合抗体免吸着検定
（ELISA）、放射免疫検定（RIA）、蛍光免疫検定、単独
または二重抗体技術、および受容体または抗原を若干の
検出可能なタグまたは指示手段で標識する他の技術が含
まれる。一般にはマギオ（Maggio）、酵素免疫検定（En
zyme Immunoassay）,CRCプレス（CRC Press,Cleveland,
Ohio），（1981）；ゴルドマン（Goldman,M.）蛍光抗体
法（Fluoresent Antibody Methods），アカデミック・
プレス（Academic Press,New York,N.Y.）（1980）参
照。そのような検定法およびこれらの方法の実施に有用
な装置の特定の例は次に記載される。
1.結核性マイコバクテリウムに対する検定 体試料中の結核性マイコバクテリウムの抗原の存在を検
定する方法もまたここに意図される。一般法において、
検定する体試料を提供し、本発明の合成ポリペプチドに
対して生起した抗体結合部位を含む受容体分子と混合す
る。混合物を受容体分子が体試料中に存在する結核性マ
イコバクテリウムの抗原と免疫反応する十分な予定時間
維持する。次いでその免疫反応の量を測定して結核性マ
イコバクテリウム抗原が検定体試料中に存在したかまた
はしなかったかを測定する。
体試料のアリコート中に存在する結核性マイコバクテリ
ウム抗原の検出に有用である本発明の１観点を具体化す
るキット形態の例示診断装置には本発明の受容体分子例
えば本発明のポリペプチドに対して生起された抗体、実
質的な全抗体、または抗体結合部位例えばFabおよびF(a
b′)2抗体部分が１パッケージ中で含まれる。この装置
はまた、受容体と抗原との間の免疫反応の存在を示す指
示手段を含む。
典型的な指示手段には放射性同位元素例えば125Iおよび
131I、酵素例えばアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼおよび
グルコースオキシダーゼ、並びに蛍光色素染料例えばフ
ルオレセインおよびローダミンが含まれる。指示手段は
本発明の受容体に直接結合させることができる。指示手
段はまた別の分子に、例えば第２抗体に、抗体結合部位
に、または本発明の受容体と反応（結合）するスタヒロ
コッカス・アウレウス（StaphyLococcus aureus）（S.a
ureus）プロテインＡに結合させることができる。その
ような別分子指示手段の特定例は125I標識スタヒロコッ
カス・アウレウス（S.aureus）プロテインＡである。
指示手段は免疫反応生成物の検出を可能になし、本発明
の受容体に直接結合しないときには受容体とは別にパッ
ケージされる。体細胞例えばアセトン固定末梢血液リン
パ球（PBL）塗抹と混合すると受容体分子は結核性マイ
コバクテリウム抗原と免疫反応して免疫反応物を形成
し、従って、存在する指示手段が免疫反応生成物の形成
を示す。
結核性マイコバクテリウム抗原に対する診断方法の１態
様は増幅試薬を含む免疫蛍光検定である。そのような検
定ではPBL塗抹は平坦顕微鏡スライドにアセトン固定さ
れる。本発明により生起された、例えばウサギまたはモ
ルモット中に生起された抗体のアリコート、一般に約10
0μｇ〜約500μｇ、を周知技術を用いてスライドに接触
させる。
本発明の非免疫反応抗体を洗浄した後、望むならばスラ
イド上の非特異性結合部位を典型的にはタンパク質例え
ばウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。次いで
第２試薬（増幅試薬）例えば補体、または抗免疫グロブ
リン抗体、例えばモルモット補体を試験スライド上でイ
ンキュベートすることができる。
この第２のインキュベーション後、未反応の増幅試薬を
洗浄により除去し、検定スライド上の初めにあげた抗体
に結合したもののみを残す。第３の試薬（指示手段）例
えば抗体例えばヤギ抗モルモット補体を次いで試験スラ
イド上でインキュベートする。第３試薬は蛍光色素染料
例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ロ
ーダミンＢイソチオシアネート（RITC）、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（TRITC）、4,4′−ジイ
ソチシオアノスチルベン−2,2′−ニスルホン酸（DID
C）などに、よく知られているように結合させることに
より標識する。
この第３のインキュベーション後に未反応第３試薬を洗
浄し、試験スライド上の補体に結合したFITC標識ヤギ抗
モルモット補体抗体を残す。FITC標識第３試薬の存在を
蛍光顕微鏡を用いて検出し、それによりマイコバクテリ
ウム感染の存在を示すことができる。
上記検定法の実施に有用な好ましい診断装置は、好まし
くはキット形態で、個々のパッケージ中に、（ａ）結核
性マイコバクテリウム抗原と免疫反応する本発明の受容
体（抗体）、（ｂ）受容体と反応する第２の増幅試薬例
えば補体例えばモルモット補体、抗免疫グロブリン抗体
またはスタヒロコッカス・アウレウス（S.aureus）プロ
テインＡ、および（ｃ）増幅手段に直接結合できるか、
または増幅試薬と反応する別の分子例えば抗体または抗
体部分であることができる指示手段、を含む。指示手段
は受容体分子と結核性マイコバクテリウム抗原との免疫
反応を増幅試薬の仲介により示す。
ここに記載した診断装置の受容体分子および別の指示手
段、並びに前記増幅試薬は溶液で、液体分散体として、
または実質的な乾燥粉末として例えば凍結乾燥形態で提
供することができる。指示手段が増幅試薬とは別の分子
である場合に、指示手段を別にパッケージすることが好
ましい。指示手段が酵素である場合に、酵素の基質もま
た装置の別のパッケージ中で与えることができる。固体
支持体例えば前記顕微鏡スライド、１種またはそれ以上
の緩衝液およびアセトンもまたこの診断検出装置中に個
々のパッケージ要素として包含することができる。
診断装置に関してここに論議したパッケージは診断装置
中に普通に使用されるものである。そのようなパッケー
ジにはガラスおよびプラスチック（例えばポリエチレ
