DK173262B1 - Syntetisk polypeptid og dets anvendelse til diagnosticering af Epstein-Barr-virus, syntetisk polypeptidoligomer og syntetis - Google Patents
Syntetisk polypeptid og dets anvendelse til diagnosticering af Epstein-Barr-virus, syntetisk polypeptidoligomer og syntetis Download PDFInfo
- Publication number
- DK173262B1 DK173262B1 DK198706388A DK638887A DK173262B1 DK 173262 B1 DK173262 B1 DK 173262B1 DK 198706388 A DK198706388 A DK 198706388A DK 638887 A DK638887 A DK 638887A DK 173262 B1 DK173262 B1 DK 173262B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- antibodies
- synthetic polypeptide
- immunoreactant
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 273
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 269
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 267
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 title abstract description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 101710134178 DNA polymerase processivity factor BMRF1 Proteins 0.000 claims description 72
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 69
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 69
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 38
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 24
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 13
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 40
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 18
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 9
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 8
- -1 amino acid ester Chemical class 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 WAAXYLYXYLKHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AALXZHPCKJILAZ-UHFFFAOYSA-N (4-propan-2-ylphenyl)methyl 2-hydroxybenzoate Chemical compound C1=CC(C(C)C)=CC=C1COC(=O)C1=CC=CC=C1O AALXZHPCKJILAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MRHPRDYMSACWSG-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-1-ol Chemical compound NCCC(N)O MRHPRDYMSACWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010026292 Epstein-Barr viral capsid antigen Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000009319 Keratoconjunctivitis Sicca Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000220010 Rhode Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N aminyl Chemical compound [NH2] MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 230000003460 anti-nuclear Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005250 beta ray Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical group C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-N ethanethioic S-acid Chemical compound CC(S)=O DUYAAUVXQSMXQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N l-leucine l-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000258 minor salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000379 polypropylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- KOODSCBKXPPKHE-UHFFFAOYSA-N propanethioic s-acid Chemical compound CCC(S)=O KOODSCBKXPPKHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920003051 synthetic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000005061 synthetic rubber Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
- C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polyamides (AREA)
Description
-1- DK 173262 B1
Den foreliggende opfindelse angår et syntetisk poly-peptid og dets anvendelse til diagnosticering af Epstein-Barr-virus, en syntetisk polypeptidoligomer og en syntetisk polypeptidpolymer, en analysefremgangsåde, et diagnosesystem 5 samt et podestof.
*
Epstein-Barr-viruset (EBV) er et yderst almindeligt miljøbestemt middel, som påvirker 80-100 procent af alle individer i hele verden. Det er dette middel, der forårsager infektiøs mononucleosis (IM) hos mennesker, og 10 EBV har også været impliceret i patogenese af Burkitt's lymphoma (BL), nasopharyngeal carcinoma (NPC) og B--lymfocytneoplasmer, som opstår i immunsupressive patienter. Udførlige beviser har også vist dette virus mulige rolle i forbindelse med humane autoimmune sygdomme, såsom 15 'rheumatoid arthritis og Sjogren's syndrom.
Den første eller primære EBV-injektion kan være akut eller sub-klinisk. Akut viral infektion fører til produktion af specifikke nucleare antigener (kaldet EBNA-I og EBNA-II), et "tidligt antigen"- (EA) -kompleks, virale cap-20 side antigener (VCA) og andre virus-associerede molekyler.
Dette efterfølges af en lang periode, i løbet af hvilken EBV-infektionen er latent i B-lymfocytter, som er til stede i blodcirkulationen, lymfekirtlerne, milten og spytkirtlerne.
25 En latent infektion er en sådan, hvori et virus er intracellulært til stede i ikke-udtrykt eller delvis udtrykt tilstand. Latente virale infektioner kan reaktiveres.
Selvom værtsfaktorerne, som kontrollerer den latente tilstand in vivo, er svææ at forstå, er der bevis for, at svigt 30 af én eller flere immunmekanismer er en vigtig faktor.
De serologiske og celle-formidlede immune responser, som følger primær infektion med EBV, er godt dokumenteret og reflekterer værtens respons over for de virale immunogene determinanter, som udtrykkes under en infektion. I forbin-35 delse med naturligt forekommende virale proteiner er immunogene determinanter de dele af et protein, som fremkalder antistof-respons, når hele det naturligt forekommende protein anvendes som immunogen. Disse immunogene determinanter menes
O
- 2 - DK 173262 B1 at være begrænset til nogle få loci på molekylet.
På den anden side defineres et område af et protein-molekyle, hvortil et antistof kan bindes, som en antigendeterminant. Påvisningen af virale antigene determinanter 5 i væv samt profilen af patientens respons over for virale immunogene determinanter bliver stadigt mere anvendelige i diagnosen af EBV-associerede sygdomme.
EA-komplekset er af særlig interesse, da antistoffer mod dette kompleks ofte er til stede i høje titere 10 i patienter med EBV-associerede sygdomme i forhold til latent inficerede, men ikke-syge kontrolgrupper. Dvs. at mennesker, som er akut inficerede med Epstein-Barr-virus (EBV) udvikler antistoffer mod et diffust tidligt antigen (EA-D). Således forsvinder anti-EA-D-antistoffer, 15 når viruset går ind i en latent fase, og vender ikke tilbage, medmindre viruset reaktiveres.
EA-komplekset vides nu at bestå af to tydelige proteinantigener, som kaldes diffus (D) og begrænset (R) baseret på fordelingen af immunofluorescent farvning 20 i EBV-inficerede celler.
Antistof mod EA-D forårsager diffus farvning af nucleus og cytoplasma i både acetone- og methanol- fikserede celler. I modsætning dertil er EA-R-farvningen begrænset til cytoplasmaet i acetone-fikserede celler 25 og er ikke til stede i methanol-fikserede celler.
Anti-EA-virkningen af sera af patienter med IM og NPC er primært rettet mod EA-D, hvorimod immunreaktiviteten i sera hos patienter med BL hovedsagelig er rettet mod EA-R. Derudover er antistoffer mod EA-kompleksét af betyd-30 ning hos patienter med EBV-associerede maligne sygdomme, da antistof-titere har tendens til at variere med forløbet af sygdommen.
Således er prøver for tilstedeværelsen af både EA-D
og anti-EA-D-antistoffer af betydning i adskillige almin-35 delige kliniske situationer .
DK 173262 B1
- 3 -O
Anti-EA-D-antistoffer er hidtil blevet bestemt ved anvendelse af EA-D-antigen fra EBV-inficerede celler. Immunofluorescens-teknikken, som er beskrevet af Henle med flere, Science, 169, 188-190 (1970) anvender 5 hel-cellepræparater uden nogen som helst rensning af antigenet. Anvendelsen af sådanne rå præparater resulterer - dog i falske positive resultater for patienter, hvis se rum også indeholder antistoffer mod pattedyr-nucleare og cytoplasmatiske antigener.
10 For nylig har Luka med flere, J. Immunol. Meth., 67, 145-156 (1984) beskrevet udviklingen af en enzymbundet immunsorbent prøve (ELISA) til anti-EA-D-anti-stoffer ved anvendelse af EA-D-mål-antigen, som er renset fra EBV-inficerede celler ved immunaffinitetschromatogra-15 fi. Selvom fremgangsmåden beskrevet af Luka med flere formindsker det falsk-positive problem, som er forbundet med anvendelsen af hel-cellepræparater, kræver det stadig fremstilling og håndtering af infektiøse materialer.
Det vil således være ønskeligt at udvikle forbedrede 20 reagenser og fremgangsmåder til analyse for tilstedeværel sen af EA-D- og anti-EA-D-antistoffer i en legemsprøve for at tillade diagnose af EBV-medvirken til sygdomme, samt diagnose af en sygdoms stadium, såsom infektiøs mono-nucleose (IM), og begrænse eller undgå behandling af infi-25 cerede cellekulturer.
Studier for nylig har vist, at kemisk syntetiserede polypeptider, som svarer til korte lineære segmenter af et proteins primære aminosyrerest-sekvens, kan anvendes til at inducere antistoffer, som immunreagerer med det 30 naturligt forekommende protein, jvf. Lerner med flere, Nature 299, 592 (1982) og Sutcliffe med flere, Science, 219, 260 (1983). Derudover har nogle studier vist, at syntetiske polypeptider kan immunreagere med antistoffer, som er induceret med naturligt forekommende proteiner. Rhodes med 35 flere, J. Immunol. 134, 211 (1985). Således kan nogle syn- DK 173262 B1
- 4 -O
tetiske polypeptider immunologisk antage lighed med de immunogene og antigene determinanter af naturligt forekommende proteiner.
Som det dog er kendt i teknikkeiv lider anvendel-5 sen af syntetisk peptidteknologi stadig adskillige mangler. P.eks. kræver identificeringen af peptider, som er i stand til at antage lighed med antigene determinanter på et naturligt forekommende protein, blandt andet kendskab til proteinets aminosyrerest-sekvens. Mens amino-10 syrerestsekvensen kan forudsiges ud fra nucleinsyre-sekvensen af genkodningen for proteinet, kan en sådan forudsigelse kun gennemføres, hvis den korrekte aflæsningsramme for genet er kendt.
Nucleinsyresekvensen af EBV-genomet har været kendt 15 siden udgivelsen af artiklen af Baer med flere, Nature, 310, 207 (1984) . Hverken EA-D-proteingenet eller dets aflæsningsramme har hidtil været identificeret med det vi-rale genom.
Desuden, selvom et proteins aminosyrerest-sekvens 20 er kendt, er fremgangsmåderne til identificering af de loci i proteinet, som udgør de immunogene og antigene determi- 1 nanter, af eksperimental art og giver ikke forudsigelige 2 resultater. Det er mindst to grunde til dette. For det første er der uden kendskab til et proteins tre-dimensio- 25 nelle struktur ingen pålidelig fremgangsmåde til bestemmelse af, hvilke lineære segmenter af proteinet, der giver adgang til værtens immunsystem. For det andet, uanset om den tre-dimensionelle struktur er kendt eller ej, synes korte lineære polypeptider ofte ikke at være i stand til 30 at antage lighed med de nødvendige sekundære og tertiære confdrme strukturer til dannelse af passende immunogene og antigene determinanter, Tainer med flere, Nature, 312, ~ 127 (1984).
En udførelsesform af den foreliggende opfindelse 35 bygger på et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig består 5 DK 173262 B1 af 13 til 40 aminosyrerester med aminosyrerest-sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet det syntetiske polypeptid har kapacitet til immunologisk at binde antistoffer, som er fremkaldt mod EA-D.
5 Et særligt foretrukket polypeptid har sekvensen, fra venstre til højre og i retning fra amino-terminus til carb-oxy-terminus, som er repræsenteret ved formlen
H-PARPETSPAIPS-OH
10
Opfindelsen angår endvidere en syntetisk polypep-tidoligomer, som er ejendommelig ved, at den indeholder op til ca. 40 aminosyrerester og omfatter flere forenede syntetiske polypeptid-gentagelsesenheder, som hovedsagelig 15 består af et polypeptid som defineret ovenfor, idet den oligomere har kapacitet til at binde antistoffer, som er fremkaldt af EA-D.
En yderligere udførelsesform af den foreliggende opfindelse bygger på en syntetisk polypeptidpolymer, som 20 indeholder en mængde åyntetiske polypeptid-gentagelsesen-heder, som ikke er fårenet med polypeptidbindinger, og som indeholder mere end ca. 100 aminosyrerester. Gentagelsesenhederne er syntetiske polypeptider, som beskrevet ovenfor.
25 Endnu en udførelsesform af dén foreliggende opfin delse bygger på en fremgangsmåde til bestemmelse af le-gemsvæskeprøver for tilstedeværelsen af antistoffer mod EA-D, og denne fremgangsmåde omfatter tilvejebringelse cif en 1egernsvæskeprøve, som skal analyseres, og et syntetisk 30 polypeptid, som beskrevet ovenfor. Legemsvæskeprøven og polypeptidet blandes til dannelse af en immunreaktionsblanding. Blandingen opbevares under biologiske analyseforhold i en forudbestemt periode, som er tilstrækkelig for alle eventuelle anti-EA-D-antistoffer, som er til stede 35 i prøven, til immunologisk at binde polypeptidet til dannelse af en immunreaktant. Tilstedeværelsen af en eventuel
O
- 6 - DK 173262 B1 immunoreaktant , som dannes i blandingen, bestemmes derpå.
En yderligere udførelsesfonn af den foreliggende opfindelse bygger på en fremgangsmåde til bestemmelse 5 af en legemsprøve for tilstedeværelsen af EA-D, hvor fremgangsmåden består i at tilvejebringe en legemsprøve, som skal analyseres, og biologisk aktive receptor-molekyler, som indeholder et antistof-forenende sted, som er induceret med et syntetisk polypeptid, som beskrevet 10 ovenfor. Legemsprøven blandes med receptorerne til dannelse af en immunreaktionsblanding. Blandingen opbevares under biologiske analysebetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til at ethvert EA-D, som er til stede i prøven, karr' bindes immunologisk af recepto-15 rerne til dannelse af en immunreaktant. Tilstedeværelsen af en eventuel immunreaktant, som dannes i blandingen, bestemmes således.
En yderligere udførelsesform af den foreliggende opfindelse bygger på et diagnosesystem til bestemmelse af : tilstedeværelsen af anti-EA-D-antistoffer i en legemsvæske- prøve. Systemet omfatter, fortrinsvis i adskilte beholdere, et syntetisk polypeptid, som beskrevet ovenfor, og et mærket specifikt bindemiddel til at vise immunreaktionen = af polypeptidet med anti-EA-D-antistoffer.
i 25
Endvidere bygges der på et podestof, som består af et syntetisk polypeptid, som beskrevet ovenfor, som er ' bundet til et bærestof og er dispergeret i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel.
Der bygges også på en receptor, som ophøjes til et 30 syntetisk polypeptid, som beskrevet ovenfor, hvor receptoren er i stand til at immunreagere med EA-D-proteinet.
I en anden udførelsesform bygger den foreliggende opfindelsen på en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af EA-D i en legemsprøve, fortrinsvis lyserede 35 perifere blodlymfocytter. Legemsprøven blandes med de DK 173262 B1 -Ί Ο ovennævnte receptorer til dannelse af en immunreaktions-blanding. Blandingen opbevares under biologiske analyse-betingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til at ethvert EA-D, som er til stede i prøven, kan 5 immunreagere med receptorerne til dannelse af en immunreaktant. Tilstedeværelsen af en eventuel immunreaktant, i som dannes i blandingen, bestemmes således.
En anden udførelsesform af den foreliggende opfindelse er et diagnosesystem til bestemmelse af tilstedevæ-10 reisen af EA-D i en legemsprøve. Systemet omfatter, fortrinsvis i adskilte beholdere, receptorer som beskrevet ovenfor, og et mærket specifikt bindemiddel til at vise immunreaktionen af receptorerne med EA-D-proteinet.
En fordel ved den foreliggende opfindelse er mulig-15 heden for at fremstille antigener og receptorer, som er beslægtede med EBV-EA-D, uden at arbejde med infektiøst materiale.
Den foreliggende opfindelse er også fordelagtig, fordi den tilvejebringer antigener og receptorer med høj 20 immunologisk specificitet, som i alt væsentligt er fri for falske positive resultater forårsaget af naturligt, forekommende nucleare og cytoplasmiske antigener.
En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at den giver tidlig opdagelse af en reaktiveret latent 2® EBV-infektion.
Yderligere fordele ved den foreliggende opfindelse vil for fagfolk tydeligt fremgå af den følgende beskrivelse.
