JP2624973B2 - エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 - Google Patents

エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はエプスタイン・バーウィルスおよびその初期
抗原（拡散）の関連する疾患の治療および診断に有用な
免疫原、抗原、抗体、方法および系に関する。
発明の背景 エプスタイン・バーウィルス（EBV）は世界中で個体
の80〜100％に感染している非常に普通の環境因子であ
る。それはヒトにおける感染性単核症（IM）の原因因子
であり、EBVはまたバーキットリンパ腫（BL）、鼻咽頭
癌（NPC）、および免疫抑制患者に生ずるＢリンパ球腫
瘍の病原論に関係づけられた。情況証拠はまたヒト自己
免疫疾患例えば慢性関節リウマチおよびシエーグレン症
候群中のこのウィルスの可能な役割を示した。
初期または一次EBV感染は急性または潜在性であるこ
とができる。急性ウィルス感染は特異核抗原（EBNA−Ｉ
およびEBNA−IIと称される）、「初期抗原」（EA）複合
体、ウィルスカプシド抗原（VCA）および他のウィルス
関連分子の生成を生ずる。これは次に長期間の間EBV感
染が循環血液、リンパ節、脾臓および唾液腺中に存在す
るＢリンパ球中に潜伏する。
潜伏感染はウィルスが未発現または部分発現状態で細
胞内に存在するものである。潜伏状ウィルス感染は再活
性化することができる。生体内潜伏を制御する宿主因子
は十分に理解されていないけれども、１つまたはそれ以
上の免疫機構の不全が重要な因子であることを示唆する
若干の証拠がある。
EBVによる一次感染に続く血清学的および細胞仲介免
疫応答はよく示され、感染の過程中に発現されるウィル
スの免疫原決定基に対する宿主の応答を表わす。自生ウ
ィルスタンパク質の関係において、免疫原決定基は全自
生タンパク質が免疫原として使用されるときの抗体応答
を誘出するタンパク質の部分である。これらの免疫原決
定基は分子上の若干の部位に制限されると思われる。
一方、抗体が結合できるタンパク質分子の領域は抗原
決定基として示される。組織中のウィルス抗原決定基の
検出並びにウィルス免疫原決定基に対する患者の応答の
プロフィルはEBV関連疾患の診断に非常に有用になって
いる。
EA複合体は、この複合体に対する抗体がしばしばEBV
関連疾患を有する患者中に、潜在的に感染したがしかし
発病しない対照集団とは対照的に高い力価で存在するの
で重要である。すなわち、エプステイン・バーウィルス
（EBV）に急性感染したヒトは拡散初期抗原（EA−Ｄ）
に対する抗体を応ずる。次にウィルスが潜伏期に入ると
抗EA−Ｄ抗体が消滅し、ウィルスが再活性化されるまで
再び表われない。
EA複合体は現在EBV感染細胞中の免疫螢光染色の分布
に基いて拡散（Ｄ）および制限（Ｒ）を示す２つの異な
るタンパク質抗原からなると知られている。EA−Ｄに対
する抗体はアセトン固定およびメタノール固定細胞の両
方において核および細胞質の拡散染色を生ずる。対照的
にEA−Ｒ染色はアセトン固定細胞中の細胞質に制限さ
れ、メタノール固体細胞中には存在しない。
IMおよびNPCを有する患者の血清の抗EA活性は主にEA
−Ｄを指向するが、BLを有する患者の血清中の免疫反応
性は主にEA−Ｒを指向する。さらに、EA複合体に対する
抗体は、抗体力価が疾患過程で変化する傾向があるの
で、EBV関連悪性を有する患者に重要である。
従って、EA−ＤおよびEA−Ｒ抗体の両方の存在につい
ての検定は若干の共通の臨床情況に重要である。
抗EA−Ｄ抗体はこれまでEBV感染細胞から得たEA−Ｄ
抗原を用いて検定された。ヘレン（Henle）ほか、サイ
エンス（Science）、169、188〜190（1970）の免疫螢光
法は抗原精製のない全細胞調製物を用いる。しかし、そ
のような粗調製物の使用は血清が哺乳動物の核および細
胞質抗原に対する抗体もまた含む患者に対し偽陽性結果
を生ずる。
より最近にはルカ（Luka）ほか、ジャーナル・オブ・
イムノロジカル・メソーズ（J.Immunol.Meth.）、67、1
45〜156（1984）がイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによりEBV感染細胞から精製したEA−Ｄ標的抗原
を用いる抗EA−Ｄ抗体に対する酵素結合抗体免疫吸着検
定（ELISA）の開発を報告した。ルカ（Luka）ほかの方
法は全細胞調製物の使用に関連する偽陽性の問題を減少
するけれども、それはなお感染物質の生成および取扱い
を必要とする。
従って、疾患中のEBV連座の診断並びに伝染性単核症
（IM）のような疾患の段階の診断を可能になし、感染細
胞培養の取扱いを制限し、回避するために体試料中のEA
−Ｄおよび抗EA−Ｄ抗体の存在について検定する改良さ
れた試薬および方法の開発が望まれる。
最近の研究はタンパク質の主アミノ酸残基配列の短線
状セグメントに相当する化学合成ポリペプチドを用いて
自生タンパク質と免疫反応する抗体を誘発できることが
示された、ラーナー（Lerner）ほか、ネーチャー（Natu
re）、299、592（1982）およびストクリフ（Sutcliff
e）ほか、サイエンス（Science）、219、260（1983）。
さらに、若干の研究は、合成ポリペプチドが自生タンパ
ク質により誘発された抗体と免疫反応できることを示し
た、ロウズ（Rhodes）ほか、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（J.Immunol.）、134、211（1985）。従って、若
干の合成ポリペプチドは自生タンパク質の免疫原および
抗原の決定基を免疫学的に模擬できる。
しかしよく知られているように、合成ペプチド技術の
適用はなお若干の欠点に悩まされる。例えば自生タンパ
ク質上の抗原決定基を模擬できるペプチドの確認は、中
でもタンパク質のアミノ酸残基配列を知ることを必要と
する。アミノ酸残基配列がタンパク質をコードする遺伝
子の核酸配列から予想できるが、そのような予想は、遺
伝子の正しい読み枠が知られれば行なうことができるに
すぎない。
EBVゲノムの核酸配列はベール（Baer）ほか、ネーチ
ャー（Nature）、310、207（1984）の論文の公表以来知
られてきた。しかし、EA−Ｄタンパク質遺伝子もその読
み枠もこれまでウィルスゲノムで確認されなかった。さ
らに、タンパク質のアミノ酸残基配列が知られたとして
も、免疫原および抗原の決定基を構成するタンパク質中
の部位を確認する方法は事実上経験的であり、予測でき
る結果を生じない。これには少くとも２つの理由があ
る。第１に、タンパク質の三次元構造が知らなければタ
ンパク質の線状セグメントを宿主の免疫系に利用できる
信頼できる測定法がない。第２に、三次元構造が知ら
れ、または知られなくても、短線状ポリペプチドがしば
しば適当な免疫原決定基および抗原決定基の構成に必要
な二次および三次配座構造を模擬する能力を有しないと
思われる、タイナー（Tainer）ほか、ネーチャー（Natu
re）、312、127（1984）。
発明の概要 本発明の１観点はEBV EA−Ｄタンパク質のアミノ末
端からおよそ位置350〜およそ位置362のアミノ酸残基配
列に相当するアミノ酸残基配列を有する約６〜約40個の
アミノ酸残基、より好ましくは約10〜約25個の残基、か
ら実質的になる合成ポリペプチドを意図する。核合成ポ
リペプチドはEA−Ｄにより誘発された抗体を免疫結合す
る能力を有する。
殊に好ましいポリペプチドは、左から右へ、アミノ末
端からカルボキシ末端へ、式、 Ｈ−PARPETPSPAIPA−OH により表わされる配列を有する。
本発明の他の観点は約12〜約40個のアミノ酸残基の、
少くとも２つの単位が前記合成ポリペプチドである複数
の結合した合成ポリペプチド反復単位を含む合成ポリペ
プチドオリゴマーを意図する。
本発明のなお他の観点は、ポリペプチド結合以外によ
り互いに結合された複数の合成ポリペプチド反復単位を
含み、約100個以上のアミノ酸残基を含む合成ポリペプ
チドポリマーを意図する。反応単位は前記合成ポリペプ
チドである。
本発明のなお他の観点は、決定する体液試料および前
記合成ポリペプチドを準備する段階を含む体液試料をEA
−Ｄに対する抗体の存在について検定する方法を意図す
る。体液試料およびポリペプチドを混合して免疫反応混
合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中に
存在する抗EA−Ｄ抗体がポリペプチドと免疫結合して免
疫反応体を形成する十分な予定時間維持する。次いで混
合物中に形成された免疫反応体の存在を測定する。
本発明の他の観点は、検定する体試料および前記合成
ポリペプチドにより誘発された抗体結合部位を含む生物
活性受容体分子を準備する段階を含む体試料をEA−Ｄの
存在について検定する方法を意図する。体試料を受容体
と混合して免疫反応混合物を形成する。その混合物を生
物検定条件下に、試料中に存在するEADが受容体により
免疫結合されて免疫反応体を形成する十分な予定時間維
持する。次いで混合物中に形成された免疫反応体の存在
を測定する。
本発明のなお他の観点は、体液試料中の抗EA−Ｄ抗体
の存在について検定する診断系を意図する。系は、好ま
しくは個々の容器中に、前記合成ポリペプチドおよびポ
リペプチドと抗EA−Ｄ抗体との免疫反応を表示する標識
された特異結合剤を含む。
さらに、担体に結合させ、生理学的に許容できる希釈
剤中に分散された前記合成ポリペプチドにより構成され
た免疫原が意図される。
前記合成ポリペプチドに対して生成され、EA−Ｄタン
パク質と免疫反応できる受容体もまた意図される。
他の観点において、本発明は体試料、好ましくは溶解
末梢血リンパ球、中のEA−Ｄの存在について検定する方
法を意図する。体試料を前記受容体と混合して免疫反応
混合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中
に存在するEA−Ｄが受容体と免疫反応して免疫反応体を
形成する十分な予定時間維持する。次いで混合物中に形
成された免疫反応体を測定する。
本発明の他の観点は、体試料中のEA−Ｄの存在につい
て検定する診断キットである。キットは、好ましくは個
々のパッケージ中に、前記受容体および受容体とEA−Ｄ
タンパク質との免疫反応を表示する標識された特異結合
剤を含む。
本発明により提供される利点の１つはEBV EA−Ｄに
関連する抗原および受容体を感染性物質を扱うことなく
生成させる能力である。
本発明はまた、天然に存在する核および細胞質抗原に
より生ずる偽陽性結果を実質的に含まない高免疫特異性