ン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）ボトル、
バイアル、プラスチックおよびプラスチック−箔積層封
筒などが含まれる。
全、無傷生物活性抗体の使用は多くの診断装置例えば前
記免疫蛍光検定に必須ではない。むしろ抗体分子の免疫
活性、イデイオタイプ含有、抗原結合および認識受容体
部位、すなわち抗体結合部位のみを用いることができ
る。そのような抗体結合部位の例は、よく知られている
ように、パパインおよびペプシンを用いるタンパク質加
水分解によりそれぞれ製造されるFabおよびＦ（ab′）2
抗体部分として知られているものである。
2.抗結核性マイコバクテリウムの抗体に対する検定 本発明の他の診断方法は体試料中の抗結核性マイコバク
テリウム抗体（例えば抗BCG−ａ抗体）を検出するELISA
である。ここに、本発明のポリペプチドは抗原として使
用され、好ましくは固体マトリックス、例えばフアルマ
シア・フアイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemica
ls,Piscataway,New Jersey）から商標セフアデックス
（SEPHADEX）のもとで入手できる架橋デキストラン、ア
ガロース、ガラスのビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチ
レン、架橋アクリルアミド、ニトロセルロース、あるい
はマイクロタイタープレートのウエルに結合（吸着）ま
たは他の方法で結合して固体支持体を形成させる。
ポリペプチドは検定する提供体試料と混合される。混合
物は体試料中に存在する抗結核性マイコバクテリウム抗
体に対するポリペプチドとの免疫反応に十分な予定時間
維持する。次いでその免疫反応の存在を、指示手段で検
定体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体の存在を
示させて測定する。
上記方法を用いるELISAの好例はポリスチレンまたはポ
リ塩化ビニルで作られた12または96ウエルマイクロタイ
タープレートのウエルを含む固体マトリックス上に吸着
された本発明のポリペプチドを含む固体支持体を用い
る。その後マイクロタイターウエル壁上の非特異性結合
部位をタンパク質例えばウシ血清アルブミン（BSA）で
ブロックする。未結合ポリペプチドおよびBSAを例えば
洗浄によりマイクロタイターウエルから除去する。
体試料アリコート例えばヒト血清、血液または血漿を上
記ポリペプチド結合固体支持体と混合して固体および液
体の相を含む混合物を形成させる。固−液相混合物を体
試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗体に対するポリ
ペプチド抗原との免疫反応に十分な時間維持する。その
後固体および液体の相を分離する。
次に初めにあげた抗体と反応する第２の標識した指示手
段を含む抗体、抗体結合部位またはスタヒロコッカス・
アウレウス（S.aureus）プロテインＡの溶液を固相と混
合し、他の固体液体相混合物を形成させる。第２抗体の
好例は初めにあげた抗体がヒト体試料である場合にペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIg抗体である。他の有用な
酵素標識にはアルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが含まれ
る。固相と第２標識抗体溶液とから形成された混合物
は、初めにあげた抗体と指示試剤との間の反応物の形
成、例えば２抗体間の免疫反応、に十分な予定時間（例
えば30分）維持（インキュベート）する。その後固体お
よび液体の相を分離する。
上記第２抗体はまたこの種の免疫グロブリン（例えばIg
G、IgM、IgE、IgAまたはIgD）の１つのみに対し特異性
で、それと免疫反応することができる。そのような抗体
は体試料中に存在する抗結核性マイコバクテリウム抗体
の免疫グロブリン種を確認する能力を提供することがで
きる。さらに、第２の抗体または抗体結合部位は２つの
型の免疫グロブリンＬ鎖（例えばκおよびλ）の１つの
みと特異的で、それと免疫反応することができる。これ
らの抗体は体試料中に存在する免疫グロブリン分子のア
イソタイプを確認する能力を提供することができる。
その後酵素標識に対する基質例えばペルオキシダーゼに
対する過酸化水素およびアルカリ性ホスフアターゼに対
する発色染料前駆物質例えばＯ−フエニレンジアミン、
またはリン酸ｐ−ニトロフエニルを含む溶液を固相と混
合する。次いで予め選定した波長（例えばそれぞれ490n
mまたは405nm）における光学濃度を予定時間（例えば60
分）経過後に測定し、対照の光学濃度と比較して抗結核
性マイコバクテリウム抗体が体試料中に存在したかどう
かを決定することができる。
本発明の他の態様には、固体マトリックス例えばポリス
チレン12ウエルマイクロタイターストリップおよび固体
マトリックスに吸着（結合）または他の方法で結合して
固体マトリックスを形成した本発明のポリペプチドから
なる固体支持体を含むキット形態の診断装置が含まれ
る。この装置はまた好ましくは結合指示手段を有する別
にパッケージした抗ヒトIg抗体例えばペルオキシダーゼ
標識ヤギ抗ヒトIg抗体を含み、また結合標識手段に対す
る基質例えば過酸化水素および着色染料前駆物質例えば
Ｏ−フエニレンジアミンをさらに個々のパッケージ中で
含むことができる。過酸化水素はそれが比較的不安定で
あるため、典型的にはキット中に含まれず、典型的には
最終使用者により供給される。この装置を用いる検定に
有用な緩衝塩もまた乾燥または液体形態で１つまたはそ
れ以上の個々のパッケージ中で含まれることができる。
ヒト抗結核性マイコバクテリウム抗体および抗結核性マ
イコバクテリウム抗体を含まないヒト抗体（正常ヒト抗
体）を含む個々のパッケージもまたそれぞれ陽性および
陰性対照として含めることができる。体試料例えば血清
中の抗結核性マイコバクテリウム抗体の存在に対する検
定は上記方法を用いてこの診断装置で行なうことができ
る。