Fig. 1 illustrerer den fuldstændige aminosyre-30 rest-sekvens af EA-D-proteinet, fra venstre til højre i retning af amino-terminus til carboxy-terminus, oversat fra ED-D-gennucleinsyresekvensen fEBV genome nucleic acid residues 79899-81110 beskrevet af Baer med flere, Nature, 310, 207 (1984)], ved anvendelse af forkortelser på ét 35 bogstav for aminosyrerester. Stederne med aminosyre-
O
- 8 - DK 173262 B1 restsekvenser af polypeptiderne, som anvendes i det foreliggende eksempel, er angivet ved kortstreg-linjer under sekvensen, idet terminalrester angives med "+" direkte under terminalresterne. Kort-5 streglinjerne er afbrudt af betegnelserne K5, K6, K7, K8 og K9, som anvendes i den foreliggende beskrivelse til henvisning til disse polypeptider.
Fig. 2 indeholder tre grafer, som illustrerer resultaterne af analysen for henholdsvis anti-EA-D-IgM-, 10 -igG- og -IgA-antistoffer i sera fra normale individer (normal) og infektiøs mononucleose-patienter (akut IM) ved anvendelse af anti-EA-D-antistof-ELISA med polypep-tid K7 som fast fasemål, som beskrevet i eksempel 5. Serumprøver fås fra 44 patienter med akut IM (udfyldte søjler) 15 og fra 194 sunde normale individer (åbne søjler, deriblandt 40, som ikke tidligere har været underkastet EBV-(VCA-).
Den optiske densitet ved 490 nanometer (nm) (OD 490), som fås ved hver enkelt prøve i analysen rundes op eller ned til den nærmeste tiendedel og er abscissen i hver 20 graf. Hver søjle repræsenterer antallet af prøver, som producerer det angivne OD 490.
Dataene for panel A viser, at hyppigheden af IgM-antistof-immunologisk binding (immunreaktant-dannelse) til EA-D-epitoper, som polypeptid K7 antager lighed med, 25 er større hos akutte IM-patienter end hos normale individer. Dataene for panel B og C viser lignende resultater for henholdsvis IgG- og IgA-antistof-responser.
Fig. 3 er et histogram, som illustrerer resultaterne, som opnås ved anvendelse af polypeptid K7 ELISA fra ek-30 sempel 5 til analyse af sera fra patienter med nasopharyngeal carcinom (NPC), Sjogren's syndrom (SS), cytomegalovirus-(CMV) -infektion og normale donorer. Mængden af anti-EA-D-anti-stof i hver serumprøve, som immunreagerer med polypeptid K7 udtrykkes som en OD 490-værdi og er angivet ved en prik 35 på histogrammet.
O
- 9 - DK 173262 B1
Fig. 4 indeholder to grafpaneler, som illustrerer resultaterne af analysen af serie-serumprøver fra 4 patienter med akut IM for anti-EA-D-antistoffer ved anvendelse af anti-EA-D-antistof ELISA med polypeptid K7 som 5 fast fasemål, som beskrevet i eksempel 5. Data fra hver patients sera er angivet med forskellige symboler, og det samme symbol anvendes for den samme patient i hvert grafpanel. Dataene i panel A illustrerer, at anti-EA-D-IgM-antistoffer kan spores i IM-patienter én uge efter 10 indtræden af de første symptomer. Dataene i panel B illustrerer bekræftelsen af IM-diagnose i de samme patienter ved at påvise forøgelsen af anti-EBNA-l-antistoffer i serumprøverne ved anvendelse af anti-EBNA-l-ELISA, som er beskrevet i Rhodes med flere, J. Immunol., 134, 211 15 (1985).
Fig. 5 indeholder to grafpaneler, som viser virkningen af serurafortynding og polypeptidkoncentration på resultater, som opnås med anti-EA-D-IgM-antistof ELISA ved anvendelse af K7 som fastfasemål.
20 Dataene i panel A illustrerer virkningen ved at variere mængden af K7-polypeptid, som er fastgjort til mikroti-terpladehullerne, på anti-EA-D-antistof-ELISA’s evne til at analysere anti-EA-D-IgM-antistoffer i serumprøver fra IM-patienter (IM; og normale individer, hvis sera er fri 25 for antistoffer mod EBV-capsidproteinantigener (VCA-) og patienter, hvis sera indeholder antistoffer mod de antigener (VCAW). Mikrotiterpladehullerne ovettrækkes med polypeptid K7, som er beskrevet i eksempel 5, bortset fra at koncentrationerne af den polypeptid K7-indeholdende opløs-30 ning, som anvendes til at fastgøre K7 til hullernes vægge varierer, som vist i mikrogram pr. milliliter (pg/ml;. De afprøvede sera fortyndes alle 1:20, før de anvendes.
Dataene i panel B illustrerer virkningen af serumfortynding på sporing af humane igM-antistoffer, som immun-35 reagerer med syntetisk polypeptid K7. Mikrotiterpladehul- væggene overtrækkes med K7 ved anvendelse af en 10 pg/ml opløsning, som beskrevet i eksempel 5. Sera fra patienter * DK 173262 B1 - 10 - o med IM, NPC og SS samt fra VCA-- og VCA+-normalé individer analyseres derpå i anti-EA-D ELISA ved de viste fortyndinger.
Udtrykket "antistof" betyder et molekyle, som er 5 medlem af en familie af glycosylerede proteiner kaldet immungiobuliner, som specifikt kan forenes med et antigen.
Udtrykket "antistof-forenende sted” betyder den strukturelle del af et antistofmolekyle, som består af 10 tunge og lette kædevariable regioner, som specifikt binder antigen.
Udtrykket "antigen" har været anvendt historisk for at betegne en-nelhed, som bindes af et antistof, og også for at betegne helheden, som forårsager produktionen af 15 antistof. Mere aktuel anvendelse begrænser betydningen af antigen til helheden, som er bundet af et antistof, hvorimod udtrykket "immunogen" anvendes for helheden, som forårsager antistofproduktion. Når en helhed, som beskrives i den foreliggende opfindelse, er både immunogen og 20 antigen, kaldes den generelt et antigen.
"Antigen-determinant" betyder den reelle strukturelle del af antigenet, som immunologisk er bundet med et antistof-forenende sted. Udtrykket anvendes også vekslende med "epitop".
25 Udtrykker "antigent beslægtede varianter" anvendes i den foreliggende beskrivelse til at betegne polypeptider af varierende almindelig aminosyrerest-sekvens, som - deler mindst en del af en antigendeterminant og derfor er immunologisk krydsreaktive. Det vil sige, at polypeptid-30 sekvenser af antigent beslægtede varianter er forskellige, men antistoffer, som produceres til hver variant, immunre-agerer med hinanden.
Udtrykket "biologisk aktive" betyder i det mindste en receptors evne til i det mindste specifikt at binde en 35 passende ligand, selvom anden generel eller effektor-mulighed kan være til stede.
i - 11 - DK 173262 B1 o
Udtrykket "kompleks", som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betyder produktet, som dannes, når et specifikt bindemiddel bindes til en målligand. Eksempler på komplekser er immunreaktanter, prdtein A bundet til 5 et antistof eller lignende.
Udtrykket "bevarende substitution", som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betyder, at én amino-syrerest er blevet udskiftet med en anden, biologisk lignende rest. Eksempler på bevarende substitutioner omfatter sub-10 stitution af en hydrophob rest, såsan isoleucin, val in, leucin eller methio-nin, for en anden eller substitution af én polær rest med en anden, såsom mellem arginin og lys in, mellem glutaminsyre og asparaginsyre, eller mellem glutamin og asparagin og lignende. Udtrykket "bevarende substitution" omfatter også anvendelsen af en substitueret aminosyre i stedet for en usubstitu-15 eret stamaminosyre, forudsat at antistoffer, som danne.-, mod et sådant poly-oeptid, også irmunreagerer med det tilsvarende. pQlypeptjd med den usub-stituerede aminosyre.
Udtrykket "svarer til" i de forskellige grammatiske former, som det anvendes i forbindelse med peptidsekvenser, 20 betyder den beskrevne peptid.=ekvens plus eller minus op til tre aminosyrerester ved den ene eller begge amino- og car-boxytermini og indeholdende kun bevarende substitutioner i særlige aminosyrerester langs polypeptidsekvensen.
"ELISA" betyder en enzym-bundet iramunsorbent-analyse, 25 hvor der anvendes et antistof eller antigen, som er bundet til en fast fase og et enzym-antigen eller enzym-antistof-conjugat til påvisning og bestemmelse af mængden af antigen eller antistof, som er til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-teknikken findes i kap. 22 i 4. udgave af Basic and 30 Clinical Immunology af D.P. Sites med flere, udgivet af
Lange Medical Publications of Los Altos, CA i 1982 og i USA--patentskrifter nr. 3.654.090, nr. 3.850.752 og nr. 4.016.043, hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse.
35 f - 12 -
O
DK 173262 B1 "Enzym" betyder et protein, som er i stand til ved katalytisk aktion at accelerere eller producere forandringer i et substrat, for hvilket det ofte er specifikt.
"Epitop" betyder den del af molekylet, som er 5 specifikt bundet af et antistof-forenende sted til dannelse af en immunreaktant. Det betyder også determinanten eller antigendeterminanten.
Udtrykket "immunologisk antager lighed med" anvendes i den foreliggende beskrivelse med den betydning, at et po-10 lypeptid ifølge opfindelsen kan : 1) være immunologisk bundet med antistoffer, som er forårsaget af et naturligt forekommende protein; og 2) fremkaldelse af produktion af antistoffer, som binder til det fremkaldte polypeptid og også til det naturligt forekommende protein.
15 Udtrykket "immunreagere" i de forskellige former be tyder binding mellem et antigen som ligand og et molekyle, som indeholder et antistof-forenende sted, såsom en del af eller et helt antistof som receptoren.
"Immunreaktant", som det anvendes i den foreliggende 20 beskrivelse, betyder produktet af en immunologisk reaktion, dvs. den helhed, der fås, når en ligand er immunologisk bun-; det af et receptormolekyle.
Udtrykkene "mærke-midler", "indikatorgruppe" eller "mærke" anvendes vekslende i den foreliggende beskrivelse 25 og betyder enkelte atomer eller molekyler, som enten direkte eller indirekte er involveret i produktionen af et påviseligt signal til indikation af tilstedeværelsen af en immun reaktant. Enhvert mærke-middel kan kædes til eller inkorporeres i en receptor eller anvendes separat, og de 30 atomer eller molekyler kan anvendes alene eller sammen med yderligere reagenser. Sådanne indikationsgrupper eller mærker er i sig selv velkendte i immunkemien og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse, såfremt de anvendes sammen med på anden måde nye receptorer, metoder og/eller 35 systemer.
"Ligand" betyder et molekyle, som indeholder en — 1 - 13 -
O
DK 173262 B1 strukturdel, som er bundet af en specifik receptor.
Udtrykkene "peptid" og "polypeptid" anvendes vekslende i den foreliggende beskrivelse for en kendt sekvens af aminosyrer ester, som er kæde't sammen af peptidbindin-5 ger.
Udtrykket "farmaceutisk acceptable salte", som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betyder et ikke-toksisk alkalimetal, jordalkalimetal og ammoniumsalte, som anvendes i den farmaceutiske industri, omfattende natrium-, 10 kalium-, lithium-, calcium-, magnesium- og ammoniumsalte og .lignende, som fremstilles ved fremgangsmåder, som er velkendte i teknikken. Udtrykket omfatter også ikke-toksiske syreadditionssalte, som generelt fremstilles ved at omsætte de her omhandlede forbindelser med en egnet organisk eller 15 uorganisk syre.
Repræsentative salte omfatter hydrochlorid, hydrobro-mid, sulfat, bisulfat, acetat, oxalat, valerat, oleat, lau-rat, vorat, benzoat, lactat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat og lignende.
20 Udtrykket "receptor", som det anvendes i den fore liggende beskrivelse, angiver et biologisk aktivt molekyle, som er omfattet af et antistof-forenende sted, som immunologisk bindes til (eller'med) et antigen. En sådan binding forekommer typisk med en affinitet på ca. 105 til ca. 1010 25 liter pr. mol og er en specifik gensidig påvirkning af epitopen af antigenet med det ahtistof-forenende sted i receptoren.
Biologisk virkning af receptormolekylet påvises ved immunologisk omsætning af receptoren med dets antigen-30 ligand efter blanding af disse i et vandigt medium til dannelse af en immunreaktant, mind.-t ved fysiologiske pH-vær-dier og ionstyrker.. -Biologisk yirknthg' finder' fortrinsvis sted under biologiske analyseforhold, dvs. sådanne, hvori de her omhandlede receptorer bindes til antigenliganden 35 inden for et pH-værdiområde på fra ca. 5 til ca. 9, og ved DK 173262 B1 - 14 -o og ved ionstyrker, f.eks. fra den for destilleret vand til den for ca. 1 molært natriumchlorid.
Receptorer er omfattet af et antistof-forenende sted, som kan binde specifikt til antigenet. Receptorer om-5 fatter Fab-, Fab'-, F(ab')2~ og F(v) -polypeptiddelene af antistoffer samt antistoffer og i alt væsentligt hele antistoffer. Fab- og F(ab’)2-dele af antistoffer er velkendte i teknikken og fremstilles ved proteolytisk omsætning af henholdsvis papain og pepsin, på hovedsagelig in-10 takte antistoffer ved fremgangsmåder, som er velkendte.
Se f.eks. USA-patentskrift nr. 4.342.566 til Theofilopolous og Dixon. Fab’-antistofdele er også velkendte og fremstilles fra F(ab’)2”dele efterfulgt af reduktion af disulfid-bindinger, som sammenkæder de to tunge kædedele^ ligesom med 15 mercaptoethanol, og derpå alkylering af den opnåede protein-mercaptan med reagens, såsom iodacetamid. Der foretrækkes intakte, hele antistoffer, og disse anvendes illustrativt for de monoklonale eller andre receptormolekyler ifølge opfindelsen.
20 Udtrykkene "sekret" og "produkt" anvendes ofte veks lende i teknikken for celler, hvorfra antistofmolekyler fås. Celler, som producerer antistoffer kan dog ikke afsondre disse molekyler i deres omgivelser. Hybridomceller af interesse i den foreliggende opfindelse afsondrer mono-25 klonale antistoffer i deres omgivelser, ikke desto mindre kaldes sådanne celler ofte "antistof-producerende" celler, og deres antistoffer siges at være "produceret" for at anvende de i teknikken anvendte udtryk.
Odtrykket "syntetisk", som det anvendes i den fore-30 liggende beskrivelse, betyder at polypeptidmolekyle- eller polypeptid-gentagelsesenheden er opbygget på kemisk måde; dvs. kemisk syntetiseret, fremfor at være fremstillet på biologisk måde; ligesom ved genetiske manipulationsteknikker. Således er de her omhandlede syntetiske polypeptider fri 35 for naturligt forekommende proteiner og fragmenter deraf.
DK 173262 B1 15
Et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen består hovedsagelig af 13 til 40 aminosyrerester, og mere foretrukket 13 til 24 rester, med aminosyrerest-sekvensen PARPETPSPAIPS-. Det syntetiske polypeptid har kapacitet til 5 immunologisk at binde antistoffer, som er fremkaldt af ÉA-D.
Ved en foretrukken udførelsesform er polypeptidet, når det kædes til en iiftmunogen bærer, såsom nøglehuls-alhueskæl--hæmocyanin som et konjugat og tilsat i effektiv mængde i et vandigt fortyndingsmiddel til et værtspattedyr, såsom 10 en rotte, mus, kanin eller et marsvin, i stand til at fremkalde sekretion af antistoffer, som ikke kun immunreage-rer med polypeptidet af konjugatet, men også immunreagerer med EA-D i den denaturerede form. Mest foretrukket immunreagerer disse inducerede antistoffer yderligere med EA-D i 15 den naturligt forekommendé form. Sålelédes kan et poly- peptid ifølge opfindelsen, ved en foretrukken udførelsesform, immunologisk antage lighed med immunogene og antigene determinanter af det naturligt forekommende EA-D-protein.