を有する抗原および受容体を提供するので有利である。
本発明の他の利点は再活性化した潜伏EBV感染の早期
検出を与えることである。
本発明のなお他の利点は次の説明から当業者に明らか
であろう。
図面の簡単な説明 本発明の開示の一部を形成する図面中、 第１図はEA−Ｄ遺伝子核酸配列〔ベール（Baer）ほ
か、ネーチャー（Nature）、310、207（1984）により公
表されたEBVゲノム核酸残基79899−81110〕から翻訳
し、１文字アミノ酸残基略号を用いて、左から右へ、ア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向にEA−Ｄタンパク質
の完全なアミノ酸残基配列を示す。この研究に用いたポ
リペプチドのアミノ酸残基配列の位置は配列の下の破線
により示され、末端残基は末端残基の直下の「＋」記号
により示される。破線は表示K5、K6、K7、K8およびK9に
より中断され、それらの表示がそれらのポリペプチドの
参照に利用される。
第２図には、実施例５に記載されるポリペプチドK7を
固相標的とした抗EA−Ｄ抗体ELISAを用いた正常個体
（正常）および感染性単核症患者（急性IM）の血清中
の、それぞれ抗EA−Ｄ IgM、IgGおよびIgA抗体に対す
る検定の結果を示す３つのグラフが含まれる。血清試料
は急性IMを有する44患者（実バー）およびEBVに対する
先行暴露を有しない40個体を含む194健康正常個体（白
抜きバー）から得た。検定中に各試料により生じた490
ナノメートル（nm）における光学濃度（OD490）は最も
近い1/10単位に丸められ、各グラフの横軸である。各バ
ーは示したOD490を生じた試料の数を表わす。
パネルＡのデータはポリペプチドK7により模擬された
EA−Ｄエピトープに免疫結合する（免疫反応体形成）Ig
M抗体の頻度が正常個体中より急性IM患者中で大きいこ
とを示す。パネルＢおよびＣのデータはそれぞれIgGお
よびIgA抗体応答に対する同様の結果を示す。
第３図は鼻咽頭癌（NPC）、シェーグレン症候群（S
S）、サイトメガロウィルス（CMV）感染を有する患者お
よび正常提供者の血清を検定するために実施例５のポリ
ペプチドK7 ELISAを用いて得られた結果を示すヒストグ
ラムである。ポリペプチドK7と免疫反応した各血清試料
中の抗EA−Ｄ抗体の量はOD490値として示され、ヒスト
グラム上の点により示される。
第４図には実施例５に記載されるポリペプチドK7を固
相標的とした抗EA−Ｄ抗体ELISAを用いて抗EA−Ｄ抗体
について急性IMを有する４患者の一連の血清試料を検定
した結果を示す２つのグラフパネルが含まれる。各患者
の血清のデータは異なる記号により表わされ、同一記号
は各グラフパネル中の同一患者に使用される。パネルＡ
のデータは抗EA−DIgM抗体を、症候発症の１週後のIM患
者中に検出できることを示す。パネルＢのデータはロウ
ズ（Rhodes）ほか、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（J.Immunol.）、134、211（1985）に記載された抗EBNA
−1ELISAを用いた血清試料中の抗EBNA−１抗体の増加の
検出による同一患者中のIM診断の確認の例示である。
第５図には固相標識としてK7を用いた抗EA−Ｄ IgM
抗体ELISAで得られた結果に対する血清希釈およびポリ
ペプチド濃度の影響を示す２つのグラフパネルが含まれ
る。
パネルＡのデータはIM患者（IM）並びに血清がEBVカ
プシドタンパク質抗原に対する抗体を含まなかった正常
個体（VCA-）および血清がこれらの抗原に対する抗体を
有した患者（VCA+）のそれぞれの血清試料料中の抗EA−
Ｄ IgM抗体を検定する抗EA−Ｄ抗体ELISAの能力に対す
るミクロタイタープレートウェルに付着したK7ポリペプ
チドの量を変える影響を示す。ミクロタイタープレート
ウェルは実施例５に記載するようにポリペプチドK7でコ
ートしたが、ウェル壁に対するK7の付着に用いたポリペ
プチドK7含有溶液の濃度はミクログラム毎ミリリットル
（μg/ml）で示したように変動させた。試験した血清は
すべて用いる前に1:20に希釈した。
パネルＢのデータは合成ポリペプチドK7と免疫反応す
るヒトIgM抗体の検出に対する血清希釈の影響を示す。
ミクロタイタープレートウェル壁は実施例５に記載され
るように10μg/ml溶液を用いてK7でコートした。IM、NP
CおよびSSを有する患者、並びにVCA-およびVCA+正常個
体の血清を次に抗EA−D ELISAで、示した希釈で検定し
た。
発明の詳細な説明 A.定義 「抗体」という語は抗原と特異的に結合できる免疫グ
ロブリンと称される１群のグリコシル化タンパク質の一
員である分子を示す。
「抗体結合部位」は抗原を特異的に結合する重鎖およ
び軽鎖可変領域からなる抗体分子の構造部分である。
「抗原」という語は歴史的に抗体により結合されるエ
ンティティーを示すため、また抗体の生成を誘発するエ
ンティティーを示すために用いられた。より最近の用法
は抗原の意味を抗体により結合されるエンティティーに
制限し、「免疫原」という語が抗体生成を誘発するエン
ティティーに対して使用される。ここに論議するエンテ
ィティーは免疫原および抗原の両方である場合に一般に
抗原と称される。
「抗原決定基」は抗体結合部位により免疫結合される
抗原の真の構造部分を示す。その語はまた「エピトー
プ」と同義に使用される。
「抗原関連変異体」という語はここに、少くとも１つ
の抗原決定基の一部を共有し、従って免疫的に交差反応
性である全体のアミノ酸残基配列の異なるポリペプチド
を示すために使用される。すなわち、抗原関連変異体の
ポリペプチド配列が異なるが、しかし各変異体に対して
生成された抗体は他と免疫反応する。
「生物活性」という語は、少くとも受容体の適当なリ
ガンドを少くとも特異的に結合する能力を示すが、しか
し他の一般またはエフエクター能力もまた存在すること
ができる。
用いた「複合体」という語は、特異的結合因子が標的
リガンドに結合したときに形成される生成物を示す。典
型的な複合体は免疫反応体、抗体に結合したプロテイン
Ａなど、である。
用いた「保存的置換」という語は、１アミノ酸残基が
他の生物学的に類似の残基により置換されたことを示
す。保存的置換基の例には１つの疎水性残基例えばイソ
ロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンを他に代
える置換、あるいは１つの極性残基を他に代える、例え
ばアルギニンとリシンとの間、グルタミン酸とアスパラ
ギン酸との間、またはグルタミンとアスパラギンとの間
などの置換、が含まれる。「保存的置換」という語には
また、ポリペプチドに対して生じた抗体もまた非置換ア
ミノ酸を有する相当するポリペプチドと免疫反応すれば
非置換親アミノ酸の代りに置換アミノ酸を用いることが
含まれる。
ペプチド配列に関して用いた種々の文法形態における
「相当する」という語は、アミノ末端およびカルボキシ
末端のいずれかまたは両方で３個までのアミノ酸残基を
加えまたは減じた、ポリペプチド配列に沿って特定アミ
ノ酸残基中に保存的置換のみを含むペプチドを意味す
る。
「ELISA」は固相に結合した抗体または抗原並びに酵
素−抗原または酵素−抗体結合体を用いて試料中に存在
する抗原または抗体の量を検定し定量する酵素結合抗体
免疫吸着検定を示す。ELISA法の説明はランゲ・メディ
カル・パブリケーションズ（Lange Mdical Publication
s、Los Altos、CA）により1982年に発行されたサイテス
（D.P.Sites）ほかによる「基礎および臨床免疫学（Bas
ic and Clinical Immunology）、４版、22章、米国特許
第3,654,090号、第3,850,752号および第4,016,043号中
に見出され、それらはすべてここに参照される。
「酵素」は、しばしば特異的である基質中の若干の変
化を触媒作用により促進するかまたは生成することがで
きるタンパク質を示す。
「エピトープ」は抗体結合部位により特異的に結合さ
れて免疫反応体を形成する分子の部分を示す。それはま
た決定基または抗原決定基として示される。
「免疫学的に模擬する」という語は、本発明のポリペ
プチドが、１）自生タンパク質により誘発された抗体に
より免疫結合されることができ、２）誘発ポリペプチド
および自生タンパク質に結合する抗体の生成を誘発でき
ることを意味するために使用される。
種々の形態における「免疫反応する」という語はリガ
ンドとしての抗原と、受容体としての抗体結合部位を含
む分子例えば全抗体またはその一部との間の結合を意味
する。
用いた「免疫反応体」という語は免疫反応の生成物、
すなわちリガンドが受容体分子により免疫結合されると
きに生ずるエンティティーを示す。
「標識手段」、「指示基」または「標識」は同義に使
用され、免疫反応体の存在を示す検出可能なシグナルの
生成に直接または間接に含まれる単個原子または分子が
含まれる。任意の標識手段を受容体に結合または取込ま
せ、あるいは個々に使用することができ、それらの原子
または分子は単独または他の試薬とともに使用できる。
そのような指示基または標識自体は免疫化学においてよ
く知られ、それらは他の新規受容体、方法および（また
は）系で使用される限り本発明の一部を構成する。
「リガンド」は特異的受容体により結合される構造部
分を含む分子を示す。
「ペプチド」および「ポリペプチド」という語は、ペ
プチド結合により互いに結合した既知配列のアミノ酸残
基と同義に使用される。
用いた「薬学的に許容できる塩」という語は製薬工業
に使用される非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属お
よびアンモニウム塩を示し、よく知られた方法により製
造されるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウ
ム、マグネシウムおよびアンモニウム塩などが含まれ
る。そこ語にはまた、本発明の化合物と適当な有機また
は無機酸との反応により一般に製造される非毒性酸付加
塩が含まれる。代表的な塩には塩酸塩、臭化水素酸塩、
硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、
オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ボラート（vorate）、安
息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩
などが含まれる。
「受容体」という語は抗原に（または抗原と）免疫結