II.方法および物質 A.ポリペプチドの合成 本発明のポリペプチドはメリフイールド（Merrifield）
ほか、ジヤーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・
ソサイアテイー（J.Am.Chem.Soc.），85,2149（1963）
およびホーテン（Houghten）ほか、インタナショナル・
ジヤーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リ
サーチ（Int.J.Pept.Prot.Res.），16,311（1980）に記
載された固相法により化学的に合成した。ポリペプチド
合成の固相法はベックマン・インスツルメント社（Beck
man Instrument Co.,Berkeley,CA）から市販されるベッ
クマン・モデル990Bペリペプチド・シンセサイザーを用
いて行なった。
接種材料中に用いた35個未満の残基を有するポリペプチ
ドには、システイン残基をカルボキシ末端またはアミノ
末端とカルボキシ末端の両方に付加させ、後記タンパク
質担体への結合を援助した。全ポリペプチドの組成はア
ミノ酸分析により確認した。
前記固相法による本発明のポリペプチドの製造におい
て、アミノ酸残基をカルボキシ末端残基のエステル結合
により樹脂（固相）へ結合させる。ポリペプチドをCys
残基により担体に結合させ、または末端Cys残基により
重合させるときにそのCys残基を樹脂にエステル結合さ
せるカルボキシ末端残基として用いることが便利であ
る。
各付加アミノ酸のα−アミノ基は、典型的にはアミノ酸
を成長ポリペプチド鎖中へ付加させる前にｔ−ブトキシ
カルボニル（ｔ−BOC）により保護する。次にｔ−BOC基
は成長ポリペプチド鎖に次のアミノ酸を付加させる前に
除去する。
反応性アミノ酸側鎖もまたポリペプチドの合成中保護さ
れる。通常の側鎖保護基は次のように： チロシンに対しＯ−（ｐ−ブロモベンジルオキシカルボ
ニル）；トレオニン、セリン、アスパラギン酸およびグ
ルタミン酸に対しＯ−ベンジル；システインに対しＳ−
メトキシベンジル、ヒスチジンに対しジニトロフエニ
ル；リシンに対し２−クロロベンゾキシカルボニルおよ
びアルギニンに対しトシルを、残留アミノ酸残基に対し
て使用した。
保護アミノ酸を適当な溶媒から再結晶して薄層クロマト
グラフィーにより単一スポットを示した。カップリング
は典型的には初期Ｎ末端アミノ酸のミリ当量よりともに
10倍モル過剰の保護アミノ酸およびジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを用いて行なった。両試薬の２モル過剰も
また使用できる。アスパラギンには等モル量のN-ヒドロ
キシ‐ベンゾトリアゾールを保護アミノ酸に加え、ジメ
チルホルムアミドを溶媒として用いた。全カップリング
反応はギシン（Gisin）、アナリチカ・シミカ・アクタ
（Anal.Chem.Acta.）58,248（1972）のピクリン酸試験
により99％以上完全であった。
所望のポリペプチドの製造後、生じた保護ポリペプチド
（約1g）をアニソール2mlで処理し、無水フッ化水素約2
0mlを反応容器中へドライアイス温度で凝縮させた。生
じた混合物を約４℃で約１時間かくはんして保護基を開
裂させ、ポリペプチドを樹脂から離した。フッ化水素を
４℃の温度でN2流で蒸発させた後、残留物を無水ジエチ
ルエーテルで３回抽出してアニソールを除き、残留物を
真空で乾燥した。
真空乾燥した物質を５％水性酢酸（50mlで３回）抽出し
て遊離ポリペプチドを樹脂から分離する。抽出物含有溶
液を凍結乾燥するとモノマーの未酸化ポリペプチドが得
られる。
生じた合成ポリペプチドを酵素結合抗体免疫吸着検定
（ELISA）に用いて抗結核性マイコバクテリウム抗体を
検出できる。合成ポリペプチドはまた、後記のように、
通常それを担体に結合させて接合体を形成させ、次いで
接合体の有効量を生理的に許容される希釈剤中に分散さ
せることにより接種材料を製造するのに用いることがで
きる。
本発明の合成マルチマーは１つのポリペプチドのカルボ
キシ末端残基と第２のポリペプチドのアミノ末端残基と
の間のアミド結合により互いに端−端（頭−尾）結合し
た複数の本発明のポリペプチドの固相合成により製造で
きることもまた認めるべきである。そのような合成マル
チマーは、好ましくは単−長ポリペプチドマルチマーと
して合成されるが、しかしまた、それらの個々の合成後
に、水中でカルボジイミド試薬例えば１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸
塩を用いて互いに結合させる個々のポリペプチドとして
製造することができる。単一ポリペプチド鎖として製造
されたマルチマー中に含まれるアミノ酸残基の全数は好
ましくは約50個未満であり、本発明の約８個までのポリ
ペプチドを、単一ポリペプチドとして合成される単−頭
−尾マルチマー鎖に結合させることができる。合成頭−
尾マルチマーは、より好ましくは本発明の、合計約40個
未満のアミノ酸残基の結合した合成ランダムコポリマー
ポリペプチドの２〜約４ブロックを含む。
B.ポリマーの製造 本発明のポリペプチドを互いに連結して複数のポリペプ
チド繰返し単位を含む抗原性および（または）免疫原性
ポリマー（合成マルチマー）を形成することができる。
そのようなポリマーは典型的には高い免疫原性および抗
原性の利点を有する。さらに、ポリマー免疫原を用いる
ときに典型的には担体が必要でない。異なるポリペプチ
ドモノマーを用いてポリマーを作る場合に若干の結核性
マイコバクテリウム抗原決定基に対する抗体と免疫反応
する能力が得られる。なお他の利点は接種材料中に用い
たときのそのようなポリマーの、結核性マイコバクテリ
ウム抗原の若干の抗原決定基と免疫反応する抗体を誘発
する能力である。
本発明のポリマーは上記のようにポリペプチドを合成
し、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方にシステイ
ン残基を含めて「ジCys末端」ポリペプチドを形成させ
ることにより製造することができる。合成後、典型的な