Et eksempel på EA-D i dets naturligt forekommende 20 form er proteinet, som det findes i legemsvæsker, såsom blodplasma i patienter med akut IM. Et eksempel på EA-D i den denaturerede form er det protein, som efter reduktion med 2-mercaptoethanol anvendes i SDS-PAGE- og western blotting-analyse.
25 Foretrukne aminosyrerest-sekvenser omfatter sekvensen, taget fra venstre til højre og i retning af amino-terminus til carboxy-terminus, som er repræsenteret ved formlen -PARPETPSPAIPS-; 30 farmaceutisk acceptable salte deraf og antigent beslægtede varianter deraf.
35 16 DK 173262 B1
Det bemærkes, at en streg i begyndelsen eller slutningen af en aminosyrerest-sekvens angiver en binding til et radikal, såsom H og OH, ved henholdsvis amino- og og carboxy-terminiene, eller en yderligere sekvens af én 5 eller flere aminosyrerester op til ialt fyrre aminosyre-rester i polypeptidkæden.
Det bemærkes endvidere, at sekvensen af aminosyrerester-ne, som kan være til stede i polypeptidet ud over aminosyre-rest-sekvensen PARPETPSPAIPS-, kan være irrelevant, for så 10 vidt polypeptidets væsentlige egenskab ved den immunologiske binding til antistoffer, som er fremkaldt af EA-D, ikke er væsentligt forringet. Mere foretrukket er den karakteristiske immunogenicitet til fremkaldelse af antistoffer, som immun-reagerer med polypeptidet og mindst denatureret EA-D, som 15 allerede beskrevet, heller ikke væsentligt forringet.
Mest foretrukket består polypeptidet hovedsagelig af én eller flere aminosyrerest-sekvenser, som er identiske med de ovennævnte stillinger for EA-D-proteinmolekylet. Disse mest foretrukne polypeptider, som indeholder en mængde amino-20 syrerest-sekvenser, som er identiske med en sekvens af EA-D, som allerede beskrevet, hører til en gruppe af forbindelser, som i den foreliggende beskrivelse kaldes "polypeptidoli-gomere", og disse beskrives herefter.
Et særlig foretrukket polypeptid har en aminosyre-25 rest-sekvens, som svarer til sekvensen, taget fra venstre til højre og i retning fra amino-terminus til carboxy-terminus, som er repræsenteret ved formlen:
H-PARPETPSPAIPS-OH
: 30 farmaceutisk acceptable salte deraf og antigent beslægtede varianter deraf.
Som det fremgår af fig. 1 har polypeptidet en amlno-syrerest-sekvens, som er identisk med den for stillingerne 35 fra 350 til 362 for EA-D, baseret på den af Baer med flere I beskrevne genome sekvens.
- 17 -
O
DK 173262 B1
Et polypeptid ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved enhver af teknikkerne, som er kendte for fagfolk inden for polypeptid-teknikken. Et fremragende sammendrag af de mange teknikker, som således er tilgængelige, findes i 5 J.M. Steward og J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides”, bind 2, s. 46, Academic Press (New York), 1973 for fastfase-peptidsyntesej og E. Schroder og K. Kubke, "The Peptides", bind 1, Academic 10 Press (New York), 1965 for klassisk opløsningssyntese.
Generelt omfatter disse fremgangsmåder sekvenstilsætningen af én eller flere aminosyrer eller passende beskyttede aminosyrer til en voksénde peptidkæde. Normalt beskyttes enten amino- eller carboxylgruppen af den første 15 aminosyrerest med en egnet, selektivt fraskillelig beskyttelsesgruppe. En anden, selektivt fraskillelig beskyttelsesgruppe anvendes til aminosyrer, som indeholder en reaktiv sidegruppe, såsom lysin.
Ved anvendelse af f.eks. en fastfasesvntese. er den 20 beskyttede eller derivatiserede aminosvre knyttet til en indifferent fast støtte crennem dets ubeskyttede carboxvl-eller aminoaruDoe. BeskvttelsesaruDoen for amino- eller car-boxvlcruooen fnernes deroå selektivt, oa den næste aminosvre i sekvensen med den komolementære (amino- eller carboxvl-) 25 aruooe, som er nassende beskyttet, blandes oa omsættes under betinaelser. som er eanede til dannelse af amid-sammenkædnin-aen med resten, som allerede er knvttet til den faste støtte. Beskvttelsesaruooen for amino- eller carboxylgruppen fjernes derpå fra dens nétop tilsatte aminosyrerest, oq den næste 30 aminosyre (passende beskyttet) tilsættes derpå, osv. Efter at alle de ønskede aminosyrer er kædet sammen i den passende sekvens, fjernes enhver resterende ende- og sidegruppe- beskyttende gruppe (og fast støtte) sekventielt eller samtidigt, til dannelse af det endelige polypeptid.
35
O
- 18 - DK 173262 B1
Alle aminosyrerester, som er angivet i den foreliggende beskrivelse, er naturligt forekommende i L-konfi-gurationen. Overensstemmende med standard polypeptid-nomenklatur, [J. Biol. Chem., 243, 3557-59 (1969)] er for-5 korteiser for aminosyrerester vist i den følgende fortegnelse:
FORTEGNELSE
10 Symbol_ aminosyre 1-bogstavs 3-bogstavs Y Tyr L-tyrosin G Gly L-glycin F Phe L-phenylalanin 15 M Met L-methionin A Ala L-alanin S Ser L-serin I Ile L-isoleucin L Leu L-leucin 20 T Thr L-threonin V Val L-valin P Pro L-prolin K Lys L-lysin H His L-histidin 25 Q Gin L-glutamin E Glu L-glutaminsyre Z Glx L-glutaminsyre eller L-qlutamin 30 W Trp L-trvptophan R Arg L-arginln D Asp L-asparaqinsvre N Asn L-asparagin B Asx L-asparaginsyre eller L-asparagln C Cys L-cystein 35 19 DK 173262 B1 C. Polypeptidoligomere
Den foreliggende opfindelse omhandler også en syntetisk polypeptidoligomer, som indeholder en mængde sammenkædede syntetiske polypeptid-gen tagel sesenheder,· hvori 5 mindst to af gentagelsesenhederne er polypeptider ifølge opfindelsen, som allerede omtalt. Sådan en oligomer indeholder op til ca. 40 aminosyrerester, og mere foretrukket 25 til 40 rester. De enkelte gentagelsesenheder kan være 13 til 34 rester i længder, hvor to polypeptidgentagelsesenheder er 10 til stede. Som allerede nævnt, er alle gentagelsesenhederne mere foretrukket ikke kun polypeptider ifølge opfindelsen, men polypeptider, hvis aminosyrerest-sekvenser er identiske med sekvensen af EA-D.
En polypeptid-oligomer ifølge opfindelsen er også 15 ejendommelig ved, at den har evnen til immunologisk at binde antistoffer, som er forårsaget af EA-D.
Mere foretrukket er en polypeptid-oligomer yderligere ejendommelig ved, at den, når den er kædet til en immunogen bærer, såsom KLH, og i et vandigt .fortyndingsmiddel indføres 20 i et værtspattedyr, som beskrevet ovenfor, forårsager sekretion af antistoffer, som immunologisk bindes til EA-D.
En særlig foretrukken polypeptid-oligomer indeholder en mængde særlig foretrukne syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen med aminosyrerest-sekvenser, fra venstre til 25 højre i retning fra aminoterminus til carboxy-terminus, som er repræsenteret ved formlen: -PARPETPSPAIPS-.
30 Ved anvendelse af tre-bogstavs-forkortelser i forteg nelsen, kan det ovennævnte polypeptid også være repræsenteret ved formlen: -ProAlaArgProGluThrProSerProAlalleProSer-.
% 35 - 20 -
O
DK 173262 B1 Således er de her omhandlede oligomere polypeptider, ligesom deres polypeptidbestanddele, antigene over for humane anti-EA-D-antistoffer og er mere foretrukket immunogene, som beskrevet ovenfor. Disse oligomere polypeptider 5 kan derfor anvendes til at fremkalde produktion af anti--EA-D-antistoffer, som er anvendelige i de følgende diagnosemetoder og -systemer, og kan også anvendes som et antigen i passende diagnosemetoder og -systemer.
Oligomere, som indeholder færre end ca. 35 aminosyre-10 rester i hele det oligomere polypeptid er typisk kædet til en Immunogen bærer, såsom KLH, til anvendelse som immunogen. De oligomere polypeptider, som indeholder mere end i alt ca. 35 aminosyrerester, er typisk tilstrækkelig immunogene til anvendelse uden en bærer.
15 Et oligomert polypeptid kan fremstilles ved at sammen- binde de syntetiserede polypeptidmonomere på en hoved-til-hale-måde ved anvendelse af den førnævnte fastfasernetode, dvs. at én fuldstændig polypeptidsekvens kan syntetiseres på harpikset, efterfulgt af én eller flere ens eller forskel-20 lige pojypeptid-sekvenser, idet hele den oligomere enhed derefter er spaltet fra harpikset og anvendt som beskrevet.
1 Sådanne hoved-til-hale-polypeptidmultimere indeholder for trinsvis ca. 2 til ca. 5 polypeptid-gentagels^senheder.
Alternativt kan pojypeptidoligomere fremstilles som en 25 polymer af syntetiske polypeptider anvendt som monomere, dvs. gentagelsesenheder som de nedenfor detaljeret beskrevne.
^ Eksempler på termineringsmidler til et sådant formål er 2-mercaptoethanol, thioglycolsyre og thiopropionsyre.
D. Polypeptidpolymere 30 Som det anvendes i den foreliggende beskrivelse be tyder udtrykket "polypeptidpolymer" i dets forskellige grammatiske former, et molekyle, som indeholder en mængde syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen som gentagelsesenheder. De polypeptid-gentagelsesenheder er ikke sammenkædet 35 med polypeptidbindinger, og den polymere omfatter mere end ca. 100 aminosyrerester. Således har en polymer ifølge opfin- i - 21 -
O
DK 173262 B1 delsen en tilsyneladende molekylmasse, M^, på ca. 10.000 eller mere, så længe den er dispergerbar i en vandig sammensætning ved en pH-værdi på ca. 5 til ca. 9, og fortrinsvis vedca. pH 6,5 til ca. 7,5. Polypeptid-gentagelsesenheder-5 ne kan være ens eller forskellige og kan omfatte én eller flere yderligere sekvenser, som ikke er en aminosyrerest-sekvens ifølqe opfindelsen, så lænqe der ikke er noget yderligere polypeptid, som er til stede i den polymere, som på væsentlig måde forstyrrer eller på anden måde 10 inhiberer immunreaktionen af antistoffer, som er forårsaget af EA-D med den polymere, dvs. forstyrrer antigenici-teten af den polymere. Tilstedeværelsen af et polypeptid i den polymere, som ikke er et ifølge opfindelsen, inhiberer i alt væsentligt heller ikke immunogeniciteten af den poly-15 mere.
Polypeptidpolymere (syntetiske multimere) har typisk fordelen af forøget immunogenicitet og antigenicitet. Desuden er det typisk ikke nødvendigt med en bærer, når der anvendes et polymert immunogen. Når der anvendes forskellige 20 polypeptidmonomere til at udgøre den polymere, opnås evnen til at immunreagere med antistoffer over for adskillige EA-D-antigendeterminanter. Endnu en fordel er en sådan polymers evne, når den anvendes i et podestof, til at frembringe antistoffer, som immunreagerer med adskillige antigen-25 determinanter af EA-D.
En polymer ifølge opfindelsen kan syntetiseres ved anvendelse af de her omhandlede polypeptidmonomere, som indeholder tilsatte cysteinrester ved både amino- og carboxy-termini (diCys-polypeptid). De diCys-polypeptidmonomere kan 30 bindes sammen med intramolekylære, interpolypeptid-cystein-disulfidbindinger ved anvendelse af en oxidationsmetode til dannelse af en immunogen, antigen polymer. Den polypeptidpolymere, der således fås, indeholder en mængde syntetiske polypeptider følge opfindelsen som gentagelsesenheder. De 35 gentagelsesenheder er bundet sammen med de ovennævnte oxiderede cystein- Tcystin-) -rester.
O
- 22 - DK 173262 B1
Tilstedeværelsen af én eller to ende-Cys-rester i et polypeptid ifølge opfindelsen med det formål at binde polypeptidet til en bærer eller til fremstilling af en polypeptidpolymer skal ikke forstås som en ændring af 5 aminosyrerest-sekvensen af et polypeptid ifølge opfindelsen.
En særlig foretrukket polypeptidpolymer indeholder en mængde af de særlig foretrukne syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen med aminosyrerest-sekvensen, fra venstre 10 til højre og i retning fra aminoterminus til carboxy-ter-minus, som er repræsenteret ved formlen -- -PARPETPSPAIPS-.
15 Således er de her omhandlede syntetiske multimere polypeptider, ligesom bestanddelene polypeptider, antigene over for humane anti-EA-D-antistoffer og mere foretrukket er immunogene som anført ovenfor. De syntetiske multimere polypeptider kan derfor anvendes til tilveje- 20 bringelse af produktion af anti-EA-D-antistoffer, som er anvendelige ved dé i det følgende beskrevne diagnosemetoder og -systemer og kan også anvendes som et antigen i passende diagnoseteknikker og -systemer.
5 25 E. Podestoffer
Ved en anden udførelsesform anvendes et polypeptid ifølge opfindelsen i et farmaceutisk acceptabelt vandigt fortyndingsmiddel til dannelse af et podestof, som, når det indgives i en effektiv mængde, kan frembringe antistof-30 fer, som immunreagerer med EA-D.
Udtrykket "podestof" i dets forskellige grammatiske former anvendes i den foreliggende beskrivelse til at beskrive sammensætninger, som indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen som en aktiv bestanddel anvendt til fremstil-35 ling af antistoffer mod EA-D. Når et polypeptid anvendes - 23 -
O
DK 173262 B1 til at frembringe antistoffer, skal det forstås, at poly-peptidet kan anvendes, bundet til en immunogen bærer, som et oligomert polypeptid, som er frit eller bundet til en bærer som et kbnjugat, eller som en polypeptidpolymer, 5 men for at gøre det lettere kaldes de forskellige udførelsesformer af polypeptiderne ifølge opfindelsen allesammen "polypeptid", og dets forskellige grammatiske former.
For polypeptider, som indeholder mindre end ca. 35 aminosyrerester, foretrækkes det at anvende en immunogen 10 bærer for at frembringe produktionen af antistoffer, som allerede beskrevet.
Som også allerede beskrevet kan én eller flere yderligere aminosyrerester sættes til amino- eller carboxy--termini af det syntetiske polypeptid for at hjælpe til at 15 binde polypeptidet til en bærer. Cysteinrester, som føjes til amino- eller carboxy-termini af det syntetiske polypeptid, har vist sig at være særlig anvendelige til dannelse af polymere via disulfidbindinger. Der kan dog også anvendes andre fra teknikken velkendte fremgangsmåder til fremstil-20 ling af konjugater. Eksempler på yderligere bindemetoder omfatter anvendelse af Michael-additionsreaktionsprodukter, di-aldehyder, såsom glutaraldehyd. Klipstein med flere, J. Infect. Dis., 147, 318326 (1983) og lignende, eller anvendelse af carbodiimidteknologi, ligesom ved anvendelse af et 25 vandopløseligt carbodiimid til dannelse af amidbindinger til immunogenbæreren, ligesom ovenfor beskrevet til binding af en mængde polypeptider til dannelse af en syntetisk mul-timer.
Anvendelige immunogene bærere er velkendte fra tek-30 nikken og er sædvanligvis selv proteiner. Eksempler på sådanne bærere er nøglehuls-albueskæl-hæmocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer, såsom.okse-serumalbumin (BSA) eller humant serumalbumin (HSA), røde blodceller, såsom fåre-erythrocytter (SRBC), tetanus-toxoid, cholera-toxoid samt polyaminosyrer, såsom poly-TD-lysin: D-glutaminsyre) og lignende.