合する抗体結合部位からなる生物活性分子を示すために
使用される。そのような結合は典型的には約105〜1010
リットル毎分子の親和性で生じ、抗原のエピトープと受
容体の抗体結合部位との特異的相互作用である。
受容体分子の生物活性は、免疫反応体を形成する水性
媒体中の混合物で少くとも生理学的pH値およびイオン強
度における受容体とその抗原リガンドとの免疫反応によ
り立証される。好ましくは、生物活性は生物検定条件下
に生ずる、すなわち、その条件で、本発明の受容体は約
５〜約９のpH値範囲内で、例えば蒸留水ないし約１モル
の塩化ナトリウムのイオン強度で抗原リガンドに結合す
る。
受容体は抗原に特異的に結合できる抗原結合部位から
なる。受容体には抗体のFab、Fab′、Ｆ（ab′）２およ
びＦ（ｖ）ポリペプチド部分、並びに抗体および実質的
な全抗体が含まれる。抗体のFabおよびＦ（ab′）２部
分はよく知られ、よく知られた方法による実質上無傷の
抗体の、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質
分解反応により製造される、例えばセオフロポラウスほ
か（Theofilopolous and Dixon）に対する米国特許第4,
342,566号参照。Fab′抗体タンパク質もまたよく知ら
れ、Ｆ（ab′）２部分から、次に２重鎖タンパク質を結
合するジスルフィド結合の例えばメルカプトエタノール
により還元し、次いで生じたタンパク質メルカプタンを
試薬例えばヨードアセトアミドによりアルキル化するこ
とにより生成される。無傷完全抗体が好ましく、本発明
の単クローン性または他の受容体分子の例として利用さ
れる。
「分泌する」および「生成する」という語はしばしば
抗体分子が得られる細胞に関して同義に使用される。し
かし、抗体を生ずる細胞はその環境中へそれらの分子を
分泌しない。関心のハイブリドーマ細胞はそれらの環境
中へ単クローン性抗体を分泌する。しかし、そのような
細胞はしばしば「抗体生成」細胞として示され、それら
の抗体は技術的に利用される語に従って「生成された」
と示される。
用いた「合成」という語はポリペプチド分子またはポ
リペプチド反復単位が、生物手段により例えば遺伝子工
業技術により製造されるよりむしろ化学的手段すなわち
化学合成により作られたことを意味する。従って、本発
明の態様である合成ポリペプチドは天然存在タンパク質
およびそのフラグメントを含まない。
B.合成ポリペプチド 本発明の合成ポリペプチドは、第１図およびベール
（Bear）ほか、ネーチャー（Nature）、310、207（198
4）のゲノム配列に帰属される位置を用いてそのアミノ
末端からおよそ位置350〜およそ位置362のEBV EA−Ｄ
タンパク質のアミノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基
配列を有する約６〜約40個のアミノ酸残基、より好まし
くは約10〜約24個の残基から実質的になる。該合成ポリ
ペプチドはEA−Ｄにより誘発された抗体を免疫結合する
能力を有する。
好ましい実施において、ポリペプチドは、結合体とし
て免疫担体例えばキーホールリンペットへモシアニン
（KLH）に結合させ、水性希釈剤中で有効量を宿主哺乳
動物例えばラット、マウス、ラビットまたはモルモット
中へ導入すると結合体のポリペプチドと免疫反応するだ
けでなく、また変性状態におけるEA−Ｄと免疫反応する
抗体の分泌を誘発できる。より好ましくは、それらの誘
発された抗体は自生状態におけるEA−Ｄと免疫反応す
る。従って、好ましい態様において本発明のポリペプチ
ドは自生EA−Ｄタンパク質の免疫原および抗原の決定基
を免疫学的に模擬することができる。
自生状態における典型的なEA−Ｄは体液例えば急性IM
の患者の血漿中に認められるタンパク質である。変性状
態における典型的なEA−Ｄは、SDS−PAGEおよびウェス
タンブロット分析に使用されるような２−メルカプトエ
タノールで還元した後のタンパク質である。
好ましいアミノ酸残基配列には左から右へ、アミノ末
端からカルボキシ末端の方向にとって、式 −PARPETPSPAIPS− により表される配列、その薬学的に許容できる塩、およ
びその抗原関連変異体が含まれる。
アミノ酸残基配列の初めまたは末端におけるダッシュ
はそれぞれアミノ末端およびカルボキシ末端における基
例えばＨおよびOH、あるいは、さらにポリペプチド鎖中
の合計40個までのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上の
アミノ酸残基の配列に対する結合を示すことが示さられ
る。
さらに、アミノ末端からおよそ位置350〜およそ位置3
62のEA−Ｄタンパク質のアミノ酸残基配列に相当する少
くとも６個のアミノ酸残基配列に加えて、ポリペプチド
中に存在できるアミノ酸残基の配列が、EA−Ｄにより誘
発された抗体に対する免疫結合におけるポリペプチドの
実質的特性が実質的に損なわれなければ無関係であるこ
とができることが示される。より好ましくは、ポリペプ
チドおよび前記の少くとも変性されたEA−Ｄと免疫反応
する抗体の誘発における特有免疫原性もまた実質的に損
なわれない。
最も好ましくは、ポリペプチドはEA−Ｄタンパク質分
子の前記位置に等しい１つまたはそれ以上のアミノ酸残
基配列から実質的になる。前記EA−Ｄの配列に等しい複
数のアミノ酸残基配列を含む最も好ましいポリペプチド
はここに「ポリペプチドオリゴマー」として示される群
内にあり、以下に論議される。
殊に好ましいポリペプチドは左から右へ、アミノ末端
からカルボキシ末端の方向にとって、式、 Ｈ−PARPETPSPAIPS−OH により表わされる配列、その薬学的に許容できる塩およ
びその抗原関連変異体に相当するアミノ酸配列を有す
る。
第１図を参照することにより知見できるように、前記
ポリペプチドはベール（Baer）ほかのゲノム配列を基に
したEA−Ｄの位置350〜362の配列に等しいアミノ酸残基
配列を有する。
本発明のポリペプチドはポリペプチド当業者に知られ
ている任意の技術により合成することができる。そのよ
うに利用できる多くの技術の優れた概要はスチュワード
ほか（J.M.Steward and J.D.Young）、「固相ペプチド
合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」、W.H.フリ
ーマン社（W.H.Freeman Co.,San Francisco）、1969;固
相ペプチド合成に対するマインホーフェル（Meinhofe
r）、「ホルモンタンパク質およびペプチド（Hormonal
Proteins and Peptides）」、２巻、46頁、アカデミッ
ク・プレス（Academic Press、New York）、1973:およ
び古典的溶液合成に対するシュローダーほか（E.Schrod
er and K.Kubke）、「ペプチド（The Peptides）、１
巻、アカデミック・プレス（Academic Press、New Yor
k）、1965、に見出すことができる。
一般に、これらの方法は１つまたはそれ以上のアミノ
酸または適当に保護したアミノ酸の成長ペプチド鎖に対
する逐次的付加を含む。通常、第１アミノ酸残基のアミ
ノ基またはカルボキシ基は適当な選択的に除去できる保
護基により保護される。異なる選択的に除去できる保護
基が反応性側基を含むアミノ酸例えばリシンに利用され
る。
例として固相合成を用いると、保護または誘導体化し
たアミノ酸をその非保護カルボキシルまたはアミノ基に
より不活性固体支持体に結合させる。アミノまたはカル
ボキシル基の保護基を次に選択的に除去し、適当に保護
された相補性（アミノまたはカルボキシル）基を配列中
に有する次のアミノ酸を混合し、既に固体支持体に結合
した残基とアミド結合の形成に適する条件下に反応させ
る。次いでアミノ基またはカルボキシル基の保護基をこ
の新たに加えたアミノ酸残基から除去し、次いで同様に
次のアミノ酸（適当に保護された）を付加させる。所望
のアミノ酸をすべて適当な配列に結合させた後、残存端
および側基保護基（並びに固体支持体）を逐次または同
時に除去すると最終ポリペプチドが得られる。
確認された全アミノ酸残基は天然のＬ配置にある。標
準ポリペプチド命名法〔ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、243、3557〜59（1969）〕に従っ
て、アミノ酸残基に対する略号は次の対応表に示される
とおりである。
C.ポリペプチド重合体 本発明はまた、少くとも２つの反復単位が前記本発明
のポリペプチドである複数の結合した合成ポリペプチド
反復単位を含む合成ポリペプチドオリゴマーを意図す
る。そのようなオリゴマーは合計約12〜約40個のアミノ
酸残基、より好ましくは約25〜約40個の残基を含む。個
々の反復単位は、２つのポリペプチド反復単位が存在す
る場合に長さで約６〜約34残基であることができる。前
記のように、より好ましくはすべての反復単位が本発明
のポリペプチドであるだけでなく、またアミノ酸残基配
列がEA−Ｄの配列に等しいポリペプチドである。
本発明のポリペプチドオリゴマーはまたEA−Ｄにより
誘発された抗体に免疫結合する能力を有することに特徴
がある。より好ましくはポリペプチドオリゴマーは、さ
らに免疫原担体例えばKLHに結合させ、水性希釈組成物
で前記宿主哺乳動物中へ導入するとEA−Ｄに免疫結合す
る抗体の分泌を誘発する能力を有することに特徴があ
る。
殊に好ましいポリペプチドオリゴマーは、複数の、左
から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、
式、 −PARPETPSPAIPS− により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを含む。
対応表の３文字略号を用いると、上記ポリペプチドは
また式、 −ProAlaArgProGluThrProSerProAlaIleproSer− により表わすことができる。
従って、本発明のオリゴマーポリペプチドはそれらの
成分ポリペプチドと同様に、ヒト抗EA−Ｄ抗体に対して
抗原性であり、前記のように、より好ましくは免疫原性
である。従って、それらのオリゴマーポリペプチドは後
記診断法および系に有用である抗EA−Ｄ抗体の生成の誘
発に使用することができ、また適当な診断法および系中
に抗原として使用することができる。
全オリゴマーポリペプチド中に約35個より少いアミノ
酸残基を含むオリゴマーは、典型的には免疫原として使
用するために免疫原担体例えばKLHに結合させる。合計