研究室製造においてジCysポリペプチド（システイン残
基を非酸化形態で含む）10mgを0.1モル（Ｍ）炭酸水素
アンモニウム緩衝液250mlに溶解する。次いで生じた溶
液を空気中で約18時間、またはエルマン（Ellman）試験
により遊離メルカプタンが検出されなくなるまで、穏や
かにかくはんすることにより溶解したジCys末端ポリペ
プチドを空気酸化する。〔エルマン（Ellman）、アルチ
ーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフ
イジックス（Arch.Biochem.Biophys.），82,70（1959）
参照〕。
ランダムコポリマーポリペプチド繰返し単位を含む。そ
のようなポリマーは典型的には頭−尾のように、並びに
頭−頭および尾−尾のように互いに結合したそれらのポ
リペプチド繰返し単位を含み、すなわち２つのポリペプ
チド繰返し単位のアミノ末端は、両ポリペプチド末端の
結合基が同一であるので２つのカルボキシル末端と同様
に単一シスチン残基を通して互いに結合できる。
C.担体に対するカップリング 合成ポリペプチドはリウ（Liu）ほか、バイオケミスト
リー（Biochem.），80,690（1979）に記載された方法に
より、担体としてのキーホールリンペットヘモシアニン
にカップルさせた。簡単に記載すると、担体４ミリグラ
ム（mg）をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル0.51mgで活性化し、次にポリペ
プチド5mgとアミノ末端またはカルボキシ末端のシステ
インにより反応させて約10〜約35重量％のポリペプチド
を含む接合体を与えた。
１個またはそれ以上の他のアミノ酸残基を合成ポリペプ
チドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加させて担
体に対するポリペプチドの結合を援助することができ
る。前記のように、合成ポリペプチドのアミノ末端また
はカルボキシ末端に付加したシステイン残基はジスルフ
イド結合によるポリマーの形成に殊に有用であると認め
られた。しかし、接合体の製造によく知られた他の方法
もまた使用することができる。他の結合操作の好適には
マイクル（Michael）付加反応生成物、ジアルデヒド例
えばグルタルアルデヒドの使用、クリプステイン（Klip
stein）ほか、ジヤーナル・オブ・インフエクシアス・
デイシーシス（J.Infect.Dis.），147,318（1983）な
ど、あるいは合成マルチマーを形成する複数のポリペプ
チドの相互の結合について前に記載したように、担体に
対するアミド結合を生ずるための水溶性カルボジイミド
の使用のようなカルボジイミド技術の使用が含まれる。
有用な担体はよく知られ、一般にはタンパク質自体であ
る。そのような担体の好例はキーホールリンペットヘモ
シアニン（KLH）、エデスチン、サイログロブリン、ア
ルブミン例えばウシ血清アルブミン（BSA）またはヒト
血清アルブミン（HSA）、赤血球例えばヒツジ赤血球（S
RBC）、破傷風トキソイド、コレラトキソイド並びにポ
リアミノ酸例えばポリ（Ｄ−リシン;D−グルタミン酸）
などである。
またよく知られているように、合成ポリペプチドをその
担体に中間結合基により結合させることがしばしば有利
である。上記のようにグルタルアルデヒドは結合基の１
つである。しかし、システインを用いたときに中間結合
基は好ましくはここに用いたようにｍ−マレイミドベン
ゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（MBS）である。
さらにMBSはリウ（Liu）ほか、前掲、により開示された
ようにエステル−アミド交換反応により担体に初めに付
加させることができる。その後、付加の後にブロックし
たメルカプト基例えばチオール酢酸（CH3COSH）をマレ
イミド二重結合を横切って付加させることができる。ア
シル保護基の開裂後、ジスルフイド結合を脱ブロック結
合基メルカプタンと合成ポリペプチドの付加システイン
残基のメルカプタンとの間に形成させる。
担体の選択は免疫原の決定基部分よりも一層免疫原の最
終用法に依存し、また本発明に特定的に含まれない基準
に基く。例えば接種材料が動物に使用されるならば、個
々の動物に不適当な反応を生じない担体を選ぶべきであ
る。
D.ELISA 抗ポリペプチド抗体結合および抑制研究は下記のように
酵素結合抗体（ELISA）により準備することができる。
簡単に記載すると、マイクロタイターウエル〔コスター
（Costar,＃3590,Cambridg,MA）〕に、ポリペプチドを1
0μｇ毎ml（μg/ml）の濃度で含むBBS〔10ミリモル（m
M）ホウ酸ナトリウム（pH8.3）、150mM NaCl〕100μｌ
を加えることにより、抗原として個々のポリペプチドで
被覆する。ウエルと抗原含有溶液との間の接触は予定時
間、典型的には15分間、20℃で維持して抗原被覆固相を
形成させる。固体および液体の相を分離し、ウエルをBB
Sで３回洗浄する。
非特異的結合部位は、各ウエル中に１％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）200μｌを混合して他の固体液体相混合物を
形成し、その固体液体相混合物を30分間20℃で維持する
ことによりブロックする。相を分離し、過剰の非結合BS
AをBBSで３回洗浄することにより除去する。
ウサギ（またはモルモット）およびヒト血清（体試料ア
リコート）は、BBS中に1:20に希釈した血清100μｌを毎
ウエルに添加し、固体／液体相組成物を形成することに
より抗ポリペプチド活性について検定する。希釈血清と
抗原被覆固体相との間の接触を予定時間例えば１時間、
20℃で維持して免疫反応物を形成させる。固体および液
体の相を分離し、固体相、すなわち抗原被覆免疫反応物
含有ウエル、を次にBBSで３回洗浄する。
吸着ポリペプチドと免疫反応するヒト血清中の抗体はア
ルカリ性ホスフアターゼ接合ヤギ抗ヒトIg抗体〔タゴ
（Tago,Burlington,CA）〕を含む指示手段を用いて検出