O
DK 173262 B1 - 24 - r Som det også er velkendt fra teknikken, er det ofte fordelagtigt at binde et syntetisk polypeptid til dets bærer ved hjælp af en mellembindegruppe. Som allerede nævnt, er glutaraldehyd <?n sådan bindegruppe. Når der anvendes 5 cystein,er mellembindegruppen dog fortrinsvis et m-maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS), som det anvendes i den foreliggende beskrivelse.
Desuden kan MBS først sættes til bæreren ved en ester-amid-udskiftningsreaktion, som beskrevet af Liu med 10 flere, Biochem., 8J), 690 (1979).
Derpå kan tilsætningen efterfølges af tilsætning af en blokeret mercaptogruppe, såsom thioleddikesyre (CH^COSH) hen over maleimido-dobbeltbindingen. Efter spaltning af acyl-blokeringsgruppen dannes der en disulfidbinding mellem mercap-15 tangruppen i den afblokerede bindegruppe og mercaptanen i den tilføjede cysteinrest i det syntetiske polypeptid.
Valg af bærer er mere afhængig af den endelige anvendelse af immunogenet end af den determinante del af immuno-genet og er baseret på kriterier, som ikke er nærmere be- 20 skrevet i den foreliggende opfindelse. F.eks. bør der udvælges en bærer, som ikke fremkalder en uheldig reaktion i det særlige ikke-humane værts- (modtager-) -dyr.
Det foreliggende podestof indeholder en effektiv, immunogen mængde af'et polypeptid ifølge den foreliggende 25 opfindelse, som et oligomert polypeptid eller som en poly- peptidpolymer af individuelle polypeptider, som er bundet sammen ved oxiderede, polypeptid-endecysteinrester eller som et konjugat, som er bundet til en bærer. Den effektive mængde polypeptid pr. enhedsdosis afhænger blandt andet af 30 - arten af dyret, som podes, dyrets legemsvægt og det valgte podningssystem, som det er velkendt fra teknikken. Podestoffer indeholder sædvanligvis polypeptidkoncentrationer på ca. 10 mikrogram til ca. 500 milligram pr. podning (dosis). De an- J givne mængder polypeptid angiver polypeptidets vægt uden væg- 35 ten af en bærer, når der anvendes en bærer. I det følgende
O
- 25 - DK 173262 B1 beskrives nærmere podestoffer, idet der angives vægt af bærer plus polypeptid (konjugat).
Udtrykket "enhedsdosis" angivet de fysisk adskilte enheder, som er egnede som enhedsdoser til dyr, idet hver 5 enhed indeholder en forudbestemt mængde aktivt materiale, som er beregnet til at fremkalde den ønskede terapeutiske virkning sammen med det nødvendige fortyndingsmiddel, dvs. bærer eller hjælpestof. Specifikationerne for den nye enhedsdosis ifølge opfindelsen er dikteret af og direkte af-10 hængig af (a) det aktive materiales enestående egenskaber og den særlige immunologe virkning, som skal opnås, og (b) begrænsningerne inden for teknikken for sammensætning af sådant aktivt materiale til immunologisk brug i dyr, som nærmere beskrevet i beskrivelsen, hvilket er karakte-15 ristiske træk ved den foreliggende opfindelse.
Podestoffer fremstilles typisk ud fra det tørrede faste pblypeptid-konjugat, oligomert polypeptid eller polypeptide o lymer ved at dispergere polypeptid-konjugatet eller den polypéptidpolymere i et fysiologisk acceptabelt 20
Tortyndingsmiddel,. såsom vand, saltopløsning, fosfat-puf ret saltopløsning og lignende, ligesom det er velkendt ved dannelse af en vandig sammensætning.
Podestoffer kan også omfatte et hjælpestof som del af fortyndingsmidlet. Hjælpestoffer, såsom komplet Freund's 25 hjælpestof (CFA), ukomplet Freund's hjælpestof (IFA) og alun er materialer, som er velkendte i teknikken og er kommercielt tilgængelige fra adskillige kilder.
F. Receptorer 30
Antistoffer og i alt væsentligt hele antistoffer, som er fremkaldt af (dannet mod) polypeptjder ifølge opfindelsen, samt antistof-forenende steder fremstillet ud fra sådanne antistoffer udgør en yderligere udførelsesform af den foreliggende opfindelse. Disse molekyler kaldes i den 35 foreliggende beskrivelse alle receptorer. Receptorer fremkaldes i værter af pattedyr, såsom mus, kaniner, geder, - 26 -
O
DK 173262 B1 marsvin, heste og lignende ved at der ved immuniseringen anvendes de ovenfor beskrevne podestoffer.
Egnede receptorer i monoklonal form, typisk hele antistoffer, kan også fremstilles ved anvendelse af hybri-5 domateknologi, som er beskrevet af Niman med flere, Proc.
Natl. Sci., USA, 80, 4949-4953 (1983), hvortil der henvises. Kort dg godty til dannelse af hybridomaet, hvorfra den mono-klonale receptor fremstilles, fusioneres et myelom eller en anden selv-bevarende cellelinie med lymfocytter, som er 10 opnået fra milten af et pattedyr, som er hyperimmuniseret med et polypeptid ifølge opfindelsen.
Det foretrækkes, at myelomcellelinien er fra samme dyreart som lymfocytterne. Typisk er en mus af racen 129 GlX' det foretrukne pattedyr. Egnede musemyelomer til 15 anvendelse i den foreliggende opfindelse omfatter de hypoxanthin-aminopterin-thymidin-sensitive (HAT) cellelinier· P3X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4, som kan fås f5a American Type Culture Collection, Rockville, MD, under betegnelserne henholdsvis CRL 1580~og 1581.
20 Splenocytterne smeltes typisk sammen med myelomceller ved anvendelse af polyethylenglycol (PEG) 1500. Sammensmeltede hybrider vælges ud fra deres sensitivitet over for HAT. Hybridomer, som afsondrer receptormolekyler ifølge opfindelsen, identificeres ved anvendelse af en enzym-bindende 25 immunsorbentanalyse (ELISA), som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.
Monoklonale antistoffer som receptorer fås ikke kun ud fra hybrldom-ovenstående væsker, men kan også opnås i generelt mere koncentreret form fra ascitesvæske fra pattedyr, 30 hvori de ønskede hybridom er indført. Fremstilling af monoklonale antistoffer ved anvendelse af ascitesvæske er velkendt og beskrives ikke nærmere i den foreliggende beskri-i velse.
En receptor ifølge opfindelsen binder både til poly-35 peptidet, som det er fremkaldt imod, og binder også til det tilsvarende EA-D-antigen-determinante sted, som poly- - 27 -
O
DK 173262 B1 peptidet ifølge opfindelsen immunologisk antager lighed med. Således kan et polypeptid ifølge opfindelsen både være et immunogen og et antigen.
Receptorerne ifølge opfindelsen, som er fremkaldt 5 af et polypeptid ifølge opfindelsen, omfattende et oligo-mert polypeptid og en polypeptidpolymer, kan beskrivés som værende oligoklonal sammenlignet med naturligt forekommende polyklonale antistoffer, da de er fremkaldt mod et immunogen (det relativt lille polypeptid) med relativt 10 få epitoper sammenlignet med epitoperne, som et intakt EA-D--molekyle antager lighed med. Således binder receptorerne ifølge opfindelsen til epitoper af polypeptidet, medens naturligt forekommende antistoffer, fremkaldt mod hele EA-D-molekylet binder til epitoper i hele EA-D-molekylet 15 og kaldes polyklonalt.
F. Analysemetoder og -systemer I. Analyser for anti-EA-D-antistoffer
Det syntetiske polypeptid ifølge opfindelsen er sær- 20 lig anvendeligt til analyse for tilstedeværelsen af anti--EA-D-antistoffer i en legemsvæskeprøve, såsom blod, serum eller plasma.
Ved én udførelse-:form tilvejebringef den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til analysering af en legems-25 væskeprøve for tilstedeværelsen af anti-EA-D-antistoffer, som omfatter: (a) Tilvejebringelse af en legemsvæskeprøve, som skal analyseres. En sådan prøve fås typisk som en kendt mængde blod og mere foretrukket som serum eller plasma.
30
Metoder til tilvejebringelse af prøver af blod, plasta og serum er velkendte i teknikken og beskrives ikke nærmere i den foreliggende beskrivelse.
(b) Tilvejebringelse af et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig består af ca. 6 til ca. 40 aminosyrerester 35 , med en aminosyrerest-sekvens, som i alt væsentligt svarer - 28 - DK 173262 B1 o til en aminosyrerest-sekvens af EA-D-proteinet fra ca. stilling 350 til ca. stilling 362 fra aminoterminus deraf, idet det syntetiske polypeptid har kapacitet til immunologisk at bindes af antistoffer, som er fremkaldt 5 af EA-D.
(c) Blanding af legemsvæskeprøven med polypeptidet til dannelse af en immunreaktionsblanding.
(d) Opbevarelse af blandingen under biologiske analysebetingelser i et forudbestemt tidsrum, såsom ca. 10 mi- 10 nutter til ca. 16-20 timer ved en temperatur på ca. 4 til 45°C, som er tilstrækkelig til, at ethvert anti-EA-D-anti-stof, som er til stede i prøven, immunologisk kan binde polypeptidet til dannelse af en første immunreaktant.
Biologiske analysebetingelser er sådanne, som beva-15 rer den biologiske aktivitet af polypeptidmolekylerne ifølge opfindelsen og anti-EA-D-antistofferne, som skal analyseres, og omfatter en temperaturskala på fra ca. 4 til ca. 45°C, en pH-værdi-skala på fra ca. 5 til ca. 9 og en ionstyrke, som varierer fra den for destilleret vand til den for ca.
20 ét mol natriumchlorid. Metoder til optimering af sådanne betingelser er velkendte i teknikken.
(e) Analyse for tilstedeværelsen af en eventuel immunreaktant, som dannes, og således tilstedeværelsen af eventuelle anti-EA-D-antistoffer i immunreaktionsblandingen.
25
Analyse for tilstedeværelsen af anti-EA-D-antistof-indeholdende immunreaktant, enten direkte eller indirekte, kan gennemføres ved analyseteknikker, som er velkendte i : teknikken. F.eks. kan der anvendes et homogent analysesystem, såsom de i USA-patentskrifter nr. 4.536.479, nr. 4.233.401, 30 nr. 4.233.402 og nr. 3.996.345 beskrevne, hvortil der hen-j vises.
Ved foretrukne udførelsesformer fremstilles den første immunreaktant fra trin (d) endvidere til analyse ifølge trin (e) ved følgende trin: 35 - 29 -
O
DK 173262 B1 (i) Tilsætning af et biologisk aktivt, mærket, specifikt bindemiddel, fortrinsvis en receptor, som binder til eventuelt tilstedeværende humant immunglobulin i den første immunreaktant til dannelse af et kompleks, 5 fortrinsvis en mærket anden immunreaktant. Mere foretrukket er det mærkede, specifikke bindemiddel immunglobulin-klasse-specifikt, dvs. at bindemidlet er i stand til at immunreagere specifikt med en immunglobulin af klasserne IgG, IgM eller IgA, som illustreret i det følgende. Det 10 mærkede, specifikke bindemiddel er i stand til at signalere tilstedeværelsen af det specifikke bindemiddel i komplekset.
(ii) Blandingen af mærket, specifikt bindemiddel og første immunreaktant, som således opnås, opbevares under biologiske analysebetingelser i et forudbestemt tidsrum, 15 som er tilstrækkeligt langt til, at det mærkede, specifikke bindémiddel kan danne et kompleks med eventuelle anti-EA-D-antistoffer, som er til stede som første immunreaktant.
Analyse for tilstedeværelsen af det mærkede, specifikke bindemiddel, bundet som del af den anden immunreaktant, som 20 indeholder anti-EA-D-antistof, tilvejebringer en analyse for tilstedeværelsen af anti-EA-D-antistoffer i prøven.
Ved foretrukne udførelsesformer bestemmes mængden af det mærkede, andet, specifikke bindemiddel, bundet som del af komplekset, og således mængden af anti-EA-D-antistoffer i 25 prøven. Den mængden kan være nul, hvilket angiver, at der ikke er nogen anti-EA-D-antistoffer til stede i prøven, inden for grænserne af, hvad der kan påvises. Fremgangsmåder til analyse for tilstedeværelsen af mængden af et mærket, specifikt bindemiddel afhænger af det anvendte mærke, og så-30 danne mærke- og analysemetoder er velkendte inden for teknikken.
Mærkningen af proteinøse, specifikke bindemidler, såsomreceptorer i form af hele antistoffer er velkendte inden for teknikken. F.eks. kan receptorer produceret ved hybrido- mer mærkes ved metabolisk inkorporering af radioisotop-indeholdende aminosyrer bestemt som en bestanddel i vævs- 35 - 30 - o DK 173262 B1 kulturmediet. Se f.eks. Galfre med flere, Meth. Enzymol.
73, 3-46 (1981). Metoder som proteinkonjugation eller kobling ved aktiverede funktionelle grupper er særlig anvendelige. Se f.eks. Auramaes med flere, Scand. J. Immunol.
5 bind 8, suppl. 1_, 7-23 (1978) og USA-patentskrift nr.
4.493.795, hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse. Desuden kan en sted-rettet koblingsreaktion gennemføres, således at mærket ikke væsentligt hæmmer immunreaktionen af den anden receptor med dets mål-10 antigen. Se f.eks. Rodwell méd flere, Biotech. 3, 889-894 (1985).
Mærkemidlerne kan være et fluorescerende mærkemiddel, som kemisk binder til antistoffer eller antigener uden at denaturere dem til dannelse af et fluorochrom (farvestof), 15 som er et anvendeligt immunfluorescerende sporstof. Egnede fluorescerende mærkemidler er fluoiochromer, såsom fluorescein- - isocyanat (FIC), fluorescein-isothlocyanat (FITC), 5-dime- thylamin-l-naphthalensulfonylchlorid (DANSC), tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissarain, rhodamin-8200- : 20 sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse af immunfluorescens-analyseteknikker findes i DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", i Antibody As A Tool, Marchalonis * med flere, eds., John Wiley & Sons, Ltd., s. 189231 (1982), i ' hvortil der henvises i den foreliggende beskrivelse.
^ 25 Ved foretrukne udførelsesformer er indikatorgruppen et enzym, såsom peberrods-peroxidase (HEP), glucose-oxidase eller lignende. I sådanne tilfælde, hvor den principale indikatorgruppe er et enzym, såsom HEP eller glucoseoxidase, kræves der yderligere reagenser for at visualisere, at der 30 er dannet et receptor-ligand-kompleks (immunreaktant). Sådanne yderligere reagenser for HRP omfatter hydrogenperoxid og en oxidations-farve-grundstof, såsom diaminobenzidin.
Et yderligere reagens, som er anvendeligt med glucose-oxidase er 2,2’-azinodi-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).
35 Radioaktive elementer er også anvendelige mærkemidle:: og anvendes illustrativt 1 den foreliggende beskrivelse.
DK 173262 B1 - 31 - o
Et eksempel på et radiomærkemiddel er et radioaktivt element, som producerer gammastråling. Elementer, som selv udsender gammastråler, såsom 12^l, 51 οσ Cr, repræsenterer én klasse af indikatorgrupper, som 5 er et gammastrålingsproducerende radioaktivt element. Sær- 125 lig foretrukket er I. En anden gruppe af anvendelige mærkemidler er elementerne ^C, ^®F, ^0 og ^N, som selv udsender positroner. Positronerne, som således udsendes, producerer gammastråler efter sammenstød med elektroner, 10 som er til stede i dyrets legeme. Et betastråleelement, sålil i som indium eller H.