約35個以上のアミノ酸残基を含むオリゴマーポリペプチ
ドは典型的には担体なく使用するのに十分な免疫原性で
ある。
オリゴマーポリペプチドは前記固相法を用いて頭−尾
のように合成ポリペプチド単量体を互いに結合させるこ
とにより製造することができ、すなわち、１つの完全な
ポリペプチド配列を樹脂上に、次いで１つまたはそれ以
上の同一または異なるポリペプチド配列を合成し、その
後全オリゴマー単位を樹脂から開裂してここに記載した
ように用いる。そのような頭−尾ポリペプチド多量体
は、好ましくは約２〜約５個のポリペプチド反復単位を
含む。
あるいは、ポリペプチドオリゴマーを次に詳細に記載
するように単量体、すなわち反復単位、として用いた合
成ポリペプチドの重合体として製造することができる。
そのような目的に対する典型的な連鎖停止剤は２−メル
カプトエタノール、チオグリコール酸およびチオプロピ
オン酸である。
D.ポリペプチド重合体 用いた「ポリペプチド重合体」という語は種々の文法
形態で複数の本発明の合成ポリペプチドを反復単位とし
て含む分子として示される。それらのポリペプチド反復
単位はポリペプチド結合以外により互いに結合され、そ
の重合体は約100個以上のアミノ酸残基を含む。従っ
て、本発明の重合体は、水性組成物中に約５〜約９のpH
値で、好ましくは約6.5〜約7.5のpHで分散性であれば、
約10,000またはそれ以上の見掛け分子質量、Mr、を有す
る。ポリペプチド反復単位は同一かまたは異なることが
でき、重合体中に存在する他のポリペプチドがEA−Ｄに
より誘発された抗体と重合体との免疫反応を実質的に妨
害または異なるような抑制をしない、すなわち重合体の
抗原性を妨害しない限り、本発明のアミノ残基配列以外
の１つまたはそれ以上の他の配列を含むことができる。
重合体中の本発明のポリペプチド以外のポリペプチドの
存在もまた、好ましくは重合体の免疫原性を実質的に抑
制しない。
ポリペプチド重合体（合成多量体）は、典型的には高
い免疫原性および抗原性である利点を有する。さらに、
重合体免疫原を用いるとき典型的には担体を必要としな
い。異なるポリペプチド単量体を重合体の製造に用いる
場合には、若干のEA−Ｄ抗原決定基に対する抗体と免疫
反応する能力が得られる。なお他の利点は、接種材料中
に用いるとEA−Ｄの若干の抗原決定基と免疫反応する抗
体を誘発する重合体の能力である。
本発明の典型的な重合体はアミノ末端およびカルボキ
シ末端の両方に付加したシステイン残基を含む本発明の
ポリペプチド単量体（ジCysポリペプチド）を用いて合
成することができる。ジCysポリペプチド単量体は酸化
操作を用いる分子内、ポリペプチド間システインジスル
フィド結合により互いに結合させ、免疫原性、抗原性重
合体を形成させることができる。そのように製造された
ポリペプチド重合体は複数の、本発明の合成ポリペプチ
ドを反復単位として含む。それらの反復単位は前記酸化
されたシステイン（シスチン）残基により互いに結合さ
れる。
担体にポリペプチドを結合させる目的、またはポリペ
プチド重合体の製造に対する本発明のポリペプチド中の
１つまたは２つの末端Cys残基の存在は本発明のポリペ
プチドのアミノ酸残基配列を変えるとは解されない。
殊に好ましいポリペプチド重合体、左から右へ、アミ
ノ末端からカルボキシ末端の方向に、式、 −PARPETPSPAIPS− により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを複数含む。
従って、本発明の合成多量体ポリペプチドは、それら
の成分ポリペプチドと同様に、ヒト抗EA−Ｄ抗体に対し
て抗原性であり、前記のように一層好ましい免疫原性で
ある。従って、それらの合成多量体ポリペプチドは、後
に論議する診断法および診断キットに有用な抗EA−Ｄ抗
体の生成の誘発に使用でき、また適当な診断法および診
断キット中に抗原として使用できる。
E.免疫原 もう１つの実施態様に於て、本発明のポリペプチドを
薬剤学的に受容可能な水性希釈剤組成物中で用いて、有
効量で投与するときEA−Ｄと免疫反応する抗体を誘導す
る能力のある接種物を形成する。
種々の文法上の形に於ける“免疫原”という用語は、
本明細書中ではEA−Ｄに対する抗体の調製に用いられる
活性成分として本発明のポリペプチドを含む組成物を記
載するために用いられる。ポリペプチドを抗体の誘導に
用いる場合、ポリペプチドは免疫原担体に結合させて、
あるいは担体なしまたは担体に結合させたオリゴマーポ
リペプチドとして、あるいはポリペプチドポリマーとし
て用いることができるが、表現が容易なために本明細書
中では本発明のポリペプチドの種々の実施態様を一括的
に“ポリペプチド”およびその種々の文法上の形で呼ぶ
と理解されるべきである。
約35個より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドで
は、既述のように抗体産生を誘導するために免疫原担体
を用いることが好ましい。
これまた既述したように、１個以上の追加のアミノ酸
残基を合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ
末端へ付加してポリペプチドの担体への結合を助けるこ
とができる。合成ポリペプチドのアミノ末端またはカル
ボキシ末端に付加されたシステイン残基はジスフィド結
合によるポリマーの生成に特に有用であることが見いだ
された。しかし、結合物調製のための技術上公知の他の
方法を用いることもできる。典型的な付加結合方法はミ
カエル（Michael）付加反応生成物、グルタルアルデヒ
ドのようなジアルデヒドの使用、クリプスタイン（Klip
stein）ら、J.Infec.Dis.，147、318326（1983）など、
あるいは前に論じたように複数のポリペプチドを一緒に
結合して合成マルチマーを生成させるため、免疫原担体
へアミド結合を生成するために水溶性カルボジイミドの
使用に於けるようなカルボジイミド技術の使用を含む。
有用な免疫原担体は技術上公知であり、一般に蛋白質
自体である。かかる担体の典型例はスカシガイのヘモシ
アニン（KLH）、エデスチン、チログロブリン、牛血清
アルブミン（BSA）またはヒト血清アルブミン（HSA）の
ようなアルブミン、羊赤血球（SRBC）のような赤血球、
テナヌストキソイド、コレラトキイソイドならびにポリ
（Ｄ−リシン:D−グルタミン酸）のようなポリアミノ酸
である。
これまた技術上公知であるように、合成ポリペプチド
を中間結合基によってその担体へ結合させることがしば
しば便利である。しかし、システインを用いる場合、中
間結合基は本明細書中で用いたように好ましくはｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（MBS）である。
さらに、リウ（Liu）ら、Biochem.、80、690（1979）
によって記載されているようにエステル−アミド交換反
応によってMBSを最初に担体へ付加させることができ
る。その後で、この付加の次にマレイミド二重結合にわ
たってチオール酢酸（CH3COSH）のような封鎖メルカプ
ト基の付加を行うことができる。アシル封鎖基の分離
後、脱封鎖結合基メルカプタンと合成ポリペプチドの付
加システイン残基のメルカプタンとの間にジスルフィド
結合を生成させる。
担体の選択は免疫原の抗原決定基部分よりも免疫原の
最終使用の方により依存しており、本発明に特別に含ま
れてはいない基準に基づいている。例えば、特別な非ヒ
ト宿主（受容体）動物に不都合な反応を生じない担体を
選ぶべきである。
本発明の免疫原は、本発明のポリペプチドの有効免疫
原量を、オリゴマーポリペプチドとして、あるいは酸化
されたポリペプチド末端システイン残基によって一緒に
結合された個々のポリペプチドのポリペプチドポリマー
として、あるいは担体へ結合された結合物として含む。
単位用量当たりのポリペプチドの有効量は、特に、接種
される動物の種、動物の体重および技術上公知のように
選ばれた接種方法に依存する。免疫原は１回の接種
（量）につき約10μｇ−約500μｇのポリペプチド濃度
を含む。ここに挙げたポリペプチド量は、担体を用いる
場合には、担体の重量を含まないポリペプチドの重量を
意味する。特別な典型的免疫原は、担体＋ポリペプチド
（結合物）の重量が示される下文に記載される。
“単位用量”という用語は動物に対する１回投与量と
して適当な物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望
の治療効果を生ずるように計算された活性物質の所定量
を、所要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共に
含む。本発明の新規単位用量の規格は、本明細書中で詳
細に記載したような、かつこれらが本明細書の特徴であ
る（ａ）活性物質の独特な特性および達成されるべき特
別な免疫学的効果と、（ｂ）かかる活性物質を動物に於
ける免疫学的使用のために配合する技術に固有の制限に
よって指令されかつこれらに直接依存する。
免疫原は、典型的には乾燥固体ポリペプチド−結合
物、オリゴマーポリペプチドまたはポリペプチドポリマ
ーから、ポリペプチド−結合物またはポリペプチドポリ
マーを、公知のように水、食塩水、燐酸塩緩衝食塩水な
どのような生理学的に許容できる（受容可能な）希釈剤
中に分散させて水性組成物を生成させることによって調
製される。
免疫原は希釈剤の部分としてアジュバントをも含むこ
とができる。フロイントの完全アジュバント（CFA）、
フロイントの不完全アジュバント（IFA）および明礬の
ようなアジュバントが技術上公知であり、幾つかの供給
源から市販されている。
F.レセプター 本発明のポリペプチドによって誘導される（に対して
産生される）抗体および実質的に全部の抗体ならびにか
かる抗体から調製される抗体結合部位は本発明のさらに
もう１つの実施態様を構成する。これらの分子を本明細
書中では一括的にレセプターと称する。レセプターは、
上で説明した免疫原を用いる免疫処置によってマウス、
ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマなどのような哺乳類宿
主中で産生される。
モノクローン形の適当なレセプター、典型的には全抗
体は、ナイマン（Niman）ら、Proc.Natl.Sci.U.S.A.、8
0、4949−4953（1983）によって記載（この記載は参照
文として本明細書に含まれるものとする）されたハイブ
リドーマ技術を用いて調製することもできる。要する
に、モノクローンレセプターがそれから産生されるハイ
ブリドーマを生成させるために、骨髄腫または他の自己
永続性細胞系を本発明のポリペプチドで過免疫処置され