することができる。吸着ポリペプチドと免疫反応するウ
サギ血清中の抗体はアルカリ性ホスフアターゼ接合ヤギ
抗ウサギIg抗体〔キルケガード・アンド・ペリ・ラボラ
トリーズ社（Kirkegard ＆ Perry Laboratories,Inc.,G
aithersburg,MD）〕を含む指示手段を用いて検出するこ
とができる。どの場合も、BBS中に1:300に希釈した指示
抗体100μｌを毎ウエルに加えてさらに固体−液体相組
成物を形成する。この固体液体相組成物を固相に結合し
たヒト抗体と指示手段との間の反応生成物の形成に予定
した時間、１時間、20℃で維持する。相を分離し、固相
をBBSで３時間洗浄する。
ポリペプチド特異性抗体に結合したアルカリ性ホスフア
ターゼ接合抗体はリン酸ｐ−ニトロフエニルのｐ−ニト
ロフエノールへの酵素加水分解を分光測光的に測定する
ことにより検出することができる。簡単に記載すると、
リン酸ｐ−ニトロフエニル〔2mM塩化マグネシウム（pH
9.8）、50mM炭酸ナトリウム中1mg/ml〕100μｌを各ウエ
ルに加える。酵素反応を１時間進行させ、次いで405nm
における光学密度をフロー・ラボラトリーズ（Flow Lab
oratories,Inglewood,CA）から入手できるタイターテク
（TITERTEK）分光光度計中で測定する。
E.免疫処置 本発明の受容体分子は哺乳動物に前記ポリペプチドおよ
び（または）マルチマーを含む接種材料で免疫処置する
ことによりそれに生じた全抗体を包含する。ポリペプチ
ドおよびマルチマーはともに単独の、または担体タンパ
ク質例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）
に接合した接種材料中に含めて用いることができる。し
かし、ポリペプチドは好ましくは接合体として使用さ
れ、マルチマーは好ましくは単独で使用される。
完全フロインドアジユバンド（CFA）中に接合体1.0mgを
含む接種材料でウサギを免疫処置し、１月後に不完全フ
ロインドアジユバント（IFA）中の接合体1.0mgで追加刺
激することができる。各免疫処置は背臀部上の１皮下注
射から構成した。追加刺激後１月および２月に採血し
た。
次いで免疫活性抗体を含む血清をよく知られている方法
により採血から生成させた。これらの抗体は１種または
それ以上の本発明のポリペプチドおよび結核性マイコバ
クテリウム抗原決定基と免疫反応した。従って、それを
装置に用いてマイコバクテリウムの感染の存在を決定す
ることができる。
個々の接種材料はCFAまたはIFAで次のように調製され
る：毎接種に所望量のポリペプチドを与える量の接合体
（例えば1mg）をPBS（約0.5ml）にpH7.2で溶解する。次
いで水と油状物質との比が1:1であった接合体、水およ
びアジユバントを含む接種材料を得るために等容積のCF
AまたはIFAを接合体に混合する。その後混合物を均質化
して接種材料を与える。そのように調製した接種材料の
容積は典型的には1ml以上であり、若干の接合体、PBSお
よびアジユバントが乳化中に失なわれることができる。
回収できる実質的にすべての乳濁液を注射器中に入れ、
次いで前記のようにウサギに導入する。ウサギに導入す
る接種材料の量は乳化段階前に存在したものの少くとも
約99％であるべきである。
上記接種材料保存溶液は本発明の接種材料の例示であ
る。ここに示したように、それを用いて結核性マイコバ
クテリウム抗原と免疫反応する受容体分子を生成させる
ことができる。
F.遅延型過敏症反応（皮膚反応試験） 前記の診断装置および検定は試験管内検定に基く。検定
の特定の段階を生体内で行なうことができるけれども、
真の免疫応答は組織培養で測定される。しかし本発明は
またＴ細胞応答の生体内測定を含む診断装置に適用でき
る。そのような装置の１例は遅延型皮膚過敏症（DCH）
反応、または皮膚反応試験として一層普通に知られたも
のである。
DCH反応は前に所与抗原に暴露（感作）した個体中での
み生ずることができる。抗原に対する個体の最初の暴露
は可視変化を生じないが、しかし個体の免疫状態は、そ
の抗原に対する新たな暴露に対して過敏症を生ずるよう
に改変される。従って抗原（好ましくは緩衝食塩溶液
中）の皮内または皮下注射で特徴的な皮膚障害−最初の
抗原暴露後に生じない障害−が注射部位に生ずる。第２
（または攻撃）抗原接種材料に対する応答が典型的には
24〜48時間遅れるので反応は遅延型過敏症として示され
る。
ヒトにおいて、感作抗原に対する暴露は疾患の原因であ
る微生物〔例えば結核菌（Mycobacterium Tuberculosi
s）からのツベルクリン、サルモネラ・チフイ（Salmone
lla typhi）からのチホイジンおよびブルセラ・アボル
タス（Brucella abortus）からのアボルチン〕との接触
で起り、感作は長期感染の結果として生ずる。動物にお
いて、感作は水、食塩水またはアジユバント中に乳化し
た抗原の接種により達成することができる。
ヒトおよび動物の両方において、過敏症は生理的に許容
される希釈剤例えば食塩溶液中に溶解した抗原の皮膚
（皮内または皮下）中の注射により生体内で試験され
る。DCHは通常抗原に対して生じた抗体の量の決定また
は測定よりも一層鋭敏な診断検定である。例えば、単に
少量のタンパク質（数百μｇ）がマウスのDCH感作に必
要であるが、抗体生成の誘発にはより大きい用量が必要
である。
本発明のポリペプチドが、本発明のポリペプチドによる
免疫処置（感作）後のモルモットＴ細胞の増殖を刺激す
るので、皮膚反応試験を攻撃抗原として１種またはそれ
以上の本合成ポリペプチドを用いて開発した。
詳しくは、遅延型皮膚過敏症反応が本発明の合成ポリペ
プチドをウシ結核菌（Mycobacterium bovis）BCG感作お
よび結核菌（Mycobacterium tuberculosis）株B37Rv感
作モルモットに皮内投与したときに認められた。
ここに記載した細菌はスクリップス・クリニック・アン
ド・リサーチ・フアウンデーション（Scripps Clinic a
nd Research Foundation）の培養コレクションから入手