Analysemetoder og -systemer ifølge opfindelsen kan Omfatte et antigen eller receptor ifølge opfindelsen, som er fæstnet til den faste matrix til dannelse af et fast 15 underlag.
Antigenet eller receptoren er typisk fæstnet til den faste matrix ved adsorbering fra et vandigt medium, selvom der kan anvendes adskillige adsorberingsmåder samt andre fastgøringsmetoder, som er velkendte for fagfolk. Eksempler på sådanne metoder fra teknikken er omsætningen af receptoren eller antigenet med den reaktive carboxylfunktion, som produceres ved omsætning af cyanogenbromid med glucose-indehol-dende matricer, såsom tværbundet dextrose eller cellulose, glutaraldehyd, der, som allerede beskrevet, binder i forbin- 25 delse med latexpartikler og lignende.
Anvendelige faste matricer er velkendte inden for teknikken. Sådanne materialer omfatter tværbundet dextran, som fås under handelsnavnet "SEPHADEX" fra firmaet Pharmacia
Fine Chemicals; agorse, perler af polystyren på ca. 1 pm 30 til ca. 5 mm i diameter fra firmaet Abbott Laboratories *," Polyvinylchlorid, polystyren, forgrenet polyacrylamid, nitrocellulose af nylon-baserede væv, såsom olader, strimler eller spatler,- glas; eller rør, plader eller fordybningerne i en mikrotiterolade, såsom de af polystyren eller polyvinyl-35 chlorid fremstillede.
- 32 -
O
DK 173262 B1
Latexpartikler, som er anvendelige i analyser af aqqlutinations-typen er også anvendelige faste matricer.
Sådanne materialer fås fra firmaet Japan Synthetic Rubber Company og beskrives som carboxy-funktionelle partikler, 5 som er dispergeret i en anionisk sæbe. Typiske dele af sådanne partikler dispergeres i en anionisk sæbe. Typiske dele af sådanne partikler har en gennemsnitsdiameter på 0,308 pm og har en for den'carboxyfunktionelle gruppe gennemsnitlig fordeling på ca. 15 til ca. 30 kvadrat-Angstrdm 10 pr. carboxygruppe.
Før anvendelse omsættes partiklerne med en dlamin, såsom 1,3-diamino-3-propanol, til dannelse af en mængde amidbindinger med carboxygruppepartiklerne, medens de forbliver frie aminogrupper. De frie aminer omsættes derpå med dialde-15 hvd, såsom qlutaraldehvd, oq receptoren eller antiqenet til dannelse af Schiff-basereaktionsprodukter. Schiff-basereak-tionsprodukterne reduceres derpå med en vandopløselig re-duktant, såsom natriumborhvdrid, til dannelse af et anvende-liqt fast underlaq.
20 Faqfolk vil forstå, at der er adskilliqe immunanalyse- metoder, som kan anvendes. Der kan dog anvendes enhver metode, som resulterer i et signal, som opnås ved omsætning af anti-EA-D-antistof med et polypeptid ifølge opfindelsen. Desuden er opfindelsen, selvom de særligt beskrevne analyse- 25 systemer og -metoder anvender en fast fase, ikke begrænset dertil. Enhver af disse analysemetoder kan omfatte enkelte eller dobbelte antistofteknikker, hvori der anvendes et indikatormiddel for at signalere immunreaktion og dermed binding af antistof, som skal analyseres med et polypeptid 30 ifølge opfindelsen. Eksempler på metoder beskrives i Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981) og i Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press,
New York, NY (1980).
35 « - 33 -
O
DK 173262 B1 2. Diagnosesystem til analyse for anti-EA-D-antistoffer
Et diagnosesystem, fortrinsvis i form af et sæt, som er anvendeligt til gennemførelse af de her omhandlede analysemetoder for anti-EA-D-antistof omfatter, i adskilte 5 enheder, (a) et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig be står af ca. 6 til ca. 40 aminosyrerester med en aminosyre-rest-sekvens, som i alt væsentligt svarer til en aminosyre-rest-sekvens af EBV-EA-D-proteinet fra ca. stilling 350 til ca. stilling 362 fra aminoterminus deraf, idet polypep-tidet har kapacitet til at kunne bindes immunologisk af antistoffer fremkaldt af EA-D, og (b) et mærket specifikt bindemiddel til at signalere immunreaktion af anti-EA-D--antistoffer med polypeptidet. Det mærkede specifikke bindemiddel er fortrinsvis en receptor, som er bundet til et en-15 zym.
Ved foretrukne udførelsesformer omfatter systemet endvidere en fast matrix, hvortil polypeptidet kan fastgøres til dannelse af et fast underlag. Anvendelige faste matricer er allerede beskrevet. Den faste matrix er dog fortrins-20 vis fordybningen i en mikrotiterplade. Mest foretrukket for-y-nes det faste underlag med en kendt mængde polypeptid, som er fastgjort til den faste matrix.
Ved foretrukne udførelsesformer omfatter systemet også antistoffer, som er fremkaldt mod et polypeptid ifølge op-25 findelsen, som skal anvendes som positiv kontrol.
Kendte mængder af polypeptidet og det mærkede specifikke bindemiddel tilvejebringes. De mængder er i det mindste nok til at gennemføre én analyse. Polypeptidet og det mærkede specifikke bindemiddel tilvejebringes typisk i en form og 30 mængde, som er udformet til at blive fortyndet til et foreskrevet volumen med vand, saltopløsning eller en puffer, •bigesom beskrevet i det følgende.
Yderligere enheder kan også omfattes af systemet.
Sådanne enheder kan indeholder (i) puffersalte i fast eller 35 flydende form, (ii) enzymsubstrater, såsom o-phetylendiamin, og lignende.
- 34 -
O
DK 173262 B1
3. Analyse for EA-D
En fremgangsmåde til analyse for tilstedeværelsen af EA-D i en legemsprøve er også omfattet af den foreliggende opfindelse. Generelt tilvejebringes en legemsprø-5 ve, som skal analyseres, såsom lyserede perifere blodlym focytter (PBL), som er lyseret med acetone- eller methanolbinding. Prøven tilsættes receptormolekyler, som indeholder et antistof-forenende sted fremkaldt af et syntetisk poly-peptid ifølge opfindelsen. Blandingen holdes under biolo-10 giske analysebetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt langt til at receptormolekylerne kan immun-- reagere med EA-D, som er til stede i legemsprøven. Mængden af den immunreaktion (dvs. mængden af den dannede immunreaktant) måles derpå til bestemmelse af, hvorvidt EA-D-15 molekyler er til stede eller fraværende i den analyserede legemsprøve.
4. Diagnosesystem til analyse for EA-D-A
Diagnosesystem, fortrinsvis i form af et udstyr, 20 som er anvendeligt til gennemførelse af den ovennævnte ana- lysemetodev omfatter, i adskilte enheder, (a) receptorer ifølge opfindelsen, som immunreagerer med EA-D, (b) et mærket specifikt bindemiddel til at signalere immunreaktion af receptorerne ifølge opfindelsen med EA-D.
25 Ved foretrukne udføre’sesformer omfatter udstyret yderligere, i adskilte enheder, et forstærkende reagens som supplement, ligesom marsvin, anti-immunglobulin-anti- stoffer eller protein A fra S. aureus "cowan"-stamme, som reagerer med receptorerne. Ved disse udførelse.-former er 30 det mærkede specifikke bindemiddel i stand til specifikt at binde de forstærkende midler, når de forstærkeridé midler bindes til en receptor ifølge opfindelsen.
Receptormolekyler og séparate indikatormidler fra ethvert diagnosesystem, som beskrives i den foreliggende 35 beskrivelse, samt det ovenfor beskrevne forstærkende reagens, kan fås i opløsning, som en væskedispersion eller som et DK 173262 B1 - 35 -o hovedsageligt tørt pulver, f.eks. i lyofiliseret form.
Når indikatormidlet er et separat molekyle fra det forstærkende reagens, foretrækkes det, at indikatormidlet pakkes separat. Når indikatormidlet er et enzym, kan en-5 zymets substrat også være i en separat pakke i systemet.
En fast matrix, såsom det ovenfor beskrevne mikroskop-objektglas, én eller flere puffere og acetone kan også omfattes som separat pakkede elementer ' diagnose-analyse-systemét.
10 De her omhandlede pakker i forbindelse med diagnose systemet er sådanne, som sædvanligvis anvendes i diagnosesystemer. Sådanne pakker omfatter glas-og plastik- (f.eks. polyethyl*»n, polypropylen og polycarbonat). flasker, hætteglas, plastik og plastikfolielaminerede kuverter og 15 lignende.
De følgende eksempler tjener til næfmeré belysning af opfindelsen uden dog at begrænse den hertil.
Eksempel 1
Syntese af polypeptlder
For at lokalisere EA-D-genet og bestemme dets aflæsningsramme, sekvenseres en del af amino-terminus af EA-D-proteinet ved anvendelse af affinitetsrenset EA-D. Amino-syrerest-sekvensen, som fremkommer således, sammenlignes 25 med eventuelle aminosyrerest-sekvens-oversættelser af EBV-geno- met, indtil en tilpasning er fundet, hvorved det formodede EA-D-gen og dets aflæsningsramme identificeres. Baseret på den aflæsningåramme er i fig. I vist den oversatte aminosyre-rest-sekvens af EA-D-proteingenet for EBV-stammen, som , 30 er beskrevet af Baer med flere, Nature 310, 207 (1984).
Ved anvendelse af den ovennævnte aminosyrerest-sekvens syntetiseres en serie af korte syntetiske polypeptider, som svarer til dele af det omsatte gen, og de undersøges for deres evne til at antage lighed med antigendeterminanter af 35 naturligt forekommende EA-D. Aminosyrerest-sekvenserne af de polypeptlder og lokaliseringen af deres sekvenser i - 36 -
O
DK 173262 B1 EA-D-proteinet fra amino-terminus er vist, fra venstre til højre og i retning af amino-terminus til carboxy-terminus, i tabel I nedenfor.
5 Tabel I~
Syntetiske polypeptider afledt af EA-D-molekyle
Betegnelse sekvens lokalisering1 10 ' K7 PARPETPSPAIPSC2 350-362 K6 RKRTSSEARQKQKC2 379-391 K5 PKKVKOAFNPLIC2 393-404 K8 TVSPSPSPPPPPRTPC2 331-345 K9 SVAADSLAAALSLC 242-255 15 -''^Lokalisering af amino-termirius'af EA-D-molekylet som omsat og forudsagt ud fra genome sekvensdata beskrevet af 20 Baer med flere, Nature, 310, 207 (1984).
2 * ' Carboxy-terminalcystein, som er tilføjet til koblingsformål, er ikke til stede i den beslægtede EA-D-protein-aminosyre-rest-sekvens.
Polypeptiderne vist i tabel I ovenfor syntetiseres 25 kemisk ved fastfase-metoder, som beskrives af Merrifield med flere, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963) og
Houghten med flere, Int. J. Pept. Prot. Res. 16, 311-320 (1980). Fastfase-metoden til polypeptidsyntese praktiseres ved anvendelse af en "Vega Model 25GC Polypeptide Synthe-30 - sizer" fra firmaet Vega Biotechnologies, Inc. , Tucson, AZ.
: Til polypeptider forskellige fra K9 føjes én oystein- remanens til carboxyl-terminus for at hjælpe med at koble til en proteinbærer, som beskrevet nedenfor. Sammensætningen af ålle polypeptiderne bekræftes ved aminosyreanalyse.
Ved fremstilling af det her omhandlede syntetiske - 37 -
O
DK 173262 B1 polypeptid ved den ovennævnte fastfase-metode bindes amino-syreresterne til et harpiks (fast fase) ved en esterbin-dingfra carboxy-terminal-resten. Hvis polypeptidet skal bindes til en bærer via en Cys-rest eller polymeniserés 5 via ende-Cys-rester, er det passende at anvende den Cys-rest som carboxy-terminalrest, som er ester*·bundet til harpikset.
a-aminogruppen af hver enkelt tilsat aminosyre beskytter typisk af en t.-butoxycarbonyi- (t-BOC) -gruppe, før 10 aminosyren sættes ind i den voksende polypeptidkæde. t-BOC--gruppen fjernes derpå før tilsætning af den næste aminosyre til den voksende polypeptidkæde.
Reaktive aminosyresidekæder beskyttes også under syntesen af polypeptiderne. Sædvanlige sidekæde-beskyttelses-15 grupper anvendes til de resterende aminosyrerester, og de er som følger: 0-(p-brombenzyloxycarbonyl) til tyrosin, 0-benzyl til threonin, serin, asparaginsyre og glutaminsyre, S-methoxybenzyl til cystein, dinitrophenyl til histidin, 2-chlorbenzoxycarbonyl til lysin og tosyl til arginin.
20 Før anvendelse omkrystalliseres beskyttede aminosyrer fra passende opløsningsmidler til dan else af enkelte pletter ved tyndtlagschromatografi. Koblinger gennemføres typisk ved anvendelse af et ti-dobbelt M overskud af både beskyttelsesaminosyre og dicyclohexylcarbodiimid i forhold 25 til antallet af mil liækvivalenter oprindelig N-teminalamino- syre. For asparagins vedkommende sættes en lige så stor M mængde N-hydroxy-benzotriazol til beskyttelsesaminosyren, og der anvendes dimethylformamid som opløsningsmiddel.
Alle koblingsreaktioner er mere end 99% fuldstændige 30 ifølge pikrinsyreforsøget beskrevet af Gisin, Anal. Chem.
Acta. 58, 248-249 (1972).
Efter fremstilling af et ønsket polypeptid behandles en del af det fremkomne, beskyttede polypeptid (ca. 1 g); med to ml anisol, og vandfrit hydrogenfluorid, ca. 20 ml, kondenseres 0ver i reaktionsbeholderen ved tøristemperatur.
35
O
DK 173262 B1 - 38 -
Den fremkomne blanding omrøres ved ca. 4°C i ca. én time til spaltning af beskyttelsesgrupperne og for at fjerne polypeptidet fra harpikset. Efter inddampning af hydrogenfluoridet ved en temperatur på 4°C med en 5 strøm af ^ ekstraheres remanensen med vandfri diethylether tre gange for at fjerne anisol, og remanensen tørres i vakuum.
Det vakuumtørrede materiale ekstraheres med 5% vandig eddikesyre (3 gange 50 ml) for at skille det frie 10 polypeptid fra harpikset. Den ekstrakt-indeholdende opløsning lyofiliseres til dannelse af et monomert uoxideret polypeptid.
Eksempel 2 15 Fremstilling af oligomere
En syntetisk oligomer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved fastfase-syntese af et stort antal polypeptider ifølge opfindelsen, som er bundet sammen "ende-til-ende" {"hoved-til-hale") meden amidbinding mellem den carboxyl- 20 éadestilléde rest af ét polypeptid og den amino-endestillede ϊ rest af et andet polypeptid. Sådanne syntetiske oligomere syntetiseres fortrinsvis som en enkelt lang polypeptidoli-gomer, men kan også fremstilles som individuelle polypeptider, som bindes sammen efter deres individuelle synteser ved an-25 vendelse af et carbodiimid-reagens, såsom 1-(3-dimethylamino-propyl)-3-ethyl-carbodiimidhydrochlorid i vand. Det samlede - antal aminosyrerester indeholdt i en oligomer, som er frem- - stillet som en enkelt polypeptidkæde, er fortrinsvis mindre end ca. 40, således at op til ca. seks polypeptider ifølge 30 opfindelsen kan inkorporeres i en "hoved-til-halé"-bligomer-kæde, som syntetiseres som et enkelt polypeptid. En syntetisk "hale-til-hale"-oligomer indeholder mere foretrukket to til ca. fire blokke af sammenkædede, syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen og i alt mindre end ca. 40 aminosyre-35 rester.