た哺乳動物の脾臓から得られるリンパ球と融合させる。
骨髄腫細胞系はリンパ球と同じ動物種からのものであ
ることが好ましい。典型的には、株129GlX′のマウスが
好ましい哺乳動物である。本発明に用いるために適当な
マウス骨髄腫はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（American Type Culture Collection）、（メリーラ
ンド州ロックビル市）からそれぞれCRL1580およびCRL15
81の名称で入手できるヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン−感受性（HAT）細胞系P3×63−Ag8.653およ
びSp2/0−Ag14を含む。
典型的には、ポリエチレングリコール（PEG）1500を
用いて脾細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合したハイ
ブリッドをそのHATに対する感受性で選択する。本発明
のハイブリドーマ分泌レセプター分子は本明細書中で説
明した酵素結合免疫吸着剤検定（ELISA）を用いて同定
される。
レセプターとしてのモノクローン抗体はハイブリドー
マ上澄液から得らえる必要があるばかりでなく、所望の
ハイブリドーマをその中へ導入してある哺乳動物の腹水
から一般により濃厚な形で得ることもできる。腹水を用
いるモノクローン抗体の調製は公知であるので、ここで
はそれ以上取り扱わないことにする。
本発明のレセプターはレセプターがそれに対して産生
されたポリペプチドへ結合すると共に、本発明のポリペ
プチドが免疫学的に模倣する対応するEA−Ｄ抗原決定部
位にも結合する。かくして、本発明のポリペプチドは免
疫原と抗原との両方であることができる。
本発明のポリペプチドによって誘導され、かつオリゴ
マーポリペプチドおよびポリペプチドポリマーを含む本
発明のレセプターは、無傷のEA−Ｄによって模倣される
エピトープに比べて比較的少ないエピトープを有する免
疫原（比較的小さいポリペプチド）に対して産生される
ので、天然産多クローン性抗体に比べてオリゴクローン
性であるとして記載することができる。結局、本発明の
レセプターはポリペプチドのエピトープに結合するが、
全EA−Ｄ分子に対して産生される天然産抗体はEA−Ｄ分
子全体にわたるエピトープに結合し、多クローン性であ
ると言われる。
F.検定方法およびキット 1.抗EA−Ｄ抗体の検定 本発明の合成ポリペプチドは、血液、血清または血漿
のような液体試料中の抗EA−Ｄ抗体の存在および量の検
定のために特に有用である。
１つの実施態様に於て、本発明は下記工程からなる抗
EA−Ｄ抗体の存在についての体液試料の検定方法を意図
する。
（ａ） 非検定体液試料を提供する工程。典型的にはか
かる試料は既知量の血液として、より好ましくは血清ま
たは血漿として提供される。血液、血漿および血清試料
を提供する方法は技術上公知であり、ここではこれ以上
論じない。
（ｂ） EA−Ｄ蛋白質の約350位から約362位までのEA−
Ｄ蛋白質のアミノ酸残基配列にほぼ相当するアミノ酸残
基配列を有する本質的に約６−約40個のアミノ酸残基か
らなる合成ポリペプチドであって、EA−Ｄによって誘導
される抗体によって免疫学的に結合される能力を有する
合成ポリペプチドを提供する工程。
（ｃ） 該体液試料を該ポリペプチドと混合して免疫反
応混合物を生成する工程。
（ｄ） 試料中に存在する抗EA−Ｄ抗体がポリペプチド
と免疫学的に結合して第１免疫反応体（immunoreactan
t）を生成するのに十分な約４℃−約45℃の温度に於て
約10分から約16−20時間までのような所定時間生物学的
検定条件下で混合物を保持する工程。
生物学的検定条件とは本発明のポリペプチド分子およ
び検定しようとする抗EA−Ｄ抗体の生物活性を保持する
条件であって、約４℃−約45℃の温度範囲、約５−約９
のpH値範囲および蒸留水から約１モルの塩化ナトリウム
までにわたるイオン強度を含む。かかる条件の最適化方
法は技術上公知である。
（ｅ） 生成された免疫反応体（immunoreactant）の存
在、それによって免疫反応混合物中に於ける抗EA−Ｄ抗
体の存在を検定する工程。
抗EA−Ｄ含有免疫反応体の存在の直接または間接的検
定は技術上公知の検定技術で達成される。例えば米国特
許第4,536,479号、第4,233,401号、第4,233,402号、第
3,996,345号に記載（これらの記載は参照文として本明
細書に含まれるものとする）されているような均一検定
システムを用いることができる。
好ましい実施態様に於ては、工程（ｅ）による検定の
ために、工程（ｄ）の第１免疫反応体は下記の工程によ
ってさらに調製される。
（ｉ）第１免疫反応体中に存在するヒト免疫グロブリン
に結合する生物学的に活性な標識された特異結合剤、好
ましくはレセプターを混合して複合体、好ましくは標識
された第２免疫反応体を生成させる工程。より好ましく
は、標識された特異結合剤は免疫グロブリンクラス特異
性であり、すなわち結合剤は以下に説明するように、Ig
G、IgMまたはIgAクラスの免疫グロブリンと特異的に免
疫反応する能力がある。標識された特異結合剤は複合体
中の特異結合剤の存在を信号で知らせる能力がある。
（ii）そのようにして生成された標識された特異結合剤
／第１免疫反応体混合物を、標識された特異結合剤が第
１免疫反応体として存在するEA−Ｄ抗体と複合体を生成
するために十分な所定時間の間生物学的検定条件下に保
持する工程。抗EA−Ｄ抗体を含む第２免疫反応体の部分
として結合される標識された特異結合剤の存在の検定は
試料中の抗EA−Ｄ抗体の存在の検定を提供する。好まし
い実質態様に於ては、複合体の部分として結合された標
識された第２特異結合剤の量が測定され、それによって
試料中の抗EA−Ｄ抗体の量が決意される。その量は零で
あることがあり、それによって検知され得る限界内で試
料中に抗EA−Ｄ抗体が存在しないことを示すことがあり
得る。標識された特異結合剤の存在および量の検定方法
は用いられる標識に依存し、かかる標識および検定方法
は技術上公知である。
全抗体の形のレセプターのような蛋白質特異結合剤の
標識は技術上公知である。例えば、ハイブリドーマによ
って産生されるレセプターは組織培地中の成分として提
供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝的結合によっ
て標識され得る。例えばガルフレ（Galfre）ら、Meth.E
nzymol．73、３−46（1981）参照。活性化官能基による
蛋白質結合（conjugation）またはカップリングの技術
は特に適用可能である。例えば、アウラミーズ（Aurame
as）ら、Scand.J.Immunol.Vol.8、Suppl.7、７−23（19
78）および米国特許第4,493,795号（これらの記載は参
照文として本明細書に含まれるものとする）参照。さら
に、標識が第２レセプターとその標的抗原との免疫反応
をほとんど妨害しないように部位指示カップリング（si
te−directed coupling）反応を行うことができる。例
えば、ロッドウエル（Rodwell）ら、Biotech.3、889−8
94（1985）参照。
標識手段は抗体または抗原にそれらを変性することな
く化学的に結合して有用な免疫螢光トレーサーである螢
光色素（染料）を生成する螢光標識剤であることができ
る。適当な螢光標識剤はフルオレッセインイソシアネー
ト（FIC）、フルオレッセインイソチオシアネート（FIT
C）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル
クロリド（DANSC）、テトラエチルローダミンイソチオ
シアネート（TRITC）、リサミン、ローダミン8200スル
ホニルクロリド（RB200SC）などのような螢光色素であ
る。免疫螢光分析技術の説明はマーチャロニス（Marcha
lonis）ら編著、アンティボディアズアトゥール（Antib
ody As A Toll）〔ジョンウィリーアンドサンズ（John
Wiley ＆ Sons）、Ltd.、pp189−231（1982）〕中のデ
ルカ（DeLuca）、“免疫螢光分析（Immuno−Fluorescen
ce Analysis）”中に記載されている（この記載は参考
文として本明細書に含まれるものとする）。
好ましい実施態様に於て、指示基はワサビ大根ペルオ
キシダーゼ（HRP）、ブドウ糖酸化酵素などのような酵
素である。主指示基がHRPまたはブドウ糖酸化酵素のよ
うな酵素であるかかる場合には、レセプター−配位子複
合体（免疫反応体）が生成した事実を目に見えるように
するため追加試薬が所要である。HRP用のかかる追加試
薬には過酸化水素およびジアミノベンジジンのような酸
化染料前駆物質が含まれる。ブドウ糖酸化酵素について
有用な追加試薬は2,2′−アジノジ−（３−エチルベン
ズチアゾリンＧ−スルホン酸）（ABTS）である。放射性
元素も有用な標識剤であり、ここで実例的に用いられ
る。
典型的な放射性標識剤はγ線放出を生ずる放射性元素
である。それ自体がγ線を放出する124I、125I、128I、
131I、132I、51Crはγ線放出生起性放射性元素指示基の
１つのクラスを示す。125Iが特に好ましい。有用な標識
手段のもう１つの群はそれら自体が陽電子を放出する11
C、18F、15O、13Nのような元素である。そのように放出
された陽電子は動物体内に存在する電子と遭遇するとき
γ線を生成する。111Inまたは3Hのようなβ放出体も有
用である。
本発明の検定方法および系は固体担体を形成するため
の固体マトリックスに結合された本発明の抗原またはレ
セプターを利用することができる。
抗原またはレセプターは、典型的には水性媒質すら吸
着によって固体マトリックスへ結合されるが、幾つかの
吸着様式ならびに当業者に公知の他の結合様式を用いる
ことができる。かかる様式の典型例は架橋されたデキス
トロースまたはセルロースのようなブドウ糖含有マトリ
ックスと臭化シアンとの反応によって生成される反応性
カルボキシル官能性とレセプターまたは抗原との反応、
ラテックス粒子と共に後述するようなグルタルアルデヒ
ド結合などである。
有用な固体マトリックスは技術上公知である。かかる
マトリックスには、ファーマシアファインケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals）（米国ニュージャーシー
州ピスカタウェイ市）からセファデックス（SEPHADEX）
の商標で発売されている架橋デキストラン；アガロース
（agorse）；米国イリノイス州ノースシカゴのアボット
ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）から発売され
ている直径約１μｍ−約5mmのポリスチレンビーズ；シ
ート、ストリップまたはパドルのようなポリ塩化ビニ
ル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセ
ルロースまたはナイロン−ベースのウェブ；ガラス；あ
るいはポリスチレンまたはポリ塩化ビニル製のようなミ
クロタイタープレートの管、プレートまたはウェルが含
まれる。
凝集型検定に有用なラテックス粒子も有用な固体マト
リックスである。かかる物質は日本合成ゴム会社（Japa
n Synthetic Rubber Company of Tokyo,Japan）から発
売されており、陰イオン性石けん中に分散されたカルボ
キシ官能性粒子として記載されている。かかる粒子の典
型的なロットは0.308μｍの平均直径を有し、カルボキ
シ基１個につき約15−約30A2の平均カルボキシ官能基分
布を有する。
使用する前に、粒子を1,3−ジアミノ−３−プロパノ
ールのようなジアミンと反応させて遊離アミノ基を保持
しながら粒子カルボキシ基と複数のアミド結合を生成さ
せる。その後で、遊離アミンをグルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒドおよびレセプターまたは抗原と反応さ
せてシッフ塩基反応生成物を生成させる。その後で、シ
ッフ塩基反応生成物を硼水素化ナトリウムのような水溶
性還元剤で還元して有用な固体担体を提供する。本発明
で利用することができる数多くの免疫検定法があること
を当業者は理解するであろう。しかし、抗EA−Ｄ抗体と
本発明のポリペプチドとの反応によって与えられる信号
をもたらすどんな方法でも意図される。さらに、特に記
載した検定システムおよび方法は固相を利用するが、本
発明はそれに限定されるものではない。これらの検定方
法のおのおのは指示手段が免疫反応、かつそれによって
検定されるべき抗体と本発明のポリペプチドとの結合の
信号を出すために利用される。模範的な技術はマギオ
（Maggio）、エンザイムイムノアッセイ（Enzyme Immun
oassay）CRCプレス（米国オハイオ州クリーブラント
市）（1981）、およびゴールドマン（Goldman）、フル
オレッセントアンティボディメソッド（Fluorescent An
tibody Methods）、アカデミックプレス（Academic Pre
ss）（米国ショーヨーク州ニューヨーク市）（1988）中
に説明されている。
2.抗EA−Ｄ抗体を検定するための診断キット 本発明の抗EA−Ｄ抗体検定法を行うために有用な、好
ましくはキットの形の診断キットは、別個の包装で
（ａ）EBA EA−Ｄ蛋白質のアミノ末端から約350位から
約362位までのEBV EA−Ｄ蛋白質のアミノ酸残基配列に
実質的に相当するアミノ酸残基配列を有する本質的に約
６−約40個のアミノ酸残基からなる合成ポリペプチドと
（ｂ）該ポリペプチドと抗EA−Ｄ抗体の免疫反応の信号
を出すための標識された特異結合剤とを含む。好ましく
は、標識された特異結合剤は酵素に結合したレセプター
である。
好ましい実施態様に於ては、キットはポリペプチドが
それに結合して固体支持体を形成する固体マトリックス
をも含む。有用な固体マトリックスは既に記載してあ
る。しかし、好ましくは、固体マトリックスはミクロタ
イタープレートのウェルである。最も好ましくは、固体
支持体は固体マトリックスに結合した既知量のポリペプ
チドで提供される。
好ましい実施態様に於ては、陽性の対照として用いる
ための本発明のポリペプチドに対して産生される抗体を
も含む。
既知量のポリペプチドおよび標識された特異結合剤が
提供される。これらの量は１回の検定を行うために少な
くとも十分な量である。ポリペプチドおよび標識された
特異結合剤は、典型的には、以下に記載されるように、
水、食塩水または緩衝液で所定容量に希釈するように設
計される形および量で提供される。
キットには追加の包装をも含むことができる。かかる
包装は（ｉ）乾燥形または液状の緩衝塩（ii）ｏ−フェ
ニレンジアミンのような酵素基質などを含むことができ
る。
3.EA−Ｄの検定 本発明は体試料中に於けるEA−Ｄの存在の検定方法を
も意図している。一般に、アセトンまたはメタノール固
定によって溶解された溶解末梢血液リンパ球（PBL）の
ような被検体試料が提供される。試料は本発明の合成ポ
リペプチドによって誘導される抗体結合部位を含むレセ
プター分子と混合される。混合物は、レセプター分子が
体試料中に存在するEA−Ｄと免疫反応するために十分な
所定時間生物学的検定条件下に保持される。次に、免疫
反応の量（すなわち生成した免疫反応体の量）を測定し
て被検体試料中にEA−Ｄ分子が存在していたか不在だっ
たかを決定する。
4.EA−Ｄ検定用診断キット 上記検定方法を実施するために有用な好ましくはキッ
ト形の診断キットは、別個の包装で、（ａ）EA−Ｄと免
疫反応する本発明のレセプターと（ｂ）本発明のレセプ
ターとEA−Ｄとの免疫反応を信号で示すための標識され
た特異結合剤とを含む。
好ましい実施態様に於ては、キットは、別個の包装
で、レセプターと反応するモルモット補体のような補
体、抗免疫グロブリン抗体またはS.アウスレウス（S.au
reus）コワン（cowan）株蛋白質Ａのような増幅用試薬
をも含む。これらの実施態様では、増幅手段が本発明の
レセプターに結合するとき、増幅手段に特異的に結合す
る能力がある。
ここで記載した診断キットのレセプター分子と別個の
指示手段ならびに上記増幅用試薬は、溶液で、あるいは
液状分散体として、あるいは実質的に乾燥した粉末、例
えば凍結乾燥形粉末として提供されることができる。指
示手段が増幅用試薬とは別個の分子である場合には、指
示手段を別個に包装することが好ましい。指示手段が酵
素である場合には、酵素の基質もキットの別個の包装で
提供することができる。前述の顕微鏡スライドのような
固体マトリックス、１種以上の緩衝剤、アセトンもこの
診断検定キットの別個包装要素として含むことができ
る。
診断キットに関連してここで述べた包装は診断キット
に於て通常用いられる包装である。かかる包装はガラス
およびプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネート）のびん、バイアル、プラスチ
ックおよびプラスチック箔積層封筒などを含む。
本発明の最良の実施形式 下記の実施例は本発明を説明するためのものであっ
て、限定するためのものではない。
実施例1:ポリペプチドの合成 EA−Ｄ遺伝子を位置決定し、その解読枠を決定するた
め、EA−Ｄ蛋白質のアミノ末端の一部分を親和性精製EA
−Ｄを用いて順序付け（sequence）した。かくして得ら
れたアミノ酸残基配列をEBVゲノムの可能なアミノ酸残
基配列翻訳と、そっくりのものが見いだされるまで比較
し、それによって推定EA−Ｄおよびその解読枠を同定し
た。その解読枠に基づいてEA−Ｄ蛋白質遺伝子の翻訳さ
れたアミノ酸残基配列を、ベール（Baer）ら、ネーチャ
ー（Nature）310、207（1984）によって利用されたEBV
株に対して第１図に示す。
上で得たアミノ酸残基配列を用いて、翻訳された遺伝
子の部分に対応する一連の短い合成ポリペプチドを合成
し、それらの自生のEA−Ｄの抗原決定基を模倣する能力
を試験した。これらのポリペプチドのアミノ酸残基配列
およびEA−Ｄ蛋白質中に於けるアミノ末端からのその配
列の位置を、上記第１表中に、アミノ末端からカルボキ
シ末端への方向に、左から右へ示してある。
第 １ 表 EA−Ｄ分子から誘導された合成ポリペプチド 名称 配 列 位 置 １ K7 PARPETPSPAIPSC2 350−362 K6 RKRTSSEARQKQKC2 379−391 K5 PKKVKQAFNPLIC2 393−404 K8 TVSPSPSPPPPPRTPC2 331−345 K9 SVAADSLAAALSLC 242−255 １ ベール（Baer）ら、ネーチャー（Nature）、310 207
（1984）に報告されているゲノム配列データから翻訳、
推定されたEA−Ｄ分子のアミノ末端からの位置。２ カップリングの目的で付加されたカルボキシ末端シス
テインは同族EA−Ｄ蛋白質アミノ酸残基配列中には存在
しない。
上の第１表中に示したポリペプチドはメリフィールド
（Merrifield）ら、J.Am.Chem.Soc.、85、2149−2154
（1963）およびホートン（Houghton）ら、Int.J.Pept.P
rot.Res.16、311−320（1980）中に記載されている固相
法によって化学的に合成された。ポリペプチド合成の固
相法はベガバイオテクノロジーズ社（Vega Biotechnolo
gies,Inc.,Tucson,Az）から市販されているベガモデル2
50Cポリペプチドシンセサイザー（Vega Model 250C Pol
ypeptide Synthesizer）を用いて実施された。
K9以外のポリペプチドの場合には、システイン残基を
カルボキシ末端へ付加して下記のように蛋白質担体への
カップリングを助けた。全ポリペプチドの組成はアミノ
酸分析で確認した。
上記固相法で本発明の合成ポリペプチドを製造する場
合、アミノ酸残基をカルボキシ末端残基からエステル結
合によって樹脂（固相）に結合させた。ポリペプチドを
Cys残基によって担体へ結合させようとする場合あるい
は末端Cys残基を経て重合させようとする場合には、樹
脂にエステル結合しているカルボキシ末端残基としてそ
のCys残基を利用するのが便利である。
典型的には各付加アミノ酸のα−アミノ基を第三ブト
キシカルボニル（ｔ−BOC）で保護した後、成長しつつ
あるポリペプチド鎖中の次のアミノ酸を付加する。次に
そのｔ−BOC基を除去した後、成長しつつあるポリペプ
チド鎖へ次のアミノ酸を付加する。
ポリペプチドの合成中には、反応性アミノ酸側鎖も保
護した。残りのアミノ酸残基のために次のような通常の
側鎖保護基を用いた。
チロシンのためにはｏ−（ｐ−ブロモベンジルオキシ
カルボニル）；スレオニン、セリン、アスパラギン酸、
グルタミン酸のためにはｏ−ベンジル；システインのた
めにはｓ−メトキシベンジル；ヒスチジンのためにはジ
ニトロフェニル；リシンのためには２−クロロベンゾキ
シカルボニル；アルギニンのためにはトシル。
使用する前に、保護されたアミノ酸を適当な溶媒から
再結して薄層クロマトグラフィーで単一スポットとす
る。カップリングは、典型的には初期Ｎ−末端アミノ酸
のミリ当量数より10倍モル過剰の保護アミノ酸とジシク
ロヘキシルカルボジイミドの両方を用いて行われた。両
方の反応剤の２モル過剰も用いることができる。アスパ
ラギンの場合には、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾ
トリアゾールを保護アミノ酸へ付加し、ジメチルホルム
アミドを溶媒として用いた。カップリング反応はすべ
て、ギシン（Gisin）、Anal.Chem.Acta.58、248−249
（1972）のピクリン酸試験によって99％以上完全であっ
た。
所望のポリペプチドの製造後、得られた保護ポリペプ
チドの一部分（約1g）を2mlのアニソールで処理し、ド
ライアイス温度に於ける反応器中へ約20mlの無水弗化水
素を凝縮させた。得られた混合物を４℃に於て約１時間
撹拌して保護基を分離し、ポリペプチドを樹脂から除去
した。温度４℃に於て、N2流で弗化水素を蒸発させた
後、残留物を無水ジエチルエーテルで３回抽出してアニ
ソールを除去し、残留物を真空乾燥した。
真空乾燥物を５％酢酸水溶液（50ml3回）で抽出して
遊離ポリペプチドを樹脂から分離した。抽出物含有溶液
を凍結乾燥してモノマー未酸化ポリペプチドを提供し
た。
実施例2:オリゴマーの製造 本発明の合成オリゴマーは、１つのポリペプチドのカ
ルボキシ末端残基と第２のポリペプチドのアミノ末端残
基との間のアミド結合によって一緒に端−端（頭−尾）
結合される複数の本発明のポリペプチドの固相合成によ
って製造することができる。かかる合成オリゴマーは好
ましくは単一の長いポリペプチドオリゴマーとして合成
されるが、個々のポリペプチドとして合成し、これらを
その個々の合成の後で、１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩水溶液のよ
うなカルボジイミド反応剤を用いて一緒に結合させるこ
とができる。単一ポリペプチド鎖として製造されたオリ
ゴマー中に含まれるアミノ酸残基の全数は、約６個まで
の本発明のポリペプチドが単一のポリペプチドとして合
成される単一の頭−尾オリゴマー鎖に結合され得るよう
に、好ましくは約40未満である。より好ましくは合成頭
−尾オリゴマーは結合した本発明の合成ポリペプチド２
−約４ブロックおよび全部で約40未満のアミノ酸残基を
含む。
実施例3:ポリマーの製造 本発明のポリペプチドポリマー（合成マルチマー）
は、実施例Ａ記載のようにして、かつアミノ末端とカル
ボキシ末端の両方にシステイン残基を含む本発明のポリ
ペプチドを合成して未酸化、還元形の“ジCys末端”ポ
リペプチドを生成することによって製造することができ
る。合成後、典型的な実験室製造では、10mgのジCysポ
リペプチド（未酸化形でシスティン残基を含む）を250m
lの0.1モル（Ｍ）炭酸アンモニウム緩衝液に溶解する。
この溶解したジCys末端ポリペプチドを、次に、得られ
た溶液を包囲常温で空気中で約18時間おだやかに撹拌す
ることにより、あるいはエルマン（Ellman）試験〔エル
マン（Ellman），Arch.Biochem.Biophys.,82、70−77
（1959）。〕で遊離メルカプタンが検出されなくなるま
で空気酸化する。
かくして製造されたポリマーは酸化システイン（シス
チン）残基によって一緒に結合された合成ポリペプチド
反復単位を複数個含む。かかるポリマーは、典型的に、
頭−尾方式ならびに頭−頭および尾−尾方式で一緒に結
合したポリペプチド反復単位を含む。すなわち２個のポ
リペプチド反復単位のアミノ未端は、両ポリペプチド末
端に於ける結合基は等しいので、２個のカルボキシル末
端ができるように単一シスチン残基によって一緒に結合
されることができる。
実施例4:担体へのカップリング 合成ポリペプチドを、リウ（Liu）ら、Biochem.、8
0、690（1979）に記載されている方法によって免疫原性
担体としてのスカシガイのヘモシアニン〔Keyhole Limp
et Hemocyanin（KLH）〕にカップリングさせた。要する
に、4mgの担体を0.51mgのｍ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化し、次
に5mgのポリペプチドとアミノ末端システインまたはカ
ルボキシ末端システインによって反応させて約10−約35
重量％のポリペプチドを含む結合物を提供した。
実施例5:抗EA−Ｄ抗体のELISA検定 種々のEBV関連臨床症状を有する患者からの血清試料
を、下記のELISAを用いて抗EA−Ｄ抗体の存在について
検定した。被検血清は、臨床的特徴と羊赤血球凝集陽性
（すなわちヘテロフィル）とに基づいて急性伝染性単核
症（IM）をもつと診断された患者からのものであった。
IM診断を確かめるために、これらの患者からの回復期血
清を抗EBNA−１抗体および抗VCA（VCA′）抗体について
試験し、これらの抗体を含むことを発見した。
異好性VCAおよびEBNA−１抗原に対して指向される抗
体が陰性である健康な個人から正常成人血清を得た。VC
A陰性（VCA-）と呼ぶこの群は多分一次EBV感染を受けて
いない。健常供給者の第２群は陽性抗VCAおよび抗EBNA
−１抗体力価をもっていた。この第２対照群はVCA陽性
（VCA+）と呼ばれ、多分以前にEBA暴露を受けている。
増加した回復期抗CMV抗体力価によって決定される急
性サイトメガロウィルス（CMV）感染を有する患者から
の血清も試験した。ショーグレン症候群（SS）を有する
患者から試験した血清は乾性角結膜炎、口内乾燥症、陽
性小唾液腺生検（スケールＩ−IVで等級IV）、ならびに
抗核抗原およびリウマトイド因子を含む上昇した自己抗
体力価を有していた。リウマトイド関節炎（RA）を有す
るが関連したSS症状が無い患者の血清も評価した。
合成ポリペプチドを、マトリックスとしてミクロタイ
タープレートウェル（microtiter plate well）〔イム
ノロン（Immunolon）II;ダイナテクラボラトリーズ社
（Dynatech Laboratories,Inc.,Alexandria,VA）〕の壁
に、各ウェルに10μg/mlのポリペプチドを含む硼酸塩緩
衝食塩水（BBS;200mM硼酸ナトリウム、160mM、NaCl、pH
8.0）0.050mlを混合することによって結合された。この
混合物を４℃に於て約16時間保持した。プレートを転倒
して振ることによって未結合ポリペプチドをウェルから
分離した。残留非特異結合部位を、次に、0.200mlの封
鎖用溶液〔10％の正常ヤギ血清（NGS）を含むPBS（10mM
リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.3）〕を各ウェル
中で混合することによって封鎖した。かくして生成した
混合物を吸湿チャンバー内で37℃に約90分間保持した。
次に、封鎖用溶液を、ウェルを転倒して振ることによっ
てウェルから除去し、かくして生成した固体支持体を空
気中で37℃に於て約１時間乾燥させた。
ポリペプチド被覆ウェル（固体支持体）のおのおのに
封鎖用溶液で1:20に希釈した0.200mlの血清を混合して
固−液相免疫反応混合物を形成させた。この混合物を25
℃に於て約１時間保持した。次に、0.05％のトゥイーン
（Tween）20〔ポリオキシエチレン（30）ソルビタンモ
ノラウレート〕〔シグマ（Sigma）〕を含むBBSで３回洗
浄することによって未結合物をウェルから分離した。
生成した固相結合免疫反応体の量を、10％NGSを含むB
BSで1:1000に希釈したワサビ大根ペルオキシダーゼ（HR
P）に結合したヒト免疫グロブリンクラス特異性抗体0.2
00mlを混合して第２固−液相混合物を形成することによ
って測定した。IgG抗体およびIgM抗体を検出するため、
HRP結合マウス抗ヒトIgGおよびマウス抗ヒトIgMモノク
ローン抗体〔それぞれオルトディアグノスティックス社
（Ortho Diagnostics,Raritan,NJ）〕を用いた。IgA抗
体を検出するためには、HRP結合ヤギ抗ヒトIgA〔キレガ
ードアンドペリー社（Kiregaard and Perry,Gaithersbu
ry,MD）〕を用いた。第２固／液相混合物を約25℃に於
て約１時間保持した。次に、上記のようにして５回洗浄
することによって未結合物を固相結合サンドイッチ（第
２）免疫反応体から分離した。
次に、HRP標識含有固相結合サンドイッチ（第２）免
疫反応体の量を、メーカーの指示に従って新たに調製し
た0.200mlのｏ−フェニレンジアミン（OPD、シグマ）基
質溶液を混合することによって検定した。約25℃に於て
約15−約30分間発色させた。次に、0.050mlの4N H2SO4
を各ウェル中に混合することによって基質転化反応を停
止させた。ダイナテクMR6000（Dynatech MR6000）〔ダ
イナテクラボラトリーズ社（Dynatech Laboratories,In
c.）〕ミクロタイタープレートリーダー（microtiter p
late reader）を用いて波長490nmに於ける混合物の光学
密度を測定した。
IMおよび正常血清の抗EA−Ｄ抗体についての結果を第
２図に示してある。固体マトリックスに結合したポリペ
プチドK7を用いると、正常血清と比べてIM患者の血清か
らはIgG、IgA、IgM抗体の明らかに高い結合が観察され
た。対照的に、合成ポリペプチドK5、K8、K9は正常血清
と比べてIM血清との増加した免疫反応性を示さなかっ
た。しかし、幾らかのIM血清中にはポリペプチドK6に対
する低免疫反応性が存在した。
鼻咽頭癌（NPC）、EBV関連疾患、SSを有する患者から
の血清も、正常血清と比べてポリペプチドK7との増加し
た免疫反応性を示した（第３図）。対照的に、乾性症状
の無いRAを有する患者からの血清は明らかな抗ポリペプ
チドK7活性を示さなかった。
上記ELISAを用いて時間経過研究も行った。４人のIM
患者から、患者がIM症状にかかっている期間中に得た一
連の試料を、ポリペプチドK7およびローデス（Rhodes）
ら、J.Immunol.,134、211−16（1985）のポリペプチド
をそれぞれ固体マトリックスに結合させて用い、抗K7抗
体および抗EBNA−１抗体の存在について試験した。第４
図に示したこれらの結果は、抗EA−Ｄポリペプチド抗体
がEBV感染の開始時に於て抗EBNA−１抗体よりも高いレ
ベルで生じることを示す。
かくして、本発明の検定方法はEBV関連疾患を有する
血清患者中に於ける本発明のポリペプチドに免疫学的に
結合する抗体を検出することができる。これらのポリペ
プチド反応性抗体はEBV感染の結果としてEA−Ｄ蛋白質
の対応する部分によって誘導されと考えられる。
実施例6:ポリペプチド濃度 ミクロタイタープレートウェル壁を被覆して固体支持
体を生成させるために用いられるポリペプチド含有溶液
の濃度を変える影響を試験した。BBS中に0.1、1.0、1
0、100μg/mlのポリペプチドK7を含む溶液を用いて実施
例５記載のようにウェル壁へポリペプチドを結合させ
た。正常個人（VCA+およびVCA-）およびIM患者からの血
清を用い、実施例５に従って抗EA−DIgM抗体を検出する
ためELISAを行った。血清はすべて1:20希釈で用いた。
この研究の結果は第5A図に示してある。これらの結果
は、試験したポリペプチド濃度の範囲にわたって各被検
血清中で検出された抗EA−DIgM抗体の量はほとんど変化
しないことを示している。かくして、0.1μg/mlポリペ
プチドのような低い濃度のポリペプチド溶液を用いて本
発明のポリペプチドをミクロタイタープレートウェルの
内壁へ結合させて固体支持体を形成することができる。
実施例7:試料希釈 実施例５のELISAに於ける被検体液試料の希釈の影響
を試験した。正常個人（VCA-およびVCA+）ならびにIM、
NPC、SSを有する患者からの血清を前述の封鎖用溶液で
1:5、1:20、1:50、1:100に希釈し、実施例５記載のよう
に検定した。
この研究の結果は第5B図に示してある。これらの結果
は、試料の希釈度の増加に伴う感度の減少が約1:20の試
料希釈で横ばいになり始めることを示している。
実施例8:抗EA−Ｄの検出 本発明の検定法の試料中に存在する抗EA−Ｄ免疫グロ
ブリンのクラスを識別する能力を試験した。このこと
は、第１表中に示したポリペプチドのおのおのを実施例
５のELISAに於ける固相結合抗原として用いることによ
って達成された。
第１表中のポリペプチドを、血清試料中のIgG、IgM、
IgA抗体と免疫反応する能力について検定した結果を下
記第２表に示す。
上記の結果は、固体マトリックスに結合（吸着などに
より）して固体支持体を形成するポリペプチドK7は急性
EBV感染を有する患者（＃2241）の血清中のIgG、IgM、I
gA抗体と免疫反応する能力があることを示す。さらに、
EBVカプシド抗原に対する抗体を含む（VCA+）２人の臨
床的に正常な個人からの血清はK7と免疫反応せず、また
EBVに対する前以ての検出可能な暴露が無い（VCA-）臨
床的に正常な個人からの血清もK7と免疫反応しなかっ
た。
特殊な実施態様および実施例を含む以上の明細書は本
発明の説明のためのものであって、限定と取られるべき
ではない。本発明の真の精神および範囲から逸脱するこ
となく数多くの他の種々の変化や変更を行うことが可能
である。
【図面の簡単な説明】
第１図は公表されたEA−Ｄ遺伝子配列から１文字アミノ
酸残基略号を用いて、左から右へ、アミノ末端からカル
ボキシ末端の方向にとったEA−Ｄタンパク質の完全なア
ミノ酸残基配列を示す図であり、 第２図は実施例５に記載されるポリペプチドK7を固相標
的とした抗EA−Ｄ抗体ELISAを用いた正常固体（正常）
および感染性単核患者（急性IM）の血清中の、それぞれ
抗EA−Ｄ IgM、IgGおよびIgA抗体に対する検定の結果
を、各試料により光学濃度（OD490）を生じた試料の数
を抗体応答の頻度として示すグラフであり、 第３図は鼻咽頭癌（NPC）、シェーグレン症候群（S
S）、サイトメガロウィルス（CMV）感染患者および正常
提供者の血清の検定に実施例５のポリペプチドK7ELISA
を用いて得られた結果を示すヒストグラムであり、 第４図は急性IM患者の血清試料をELISAを用いて検定し
た結果を示すグラフであり、Ａは抗EA−Ｄ抗体ELISAを
用い、Ｂは抗EBNA−Ｉ ELISAを用いた結果を示し、 第５図は抗EA−Ｄ IgM抗体ELISAにおける血清希釈およ
びポリペプチド濃度の影響を示すグラフであり、Ａはペ
プチドK7の濃度、Ｂは血清希釈、のそれぞれの影響を示
す。

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】EBV EA−Ｄタンパク質の、そのアミノ末
    端から位置350〜362のアミノ酸残基配列に相当するアミ
    ノ酸残基配列を有する13〜40個のアミノ酸残基からなる
    合成ポリペプチドであって、EA−Ｄに対し生成される抗
    体に免疫結合する能力を有する合成ポリペプチド。
  2. 【請求項２】13〜25個のアミノ基残基を含み、左から右
    へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって、
    式： −PARPETPSPAIPS− により表わされるアミノ酸残基配列を含む、請求項１記
    載の合成ポリペプチド。
  3. 【請求項３】ポリペプチドのアミノ酸残基配列が、左か
    ら右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にとっ
    て、式： Ｈ−PARPETPSPAIPS−OH により表わされる配列に相当する、請求項１記載の合成
    ポリペプチド。
  4. 【請求項４】結合した反復単位として、前記合成ポリペ
    プチドを複数含有するオリゴマーの形態にある、請求項
    １記載の合成ポリペプチド。
  5. 【請求項５】体液試料をEA−Ｄに対する抗体の存在につ
    いて検定する方法であって、 （ａ） 検定する体液試料を準備する段階、 （ｂ） EBV EA−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端か
    ら位置350〜362のアミノ酸残基配列に相当するアミノ酸
    残基配列を有する13〜40個のアミノ酸残基を含む合成ポ
    リペプチドであって、EA−Ｄにより誘発された抗体に免
    疫結合する能力を有する合成ポリペプチドを準備する段
    階、 （ｃ） 体液試料とポリペプチドとを混合して第１免疫
    反応混合物を形成する段階、 （ｄ） 混合物を生物検定条件下に、試料中に存在する
    抗EA−Ｄ抗体がポリペプチドに免疫結合して第１免疫反
    応体を形成する十分な予定時間維持する段階、および （ｅ） 前記混合物中に形成された第１免疫反応体の存
    在について検定する段階、 を含む方法。
  6. 【請求項６】体液試料が血清または血漿である、請求項
    ５記載の方法。
  7. 【請求項７】ポリペプチドが固体マトリックスに固体支
    持体として付着され、さらに第１免疫反応体を、段階
    （ｅ）による検定のために、 （ａ） 第１免疫反応体中に存在するヒト免疫グロブリ
    ンに結合して標識された第２免疫反応体を形成する生物
    活性標識受容体であって、前記第２免疫反応体中の前記
    標識受容体の存在を表示できる標識受容体を混合し、 （ｂ） そのような形成された混合物を生物検定条件下
    に、前記標識受容体が第１免疫反応体として存在する抗
    EA−Ｄ抗体と第２免疫反応体を形成する十分な予定時間
    維持する、 ことにより調製する、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】体液試料中の抗EA−Ｄ抗体の存在について
    検定する判断キットであって、 （ａ） EBV EA−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端か
    ら位置350〜362のアミノ酸残基配列に相当するアミノ酸
    残基配列を有する13〜40個のアミノ酸残基からなる合成
    ポリペプチドであって、EA−Ｄにより誘発された抗体に
    より免疫結合する能力を有する合成ポリペプチド、およ
    び （ｂ） 抗EA−Ｄ抗体とポリペプチドとの免疫反応を表
    示する標識された特異結合剤、 を個々のパッケージ中に含む診断キット。
  9. 【請求項９】ポリペプチドを固体マトリックスに付着さ
    せて固体支持体を形成させ、また標識された特異結合剤
    が酵素標識受容体である、請求項８記載の診断キット。
  10. 【請求項１０】標識された受容体がヒト免疫グロブリン
    クラス特異性である、請求項９記載の診断キット。
  11. 【請求項１１】EBV EA−Ｄタンパク質の、そのアミノ
    末端から位置350〜362のアミノ酸残基配列に相当する配
    列を有する13〜40個のアミノ酸残基からなる合成ポリペ
    プチドであって、担体に結合され、生理学的に許容でき
    る希釈剤中に分散されたポリペプチドの有効量により構
    成された免疫原。
  12. 【請求項１２】ヒト体液試料をEA−Ｄに対するIgA、IgM
    またはIgG抗体の量について検定する方法であって、 （ａ） 検定する血清または血漿試料を準備する段階、 （ｂ） EBV EA−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端か
    ら位置350〜362のアミノ酸残基配列に相当するアミノ酸
    残基配列を有する13〜40個のアミノ酸残基からなる合成
    ポリペプチドであって、EA−Ｄに対し生成される抗体と
    免疫結合する能力を有する合成ポリペプチドを付着した
    固体マトリックスを含む固体支持体を準備する段階、 （ｃ） 体液試料と固定支持体とを混合して第１免疫反
    応混合物を形成する段階、 （ｄ） 前記免疫反応混合物を生物検定条件下に、試料
    中に存在する抗EA−Ｄ抗体が固体支持体のポリペプチド
    と免疫結合して第１免疫反応体を形成する十分な予定時
    間維持する段階、 （ｅ） その後前記固体支持体を前記体液試料から分離
    する段階、 （ｆ） 前記分離した固体支持体を、免疫グロブリンク
    ラス特異性の生物活性標識受容体であって第１免疫反応
    体として存在するクラスIgA、IgMまたはIgGのヒト免疫
    グロブリンと結合してその存在を表示できる標識受容体
    と混合して第２免疫反応混合物を形成する段階、 （ｇ） 形成された第２免疫反応混合物を生物検定条件
    下に、前記標識受容体が第１免疫反応体として存在する
    EA−Ｄに対するIgA、IgMまたはIgG抗体と第２免疫反応
    体を形成する十分な予定時間維持する段階、 （ｈ） 固体支持体を、第２免疫反応体として結合しな
    い標識受容体から分離する段階、および （ｉ） 第２免疫反応体として存在する標識受容体の
    量、それにより前記体液試料中に存在するIgA、IgMまた
    はIgG抗体の量を検定する段階、 を含む方法。
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