し、ミンデン（Minden）ほか、サイエンス（Scienc
e），176,57（1972）およびミンデン（Minden）ほか、
インフエクション・アンド・イミユニテイ（Infect.Imm
un.），６,574（1972）に記載されたように成長させ
た、それらの刊行物は参照によりここに示される。
詳しくは熱不活性化BCG含有またはH37Rv含有細胞音波処
理物で約６週前に免疫処置したモルモットが合成ポリペ
プチド約250μｇの皮内感染で遅延型皮膚過敏症（DCH）
反応を示した。ポリペプチドは典型的には0.005％のツ
イーン20を含むリン酸塩緩衝食塩水（pH7.0）約100μｌ
中で投与した。
従来の実施において、DCH反応は抗原の注射後24〜48時
間に探索される。抗体の皮内注射後24〜48時間に生ずる
炎症性浸潤物（主に単核細胞からなる）および付随浮腫
が皮膚の硬化を生ずる。紅斑の共存領域もまた生ずるこ
とができる。この硬化の直径は皮膚過敏症の指数であ
り、約5mmまたはそれ以上の直径の硬化が陽性DCH反応の
一般に許容される基準である。
本発明のポリペプチドは注射部位周囲に直径少くとも10
mmの紅斑領域および硬化を誘出した。非免疫処置動物は
ポリペプチドの皮内注射でDCH反応を示さなかった。非
結核性マイコバクテリウムの細胞抽出物で免疫処置した
動物はポリペプチドに対し辺縁DCH（約5mm未満の紅斑お
よび硬化）を示した。
最も顕著なDCH反応を誘出したポリペプチドはアミノ末
端およびカルボキシ末端におけるシステイン残基により
重合された。第１図の３行に示されるジCysポリペプチ
ド参照。そのポリペプチドを用いたDCH試験の結果は表
Ｉに示される。
1.ミンデン（Minden）ほか、インフエクション・アンド
・イミユニテイ（Infect.Immun.），46,519（1984）に
記載のように調製して免疫処置した、その刊行物は参照
によりここに示される。
2.遅延型皮膚過敏症 3.アミノ酸残基配列 −CysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys を有するポリペプチド（第１図３行に示されるポリペプ
チド）250μｇを、ツイーン20（ICIアメリカス社（ICI
Americas Inc.,Wilmington,D）約0.005％を含むリン酸
塩緩衝食塩水（pH7.0）約100μｌに溶解した。
4.各列中の初めの数字は陽性DCH反応の数を示し、２番
目の数字は試験の全数を示す。
5.コノート・ラボラトリーズ社（Connaught Laboratori
es LTD.,Willowdale,Canada）から入手したPPD（精製タ
ンパク質誘導体）を約250ツベルクリン単位に等しい100
μｌ量で投与した。
表Ｉについて説明するとウシ結核菌（M.bovis）株BCGま
たは結核菌（M.tuberculosis）H37Rv株の細胞音波処理
物で免疫処置したモルモットはポリペプチドおよびPPD
（精製タンパク質誘導体）に対し強いDCH反応を生じ
た。
非結核性マイコバクテリウム〔マイコバクテリウム・フ
オーチユイタム（M.fortuitum）、マイコバクテリウム
・カンサシイ（M.Kansasii）、およびマイコバクテリウ
ム・イントラセルラーレ（M.intracellulare）〕で免疫
処置した動物はポリペプチドに対して反応しなかった
（それぞれ表Ｉ参照）が、しかしPPDに対して強いDCH反
応を示した。
ジCys末端ポリペプチドで免疫処置した動物はポリペプ
チドに対してDCH反応を示したが、しかしPPDには示さな
かった。
非免疫処置正常動物はポリペプチドまたはPPDに対してD
CH反応を生じなかった。
本ポリペプチドの免疫原性もまたポリペプチドを抗体の
誘出について調べた。特異性および結合特性は生じた抗
体をここに記載したように酵素結合抗体免疫吸着検定
（ELISA）で測定した。
強い抗ポリペプチド応答がポリペプチド（第１図２行に
示される）をタンパク質担体（キーホールリンペットヘ
モシアニン）にカップリングさせ、不完全フロインドア
ジユバントとともにウサギに注射した。ポリペプチドに
対して生じた抗血清の力価はポリスチレンマイクロタイ
タープレートの各ウエル中にポリペプチド１μｇを固定
化し、次いで結合したポリペプチドを系列希釈の抗血清
と反応させることにより測定した。抗体力価はELISAで5
0％の最大結合を生ずる抗体の希釈の逆数として示され
る。抗血清は1250〜2500の抗ポリペプチド力価を有し
た。
ポリペプチド誘出抗体の種々のマイコバクテリウム種の
抽出物との反応性を、「Ｓ抗原」調製物をポリスチレン
マイクロタイタープレートのウエル中に固定化したELIS
Aで測定した。（「Ｓ抗原」は、参照によりここに示さ
れるミンデン（Minden）ほか、インフエクション・アン
ド・イミユニテイ（Infect.Immun.），46,519（1984）
に記載されたように音波処理により分裂させた細菌懸濁
液を100,000×ｇで遠心分離した後の上澄み画分中に存
在する抗原である）。
BCG−ａタンパク質の残基１〜12に相当するアミノ酸残
基配列を有しカルボキシ末端にシステインを有するポリ
ペプチドの場合に、抗ポリペプチド抗体はポリペプチド
（力価＝1250）、精製BCG−ａタンパク質（1250）並び
にウシ結核菌（M.bovis）株BCG（675）および結核菌
（M.tuberculosis）株H37Rv（675）の可溶性音波処理抽
出物と強く反応した。マイコバクテリウム・フオーチユ
イタム（M.fortuitum）（50）、マイコバクテリウム・
カンサシイ（M.kansasii）（25）およびマイコバクテリ
ウム・イントラセルラーレ（M.intracellulare）（25）
の音波処理抽出物に対して単に辺縁結合が認められた。
この種の辺縁結合はまた免疫前ウサギ血清でみられ、ウ
サギ抗体がこれらのマイコバクテリウムに非特異的につ
くことができたことを示唆した。大腸菌（E.Coli）、リ
ステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogene
s）、サルモネラ・エピデルミス（Salmonella epidermi
s）、サルモネラ・チフイムリウム（Salmonella typhim
urium）またはシユードモナス・スプ（Pseudomonas s
p）の「Ｓ抗原」に対して結合がなかった（力価10未
満）。これらのデータは該ポリペプチドが主に結核性マ
イコバクテリウム種中に発現される免疫原エピトープを
含むことを示す。
ポリペプチドの抗原性を２つの方法で測定した。第１に
体液抗体との反応性を測定するために、ポリペプチドを
マイクロタイタープレートのウエル上に固定化し、種々
の抗体調製物と反応させた。BCG−ａタンパク質の残基
１〜12に相当するアミノ酸残基配列を有しカルボキシ末
端にシステインを有するポリペプチドの場合に、ポリペ
プチド（力価＝1250）、BCG−ａタンパク質（625）およ
びウシ結核菌（M.bovis）BCGの全音波処理抽出物（62
5）を指向する抗体によりポリペプチドに対しかなりの
結合があった。マイコバクテリウム・カンサシイ（M.ka
nsasii）（25）およびマイコバクテリウム・フオーチユ
イタム（M.fortuitum）（５）の抽出物により誘出され
た抗体により単に辺縁結合があった。大腸菌（E.Col
i）、リステリア・モノサイトゲネス（L.monocytogene
s）、サルモネラ・エピデルミス（S.epidermis）、サル
モネラ・チフイムリウム（S.typhimurium）またはシユ
ードモナス・スプ（Pseudomonas sp）の抽出物により誘
出された抗血清に対して検出可能な結合がなかった。再
びデータは、このエピトープが主に結核性種によって発
現され、あるとしても試験した２つの非定型株〔マイコ
バクテリウム・カンサシイ（M.Kansasii）およびマイコ
バクテリウム・フオーチユイタム（M.fortuitum）〕に
は貧弱であることを示唆する。
DCH反応の結果は本発明の合成ポリペプチドを結核性マ
イコバクテリウム抗原に対する細胞仲介免疫応答の存在
に対する生体内診断装置に使用できることを示す。
前記ポリペプチドの安全性および有効性が動物研究にお
いて示されるので該ポリペプチドを結核性マイコバクテ
リウムワクチンの受容体に対してヒト皮膚反応試験にお
ける攻撃抗原として使用することができる。該ポリペプ
チドは前記のように合成し、高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）技術により精製し、滅菌し、発熱物質試験さ
れる。
ヒト結核性マイコバクテリウムワクチン受容体のＴ細胞
増殖応答がポリペプチド特異性に関連して完全に変動で
きるので、ワクチン受容体および非接種対照として作用
させる個体を一連のポリペプチドで攻撃する。速度論お
よび最適抗原用量は動物研究の結果を指針として使用し
てワクチン受容体群中に決定することができる。
長期感染固体もまた合成ポリペプチドを皮膚反応試験の
ための抗原として用いて結核性マイコバクテリウム特異
性Ｔ細胞感作について調べることができる。
各事例において、攻撃抗原は個々のポリペプチドの生理
的に許容される溶液中で（約1ml）前腕手掌表面中に皮
内注射により投与される。25または27ゲージ針の使用は
通常抗原の皮下投与よりもむしろ皮内投与を保証する。
皮下注射は組織中で抗原の希釈を生ずることができ、疑
陰性試験を生ずることができる。次いで注射部位を紅斑
（皮膚の赤らみ）および硬化（膨化）について攻撃後４
時間、24時間および48時間に観察する。
前記は本発明の例示として意図され、限定ではない。多
くの変更および変形を本発明の新規な概念の真の精神お
よび範囲から逸脱することなく行なうことができる。本
明細書に例示した特定のポリペプチド、抗体、その組成
物および使用に関して何ら限定が意図されず、または限
定を推論すべきでないことを理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホーテン リチャード エイ アメリカ合衆国 カルフォルニア州 92075 ソフナ ビーチ フォード アベ ニュー 558

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】左から右へアミノ末端からカルボキシ末端
    の方向に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys 又はCysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により示される合成ポリペプチドであり、担体に結合さ
    せて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバ
    クテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発でき
    る合成ポリペプチド。
  2. 【請求項２】左から右へアミノ末端からカルボキシ末端
    の方向に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys 又はCysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により示される合成ポリペプチドであり、担体に結合さ
    せて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバ
    クテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発でき
    るポリペプチドを、製剤に許容される希釈剤中に有効量
    溶解または分散して含む合成ポリペプチド接種材料であ
    って、哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコ
    バクテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発で
    きる合成ポリペプチド接種材料。
  3. 【請求項３】ポリペプチドが担体に結合されている、請