- 39 -
O
DK 173262 B1
Eksempel 3
Fremstilling af polymere
En polypeptidpolymer (syntetisk multimer) ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at syntetisere et polypep-5 tid ifølge opfindelsen, som beskrevet i eksempel A, og omfatter cycteinrester ved både amino- og carboxyterminiene til dannelse af et "di-Cys-termineret" polypeptid i ikke-oxideret, reduceret form. Efter syntese, ved en typisk labo-ratoriefremstilling, opløses 10 ml diCys-polypeptid (inde-10 holdende cysteinrester i ikke-oxideret form) i 250 ml 0,1 M ammoniumhydrogencarbonat-puffer. Det opløste diCys-termine-rede polypeptid luftoxideres derpå ved forsigtig omrøring af den fremkomne opløsning i ca. 18 timer ved normal stuetemperatur, eller indtil der ikke længere kan påvisen fri 15 mercaptan ifølge Ellman-forsøget. [Ellman, Arch. Biochem.
Biophys., 82, 70-77 (1959).]
Den således fremstillede polymer indeholder et stort antal syntetiske polypeptid-gentagelsesenheder, som er bundet sammen med oxiderede cystein- (cystin) -rester. Sådanne 20 polymere indeholder typisk deres polypeptid-gentagelsesenhe der bundet sammen "hoved-til-hale" samt "hoved-til-hoved" og "håle-til-hale", dvs. aminoterminiene af to polypeptid-:· gentagelsesenheder kan bindes sammen ved en enkelt cystin-rest, ligesom to carboxyl-termini, da bindegruppeme ved 25 begge polypeptid-termini er identiske.
Eksempel 4 Kobling til bærere
De syntetiske polypeptider kobles til nØgl'ehuls-albueskæl-hæTD-30 cyanin (KLH) som immunogen bærer ved metoden beskrevet af
Liu med flere, Biochem., 80^ 690 (1979). Kort sagt aktiveres 4 mg af bæreren med 0,51 mg m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester, og blandingen omsættes derpå med 5 mg af polypeptidet ved en amino- eller carboxy-endestillet cystein 35 til dannelse af et konjugat indeholdende ca. 10 til ca. 35 vægtprocent polypeptid.
O
DK 173262 B1 - 40 -
Eksempel:5 ELISA-analyse for antl-EA-D-antistof
Serumprøver fra patienter med et stort antal EBV-associerede kliniske betingelser analyseres for tilstede-5 værelsen af anti-EA-D-antistoffer, idet der anvendes den nedenfor beskrevne ELISA. De analyserede sera er fra patienter, som er diagnosticeret til at have akut infektiøs mononucleose (IM), baseret på deres kliniske træk og en positiv celleagglutination med røde blodlegemer fra får 10 (dfrs. heterofil). Til bekræftelse af IM-diagnosen undersøges rekonvalescent-sera fra disse patienter, og de viser sig at indeholder anti-EBNA-1- og anti-VCA- (VCA?) -antistoffer.
Normale voksensera fås fra sunde individer, som rea-15 gerer negativt over for antistoffer rettet mod heterofile, VCA- og EBNA-l-antigener. Denne gruppe, som kaldes VCA--negative (VCA-), har formentlig ikke haft en primær EBV-infektion. En anden gruppe af sunde normale donorer har positive anti-VCA- og anti-EBNA-l-antistoftitere. Denne anden 20 kontrolgruppe, som kaldes VCA-positive (VCA+), har formentlig før været udsat for EBV.
Sera fra patienter med akut cytomegalovirus- (CMV) -Infektion, bestemt ved forøgede convalescente anti-CMV-antistoftitere, undersøges også. Det undersøgte sera fra 25 patienter med Sjdgren's syndrom (SS) har keratoconjunctivitis sicca, xerostomi, positiv mindre spytkirtelbiopsi Tgrad IV på en skala fra I-IV) og forhøjede autoantistoftitere, I omfattende anti-nukleært antigen og rheumatoid faktor. Der bedømmes også sera fra patienter med rheumatoid arthritis, 30 men som mangler associerede SS-symptomer-
Syntetisk polypeptid fastgøres til væggene af fordybningerne i en mikrotiterplade (Immunolon II, Dynatech Laboratorie Ina;, Alexandria, VA) som matrix ved til hver fordybning at sætte 0.050 ml borat-oufret saltopløsning (BBS, 200 mM 35 natriumborat. 160 mM NaCl, pH. 8,0) indeholdende 10 pg ~ pr. ml polypeptid. Blandingen holdes i ca. 16 timer ved ca.
4°C. Ikke-bundet polypeptid skilles fra fordybningerne - 41 -
O
DK 173262 B1 ved at vende pladerne om og .omryste. Resterende ikke-specifikke bindesteder blokeres derpå ved at sætte 0,200 ml blokeringsopløsning IPBS (10 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,3) indeholdende 10% normalt gedeserum 5 (NGS)] til hver fordybning. De således fremkomne blandinger holdes i ca. 90 minutter ved 37°C i et fugtet kammer. Blokeringsopløsningen fjerner; derpå fra fordybningerne ved omvending og omrystning, og de således fremkomne faste underlag får lov at lufttørre i ca. én time ved 37°C.
10 Til hver enkelt polypeptid-overtrukket fordybning (faste underlag) sættes 0,200 ml serum, fortyndet 1:20, til blokeringsopløsningen til dannelse af en fast-væskefase-immunreaktionsblanding. Blandingerne holdes i ca. 1 time ved 25°C. Ikke-bundet materiale skilles derpå fra fordybningerne 15 ved at :vaske tre gange med BBS indeholdende 0,05% "Tween 20" [polyoxyethylen (30) sorbitanmonolaurat] fra firmaet Sigma.
Mængden af fastfase-bundet immunreaktant, som fremkommer, bestemmes ved at sætte 0,200 ml humant immung1obulin-20 klassespecificeret antistof, som er bundet til peberrod- peroxidase (HRP) fortyndet 1:1000 til BBS indeholdénde 10% NGS til dannelse af en anden fast væskefaseblanding. Til påvisning af IgG- og IgM-antistoffer anvendes der henholdsvis HRP-bUndet muse-ahti-humant IgG og muse-anti-humant IgM-25 monoklonale antistoffer (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ)'.
Til påvisning af IgA-antistoffer anvendes der HRP-bundet gede-anti-humant IgA (Kiregaard og Perry, Gaithersburg, MD).
De andre fast/væskefaseblandinger holdes i ca. én time ved ca. 25°C. Ikke-bundet materiale skilles derpå fra den ; fastfase-bundede sammensætning (anden) immunreaktant ved at vaske 5 gange som beskrevet ovenfor.
Mængden af fastfase-bundet sammensætning (anden) immunreaktakt-indeholdende HRP-mærke analyseres derpå ved at sætte 0,200 ml o-phenylendiamirr (OPD fra sigma) -substrat-35 opløsning, som er friskfremstillet ifølge leverandørens instruktioner, dertil. Farven får lov at udvikle sig i ca.
- 42 -
O
DK 173262 B1 15 til ca. 30 minutter ved ca. 25°C. Substratomdannelses-reaktionen stoppes derpå ved til hver fordybning at sætte 0,050 ml 4N H2S04. Den optiske densitet (O.D.) af blandingerne bestemmes ved en 490 nanometer (nm) bølgelængde ved 5 anvendelse af et "Dynatech MR6000" fra Dynaiech Laboratories, Inc.) mikrotiterpladelæser.
Resultaterne af analysen af IM og normale sera for anti-EA-D-antistoffer er vist i fig. 2. Ved anvendelse af polypeptid K7 bundet til den faste matrix observeres der 10 væsentlig større binding af IgG-, IgA- og IgM-antistoffer fra IM-patienters sera sammenlignet med normale sera. I modsætning dertil udviser syntetiske polypept;der K5, K8 og K9 ikke forøget immunaktivitet med IM-sera sammenlignet med normale sera. Til stede er dog en lav immunaktivitet mod 15 polypeptid K6 i nogle IM-sera.
Sera fra patienter med naso-pharyngeal carconom (NPC), en EBV-beslægtet sygdom, og med SS udviser også forøget immunaktivitet med polypeptid K7 sammenlignet med normale sera (fig. 3). I modsætning dertil udviser sera fra patien-20 ter med RA-manglende sicca-symptomer ikke væsentlig anti-polypeptid-K7-aktivitet.
Der foretages også et tidsforløbsstudium ved anvendelse T af den ovenfor beskrevne ELISA. Serieprøver fra fire IM- -patienter tages i et tidsrum, hvor de hår IM-symptomer, ^ 25 undersøges for tilstedeværelsen af anti-K7 og anti-EBNA-1- antistoffer ved anvendelse af polypeptid K7 og polypeptid fra ! Rhodes med flere, J. Immunol., 134, 211-16 (1985), som hver især er bundet til den faste matrix. De i fig. 4 angivne resultater viser, at anti-EA-D-polypeptidantistoffer forekom-30 mer i større mængder ved indtræden af EBV-infektion end anti-EBNA-l-antistoffer.
Således kan den her omhandlede analysemetode påvise antistoffer, som immunologisk binder til et polypeptid t ifølge opfindelsen, i sera-patienter med EBV-as?ociereret 35 sygdom. Det menes, at disse polypeptid-reaktive antistoffer - 43 -
O
DK 173262 B1 fremkaldes af tilsvarende mængder af EA-D-protein som resultat af EBV-infektion.
Eksempel 6 5 Poiypeptidkoncentration
Virkningerne af ændringer i koncentrationen af poly-peptid-indeholdende opløsning, som anvendes til overtrækning af væggene af en mikrotiterplade huller til dannelse af faste underlag undersøges. Opløsninger indeholdende 0,1 10 , 1,0, 10 og 100 pg/ml polypeptid K7 i BBS anvendes til at binde polypeptidet til hulvæggene, som beskrevet i eksempel 5. Der foretages en ELISA til påvisning at anti--EA-D-IgM-antistoffer ifølge eksempel 5 ved anvendelse af sera fra normale individer (VCA og VCA”) og fra en IM-15 -patient. Alle sera anvendes i en 1:20 opløsning.
Resultaterne af dette studium er vist i fig. 5A. Resultaterne viser, at mængden af anti-EA-D-IgM-antistof, som påvises i de analyserede sera ikke varierer væsentligt fra rækken af undersøgte polypeptidkoncentrationer. Således 20 kan der anvendes en polypeptidopløsning med en koncentration så lav som 0,1 pg/ml polypeptid til binding af et polypeptid ifølge opfindelsen til de indre vægge af en mlkrotiterplade-fordybning til dannelse af et fast underlag.
25 Eksempel 7
Prøvefortyndinq
Virkningerne af fortynding af legemsvæskeprøven, som skal analyseres ved ELISA ifølge eksempel 5, undersøges også. Sera fra normale individer (VCA og VCA+) og fra patienter 30 med IM, NPC eller SS fortyndes 1:5, 1:20, 1:50 og 1:100 i den ovennævnte blokeringsopløsning, og de analyseres som beskrevet i eksempel 5.
Resultaterne af dette studium er vist i fig. 5B. Resultaterne viser, at nedsættelse af følsomheden, som er for-35 bundet med forøgelse af fortynding af prøven, begynder at aftage ved en fortynding af prøven ved ca. 1:20.
- 44 -
O
DK 173262 B1
Eksempel 8 Påvisning af anti-EA-D Immunglobulln-klasse
Den her omhandlede analysemetodes evne til at 5 adskille klasserne af anti-EA-D-immunglobulin, som er til stede i en prøv^ undersøges. Dette gennemføres ved anvendelse af hvert enkelt af de i tabel I viste poly-peptider som et fastfase-bundet antigen i ELISA ifølge eksempel 5.
io Resultaterne af analysen af polypeptiderne ifølge
Tabel I for deres evne til at immunreagere med IgG-, IgM-og IgA-antistoffer i serumprøver er vist i tabel II nedenfor.
15 20 25 30 35 - 45 -
O
DK 173262 B1
Tabel II
Binding· af IgG-, IgM- og IgA-antistofJer til forskellige polypeptider+ 5 PEPTID2 ! 1
Wve K5 K5 K7 K8 K9 10
XgG
R.S.3 0,006 0,002 0,002 0,000 0,000 22414 0,002 0,024 0,207 0,025 0,012 15 A.W.5 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 R.R.5 0,000 0,005 0,008 0,003 0,020 D.M.6 0,000 0,016 0,004 0,000 0,008
I3M
20 R.S. 0,060 0,057 0,052 0,041 - 0,042 2241- 0,357 0,298 0,540 0,558 0,314 A.W. 0,107 0,167 0,101 0,100 0,080 R.R. 0,144 0,083 0,070 0,081 0,047 25 D.M. 0,405 0,566 0,330 0,308 0,295
iqA
R.S. 0,002 0,009 0,000 0,000 0,007 30 2241 0,015 - 0,018 0,296 0,021 0,021 A.W. 0,000 0,051 - 0,000 0,003 0,006 R.R. 0,018 0,034 0,000 0,002 0,025 •D.M. ' 0,007 0,020 0,000 0,000 0,003 35 - 46 -
O
DK 173262 B1
De angivne 1værdier er enheder af optisk densitet i forhold til BBS ved en let bølgelængde på 490 nanometer.
2
Polypeptider K5, K6, K7, K8 og K9 har aminosyre-5 rest-sekvensen, som er vist i tabél X.
3Serum fra et klinisk normalt individ, som ikke tidligere har været udsat for EBV (VCA~).
4
Serum fra en patient med en klinisk akut EBV-in-fektion (IM).
10 5Serum fra et klinisk normalt individ, som tidligere har været udsat for EBV (VCA+).
^Serum fra et klinisk normalt individ, som tidligere har været udsat for EBV (VCA+), men med et forhøjet anti-EA-IgM-niveau (falsk positiv).
15 De ovennævnte resultater angiver, at polypeptid K7, som er fastgjort (ligesom ved adsorbering) til en fast matrix til dannelse af et fast underlag, har evne til at immunreagere med IgG-, IgM- og IgA-antistoffer i serummet fra en patient (nr. 2241) med en akut EBV-infektion. Endvidere 20 immunreagerer sera fra 2 klinisk normalt individer indeholdende antistoffer mod EBV-capsid antigen (VCA ) ikke med K7, og heller ikke serummet fra et klinisk normalt individ, som ikke kan påvises tidligere at have været udsat for EBV (VCA~) .
25 3° 35
Claims (16)
1. Syntetisk polypeptid, kendetegnet ved, at det hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyrerester med aminosyrerest-sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet det syntetiske 5 polypeptid har kapacitet til immunologisk at binde antistoffer, som er fremkaldt mod EA-D.
2. Syntetisk polypeptid ifølge krav l, kende -tegnet ved, at det indeholder 13 til 25 aminosyre-rester, og omfatter aminosyrerest-sekvensen, taget fra ven- 10 stre til højre og i retning af amino-terminus til carboxy-terminus, der er repræsenteret ved formlen PARPETPSPAIPS-.
3. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, kende te g n e t ved, at aminosyrerest-sekvensen af polyeptidet svarer til sekvensen, taget fra venstre til højre og i retning fra amino-terminus til carboxy-terminus, der er repræsenteret ved formlen 20 H-PARPETPSPAIPS-OH.
4. Syntetisk polypeptidoligomer, kendeteg -net ved, at den indeholder op til ca. 40 aminosyrerester 25 og omfatter flere forenede syntetiske polypeptid-gentagelses-enheder, som hovedsagelig består af et polypeptid ifølge krav 1, idet den oligomere har kapacitet til at binde antistoffer, som er fremkaldt af EA-D.
5. Syntetisk polypeptidpolymer, kendeteg- 30. e t ved, at den indeholder et stort antal syntetiske polypeptid-gentagelsesenheder, som ikke er samlet med poly-peptidbindinger, og som indeholder mere end ca. 100 aminosyrerester, idet enhederne hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyresekvenser med en sekvens, som svarer til aminosyre- 35 rest-sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet den polymere er vand-dispergerbar ved en pH-værdi på ca. 5 til ca. 9 og har evne 48 DK 173262 B1 til at immunreagere med antistoffer, som er fremkaldt af EA-D.
6. Fremgangsmåde til analysering af en legemsvæskeprøve for tilstedeværelsen af antistoffer mod EA-D, 5 kendetegnet ved, at (a) der tilvejebringes en legemsvæskeprøve, som skal analyseres; (b) der tilvejebringes et syntetisk polypeptid indeholdende 13 til 40 aminosyrerester med aminosyrerest-se- 10 kvensen PARPETPSPAIPS-, idet det syntetiske polypeptid har kapacitet til immunologisk at binde antistoffer, som er fremkaldt mod EA-D; (c) der til polypeptidet sættes legemsvæskeprøven til dannelse af en første immunreaktionsblanding; 15 (d) blandingen holdes under biologiske analysebetin gelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt langt til at eventuelle anti-EA-D-antistoffer, som er til stede i prøven, immunologisk kan binde til polypeptidet til dannelse af en første iiranunreaktant; og 20 (e) der analyseres for'tilstedeværet sen af en eventuel første immunreaktant, som er dannet i denne blanding.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at denne legemsvæskeprøve enten er serum eller plasma.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet 25 ved, at polypeptidet er fastgjort til den faste matrix '>om et faststof-underlag, og den første immunreaktant forarbejdes yderligere til analyse ifølge trin (e) ved at (a) tilsætte en biologisk aktiv, mærket receptor, som binder til humant immunglobulin, som er til stede i 30 den første immunreaktant til dannelse af en mærket, anden immunreaktant, idet denne mærkede receptor er i stand til at signalere tilstedeværelsen af denne mærkede receptor i den anden immunreaktant, og (b) holde den således fremkomne blanding under bio-35 logiske analyseforhold i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt langt til at den mærkede receptor kan danne 49 DK 173262 B1 en anden immunreaktant med eventuelle anti-EA-D-antistoffer, sotn er til stede som første immunreaktant.
9. Diagnosesystem til analysering for tilstedeværelsen af anti-EA-D-antistoffer i en legemsvæskeprøve, kende-5 tegnet ved, at det i adskilte pakker indeholder: (a) et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyrerester med aminosyrerest-sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet det syntetiske polypeptid har kapacitet til immunologisk at binde antistoffer, som er fremkaldt mod
10. Diagnosesystem ifølge kra^ 9, kendetegne t ved, at polypeptidet fastgøres til den faste matrix 15 til dannelse af et fast underlag, og det mærkede, specifikke bindemiddel er en enzym-mærket receptor.
10 EA-D; og (b) et mærket, specifikt bindemiddel til at signalere immunreaktion af anti-EA-D-antistoffer med polypeptidet.
11. Diagnosesystem ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den mærkede receptor er humant immunglobulin klasse-specifikt.
12. Podestof, som er sammensat af en effektiv mængde af et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyrerester med sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet polypeptidet er bundet til en bærer og dispergeret i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel.
13. Receptor, fremkaldt over for et syntetisk poly peptid, kendetegnet ved, at polypeptidet hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyrerester med sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet receptoren er i stand til at immun-reagere med AE-D-proteinet.
14. Fremgangsmåde til analyse for tilstedeværelsen af EA-D i en legemsprøve, som hovedsagelig består af lyserede perifere blodlymfocytter, kendetegnet ved, at (a) blande prøven med receptorer til dannelse af en 35 immunreaktionsblanding, hvor receptorer fremkaldt over for et syntetisk polypeptid hovedsagelig består af 13 til 50 DK 173262 B1 40 aminosyrerester med sekvensen PARPETPSPAIPS-; (b) holde blandingen under biologiske analysebetingelser i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt langt til at eventuelt EA-D, som er til stede i prøven, kan immun- 5 reagere med receptorerne til dannelse af en immunreaktant, og (c) analysere for tilstedeværelsen af eventuel immunreaktant dannet i Blandingen.
15. Diagnosesystem til analysering for tilstedeværel-10 sen af EA-D i en legemsprøve, kendetegnet ved at den i adskilte pakker består af: (a) receptorer, som er fremkaldt over for et syntetisk polypeptid, som hovedsagelig består af 13 til 40 aminosyrerester med sekvensen PARPETPSPAIPS-, idet receptorerne er i 15 stand til at immunreagere med EA-D-proteinet; og (b) et mærket, specifikt bindemiddel til signalering af immunreaktionen af receptorerne med EA-D-protein.
16. Fremgangsmåde til analysering af en human legems-væskeprøve for mængden af IgA-, IgM- eller IgG-antistoffer 20 mod EA-D, kendetegnet ved, at den omfatter: (a) tilvejebringelse af en serum- eller plasmaprøve, som skal analyseres; (b) tilvejebringelse af et fast underlag, som omfatter en fast matrix, hvortil der er fastgjort et syntetisk 25 polypeptid med en amlnosyrerest-sekvens, taget fra venstre til højre og i retning fra amino-terminus til carboxy--terminus, som er repræsenteret ved formlen H-PARPETPSPAIPS-OH,' 30 (c) tilsætning af legemsvæskeprøven til det faste underlag til dannelse af en første immunreaktJonsblanding; (d) opbevaring af immunreaktionsblandingen under biologiske analyseforhold i et forudstemt tidsrum, som er til- 35 strækkeligt langt til at eventuelle anti-EA-D-antistuffer, som er til stede i prøven,kan binde immunologisk til poly- DK 173262 B1 51 peptidet af det faste underlag til dannelse af en første immunreaktant; (e) derpå fraskillelse af det faste underlag fra legemsvæskeprøven 5 (f) sætte det fraskilte faste underlag til biologisk aktive, mærkede receptorer til dannelse af en anden immun-reaktionsblanding, idet de mærkede receptorer er immunglo-bulin klasse-specifikke og i stand til at binde til og signalere tilstedeværelsen af eventuelt humant immunglobulin 10 af klasserne IgA, IgM eller IgG, som er til stede som første immunreaktant; (g) opbevaring af den anden således fremkomne immunreaktionsblandingen under biologiske analyseforhold i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt largt tH at 15 de mærkede receptorer kan danne en anden immunreaktant med eventuelle IgA-, IgM- eller IgG-antistoffer mod EA-D, som er til stede som første immunreaktant; (h) fraskillelse af det faste underlag fra eventuelle mærkede receptorer, som ikke er bundet som anden immun- 20 reaktant; og (i) analysering af mængden af mærkede receptorer, som er til stede som anden immunreakta; t og således mængden af IgA-, IgM- eller IgG-antistoffer, som er til stede i legemsvæskeprøven . 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93864386 | 1986-12-05 | ||
| US06/938,643 US4879213A (en) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK638887D0 DK638887D0 (da) | 1987-12-04 |
| DK638887A DK638887A (da) | 1988-06-06 |
| DK173262B1 true DK173262B1 (da) | 2000-05-29 |
Family
ID=25471727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198706388A DK173262B1 (da) | 1986-12-05 | 1987-12-04 | Syntetisk polypeptid og dets anvendelse til diagnosticering af Epstein-Barr-virus, syntetisk polypeptidoligomer og syntetis |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879213A (da) |
| EP (1) | EP0280813B1 (da) |
| JP (2) | JP2624973B2 (da) |
| AT (1) | ATE107316T1 (da) |
| AU (1) | AU610099B2 (da) |
| CA (1) | CA1315481C (da) |
| DE (1) | DE3750088T2 (da) |
| DK (1) | DK173262B1 (da) |
| ES (1) | ES2054692T3 (da) |
| IE (1) | IE63368B1 (da) |
| IL (1) | IL84690A (da) |
| NZ (1) | NZ222794A (da) |
| ZA (1) | ZA879025B (da) |
Families Citing this family (164)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7351412B1 (en) * | 1983-12-05 | 2008-04-01 | Institut Pasteur | Cloned DNA sequences related to the genomic RNA of lymphadenopathy-associated-virus (LAV) and proteins encoded by said LAV genomic RNA |
| US5116725A (en) * | 1984-08-08 | 1992-05-26 | Scripps Clinic And Research Foundation | Assay for Epstein-Barr virus infection with solid phase bound synthetic polypeptides |
| US6261563B1 (en) * | 1985-11-26 | 2001-07-17 | Pharmacia & Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| US6251634B1 (en) * | 1985-11-26 | 2001-06-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| US5256768A (en) * | 1985-12-13 | 1993-10-26 | The Johns Hopkins University | Expression of antigenic Epstein-Barr virus polypeptides in bacteria and their use in diagnostics |
| DE3706233A1 (de) * | 1987-02-26 | 1988-09-08 | Behringwerke Ag | Immunogene fusionsproteine, die epstein-barr-virusproteine enthalten |
| NZ225295A (en) * | 1987-07-07 | 1991-07-26 | Biotech Australia Pty Ltd | Nematode antigen, its production and vaccines containing it |
| US5948644A (en) * | 1988-09-26 | 1999-09-07 | Biotechnology Australia Pty Ltd. | Polynucleotides encoding excretory/secretory proteins of parasitic nematodes, host cells transformed therewith |
| US5079172A (en) * | 1988-11-04 | 1992-01-07 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit |
| US6572862B1 (en) * | 1989-11-08 | 2003-06-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and reagents to detect and characterize Norwalk and related viruses |
| EP0585216A1 (en) * | 1989-11-24 | 1994-03-09 | The Council Of The Queensland Institue Of Medical Research | Im peptides |
| AU640430B2 (en) * | 1989-11-24 | 1993-08-26 | Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The | Im peptides |
| US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
| JP2596466B2 (ja) * | 1990-03-03 | 1997-04-02 | アサヒビール株式会社 | ダニの主要アレルゲンの還伝情報を有するｄｎａおよび該アレルゲンの製造方法 |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| US5798105A (en) * | 1990-06-06 | 1998-08-25 | University Of Nijmegan | DNA encoding a plasmodium 16kD protein |
| GB9014950D0 (en) * | 1990-07-06 | 1990-08-29 | Univ Glasgow | Ehv-4 glycoprotein vaccine |
| US5674735A (en) * | 1990-07-06 | 1997-10-07 | University Court Of The University Of Glasgow | DNA encoding the EHV-4 gH or gC glycoprotein |
| US6730305B1 (en) | 2000-05-08 | 2004-05-04 | The Uab Research Foundation | Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins |
| WO1992001471A1 (en) * | 1990-07-24 | 1992-02-06 | The Uab Research Foundation | Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins vaccines, antibodies, and transformed cells |
| GB9016315D0 (en) * | 1990-07-25 | 1990-09-12 | Burnie James P | Medicaments |
| US5736362A (en) * | 1990-10-26 | 1998-04-07 | The University Of Melbourne | Ryegrass pollen allergen |
| US5972337A (en) * | 1990-11-01 | 1999-10-26 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein |
| US5200344A (en) * | 1990-11-13 | 1993-04-06 | Blaser Martin J | Diagnostic testing for campylobacter jejuni or campylobacter coli infections using novel antigens |
| JP3015969B2 (ja) * | 1990-11-30 | 2000-03-06 | ダイナボット株式会社 | 扁平上皮癌関連抗原蛋白質及び該蛋白質をコードするｄｎａ |
| GB9027728D0 (en) * | 1990-12-20 | 1991-02-13 | Smithkline Beecham Biolog | Novel protein |
| US5741493A (en) * | 1991-01-24 | 1998-04-21 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Vaccine composition against influenza, with synergic effects, containing influenza virus core as an additive |
| AU663863B2 (en) * | 1991-02-06 | 1995-10-26 | Biotech Australia Pty Limited | Nematode vaccine |
| US5525508A (en) * | 1991-02-06 | 1996-06-11 | Biotech Australia Pty Limited | Haemonchus contortus vaccine |
| US6099843A (en) * | 1991-02-12 | 2000-08-08 | Heska Corporation | Parasitic helminth PLA2 proteins |
| US6673916B1 (en) | 1991-02-12 | 2004-01-06 | Colorado State University Research Foundation | Compositions of parasitic helminth PLA2 nucleic acid molecules and uses thereof |
| US6419923B1 (en) * | 1991-02-12 | 2002-07-16 | Heska Corporation | Filariid nematode cysteine protease proteins, and uses thereof |
| DE69233441T2 (de) | 1991-04-26 | 2005-10-13 | Osaka Bioscience Institute, Suita | Menschliches Zelloberflächen-Antigen codierende DNA |
| US5670362A (en) * | 1991-06-18 | 1997-09-23 | Akzo Nobel N.V. | DNA encoding an Eimeria 100kD antigen |
| ZA924203B (en) * | 1991-06-18 | 1993-03-31 | Akzo Nv | Coccidiosis poultry vaccine |
| US6146870A (en) * | 1991-12-13 | 2000-11-14 | Heska Corporation | Flea protease proteins |
| GB9200117D0 (en) * | 1992-01-06 | 1992-02-26 | Connaught Lab | Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use |
| US7141244B1 (en) * | 1992-03-02 | 2006-11-28 | Chiron Srl | Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics |
| GB9209993D0 (en) * | 1992-05-08 | 1992-06-24 | Munn Edward A | Vaccines |
| US5736141A (en) * | 1992-06-05 | 1998-04-07 | Dalhousie University | Method to prevent fertilization in mammals by administering a single dose of zona pellucida derived antigens, liposome and Freund's adjuvant |
| USRE37224E1 (en) * | 1992-06-05 | 2001-06-12 | Dalhousie University | Method to prevent fertilization in mammals by administering a single dose of zona pellucida derived antigens, liposome and adjuvant |
| US5980899A (en) * | 1992-06-10 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Identification of peptides that stimulate hepatitis C virus specific cytotoxic T cells |
| PT671946E (pt) * | 1992-09-15 | 2000-12-29 | Univ Georgetown | Peptidos imunorreactivos do virus epstein-barr |
| US7060283B1 (en) | 1992-09-15 | 2006-06-13 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Immunoreactive peptides from Epstein-Barr virus |
| US7326535B2 (en) * | 1993-09-15 | 2008-02-05 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Immunoreactive peptides from Epstein-Barr virus |
| US5962316A (en) * | 1992-10-16 | 1999-10-05 | Cold Spring Harbor Laboratory | Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto |
| US6290962B1 (en) * | 1992-11-03 | 2001-09-18 | Oravax, Inc. | Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection |
| US5972336A (en) * | 1992-11-03 | 1999-10-26 | Oravax Merieux Co. | Urease-based vaccine against helicobacter infection |
| AU685776B2 (en) * | 1993-01-22 | 1998-01-29 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Ganglioside-KLH conjugate vaccines with QS-21 |
| CN1080307C (zh) * | 1993-02-26 | 2002-03-06 | 芬兰国家公众健康机构 | 促进革兰氏阳性细菌中产生商业重要的外蛋白的方法和系统 |
| US6849427B1 (en) * | 1993-03-12 | 2005-02-01 | Immulogic Pharmaceutical Corp. | Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p VII, and uses therefor |
| CA2116640A1 (en) * | 1993-03-25 | 1994-09-26 | Alexey Terskikh | Carcinoembryonic antigen derivatives |
| US6632613B1 (en) * | 1993-06-02 | 2003-10-14 | University Of Utah Research Foundation | Compositions and kits for fluorescence polarization assay of large molecules |
| GB9312324D0 (en) * | 1993-06-15 | 1993-07-28 | Pitman Moore Inc | Vaccine |
| US5571711A (en) * | 1993-06-17 | 1996-11-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for BAGE tumor rejection antigen precursors |
| CA2167691A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-02 | Martin J. Blaser | Campylobacter jejuni antigens, and methods for their production and use |
| JPH09502091A (ja) * | 1993-09-03 | 1997-03-04 | マックギル ユニヴァーシティー | 特異的に発現するリーシュマニア遺伝子及び蛋白質 |
| GB9322702D0 (en) * | 1993-11-03 | 1993-12-22 | Agricultural & Food Res | Vaccines |
| US7691632B2 (en) * | 1993-11-18 | 2010-04-06 | Cold Spring Harbor Laboratory | Kit for detecting the level of cyclin-dependent kinase inhibitor P16 gene expression |
| US6740734B1 (en) | 1994-01-14 | 2004-05-25 | Biovitrum Ab | Bacterial receptor structures |
| SE9400088D0 (sv) * | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