    求項２記載の合成ポリペプチド接種材料。
  4. 【請求項４】ポリペプチドが約100μｇ〜約500mg毎用量
    の量で存在する単位投薬形態にある、請求項２記載の合
    成ポリペプチド接種材料。
  5. 【請求項５】体試料中の抗結核性マイコバクテリウム抗
    体を検定する方法であって： （ａ）検定する体試料を提供する段階、 （ｂ）前記体試料を、左から右へアミノ末端からカルボ
    キシ末端の方向に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys 又はCysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により示される合成ポリペプチドであり、担体に結合さ
    せて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバ
    クテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発でき
    る合成ポリペプチドと混合する段階、 （ｃ）前記混合物を、前記試料中に存在する抗結核性マ
    イコバクテリウム抗体が前記ポリペプチドと免疫反応す
    るのに十分な時間維持する段階、および （ｄ）前記免疫反応の存在を測定する段階、 を含む方法。
  6. 【請求項６】体試料が血液、血清および血漿からなる群
    から選ばれる、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】さらに、前記混合の前に前記ポリペプチド
    を固体支持体に結合させる段階を含む、請求項５記載の
    方法。
  8. 【請求項８】体成分中の結核性マイコバクテリウムの抗
    原に対する抗体の存在を検定するキット形態の診断装置
    であって、 （ａ）左から右へアミノ末端からカルボキシ末端の方法
    に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys 又はCysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により示される合成ポリペプチドであり、担体に結合さ
    せて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバ
    クテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発でき
    る合成ポリペプチド、および （ｂ）前記ポリペプチドの結核性マイコバクテリウムの
    抗原に対する抗体との免疫反応を示す指示手段、 を個々のパッケージ中に含む診断装置。
  9. 【請求項９】さらに、前記ポリペプチドを結合できる固
    体マトリックスを含む、請求項８記載の診断装置。
  10. 【請求項１０】合成ポリペプチドを前記固体マトリック
    スに結合させて固体支持体を形成する、請求項９記載の
    診断装置。
  11. 【請求項１１】固体マトリックスがポリスチレン、ポリ
    塩化ビニル、およびニトロセルロースからなる群れから
    選ばれる、請求項９記載の診断装置。
  12. 【請求項１２】固体マトリックスが、複数のウエルを含
    むマイクロタイターストリップである、請求項９記載の
    診断装置。
  13. 【請求項１３】指示手段がヒト抗結核性マイコバクテリ
    ウム抗体と免疫反応できる標識抗体である、請求項８記
    載の診断装置。
  14. 【請求項１４】標識抗体がアルカリ性ホスファターゼ、
    西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
    ゼおよびグルコースオキシダーゼからなる酵素の群から
    選ばれる酵素で標識されている、請求項13記載の診断装
    置。
  15. 【請求項１５】宿主中の結核性マイコバクテリウム抗原
    の存在を測定する診断装置であって、左から右へアミノ
    末端からカルボキシ末端の方向に書いて式： AlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys 又はCysAlaLysValAsnIleLysProLeuGluAspLysIleCys により示される合成ポリペプチドであり、担体に結合さ
    せて哺乳動物宿主中へ有効量導入すると結核性マイコバ
    クテリウムの抗原と免疫反応する抗体の生成を誘発でき
    る合成ポリペプチドを含み、前記合成ポリペプチドが、
    生理的に許容される希釈剤中で宿主に皮内投与されると
    宿主中に胸腺誘導細胞の増殖を誘発することができ、前
    記増殖が皮内投与の部位における紅斑および硬化により
    示される診断装置。
  16. 【請求項１６】生理的に許容される希釈剤が水、食塩水
    およびアジュバントからなる群の一員である、請求項15
    記載の診断装置。
  17. 【請求項１７】合成ポリペプチドが担体に結合されてい
    る請求項15記載の診断装置。
  18. 【請求項１８】担体がキーホールリンペットヘモシアニ
    ン、不完全フロイントアジュバント中のキーホールリン
    ペットヘモシアニン、ミョウバン、キーホールリンペッ
    トヘモシアニン−吸着ミョウバン、キーホールリンペッ
    トヘモシアニン−吸着ミョウバン百日咳、エデスチン、
    サイログロブリン、破傷風トキソイド、不完全フロイン
    トアジュバント中の破傷風トキソイド、コレラトキソイ
    ドおよび不完全フロイントアジュバント中のコレラトキ
    ソイドからなる群から選ばれる、請求項17記載の診断装
    置。
JP61504608A 1985-08-12 1986-08-12 マイコバクテリウム感染検出合成ポリペプチド Expired - Lifetime JPH0762030B2 (ja)

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