| AUPM368994A0 (en) * | 1994-02-04 | 1994-02-24 | Saramane Pty Ltd | Malaria merozoite antigen subunit vaccine |
| CA2182778A1 (en) * | 1994-02-09 | 1995-08-17 | Leo Sjoerd Melchers | Antifungal proteins, dna coding therefor, and hosts incorporating same |
| EP0745124B1 (en) | 1994-02-14 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | Mammalian cell cycle protein |
| US20030129204A1 (en) * | 1994-03-25 | 2003-07-10 | Moredun Scientific Limited | Vaccines against helminthic parasites |
| US5693496A (en) * | 1994-06-20 | 1997-12-02 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding the mouse and human PH30 beta chain protein |
| JPH10502366A (ja) * | 1994-07-01 | 1998-03-03 | リカン・リミテッド | ヘリコバクター・ピロリ抗原タンパク質調製品およびイムノアッセイ |
| ZA958366B (en) * | 1994-10-06 | 1996-04-24 | Akzo Nobel Nv | New toxoplasma gondii antigens |
| US8114414B2 (en) * | 1994-11-08 | 2012-02-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of cervical cancer |
| US8956621B2 (en) | 1994-11-08 | 2015-02-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of cervical dysplasia |
| US6051237A (en) * | 1994-11-08 | 2000-04-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Specific immunotherapy of cancer using a live recombinant bacterial vaccine vector |
| US8791237B2 (en) | 1994-11-08 | 2014-07-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma |
| US5976543A (en) * | 1994-12-04 | 1999-11-02 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | 12-kDa protein derived from M. Tuberculosis useful for treatment of autoimmune diseases |
| FR2728904B1 (fr) * | 1995-01-04 | 1997-03-14 | Pasteur Institut | Reactif peptidique permettant de detecter une infection primaire a virus d'epstein-barr par recherche des anticorps correspondants, et procede d'utilisation de ce reactif |
| US6287574B1 (en) * | 1995-03-17 | 2001-09-11 | Biochem Pharma Inc. | Proteinase K resistant surface protein of neisseria meningitidis |
| US6506553B1 (en) * | 1995-03-30 | 2003-01-14 | Ortho Diagnostics Systems, Inc. | Method for diagnosis of Epstein-Barr virus associated disease |
| ES2170195T3 (es) * | 1995-06-06 | 2002-08-01 | Organon Teknika Bv | Peptidos del virus de epstein-barr y anticuerpos contra estos peptidos. |
| US6251405B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-06-26 | Connaught Laboratories, Inc. | Immunological combination compositions and methods |
| ZA964896B (en) * | 1995-06-07 | 1997-01-08 | Connaught Lab | Expression of lipoproteins |
| US5863543A (en) * | 1996-06-05 | 1999-01-26 | University Of Saskatchewan | Camp factor of streptococcus uberis |
| US6936259B2 (en) | 1995-06-08 | 2005-08-30 | University Of Saskatchewan | CAMP factor of Streptococcus uberis |
| FR2736360B1 (fr) * | 1995-07-04 | 1997-09-05 | Pasteur Institut | Clonage et caracterisation du gene fiba de h.pylori, production de souches aflagellees |
| US6592877B1 (en) * | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6338852B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-01-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) * | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| CN1214080A (zh) * | 1995-09-26 | 1999-04-14 | 华盛顿州大学 | Rfhv/kshv亚族疱疹病毒的糖蛋白b |
| US6610506B1 (en) * | 1995-12-01 | 2003-08-26 | University Technologies International, Inc. | Transferrin binding proteins of Pasteurella haemolytica and vaccines containing same |
| US6001600A (en) * | 1996-12-20 | 1999-12-14 | Smithkline Beecham Plc | DNA encoding tests polypeptides |
| GB9526359D0 (en) * | 1995-12-22 | 1996-02-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| GB9526356D0 (en) * | 1995-12-22 | 1996-02-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| AU1463097A (en) * | 1996-01-04 | 1997-08-01 | Rican Limited | Helicobacter pylori bacterioferritin |
| US5910568A (en) * | 1996-01-11 | 1999-06-08 | The Penn State Research Foundation | Molecule involved in binding of sperm to egg surfaces and procedures for use of this molecule to enhance or decrease potential fertility |
| GB9600955D0 (en) * | 1996-01-17 | 1996-03-20 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| DE19601754A1 (de) * | 1996-01-19 | 1997-07-24 | Hoechst Ag | Dictyocaulus viviparus Antigen zur Diagnose des Lungenwurmbefalls und zur Vakzinierung |
| US6087163A (en) | 1997-02-06 | 2000-07-11 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Mycobacterium tuberculosis specific proteins and genes, mixtures of anitgens and uses thereof |
| US7341727B1 (en) * | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
| US5952194A (en) * | 1996-08-01 | 1999-09-14 | Heska Corporation | Flea nucleic acid sequences and uses thereof |
| BR9706543A (pt) * | 1996-08-01 | 1999-12-28 | Dale Wallis | Serpens spp biologicamente pura cepa hbl-112, composição farmacêutica e processos para evitar e/ou tratar dermatite digital papilomatosa de ruminante, e para determinar a presença de anticorpos pdd em uma amostra de soro e de anticorpos anti-serpens spp. em um ruminante, e, kit de diagnóstico |
| US6284255B1 (en) * | 1996-08-29 | 2001-09-04 | Genesis Research & Development Corporation Limited | Compounds and methods for treatment and diagnosis of mycobacterial infections |
| US6190659B1 (en) * | 1996-09-17 | 2001-02-20 | The Rockefeller University | Bacterial plasmin binding protein and methods of use thereof |
| US5976542A (en) * | 1996-09-23 | 1999-11-02 | New England Medical Center | Compositions and methods for treatment of streptococcus pneumoniae infection |
| US6451315B1 (en) | 1996-10-01 | 2002-09-17 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of B. microti infection |
| US6214971B1 (en) | 1996-10-01 | 2001-04-10 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of Babesia microti infection |
| US6183976B1 (en) | 1996-10-01 | 2001-02-06 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of B. microti infection |
| US20040023865A1 (en) * | 1996-10-01 | 2004-02-05 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of B. microti infection |
| US6569433B1 (en) | 1996-10-01 | 2003-05-27 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of B. microti infection |
| US6306396B1 (en) * | 1996-10-01 | 2001-10-23 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of B. microti infection |
| US6593147B1 (en) | 1996-10-17 | 2003-07-15 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Nucleic acid vaccines against rickettsial diseases and methods of use |
| US6653128B2 (en) | 1996-10-17 | 2003-11-25 | University Of Florida | Nucleic acid vaccines against rickettsial diseases and methods of use |
| US6025338A (en) * | 1996-10-17 | 2000-02-15 | University Of Florida | Nucleic acid vaccines against rickettsial diseases and methods of use |
| US6372887B1 (en) * | 1996-11-07 | 2002-04-16 | Heska Corporation | Flea serine protease inhibitor proteins |
| US5869290A (en) * | 1996-11-21 | 1999-02-09 | Smithkline Beecham Corporation | Cayae1 polynucleotides |
| US6403093B1 (en) * | 1997-03-21 | 2002-06-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods to detect granulocytic ehrlichiosis |
| US6555653B2 (en) | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
| US6613881B1 (en) | 1997-05-20 | 2003-09-02 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
| AUPO784197A0 (en) * | 1997-07-10 | 1997-08-07 | Csl Limited | Treatment of nasopharyngeal carcinoma |
| US6761888B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7588766B1 (en) * | 2000-05-26 | 2009-09-15 | Elan Pharma International Limited | Treatment of amyloidogenic disease |
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| EP1125130B1 (de) * | 1998-10-29 | 2006-07-26 | DakoCytomation Denmark A/S | Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| MXPA01009256A (es) * | 1999-03-12 | 2003-07-14 | Aventis Pasteur | Antigenos de chlamydia y fragmentos de acido desoxirribonucleico correspondientes y usos de los mismos. |
| US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6602977B1 (en) | 1999-04-19 | 2003-08-05 | Biovitrum Ab | Receptor structures |
| WO2001024820A1 (en) * | 1999-10-07 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| WO2001062893A2 (en) * | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| CA2404164A1 (en) * | 2000-03-29 | 2001-10-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for enhancing immunogenicity of antigens |
| ATE526994T1 (de) * | 2000-06-20 | 2011-10-15 | Corixa Corp | Mtb32a antigen aus mycobakterium tuberculosis mit inaktivierter protease aktivität und fusionsproteine die das antigen enthalten |
| US6821739B2 (en) * | 2000-10-13 | 2004-11-23 | The Regents Of The University Of California | Methods of diagnosing and treating Crohn's disease using Pseudomonas antigens |
| US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
| US7700344B2 (en) * | 2001-03-26 | 2010-04-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for enhancing the immunogenicity of antigens |
| US8771702B2 (en) | 2001-03-26 | 2014-07-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Non-hemolytic LLO fusion proteins and methods of utilizing same |
| JP2005506322A (ja) * | 2001-08-31 | 2005-03-03 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉワクチン接種 |
| NO318426B1 (no) | 2001-10-02 | 2005-04-18 | Neurozym Biotech As | Et materiale for a senke konsentrasjonen av patogene tarmpeptider |
| AU2003213118A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7344718B2 (en) * | 2003-01-31 | 2008-03-18 | University Of North Dakota | Yersinia species compositions |
| BRPI0407058A (pt) * | 2003-02-01 | 2006-01-17 | Neuralab Ltd | Métodos de profilaxia e de tratamento de uma doença, composição farmacêutica, e, uso de um fragmento |
| TWI306458B (en) | 2003-05-30 | 2009-02-21 | Elan Pharma Int Ltd | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| PL1961426T3 (pl) * | 2003-10-02 | 2012-03-30 | Gsk Vaccines S R L | Skojarzone szczepionki przeciwko zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych |
| CA2590337C (en) | 2004-12-15 | 2017-07-11 | Neuralab Limited | Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition |
| EP1838854B1 (en) | 2004-12-15 | 2012-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Antibodies that recognize Beta Amyloid Peptide |
| GB0507632D0 (en) * | 2005-04-15 | 2005-05-25 | Secr Defence | Vaccine |
| GB0519871D0 (en) * | 2005-09-30 | 2005-11-09 | Secr Defence | Immunogenic agents |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| US8268326B2 (en) * | 2006-08-15 | 2012-09-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising HMW-MAA and fragments thereof, and methods of use thereof |
| US8241636B2 (en) * | 2006-08-15 | 2012-08-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising HMW-MAA and fragments thereof, and methods of use thereof |
| CA2684494C (en) * | 2007-04-16 | 2016-07-05 | Lunds Universitets Utvecklingsaktiebolag | Fusion protein capable of eliciting protective immunity against group b streptococcus |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| ES2498040T3 (es) | 2007-07-27 | 2014-09-24 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| US8758765B2 (en) * | 2008-07-29 | 2014-06-24 | The University Of Chicago | Compositions and methods related to Staphylococcal bacterium proteins |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
| GB0900455D0 (en) | 2009-01-13 | 2009-02-11 | Secr Defence | Vaccine |
| PT2403935T (pt) | 2009-03-04 | 2017-09-22 | Univ Pennsylvania | Composições compreendendo fatores angiogénicos e metedos para a sua utilização |
| DK2248533T3 (da) * | 2009-05-05 | 2014-02-10 | Universitaetsklinikum Freiburg | Polypeptid afledt af enterococcus samt dets anvendelse til vaccination |
| EP2717909B1 (en) * | 2011-06-04 | 2017-12-06 | Rochester General Hospital Research Institute | Compositions and methods related to p6 of haemophilus influenzae |
| US9211327B2 (en) | 2011-06-22 | 2015-12-15 | University Of North Dakota | Use of YSCF, truncated YSCF and YSCF homologs as adjuvants |
| US9133525B2 (en) | 2012-01-26 | 2015-09-15 | Luc Montagnier | Detection of DNA sequences as risk factors for HIV infection |
| WO2014025254A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Stichting Vu-Vumc | Ebv markers and systemic lupus erythematosus |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707358A (en) * | 1984-01-30 | 1987-11-17 | The University Of Chicago | Vaccine against Epstein-Barr Virus |
| US4654419A (en) * | 1984-08-08 | 1987-03-31 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to epstein-barr virus nuclear antigen |
-
1986
- 1986-12-05 US US06/938,643 patent/US4879213A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-12-01 ZA ZA879025A patent/ZA879025B/xx unknown
- 1987-12-02 ES ES87310609T patent/ES2054692T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-02 AT AT87310609T patent/ATE107316T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-12-02 DE DE3750088T patent/DE3750088T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-02 EP EP87310609A patent/EP0280813B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-02 IL IL84690A patent/IL84690A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-12-03 NZ NZ222794A patent/NZ222794A/xx unknown
- 1987-12-03 AU AU82073/87A patent/AU610099B2/en not_active Expired
- 1987-12-04 DK DK198706388A patent/DK173262B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-12-04 JP JP62307353A patent/JP2624973B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-04 CA CA000553508A patent/CA1315481C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-04 IE IE330387A patent/IE63368B1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-11-16 JP JP6281648A patent/JP2682959B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2054692T3 (es) | 1994-08-16 |
| JP2624973B2 (ja) | 1997-06-25 |
| CA1315481C (en) | 1993-03-30 |
| ATE107316T1 (de) | 1994-07-15 |
| JP2682959B2 (ja) | 1997-11-26 |
| EP0280813B1 (en) | 1994-06-15 |
| IL84690A0 (en) | 1988-05-31 |
| JPH07233200A (ja) | 1995-09-05 |
| US4879213A (en) | 1989-11-07 |
| EP0280813A2 (en) | 1988-09-07 |
| NZ222794A (en) | 1991-01-29 |
| DK638887D0 (da) | 1987-12-04 |
| IL84690A (en) | 1992-11-15 |
| ZA879025B (en) | 1988-05-27 |
| AU8207387A (en) | 1988-06-09 |
| IE63368B1 (en) | 1995-04-19 |
| EP0280813A3 (en) | 1990-06-06 |
| DE3750088D1 (de) | 1994-07-21 |
| AU610099B2 (en) | 1991-05-16 |
| IE873303L (en) | 1988-06-05 |
| JPS63225398A (ja) | 1988-09-20 |
| DE3750088T2 (de) | 1994-12-01 |
| DK638887A (da) | 1988-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173262B1 (da) | Syntetisk polypeptid og dets anvendelse til diagnosticering af Epstein-Barr-virus, syntetisk polypeptidoligomer og syntetis | |
| CA1292839C (en) | Synthetic polypeptides and antibodies related to epstein-barr virus nuclear antigen | |
| Dales et al. | Infection with vaccinia favors the selection of hybridomas synthesizing autoantibodies against intermediate filaments, one of them cross-reacting with the virus hemagglutinin. | |
| US5116725A (en) | Assay for Epstein-Barr virus infection with solid phase bound synthetic polypeptides | |
| JP4957974B2 (ja) | エプスタイン・バールウイルスのペプチド及びこれらのペプチドに対する抗体 | |
| KR100523972B1 (ko) | 엡스타인-바르바이러스펩타이드및이들펩타이드에대한항체 | |
| AU643188B2 (en) | Synthetic polypeptides and antibodies related to epstein-barr virus nuclear antigen | |
| JP3032221B2 (ja) | 合成ペプチドおよびエプスタインバールウィルス核抗原に対する抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |