PT2403935T - Composições compreendendo fatores angiogénicos e metedos para a sua utilização - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO FATORES ANGIOGÉNICOS E MÉTODOS
PARA A SUA UTILIZAÇÃO
CAMPO DE INVENÇÃO A presente invenção proporciona estirpes Listeria recombinantes compreendendo um fator angiogénico, vacinas relacionadas, e utilizações médicas imunogénicas e terapêuticas que a utilizam.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As células de segmentação envolvidas na angiogénese paralisam os tumores que crescem rapidamente, limitando o suprimento de oxigénio e nutrientes ou, dependendo da estratégia empregue, aumentando a suscetibilidade das células tumorais à quimioterapia, aumentando a eficiência de uma droga administrada por meio da reorganização da rede vascular. A resistência das células tumorais ao tratamento anti-angiogénese foi observada em sistemas de ratos e relatada para estudos humanos para vários tratamentos diferentes. Além disso, o microambiente do tumor (TME) recruta células supressoras derivadas de mieloides (MDSC) que são responsáveis pelo necessário circulo angiogénico necessário para o crescimento do tumor e eventual disseminação.
Estudos realizados por vários pesquisadores demonstraram repetidamente a importância de se direcionar a angiogénese tumoral devido ao seu papel central na invasão, crescimento e metástase. Uma vez que as células tumorais frequentemente matam em resposta à terapia ou a moléculas de classe I do MHC necessárias para respostas mediadas por células T, as células endoteliais e os pericitos, que são essenciais para a sobrevivência do tumor e podem não ter os mecanismos imunossupressores implantados pelos tumores, seriam vantajosos.
No entanto, trinta anos após, a angiogénese ter demonstrado desempenhar um papel habilitante no cancro, a medicina moderna ainda está a tentar desenvolver novos compostos e terapêuticas para direcionar a vasculatura do tumor. No entanto, a maioria das terapêuticas requer várias rodadas de administração e pode ter efeitos colaterais tóxicos. A WO 03/073995 (The Scripps Research Institute) descreve uma vacina de ADN compreendendo VEGFR2 para uso contra células proliferantes endoteliais e para o tratamento de tumores. A WO 2008/079172 (The Trustees of the University of Pennsylvania) descreve uma vacina baseada em Listeria compreendendo MHW-MAA para uso na indução de uma resposta imune contra e tratamento de tumores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico, em que o referido fator angiogénico é um polipéptido do recetor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), em que o referido polipéptido VEGFR2 é uma quinase de fígado fetal-1 (Flk-l)-El contendo SEQ ID NO: 5 ou uma sequência possuindo uma identidade maior que 83%, ou um fragmento Flk-l-Il compreendendo a SEQ ID NO: 7, ou uma sequência com uma identidade superior a 95%, ou uma combinação do mesmo.
Numa forma de realização, o fator angiogénico é expresso a partir de um promotor hly, um promotor prfA, um promotor actA ou um promotor p60.
Numa forma de realização, o fator angiogénico é expresso a partir de um vetor episomal ou do cromossoma Listeria.
Numa forma de realização, o fator angiogénico é fundido num polipéptido adicional, em que o referido polipéptido adicional é a) um LLO não hemolítico, b) um ActA N-terminal, ou c) uma sequência PEST. 0 polipéptido adicional pode aumentar a imunogenicidade do referido fator angiogénico.
Numa forma de realização, a estirpe Listerial recombinante é uma estirpe Listerial monocytogenes recombinante.
Numa forma de realização, a estirpe
Listeria recombinante foi passada através de um hospedeiro animal.
Numa forma de realização, a estirpe
Listeria recombinante induz a libertação de um ou mais fatores anti-angiogénicos, tais como o interferão-gama.
Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma vacina compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante da invenção e um adjuvante.
Noutra forma de realizaçãoo, a invenção proporciona uma estirpe Listeria recombinante da invenção, ou uma vacina, tal como aqui descrita, para utilização no tratamento, inibição ou supressão do crescimento de um tumor ou cancro num indivíduo, para utilização na direção da vasculatura tumoral do crescimento dum tumor ou cancro num sujeito, ou para uso na prevenção da recorrência de um tumor ou para uso na inibição de metástases de um tumor ou cancro num indivíduo. 0 tumor ou cancro pode ser um tumor ou cancro da mama, uma metástase cerebral ou um tumor ou cancro que expressa Her-2/neu.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Conceção do Flk-1/VEGFR2 que expressa construções baseadas em Lm. A. Cada fragmento de gene foi clonado no vetor de expressão pGG34 fundido com LLO e colocado sob o controlo do promotor hly. B. Transferência de Western a partir de sobrenadantes de cultura mostrando a expressão de cada proteína de fusão a partir das construções listadas. 0 anticorpo policlonal, coelho e anti-PEST foi utilizado para a deteção da proteína de fusão (parte inferior), e o anticorpo anti-LLO do rato foi utilizado para confirmação (topo). Observe que todas as pistas foram retiradas da mesma mancha de Western. C. IFN-g ELISpot mostrando respostas restritas de células T CD8+ ex vivo após imunização com cada construção. 0 grupo ingénuo foi injetado com PBS sozinho; Todos os grupos continham um controlo do grupoLm. As respostas são para os epítopos mapeados correspondentes para cada fragmento Flk. N = 5 por grupo. Os gráficos mostram média ± SEM; * P <0,05, teste estatístico de Mann-Whitney, experiência repetida uma vez.
Figura 2. Conceção do Flk-1/VEGFR2 que expressa construções baseadas em Lm. A. Regiões clonadas encaixotadas para cada construção construída, os aminoácidos destacados/negrito mostram epítopos de CTL mapeados para o haplotipo MH H2d/Ç. B. Mapa do gene flk que mostra uma forma de realização dos fragmentos utilizados na presente invenção. C. Desenhos animados mostrando como os fragmentos flk utilizados numa forma de realização da presente invenção relacionaram-se com os vários domínios do gene flk. D. O ensaio de infeção por macrófagos foi realizado como descrito nos métodos. As células J774A.1 foram incubadas com construções Listeria, lavadas e depois incubadas com gentimicina, bactérias capazes de infetar o macrófago e escapar para o citoplasma são mostradas em Alexa-488 (verde) , o PE CD1 lb+ Halo (vermelho) destrói a forma e o tamanho da célula.
Figura 3. As vacinas Lm -LLO-Flk-1 podem induzir a regressão de tumores Her-2/neu+ estabelecidos in vivo. A. volume de NT-2 do tumor (mm3) a partir de ratinhos tratados com cada construção. O gráfico mostra média ± SEM; * P <0,05, teste estatístico de Mann-Whitney, N = 8 ratos por grupo, experiência repetida duas vezes. B. IFN-g ELISpots mostrando epitopo espalhando-se para várias regiões de Her-2/neu. Os esplenócitos do ponto de tempo de 64 dias foram reestimados ex vivo com os epitopos do péptido Her-2/neu. 0 gráfico mostra média ± SEM; * P <0,05, teste estatístico de Mann-Whitney, N = 5 ratos por grupo, experiência repetida uma vez. C. Os ratos foram imunizados três vezes ao longo de três semanas após o estabelecimento inicial de tumores NT- 2. Nesta figura, mostramos coloração para o marcador de pan-endotelial CD31-PE e núcleo usando DAPI. Os controlos de isotipo foram usados em seções sequenciais como mostrado à direita. Quantificação da densidade do vaso realizada pelo software Image Pro. O gráfico mostra média ± SEM, * p <0,05, teste de Mann-Whitney, ns = não significativo. D. Coloração para o marcador de pan-endotelial CD31-PE, o núcleo usando DAPI e o marcador hipóxico nuclear Hypoxia Inducible Factor-la (HIF-la).
Figura 4. Os ratos com tumores totalmente regredidos mostram memória de longo prazo para o re-desafio do tumor. A. Os ratos que tinham tumores totalmente regredidos foram re-desafiados com NT-2 no flanco contra lateral no dia 100. Um grupo tratado com solução salina foi usado como nosso controlo negativo para o crescimento tumoral. B. Volume tumoral para ratos que cresceram tumores após o re-desafio no dia 100 dos ratinhos isentos de tumor. Ambos os gráficos se referem a uma única experiência. 0 número de ratinhos isentos de tumor foi 2/8 para os grupos Flk-El e Flk-Il, o grupo salino tinha 5 ratos.
Figura 5. As vacinas anti-angiogénese não são eficazes em ratinhos tolerantes a HER-2/neu. Os ratinhos transgénicos FVB/N tipo selvagem (WT) ou FVB/N transgénicos (Tg) foram injetados com lxlO6 células NT-2 sc, os tumores foram autorizados a crescer até se mostrarem palpáveis antes do inicio do tratamento. Os ratinhos foram imunizados um total de três vezes, os tamanhos médios do tumor são mostrados aqui por até 69 dias após a inoculação do tumor. Os gráficos mostram média ± SEM; * P <0,05, teste de Mann-Whitney, experiência repetida duas vezes. B. Os baços foram processados para IFN-g ELISpots, estimulados com vários péptidos Her-2/neu ex vivo, ou um péptido de terceiros como um controlo negativo (pGag). Os gráficos mostram média ± SEM; * P <0,05, teste de Mann-Whitney, experiência repetida uma vez. C. Os tumores de cada grupo foram agrupados e digeridos para TILs; aqui mostramos a coloração de células T Her-2/neu especifica para tetrâmeros específicos de CD8a e EC1 ou IC1. Significativamente, mais células T específicas de Her-2/neu são encontradas nos ratinhos de tipo selvagem (WT) mas não transgênicos (Tg); o grupo Lm de controlo mostra baixo nível de fundo. Experiência repetida uma vez dando resultados semelhantes.
Figura 6. Os ratinhos protegidos com vacinas anti-Flk-1 Lm mostram crescimento reduzido do tumor primário, carga tumoral e redução da morbidade e mortalidade quando desafiados com metástases experimentais 4T1. A. Os tumores subcutâneos primários 4T1 crescem mais lentamente em animais protegidos com Lm -LLO-Flk-1. Os ratinhos foram imunizados três vezes com cada vacina, em seguida, injetados com sc e iv com 50 000 células 4T1. O gráfico mostra média ± SEM para o volume do tumor. B. Carga tumoral mostrada como percentagem de ratinhos isentos de tumor após o desafio com células 4T1 sc O gráfico mostra a média de 8 ratinhos por grupo tratado. C. O gráfico mostra percentagem de ratinhos bem/ saudáveis com base em inspeção visual e observação. N = 8 ratos por grupo.
Figura 7. As vacinas Flk-1 podem proteger os ratinhos de metástases experimentais e induzem o epítopo fraco de Her- 2/neu espalhando-se num modelo de tumor mais agressivo para cancro da mama. A. Os ratinhos foram imunizados três vezes com cada vacina, em seguida injetados com 50000 células 4T1 iv, os tumores foram autorizados a crescer durante 25 dias, em seguida, os ratos foram sacrificados. As secções coradas com H + E foram realizadas em tecidos pulmonares, os nós tumorais foram contados à mão. O gráfico mostra o número de metástases pulmonares por lóbulo por animal, média ± SEM; * P <0,05, teste de Mann-Whitney, experiência repetida uma vez, N = 5 ratos mostrados. B. Os baços destes animais foram processados e re-desafiados ex vivo em ensaios ELISpot de IFN-g para propagação de epitopos Her-2/neu. A linha celular 4T1 expressa niveis baixos de rato Her-2/neu. A dispersão é vista apenas nos ratos imunizados Flk-l-El. O gráfico mostra a média de + SEM para o número do ponto por poço em comparação com o grupo de controlo Lm; * P <0,05, teste de Mann-Whitney, experiência repetida uma vez, N = 5 por grupo. C. Uma experiência similar em que os ratinhos foram protegidos por imunização com cada vacina por uma série de três semanas, em seguida, injetadas com 50000 células 4T1-Luc iv, os ratinhos foram fotografados longitudinalmente ao longo de quatro semanas procurando a incidência de semeadura pulmonar e taxa de metástase. Radiação média em fotões (p) capturados por segundo (s) por cm2 para a área de superfície (sr) fechada no ROI. O gráfico mostra média ± SEM; * P <0,05, teste de Mann-Whitney. Significado para ratos da seguinte forma: Dia 18, somente Flk-El significativo; Dia 25, ambos Flk-El e Flk-Il significativamente diferentes quando comparados ao controlo Lm.
Figura 8. Estudos de segurança usando as vacinas anti-angiogénese Flk-1. Os ratinhos foram imunizados três vezes como realizado em todas as experiências anteriores, em seguida, foram permitidos para se matricular ou entrar em estudos de cicatrização de feridas. A. Os ratos (n = 5/ grupo) foram acasalados com machos singénicos FVB/N, a gestação foi confirmada após a observância de um exsudado vaginal após o coito. Isso foi considerado como dia 0.5 dpc. A duração total da gestação, a massa do cacho no termo e o tamanho total da ninhada foram medidos, os gráficos mostram média ± SEM; * P <0,05. B. Um par de biópsias de pele estéril foram produzidas nas costas de cada rato vacinado (N = 5/grupo). A cura foi observada diariamente. No dia 14, a cura foi completa para todos os grupos testados, observou-se uma cura idêntica para todos os grupos. O gráfico mostra o número de dias até o fechamento da ferida, média ± SEM; * P <0,05, teste de Mann-Whitney.
Figura 9. A disseminação do epítopo induzido pela vacina Flk-1 pode não ser devido à reatividade cruzada entre os domínios compartilhados Flk-1 e Her-2/neu. Os ratos foram imunizados três vezes com a vacina Lm ou Flk-Il de controlo. Os esplenócitos foram processados e re-desafiados ex vivo para a secreção de IFN-g em resposta ao desafio do péptido. Os péptidos incluídos foram o epítopo pFlk-Il previamente mapeado (PGGPLMVIV; SEQ ID NO: 1), um epítopo pICl putativo para Her-2/neu (GSGAFGTVYK; SEQ ID NO: 2) ou o epítopo em questão, um epítopo compartilhado putativo entre os domínios de quinase Her-2/neu e Flk-1 (GRGAFGQVI; SEQ ID NO: 3) e um epítopo de terceiros usado como controlo negativo (pGag). O gráfico mostra a média ± SEM, N = 3/grupo.
Figura 10A. As vacinas Flk-1 podem retardar significativamente o crescimento tumoral em modelos espontâneos e ortotópicos para o cancro da mama Her-2/ neu. Os ratinhos transgénicos FVB-rHer-2/neu foram imunizados três vezes com cada vacina Flk ou controlo Lm sozinhos. Os tumores de cada rato foram examinados para a mensagem mutada Her-2/neu. Mensagem ARN foi recolhida, cADN sintetizado e sequenciado. A sequência resultante foi emparelhada ao lado da sequência do tipo selvagem para determinar os resíduos mutados. Somente as mutações que surgiram 4 vezes ou mais foram consideradas mutações verdadeiras. Um resumo de todas as mutações é encontrado à esquerda, isto mostra um N de pelo menos 3, mas não mais de 5 ratos, por grupo. Todos os dados mutacionais são combinados e sobrepostos na sequência de tipo selvagem Her-2/neu do rato. Os negativos negros são mutações que ocorrem quando as vacinas estão contra os domínios Her-2/neu (Singh, 2007). Os resíduos aa de destaque vermelho são mutações que surgem quando as vacinas Flk-1 são usadas. A região com destaque azul mostra o domínio Her-2/neu quinase. A região com destaque verde mostra o domínio de ligação a ATP.
Figura 10B. 0 crescimento tumoral é devido a mutações que surgem nos principais epítopos de CTL responsáveis por manter o tumor em registo. Olhando mais de perto "hot-spots" ou cordas de resíduos mutados, descobrimos que vários resíduos mutados são encontrados nos epítopos CTL anteriormente descritos (Singh, 2005 e 2007) . Um desses epítopos mostra mutações em aminoácidos chave responsáveis pela ancoragem do epítopo à molécula H2Dq MHC I. Outros "hot-spots" estão a ser investigados para novos epítopos de CTL.
Figura 11A. A vacina quimérica humana anti-Her-2/neu pode retardar o crescimento de uma linha metastática de cancro da mama no cérebro de ratinhos protegidos. Os ratinhos Balb/c foram imunizados três vezes com cada vacina, quer anti-humano Her-2/neu ou vacinação de controlo NYESOl. As células EMT6-Luc (do laboratório de John Ohlfest na Universidade de Minnesota) foram cultivadas in vitro e injetadas no cérebro de ratinhos anestesiados a 5000 células por rato. As células EMT6-Luc expressam níveis baixos de Her-2/neu do rato (dados não mostrados). As células foram autorizadas a crescer antes de serem fotografadas nos dias indicados. As células EMT6-Luc produzem a enzima luciferase e quando metabolizam a D-Luciferina in vivo, os subprodutos são fotões capturados ex vivo usando uma câmara Xenogen X-100 e exibida usando um mapa de calor. A intensidade de pixel é representada como número de fótões por segundo por cmA2 por cm de área de superfície, apresentado como radiação média.
Figura 11B. A vacina humana anti-HMWMAA pode retardar o crescimento de uma linha de melanoma metastático no cérebro de ratinhos protegidos. Os ratinhos C57B1/6 foram imunizados três vezes com cada vacina, seja HMWMAA-C anti-humano ou vacinação de controlo NYES01. As células B16F10-Luc (do laboratório de Jeff Miller na UCSF) foram cultivadas in vitro e injetadas no cérebro de ratinhos anestesiados a 5000 células por rato. A linha parental B16F10 não expressa HMWMAA (comunicação pessoal), portanto, a única fonte de HMWMAA está em pericítes e células gliais. Mecanismo de Luciferase e captura de imagem da mesma forma que na Figura 11A.
Figura 12. Sequência de endoglina (CD105). O fragmento original, baseado na sequência clonada pelo grupo de Reisfeld, que foi clonado em Lm-LLO-CD5 está em negrito e sublinhado. Note-se que Rankpep e outros programas de predição de epítopos do MHC mostraram que existem vários epítopos de CTL putativos (destacados em vermelho) para os haplótipos b, d e k H-2 que se encontram fora dessa região.
Figura 13. O design das construções Listeria que expressam CD105A e CD105B. A. As regiões clonadas para cada construção estão em negrito e dois epítopos putativos são sublinhados; Lm-LLO-CD105A e Lm-LLOCD105B abrangem quase todo o gene endoglina e abrangem mais epítopos de CTL potenciais. B. Cada fragmento sublinhado foi clonado no vetor de expressão pGG34 fundido com LLO adjuvante.
Figura 14. Lm-LLO-CD105A expressa e segrega uma proteína de tamanho apropriado (~ 80 kD) detetada por um anticorpo anti-LLO e Western Blot: as estirpes XFL7 foram transformadas com plasmídeo CD105A usando eletroporação. As células XFL7 transformadas foram plaqueadas em 37 pg/mL e 250 pg / uL de cloranfenicol e estreptomicina. As colónias que se formaram durante o período de incubação de dois dias foram cultivadas em meio LB, centrifugadas e o sobrenadante e o lisado celular foram submetidos a transferência de Western para detetar a proteína de fusão de fusão como uma proteína secregada no sobrenadante ou proteína endógena n presa dentro da célula bacteriana.
Figura 15. Lm-LLO-CD105B expressa e segrega uma proteína de tamanho apropriado (~ 74kD) detetada por um anticorpo anti-LLO e Western Blot: as estirpes XFL7 foram transformadas com plasmídeo CD105A usando eletroporação. As células XFL7 transformadas foram plaqueadas em 37 pg/mL e 250 pg/uL de clorapenicol e estreptomicina. As colónias que se formaram durante o período de incubação de dois dias foram cultivadas em meio LB, centrifugadas e o sobrenadante e o lisado celular foram submetidos a transferência de Western para detetar a proteína de fusão de fusão como uma proteína segregada no sobrenadante ou proteína endógena n presa dentro da célula bacteriana.
Figura 16. Crescimento de tumores 4T1 (2 x 105 células implantadas na almofada de gordura mamária) em ratinhos Balb/ c imunizados com Lm-LLO-CD105 A e B em comparação com uma vacina de controlo Lm-LLO-NY-ESO-1. Os ratinhos foram vacinados com 2 x 108 ufc de cada vacina nos dias indicados.
Figura 17. Os ratinhos da experiência mostrada na Figura 5B foram sacrificados no dia 32 e os pulmões foram removidos e inflados com PBS. As metástases da superfície visível foram contadas sob um microscópio de dissecação. Uma diminuição significativa foi observada apenas para Lm-LLO-CD105B em comparação com ingénuo (p <0,01) ou Lm-LLO-NY-ESOl (p <0,05).
Figura 18. A imunização com Lm-LLO-CD105A e B induz o espalhamento de epítopos para antigenos endógenos HER-2/neu e gp70 e a indução de células T especificas de antigeno no baço. No dia 22 após a implantação do tumor na experiência mostrada na Figura 5B, os baços foram removidos de 3 ratinhos, reunidos, e uma única suspensão celular foi analisada por ELISpot após a estimulação com os péptidos mostrados. Note-se que Kd e Dd são dois péptidos da sequência de endoglina que se prevê que se liguem a estas moléculas MHC de classe I. Residem no CD105A: AGPRTVTVM (Dd) e em CD105B AYSSCGMKV (Kd).
Figura 19. A imunização com Lm-LLO-CD105A e B induz o espalhamento de epítopos para antigenos endógenos HER-2/neu e gp70 e a indução de células T específicas de antigeno que se infiltram no tumor. No dia 22 após a implantação do tumor na experiência mostrada na Figura 5B, os tumores foram removidos de 3 ratinhos, agrupados e processados para análise FACS e corados com tetrâmeros EC1, EC2, IC1 e AH1, anti CD8 e CD62L, CD11B. A população CD11B- foi localizada em CD8+, CD62Llow e analisada quanto à especificidade do antigeno usando os tetrâmeros mostrados.
Figura 20. Crescimento de tumores NT-2 (1 x 106 células) implantados subcutaneamente em ratinhos FVB, que foram posteriormente imunizados com Lm-LLO-CD105 A e B ou uma vacina de controlo Lm-LLO-NY-ESO-1 nos dias 4, 11 e 18, com 2 x 108 ufc de cada vacina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona estirpes Listeria recombinantes compreendendo um fator angiogénico, em que o referido fator angiogénico é um polipéptido receptor-2 (VEGFR2) do fator de crescimento vascular (VEGFR2), em que o referido polipéptido VEGFR2 é uma quinase-1 de fígado (Flk-1) fragmento El compreendendo SEQ ID NO: 5 ou uma sequência possuindo uma identidade maior que 83%, ou um fragmento Flk-l-Il compreendendo SEQ ID NO: 7, ou uma sequência com uma identidade superior a 95%, ou uma combinação destes
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico, em que o referido fator angiogénico é um fragmento VEGFR2 Flk-l-El compreendendo SEQ ID NO: 5 ou uma sequência com uma identidade superior a 83%, ou um VEGFR2 Flk-l-Il compreendendo SEQ ID NO: 7, ou uma sequência com uma identidade superior a 95%, ou uma combinação destes
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria recombinante compreendendo um ácido nucleico que codifica um fator angiogénico, em que o referido fator angiogénico é um fragmento VEGFR2 Flk-l-El compreendendo SEQ ID NO: 5 ou uma sequência com uma identidade superior a 83% ou um fragmento VEGFR2 Flk-l-Il compreendendo SEQ ID NO: 7, ou uma sequência com uma identidade superior a 95%, ou uma combinação destas.
Essas estirpes de Listeria recombinantes são úteis para direcionar a vasculatura tumoral de um crescimento tumoral ou cancro num sujeito, em que o sujeito monta uma resposta imune contra o fator angiogénico. A estirpe Listeria recombinante das composições e usos médicos da presente invenção é, noutra forma de realização, uma estirpe Listeria monocytogenes recombinante. Noutra forma de realkização, a estirpe Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria seeligeri. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe Listeria grey recombinante. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria ivanovii. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe recombinante de Listeria murrayi. Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe Listeria welshimeri recombinante. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe recombinante de qualquer outra espécie Listeria conhecida na técnica. Numa forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe Listeria compreendendo LLO, enquanto que noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe Listeria compreendendo ActA, enquanto que noutra forma de realização, a estirpe Listeria é uma estirpe Listeria compreendendo sequências semelhantes a PEST.
Listeria monocytogenes é uma bactéria intracelular facultativa gram-positiva capaz de infetar células fagociticas e cujo ciclo de vida a torna um veiculo de entrega valioso para proteínas estranhas. Após a fagocitose, Lm escapa ao fagosoma através do fator de virulência hemolítica LLO, codificado pelo gene hly, para se replicar no citoplasma. Lm pode ser projetado para expressar um gene de interesse fundido aos primeiros 441 aminoácidos de LLO de modo a excluir o domínio hemolítico. 0 LLO contém um domínio PEST que é importante para a atividade adjuvante nas proteínas fundidas.
Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é atenuada por deleção de um gene. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é atenuada por deleção de mais de 1 gene. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é atenuada por deleção ou inativação de um gene. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é atenuada por deleção ou inativação de mais de 1 gene.
Em outra forma de realização, o gene que está mutado é hly. Noutra forma de realização, o gene que é mutado é actA. Noutra forma de realização, o gene que é mutado é plc A. Em outra forma de realização, o gene que é mutado é plcB. Em outra forma de realização, o gene que é mutado é mpl. Noutra forma de realização, o gene que é mutado é inl A. Em outra forma de realização, o gene que é mutado é inlB. Noutra forma de realização, o gene que é mutado é bsh.
Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é um mutante auxotrófico. Noutra forma de realização, a estirpe de Listeria é deficiente num gene que codifica um gene de síntese de vitaminas. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente num gene que codifica a sintase do ácido pantoténico.
Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente numa enzima de metabolismo AA. Noutra forma de realização, a estirpe de Listeria é deficiente num gene de sintase de ácido D-glutâmico. Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente no gene dat. Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente no gene dal. Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente no gene dga. Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente num gene envolvido na síntese de ácido diaminopimélico. CysK. Noutra forma de realização, o gene é a metionina sintase independente da vitamina B 12. Noutra forma de realização, o gene é trpA. Noutra forma de realização, o gene é trpB. Noutra forma de realização, o gene é trpE. Em outra forma de realização, o gene é asnB. Em outra forma de realização, o gene é gltD. Noutra forma de realização, o gene é gltB. Noutra forma de realização, o gene é leuA. Noutra forma de realização, o gene é argG. Em outra forma de realização, o gene é thrC. Noutra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente num ou mais dos genes descritos acima.
Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente num gene sintase. Noutra forma de realização, o gene é um gene de síntese AA. Em outra forma de realização, o gene é folP. Noutra forma de realização, o gene é a proteína da família de diidrouridina sintase. Noutra forma de realização, o gene é ispD. Noutra forma de realização, o gene é ispF. Noutra forma de realização, o gene é fosfoenolpiruvato sintase. Em outra forma de realização, o gene é FF. Em outra forma de realização, o gene é o seu H. Noutra forma de realização, o gene é flil. Noutra forma de realização, o gene é a subunidade de pseudouridina sintase de ribossomal grande. Noutra forma de realização, o gene é ispD. Em outra forma de realização, o gene é a proteína GMP sintase/glutamina amidotransferase bifuncional. Noutra forma de realização, o gene é cobS. Noutra forma de realização, o gene é cobB. Em outra forma de realização, o gene é cbiD. Noutra forma de realização, o gene é uroporfirina-III C-metiltransferase/uroporfirinogénio-III sintase. Noutra forma de realização, o gene é cobQ. Noutra forma de realização, o gene é uppS. Noutra forma de realização, o gene é truB. Em outra forma de realização, o gene é dxs. Em outra forma de realização, o gene é mvaS. Noutra forma de realização, o gene é dapA. Noutra forma de realização, o gene é ispG. Noutra forma de realização, o gene é folC. Noutra forma de realização, o gene é citrato sintase. Em outra forma de realização, o gene é argJ. Noutra forma de realização, o gene é 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintase. Noutra forma de realização, o gene é indole-3-glicerol-fosfato sintase. Noutra forma de realização, o gene é o componente antranilato sintase/glutamina amidotransferase. Em outra forma de realização, o gene é menB. Noutra forma de realização, o gene é a iso-isoorismato sintase especifica para menaquinona. Noutra forma de realização, o gene é a fosforibosilformilglicinamidina sintase I ou II. Noutra forma de realização, o gene é fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintase. Noutra forma de realização, o gene é carB. Noutra forma de realização, o gene é carA. Em outra forma de realização, o gene é thyA. Noutra forma de realização, o gene é mgsA. Noutra forma de realização, o gene é aroB. Noutra forma de realização, o gene é hepB. Noutra forma de realização, o gene é rluB. Noutra forma de realização, o gene é ilvB. Em outra forma de realização, o gene é ilvN. Noutra forma de realização, o gene é alsS. Noutra forma de realização, o gene é fabF. Noutra forma de realização, o gene é fabH. Noutra forma de realização, o gene é a pseudouridina sintase. Noutra forma de realização, o gene é pyrG. Noutra forma de realização, 0 gene é truA. Noutra forma de realização, o gene é pabB. Noutra forma de realização, o gene é urn gene de atp sintase (eg atpC, atpD-2, aptG, atpA-2, etc.).
Noutra forma de realização, o gene é phoP. Noutra forma de realização, o gene é aroA. Noutra forma de realização, o gene é aroC. Noutra forma de realização, o gene é aroD. Noutra forma de realização, o gene é plcB.
Em outra forma de realização, a estirpe Listeria é deficiente num transportador de péptidos. Noutra forma de realização, o gene é transportador ABC/proteina de ligação/permease de ATP. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de oligopéptido ABC/proteina de ligação ao oligopéptido. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de oligopéptido ABC transportador/permease. Noutra forma de realização, o gene é transportador ABC de zinco/proteina de ligação ao zinco. Noutra forma de realização, o gene é transportador ABC de açúcar. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de fosfato. Em outra forma de realização, o gene é transportador de zinco ZIP. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de resistência à droga da família EmrB/QacA. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de sulfato. Noutra forma de realização, o gene é transportador de oligopéptido dependente de protão. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de magnésio. Noutra forma de realização, o gene é formador/ transportador de nitrito. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de espermidina/putrescina. Em outra forma de realização, o gene é Na/Pi-co transportador. Noutra forma de realização, o gene é transportador de fosfato de açúcar. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de glutamina ABC. Em outra forma de realização, o gene é o principal transportador familiar facilitador. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de glicina betaina/L-prolina. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de molibdénio. Noutra forma de realização, o gene é transportador ABC de ácido tálico. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de cobalto. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de amónio. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de aminoácido. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC da divisão celular. Noutra forma de realização, o gene é o transportador ABC de manganês. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de ABC do composto de ferro. Noutra forma de realização, o gene é transportador de maltose/maltodextrina ABC. Noutra forma de realização, o gene é o transportador de resistência à droga da família Bcr/CflA.
Noutra forma de realização, o gene é uma subunidade de uma das proteínas acima.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção induzem uma forte estimulação inata do interferão-gama, que numa forma de realização tem propriedades anti-angiogénicas. Numa forma de realização, uma Listeria da presente invenção induz uma forte estimulação inata do interferão-gama, que numa forma de realização possui propriedades anti-angiogénicas (Dominiecki et al., Cancer Immunol Immunother. 2005 maio; 54 (5) : 477-88; Beatty e Paterson, J Immunol. 2001 15 de fevereiro; 166 (4): 2276-82). Numa forma de realização, as propriedades anti-angiogénicas da Listeria são mediadas por células T CD4+ (Beatty e Paterson, 2001) . Noutra forma de realização, as propriedades anti-angiogénicas de Listeria são mediadas por células T CD8+. Noutra forma de realização, a secreção de IFN-gama como resultado da vacinação de Listeria é mediada por células NK, células NKT, células T Thl CD4+, células T TCl CD8+ ou uma combinação destes.
Noutra forma de realização, as composições da presente invenção induzem a produção de uma ou mais proteínas ou fatores anti-angiogénicos. Numa forma de realização, a proteína anti-angiogénica é IFN-gama. Noutra forma de realização, a proteína anti-angiogénica é o factor derivado do epitélio pigmentar (PEDF); Angiostatina; Endostatina; Tirosina quinase tipo fms (sFlt)-l; ou endoglina solúvel (sEng). Numa forma de realização, uma Listeriada presente invenção está envolvida na libertação de fatores anti-angiogénicos e, portanto, em uma forma de realização, tem um papel terapêutico além do seu papel como vetor para a introdução de um antígeno num sujeito.
Noutra forma de realização, a Listeria recombinante das composições da presente invenção é transformada de forma estável com uma construção que codifica um antigénio ou uma fusão de antigénio LLO. Numa forma de realização, a construção contém um poliligador para facilitar uma subclonagem adicional. Várias técnicas para produzir Listeria recombinante são conhecidas.
Numa forma de realização, uma construção útil nas composições da presente invenção é expressa a partir do cromossoma Listeria.
Noutra forma de realização, a construção ou gene heterólogo está integrado no cromossomo Listeria utilizando recombinação homóloga. As técnicas para a recombinação homóloga são bem conhecidas na técnica, e são descritas, por exemplo, em Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J, and Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766 - 4774. 1995; Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K and Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge. Vaccine 19:1435-45, 2001; Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D, and Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of SIV239 viral replication. Virology. 333: 88-101, 2005. Noutra forma de realização, a recombinação homóloga é realizada como descrito na Patente US 6855320. Noutra forma de realização, um plasmideo sensível à temperatura é utilizado para seleccionar os recombinantes.
Noutra forma de realização, a construção ou o gene heterólogo está integrado no cromossomo Listeria utilizando a inserção do transposão. As técnicas para a inserção do transposão são bem conhecidas na técnica e são descritas, inter alia, por Sun et al. (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778) na construção do DP-L967. A mutagénese de transposão tem a vantagem, noutra forma de realização, de que um mutante de inserção genómico estável pode ser formado. Noutra forma de realização, a posição no genoma onde o gene estranho foi inserido por mutagénese de transposão é desconhecida.
Noutra forma de realização, a construção ou o gene heterólogo está integrado no cromossomo Listeria utilizando sítios de integração de fagos (Lauer P, Chow MY et al, Construction, characterization, and use of two LM site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002;184(15): 4177-86) . Noutra forma de realização, é utilizado um gene de integrase e um local de ligação de um bacteriófago (por exemplo, listeriófago U153 ou PSA) para inserir o gene heterólogo no local de ligação correspondente, que pode ser qualquer local apropriado no genoma (por exemplo, comK ou o extremo 3' do gene arg tRNA). Noutra forma de realização, os prófagos endógenos são curados a partir do local de ligação utilizado antes da integração da construção ou gene heterólogo. Noutra forma de realização, este método resulta em integrantes de cópia única.
Numa forma de realização, o fator angiogénico é expresso a partir de um vetor episomal numa estirpe Listeria. Noutra forma de realização, a construção é transportada pela estirpe de Listeria num vetor episomal. Noutra forma de realização, a construção é transportada pela estirpe Listeria sobre um plasmídeo. Os vetores LM que expressam proteínas de fusão de antigénio foram construídos através desta técnica. O Lm-GG/E7 foi preparado complementando um mutante de deleção prfA com um plasmídeo contendo uma cópia do gene prfA e uma cópia do gene E7 fundido a uma forma do gene LLO (hly) truncado para eliminar a atividade hemolítica da enzima, conforme descrito aqui. LLO funcional foi mantida pelo organismo através da cópia cromossómica endógena de hly. Noutra forma de realização, o plasmídeo contém um gene de resistência aos antibióticos. Noutra forma de realização, o plasmídeo contém um gene que codifica um fator de virulência que está a faltar no genoma da estirpe Listeria transformada. Noutra forma de realização, o fator de virulência é prfA. Noutra forma de realização, o fator de virulência é LLO. Em outra forma de realização, o fator de virulência é ActA. Noutra forma de realização, o fator de virulência é qualquer um dos genes enumerados acima como alvos de atenuação. Noutra forma de realização, o fator de virulência é qualquer outro fator de virulência conhecido na técnica.
Noutra forma de realização, um péptido recombinante da presente invenção é fundido com uma proteína Listeria, tal como PI-PLC, ou uma construção que codifica a mesma. Noutra forma de realização, uma sequência de sinal de uma proteína Listeria segregada tal como hemolisina, ActA ou fosfolipases é fundida com o gene que codifica o antigénio. Noutra forma de realização, é utilizada uma sequência sinal do vetor de vacina recombinante. Noutra forma de realização, é utilizada uma sequência de sinal funcional no vetor de vacina recombinante.
Noutra forma de realização, a construção está contida na estirpe de Listeria de uma forma episomal. Noutra forma de realização, o antigénio estranho é expresso a partir de um vetor abrigado pela estirpe Listeria recombinante.
Noutra forma de realização, uma estirpe Listeria recombinante da presente invenção foi passada através de um hospedeiro animal. Noutra forma de realização, a passagem maximiza a eficácia da estirpe como um vetor de vacina. Noutra forma de realização, a passagem estabiliza a imunogenicidade da estirpe Listeria. Noutra forma de realização, a passagem estabiliza a virulência da estirpe Listeria. Noutra forma de realização, a passagem aumenta a imunogenicidade da estirpe Listeria. Noutra forma de realização, a passagem aumenta a virulência da estirpe Listeria. Em outra forma de realização, a passagem remove subestirpes instáveis da estirpe Listeria. Em outra forma de realização, a passagem reduz a prevalência de subestirpes instáveis da estirpe Listeria. Noutra forma de realização, a passagem atenua a estirpe, ou noutra forma de realização, torna a estirpe menos virulenta. Numa forma de realização, o animal através do qual a Listeria é passada é um mamífero que, numa forma de realização, é um rato. A presente invenção contempla o uso de mamíferos tais como ratinhos, coelhos, cobaias, hamsters, gerbils, ratos e semelhantes. Tais mamíferos são bem conhecidos na arte e estão disponíveis para especialistas na técnica através de uma variedade de grossistas, distribuidores e laboratórios, por exemplo, Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Métodos para passar uma estirpe de Listeria recombinante através de um hospedeiro animal é conhecida na técnica e são descritas, por exemplo, no número de série do pedido de patente US 10/ 541,614.
Também são revelados ácidos nucleicos isolados que codificam uma proteína truncada de ActA, LLO ou PEST e um ácido nucleico isolado que codifica o fragmento imunogénico de VEGFR2 operacionalmente ligado a um ácido nucleico compreendendo uma sequência promotora/reguladora de tal modo que o ácido nucleico é de preferência capaz de dirigir a expressão da proteína codificada pelo ácido nucleico. Deste modo, também são descritos vetores de expressão e métodos para a introdução de ADN exógeno em células com expressão concomitante do ADN exógeno nas células tais como as descritas, por exemplo, em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, Nova Iorque).
Tal como aqui descrito, "ácidos nucleicos" ou "nucleótidos" refere-se a uma cadeia de, pelo menos, duas combinações de base-açúcar-fosfato. 0 termo inclui ADN e ARN. "Nucleotídeos" refere-se às unidades monoméricas de polímeros de ácido nucleico. O ARN pode estar na forma de um ARNt (ARN de transferência), snRNA (ARN nuclear pequeno), ARNr (ARN ribossómico) , ARNm (ARN mensageiro) , ARN antessentido, ARN pequeno inibitório (siRNA), micro ARN (miARN) e ribozimas. Foi descrito o uso de siRNA e miARN (Caudy AA et al, Genes &amp; Devei 16: 2491-96 e referências citadas) . O ADN pode estar na forma de ADN plasmídico, ADN virai, ADN linear ou ADN cromossómico ou derivados desses grupos. Além disso, essas formas de ADN e ARN podem ser únicas, duplas, triplas ou quádruplas. 0 termo também inclui ácidos nucleicos artificiais que contêm outros tipos de estruturas, mas as mesmas bases. 0 ácido nucleico artificial pode ser um PNA (ácido nucleico peptídico). 0 PNA contém péptidos e bases nucleotídicas e são capazes de se ligar a moléculas de ADN e ARN. 0 nucleótido pode ser oxetano modificado ou pode ser modificado por substituição de uma ou mais ligações fosfodiéster com uma ligação fosforotioato. O ácido nucleico artificial pode conter qualquer outra variante do esqueleto fosfato de ácidos nucleicos nativos conhecidos na técnica. Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9: 353-57; e Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297: 1075-84. A produção e utilização de ácidos nucleicos é conhecida dos especialistas em arte e é descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. and Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed.
Um "ácido nucleico isolado" refere-se a um segmento ou fragmento de ácido nucleico que foi separado de sequências que o flanqueiam num estado de ocorrência natural, por exemplo, um fragmento de ADN que foi removido das sequências que são normalmente adjacentes ao fragmento, por exemplo, as sequências adjacentes ao fragmento num genoma em que ocorre naturalmente. 0 termo também se aplica a ácidos nucleicos que foram substancialmente purificados a partir de outros componentes que acompanham naturalmente o ácido nucleico, por exemplo, ARN ou ADN ou proteínas, que naturalmente o acompanham na célula. 0 termo inclui, por exemplo, um ADN recombinante que é incorporado num vetor, num plasmídeo ou vírus de replicação autónoma ou no ADN genómico de um procariota ou eucariota ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, como um cADN ou um fragmento genómico ou cADN produzido por PCR ou digestão com enzimas de restrição) independente de outras sequências. Inclui também um ADN recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica sequência de polipéptido adicional.
Também são divulgados vetores que compreendem um polinucleótido que codifica um polipéptido expresso pela Listeria recombinante da presente invenção. Numa forma de realização, o termo "polinucleótido" refere-se a uma cadeia de muitos nucleótidos que, numa forma de realização, é mais de 5, noutra forma de realização, mais de 10, noutra forma de realização, mais de 20, noutra forma de realização, mais de 50. Numa forma de realização, um oligonucleótido ou polinucleótido ou ácido nucleico pode referir-se a sequências procarióticas, mRNA eucariótico, cADN a partir de ARNm eucariótico, sequências de ADN genómico de ADN eucariota (por exemplo, mamífero) ou sequências de ADN sintético. O termo também se refere a sequências que incluem qualquer dos análogos de base conhecidos de ADN e RNA.
Numa forma de realização, dois polinucleótidos úteis na Listeria recombinante da presente invenção estão ligados operativamente. Por exemplo, numa forma de realização, os polinucleótidos que codificam LLO e Flkl-El ou Flkl-Il estão operativamente ligados. Numa forma de realização, "ligada operativamente" indica que uma unidade de ácido nucleico de cadeia simples ou de cadeia dupla compreende os dois polinucleótidos dispostos dentro da unidade de ácido nucleico de tal maneira que são expressos em conjunto. A titulo de exemplo, um promotor operacionalmente ligado à região de codificação de um gene é capaz de promover a transcrição da região de codificação.
Numa forma de realização, um polinucleótido útil na Listeria recombinante da presente invenção compreende uma sequência promotora/reguladora. A sequência promotora/ reguladora pode ser posicionada na extremidade 5' da sequência codificadora de proteina desejada de modo a que apresente a expressão da proteína desejada numa célula. Em conjunto, o ácido nucleico que codifica a proteína desejada e a sua sequência promotora/reguladora compreendem um "transgene".
Numa forma de realização, um ácido nucleico isolado pode ser expresso sob o controlo de um promotor que, numa forma de realização, é um promotor hly, um promotor prfA, um promotor ActA ou um promotor p60. Noutra forma de realização, um polipéptido pode ser expresso a partir de um promotor, tal como aqui descrito, tal como um promotor CMV ou CAG. Outros promotores que podem ser utilizados são conhecidos na técnica.
Numa forma de realização, o termo "sequência promotora/ reguladora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é necessária para a expressão de um produto de gene operacionalmente ligado à sequência promotora/ reguladora. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência promotora do núcleo e, noutros casos, esta sequência pode também incluir uma sequência intensificadora e outros elementos reguladores que são necessários para a expressão do produto do gene. A sequência promotora/ reguladora pode, por exemplo, ser uma que expressa o produto do gene de uma maneira especifica de tecido.
Um promotor "constitutivo" é uma sequência de nucleótidos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleótido que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido numa célula humana viva sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.
Um promotor "induzível" é uma sequência de nucleótidos que, quando operacionalmente ligada com um polinucleótido que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido numa célula viva substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.
Um promotor "especifico de tecido" é uma sequência de nucleótidos que, quando operacionalmente ligada a um polinucleótido que codifica ou especifica um produto de gene, faz com que o produto de gene seja produzido numa célula humana viva substancialmente apenas se a célula for uma célula do tecido tipo correspondente ao promotor.
Também são divulgados vetores que compreendem um ácido nucleico isolado que são úteis na Listeria recombinante da presente invenção. A incorporação de um ácido nucleico desejado num vetor e a escolha de vetores é bem conhecida na técnica como descrito em, por exemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, Nova Iorque). A aplicação também descreve células, vírus, provirus e similares, contendo esses vetores. Os métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, Nova Iorque). 0 vetor de expressão pode ser um plasmídeo. Os métodos para construir e utilizar vetores recombinantes são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: Manual de Laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em Brent et al. (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, Nova York). O vetor pode ser um agente patogénico intracelular ou derivado de um patógeno citosólico ou um patógeno intracelular. Um agente patogénico intracelular pode induzir uma resposta imune predominantemente mediada por células. 0 vetor pode ser uma estirpe de Salmonella, uma estirpe BCG ou um vetor bacteriano. As células dendríticas transduzidas com um vetor da presente invenção podem aumentar a regulação da resposta imunitária do sujeito, o que pode ser realizado por elevação da atividade CTL. O vetor de vacina recombinante pode induzir uma resposta imune de tipo Thl predominantemente. O vetor pode ser selecionado de Salmonella sp., Shigella sp., BCG, L. monocytogenes, E. coli e S. gordonii. As proteínas de fusão podem ser administradas por vetores bacterianos recombinantes modificados para escapar da fusão fagolisossómica e vivos no citoplasma da célula. Noutra forma de realização, o vetor é um vetor virai. Em outras formas de realização, o vetor é selecionado de Vaccinia,
Avipox, Adenovirus, AAV, Vaccinia virus NYVAC, estirpe de vacina Ankara modificada (MVA), virus da Semliki Forest, virus da encefalite equina venezuelana, virus herpes e retrovirus. Noutra forma de realização, o vetor é um vetor de ADN nu.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma Listeria que, numa forma de realização, é uma estirpe de vacina Listeria compreendendo um ácido nucleico ou vetor isolado da presente invenção. Numa forma de realização, uma "estirpe de vacina Listeria" é aqui utilizada para se referir a um organismo Listeria recombinante que expressa um polipéptido Flk-l-El de VEGFR2 ou Flk-l-Il, ou uma combinação destes.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma estirpe Listeria recombinante da presente invenção e um adjuvante.
Numa forma de realização, uma vacina da presente invenção compreende um adjuvante e adicionalmente compreende uma citoquina, quimiocina ou uma combinação destes. Numa forma de realização, uma vacina é uma composição que provoca uma resposta imune a um antigénio ou polipéptido na composição como resultado da exposição à composição. Noutra forma de realização, a vacina ou composição adicionalmente compreende APCs, que numa forma de realização são autólogos, enquanto que noutra forma de realização são alogénicas para o sujeito.
Numa forma de realização, uma "vacina" é uma composição que provoca uma resposta imune num hospedeiro a um antigénio ou polipéptido na composição como resultado da exposição à composição. Numa forma de realização, a resposta imune é a um antigénio particular ou a um epítopo particular no antigénio. Noutra forma de realização, a vacina pode estar contida dentro e, noutra forma de realização, fornecida por uma célula, que numa forma de realização é uma célula bacteriana que, numa forma de realização, é uma Listeria. Numa forma de realização, uma vacina pode impedir que um sujeito contraia ou desenvolve uma doença ou condição, em que, noutra forma de realização, uma vacina pode ser terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição. Os efeitos terapêuticos e profiláticos das composições da presente invenção são descritos acima. Numa forma de realização, uma vacina da presente invenção, compreende uma composição da presente invenção e um adjuvante, citoquina, quimiocina ou suas combinações.
Uma composição imunogénica da presente invenção pode compreender, noutra forma de realização, um adjuvante que favorece uma resposta imune de tipo Thl predominantemente. Noutra forma de realização, o adjuvante favorece uma resposta imune mediada por Thl predominantemente. Noutra forma de realização, o adjuvante favorece uma resposta imune de tipo Thl. Noutra forma de realização, o adjuvante favorece uma resposta imune mediada por Thl. Noutra forma de realização, o adjuvante favorece uma resposta imune mediada por células através de uma resposta mediada por anticorpos. Noutra forma de realização, o adjuvante é qualquer outro tipo de adjuvante conhecido na técnica. Noutra forma de realização, a composição imunogénica induz a formação de uma resposta imune das células T contra a proteína alvo.
Noutra forma de realização, o adjuvante é MPL. Noutra forma de realização, o adjuvante é QS21. Noutra forma de realização, o adjuvante é um agonista de TLR. Noutra forma de realização, o adjuvante é um agonista de TLR4. Noutra forma de realização, o adjuvante é um agonista de TLR9. Noutra forma de realização, o adjuvante é Resiquimod®. Noutra forma de realização, o adjuvante é imiquimod. Noutra forma de realização, o adjuvante é um oligonucleótido CpG. Noutra forma de realização, o adjuvante é uma citoquina ou um ácido nucleico que codifica o mesmo. Noutra forma de realização, o adjuvante é uma quimiocina ou um ácido nucleico que codifica o mesmo. Noutra forma de realização, o adjuvante é IL-12 ou um ácido nucleico que codifica o mesmo. Noutra forma de realização, o adjuvante é IL-6 ou um ácido nucleico que codifica o mesmo. Noutra forma de realização, o adjuvante é um lipopolissacárido. Noutra forma de realização, o adjuvante é como descrito em Fundamental Immunology, 5a ed (agosto de 2003): William E. Paul (Editor); Lippincott Williams &amp; Wilkins Publishers; Capitulo 43: Vaccines, GJV Nossal. Noutra forma de realização, o adjuvante é qualquer outro adjuvante conhecido na técnica.
Numa forma de realização, uma "resposta imune predominantemente do tipo Thl" refere-se a uma resposta imune na qual a IFN-gama é segregada. Noutra forma de realização, refere-se a uma resposta imune em que o fator de necrose tumoral-p é segregado. Noutra forma de realização, refere-se a uma resposta imune na qual a IL-2 é segregada.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe Listeria recombinante compreendendo um polipéptido VEGFR2 Flk-l-El ou Flk-l-Il, ou uma combinação destes, operativamente ligado a um polipéptido não VEGFR2 selecionado de uma listeriolissina não hemolitica (LLO), um polipéptido ActA ou um polipéptido tipo PEST ou um seu fragmento. Numa forma de realização, o fragmento tem a mesma ou uma propriedade ou funções semelhantes como o péptido ou proteína de comprimento total, como pode ser demonstrado utilizando ensaios e ferramentas conhecidas na técnica. As propriedades e funções de péptidos e proteínas de comprimento total da presente invenção são descritas em detalhes a seguir.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe Listeria recombinante compreendendo um ácido nucleico que codifica um fator angiogénico, em que o fator angiogénico é um polipéptido VEGFR2 Flk-l-El ou Flk-l-Il, ou uma combinação destes.
Numa forma de realização, o fator angiogénico está operacionalmente ligado a um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST.
Numa forma de realização, o fator angiogénico VEGFR2 compreende um ou mais epitopos reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro. Em uma forma de realização, o fator angiogénico é uma molécula envolvida na formação de novos vasos sanguíneos.
Assim, numa forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção visam a vasculatura do tumor. Numa forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção demonstram uma expansão profunda do epítopo, que em uma forma de realização é um processo pelo qual os epitopos distintos e não-reativos cruzados com um epítopo indutor tornam-se os principais alvos de uma resposta imune em curso. Numa forma de realização, os dados apresentados nos Exemplos abaixo demonstram que uma vacina dirigida à vasculatura tumoral pode induzir uma resposta imune contra antígenos tumorais endógenos, o qual, numa forma de realização, permite que um especialista tecnológico trate, suprima ou inibe um tumor sem atingir um antígeno específico associado ao tumor. Assim, numa forma de realização, as composições da presente invenção servem como uma vacina universal contra um cancro ou tumor, que numa forma de realização, não é dependente de um determinado antigénio tumoral para ser eficaz. Numa forma de realização, a especificidade do tumor é conferida porque os tumores têm pouca cobertura de vasculatura e pericito.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção são extremamente eficazes nas utilizações médicas da presente invenção, numa forma de realização, por períodos prolongados de tempo, porque são improváveis as variantes de perda de antigénio, porque os polipéptidos relacionados com a angiogénose tais como o VEGFR2 são cruciais para o funcionamento geral e, portanto, não será perdido ou substituído. Numa forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção não danificarão o tecido normal, que possui cobertura de vasculatura e pericito bem desenvolvida, mas irá direcionar a vasculatura tumoral, cuja cobertura de vasculatura e pericito não está bem desenvolvida.
Nesta invenção, o fator angiogénico usado nas composições e usos médicos da presente invenção é um flk-l-El ou um fragmento Flk-l-Il de VEGFR2. Numa forma de realização, o fragmento contém epítopos de células T. 0 fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma importante proteína de sinalização envolvida tanto na vasculogénese (a formação do sistema circulatório embrionário) como na angiogénese (o crescimento dos vasos sanguíneos da vasculatura pré-existente). Numa forma de realização, a atividade do VEGF é restringida principalmente às células do endotélio vascular, embora tenha efeitos sobre um número limitado de outros tipos de células (por exemplo, migração estimulada de monócitos/macrófagos). In vitro, o VEGF demonstrou estimular a mitogénese das células endoteliais e a migração celular. 0 VEGF também aumenta a permeabilidade microvascular e às vezes é referido como fator de permeabilidade vascular.
Numa forma de realização, todos os membros da família VEGF estimulam respostas celulares ligando-se aos recetores de tirosina quinase (os VEGFRs) na superfície celular, fazendo- os dimerizar e se tornarem ativados por transfosforilação. Os recetores de VEGF têm uma porção extracelular consistindo em 7 domínios semelhantes a imunoglobulina, uma única região de transmissão transmembranar e uma porção intracelular contendo um domínio de tirosina-quinase dividida.
Numa forma de realização, VEGF-A é um ligando VEGFR-2 (KDR/ Flk-1), bem como um ligando VEGFR-1 (Flt-1). Numa forma de realização, o VEGFR medeia quase todas as respostas celulares conhecidas ao VEGF. A função de VEGFR-1 é menos bem definida, embora seja pensado para modular a sinalização de VEGFR-2, numa forma de realização, através do sequestro de VEGF da ligação de VEGFR-2, que em uma forma de realização, é particularmente importante durante a vasculogénese no embrião. Numa forma de realização, o VEGF-C e o VEGF-D são ligandos do recetor VEGFR-3, que numa forma de realização, medeia a linfangiogénese.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção compreendem um Flk-l-El ou um fragmento Flk-l-Il de VEGFR-2, ou uma combinação destes. 0 recetor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2) é altamente expresso em células endoteliais ativadas (ECs) e participa na formação de novos vasos sanguíneos. Numa forma de realização, VEGFR2 liga todas as 5 isoformas de VEGF. Numa forma de realização, a sinalização de VEGF através de VEGFR2 em ECs induz a proliferação, migração e eventual diferenciação. Numa forma de realização, o homólogo de ratinho de VEGFR2 é o gene-1 do fígado-quinase fetal (Flk-1), que é um forte alvo terapêutico, e tem papéis importantes no crescimento, invasão e metástase do tumor. Numa forma de realização, VEGFR2 também é referido como recetor de domínio de inserção de quinase (um recetor de tirosina quinase de tipo III) (KDR), grupo de diferenciação 309 (CD309), FLK1, Ly73, Krd-1, VEGFR, VEGFR-2 ou 6130401C07 .
Noutra forma de realização, a proteína VEGFR2 tem a seguinte sequência:
MESKALLAVALWFCVETRAASVGLPGDFLHPPKLSTQKDILTILANTTLQITCRGQR DLDWLWPNAQ ΡΡ5ΕΕΚνΐνΤΕα(^Ρ8ΙΕ0ΚΤ1ΤΙΡΚνν(3Π)Τ6ΑΥΙ«:8ΥΚΙ)νΡΙΑ8Τ VYVYVRDYRSPFIASVSDOHGIVYITENKNKTWIPCRGSISNLNVSLCARYPEKRFVP D
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Ρ6ΜΗΜ.ΤΙΗΡνΗΚΕΡ66Ι.ΥΤ00ΑΰΝνΐ6€ΑΕΑΕΤΙ.ΓΙ IEGAQEKTNLEVIILVGTAVIA MF
FWLLLVIVLRTVKRAN EGELKTGYLSIVMDPDELPLDERCERLPYDASKWEFPRDRLK LGKPLGRGAFGQVIEADAFGIDKTATCKTVAVKMLKEGATHSEHRALMSELKILIHIG HHLNWNLLGACTKPGGPLMVIVEFCKFGNLSTYLRGKRNEFVPYKSKGARFRQGK DYVGELSVDLKRRLDSITSSQSSASSGFVEEKSLSDVEEEEASEELYKDFLTLEHLICY
S_FQVAKGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSEKNV
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EVK VIPDDSQTDSGMVLASEELKTLEDRNKLSPSFGGMMPSKSRESVASEGSNQTSGYQSGY HS DDTDTTVYSSDEAGLLKMVDAAVHADSGTTLRSPPV (N° . de Acesso GenBank NP_034742.2, AAH20530.1, ou EDL37891.1; SEQ ID NO: 4; a sequência de ácido nucleico é apresentada em N° de Acesso GenBank NM_010612.2 ou BC020530.1). Numa forma de realização, AA 68-277 corresponde a El aqui descrito, AA 545-730 corresponde a E2 aqui descrito, e AA 792-1081 corresponde a II aqui descrito. Noutra forma de realização, a sequência acima é utilizada como a fonte do fragmento VEGFR2 incorporado numa vacina da presente invenção. Noutra forma de realização, uma sequência AA VEGFR2 AA das composições da presente invenção é um homólogo da SEQ ID NO: 4.
Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada em uma das seguintes entradas GenBank: EDL37891.1; CAA61917.1; BAC27532.1; BAE24892.1; AAH20530.1; AAB25043.1; CAA42040.1; Ou CAA50192.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada em uma das seguintes entradas GenBank: EAX05462.1; EAX05463.1; EAX05464.1; CAA61916.1; BAD93138.1; AAB88005.1; AAC16450.1; BAG57114.1; AAI31823.1; ACF47599.1; AAA59459.1; ou CAA43837.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada numa das seguintes entradas GenBank: EDL89914.1; EDL89915.1; EDL89916.1; AAH87029.1; AAB97508.1; Ou AAB97509.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada em uma das seguintes entradas GenBank: CAQ13438.1; AAF03237.1; AAN47136.1; AAL16381.1; AAI29159.1; CAM73177.1; AAB18415.1; AAB41042.1; ou AAB62405.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 possui qualquer sequência de aminoácidos VEGFR2 conhecida na técnica. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um homólogo de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma variante de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank. 0 VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas acima do GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank. 0 VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas acima do GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank.
Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de ácido nucleico estabelecida em uma das seguintes entradas GenBank: AC124615.il; AC134903.4; AC160723.2; AF061804.1; AF153058.1 CH466524.1; X89777.1; AK031739.1; AK054510.1; AK141938.1; B C020530.1; S53103.1; X59397.1; Ou X70842.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de ácido nucleico estabelecida em uma das seguintes entradas GenBank: AC021220.7; AC111194.4; CH471057.1; EAX05463.1; EAX05464.1; X89776.1; AB209901.1; AF035121.1; AF063658.1; AK293668.1; B C131822.1; BP280621.1; CR606055.1; EU826563.1; L04947.1; Ou X61656.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de ácido nucleico apresentada numa das seguintes entradas GenBank: CH473981.1; BC087029.1; U93306.1; Ou U93307.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 tem uma sequência de ácido nucleico estabelecida numa das seguintes entradas Genbank: AL935131.7; BX247946.6; CR759732.9; AF180354.1; AF487829.1; AY056466.1; BC129158.1; CU458916.1; U75995.1; U82383.1; e U89515.1. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um homólogo de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma variante de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é uma isoforma de uma sequência de uma das entradas anteriores do
GenBank. Noutra forma de realização, o VEGFR2 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas anteriores do GenBank.
Noutra forma de realização, um fragmento de polipéptido VEGFR2 é utilizado em composições e utilizações médicas da presente invenção. Noutra forma de realização, o fragmento VEGFR2 compreende os aminoácidos 68-277 da proteína VEGFR2, que, numa forma de realização, é referido como Flkl-E1. Noutra forma de realização, o fragmento do polipéptido VEGFR2 tem a sequência:
RDSEERVLVTECGGGDSIFCKTLTIPRWGNDTGAYKCSYRDVDIASTVYVYVRDY RS PFIASVS DQHGIVYITENKNKTWIPCRGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWD SEIGF
TLPSYMISYAGMVFCEAKINDETYQSIMYIWWGYRIYDVILSPPHEIELSAGEKLVL NCTA RTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKKIVNR (SEQ ID NO: 5) . Noutra forma de realização, uma sequência de VEGFR2 AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é um homólogo da SEQ ID NO: 5. Noutra forma de realização, a sequência VEGFR2 AA é uma variante da SEQ ID NO: 5. Noutra forma de realização, a sequência VEGFR2 AA é um fragmento de SEQ ID NO: 5. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é uma isoforma de SEQ ID NO: 5.
Noutra forma de realização, o fragmento VEGFR2 compreende os aminoácidos 792-1081 da proteína VEGFR2, que numa forma de realização, é referido como Flkl-Il. Noutra forma de realização, o fragmento do polipéptido VEGFR2 tem a sequência:
EGELKTGYLSIVMDPDELPLDERCERLPYDASKWEFPRDRLKLGKPLGRGAFGQVI
EADAFGIDKTATCKTVAVKMLKEGATHSEHRALMSELKILIHIGHHLNWNLLGACTKP
GG
PLMVIVEFCKFGNLSTYLRGKRNEFVPYKSKGARFRQGKDYVGELSVDLKRRLDSITSS
QSS ASSGFVEEKSLSDVEEEEASEELYKDFLTLEHLICYSFQVAKGMEFLASRKCIHRDLAA RNIL LSEKNWKICDFGLARDIYKDPDYVRKGDARLPLKWMAPETIFDRVYT (SEQ ID NO: 7). Noutra forma de realização, uma sequência AA de VEGFR2 AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é um homólogo de SEQ ID NO: 7. Noutra forma de realização, a sequência VEGFR2 AA é uma variante da SEQ ID NO: 7. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é um fragmento de SEQ ID NO: 7. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é uma isoforma de SEQ ID NO: 7.
Noutra forma de realização, uma sequência AA VEGFR2 AA de composições da presente invenção consiste na sequência apresentada nas SEQ ID NO: 54-58. Noutra forma de realização, uma sequência de composições VEGFR2 AA da presente invenção compreende uma ou mais da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 54-58. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é um homólogo de SEQ ID NO: 54-58. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é uma variante de SEQ ID NOs: 54-58. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é um fragmento de SEQ ID NOs: 54-58. Noutra forma de realização, a sequência AA de VEGFR2 é uma isoforma de SEQ ID NOs: 54-58.
Assim, numa forma de realização, o fragmento VEGFR2 utilizado nas composições e a presente invenção é Flkl-El ou Flkl-Il, ou uma combinação destes. Noutra forma de realização, o fragmento VEGFR2 utilizado nas composições da presente invenção é selecionado de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.
Numa forma de realização, o VEGFR2 para as composições e usos médicos da presente invenção compreende a sequência de sinal de VEGFR2, que numa forma de realização, são os aminoácidos 1-20 da sequência de aminoácidos de VEGFR2. Noutra forma de realização, o VEGFR2 para as composições e utilizações médicas da presente invenção exclui a sequência de sinal de VEGFR2.
Noutra forma de realização, um polipéptido recombinante na Listeria da presente invenção compreende ainda um péptido não VEGFR2. Noutra forma de realização, um polipéptido recombinante na Listeria da presente invenção está operacionalmente ligado a um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST. Noutra forma de realização, o péptido não VEGFR2 aumenta a imunogenicidade do fragmento.
Numa forma de realização, o polipéptido não VEGFR2 compreende uma sequência semelhante a PEST, enquanto que noutra forma de realização, o polipéptido não-VEGFR2 consiste numa sequência semelhante a PEST. O polipéptido não VEGFR2 é, noutra forma de realização, um oligopéptido de listeriolisina (LLO), que numa forma de realização, compreende uma sequência semelhante a PEST. Noutra forma de realização, o péptido não VEGFR2 é um oligopéptido ActA, que numa forma de realização compreende uma sequência semelhante a PEST. Noutra forma de realização, o péptido não VEGFR2 é um oligopéptido tipo PEST. Conforme aqui proporcionado, a fusão para LLO, ActA, sequências semelhantes a PEST e seus fragmentos aumenta a imunogenicidade mediada por células de antigenos. Numa forma de realização, a fusão para LLO, ActA, sequências semelhantes a PEST e seus fragmentos aumenta a imunogenicidade mediada por células de antigénios em uma variedade de sistemas de expressão. Numa forma de realização, o sistema de expressão é virai, enquanto em outra forma de realização, o sistema de expressão é bacteriano. Noutra forma de realização, o péptido não VEGFR2 é qualquer outro péptido não-VEGFR2 imunogénico conhecido na técnica.
Numa forma de realização, um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST é um péptido de listeriolisina (LLO) . Numa forma de realização, um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST é um polipéptido de listeriolisina não-hemolítico (LLO). Numa forma de realização, um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST é um polipéptido ActA. Numa forma de realização, um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST é um polipéptido ActA N-terminal. Numa forma de realização, um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST consiste numa sequência semelhante a PEST.
Um oligopéptido LLO para utilização nas composições da presente invenção é, noutra forma de realização, um oligopéptido LLO não hemolitico. Noutra forma de realização, o oligopéptido é um fragmento LLO. Noutra forma de realização, o oligopéptido é uma proteína LLO completa. Noutra forma de realização, o oligopéptido é qualquer proteína LLO ou um seu fragmento conhecido na técnica.
Numa forma de realização, a proteína LLO é o principal fator de virulência de Lm responsável pela lise do fagolisossoma. Numa forma de realização, LLO é altamente imunogénico, noutra forma de realização, LLO induz a maturação de células T específicas de antigénio em células Thl, e noutra forma de realização, LLO induz a secreção de interferão-gama por células T.
Numa forma de realização, o fragmento LLO compreende uma mutação no domínio de ligação ao colesterol ou uma deleção dentro do domínio de ligação ao colesterol ou uma deleção do domínio de ligação ao colesterol que, numa forma de realização, torna o LLO não hemolítico. Em outra forma de realização, o fragmento LLO é tornado não hemolítico por tratamento químico. Noutra forma de realização, o tratamento químico compreende glutaraldeído. Noutra forma de realização, o tratamento químico compreende um composto de ação semelhante. Noutra forma de realização, o tratamento químico compreende qualquer outro composto adequado conhecido na técnica.
Noutra forma de realização, a proteína LLO utilizada para construir vacinas da presente invenção tem a seguinte sequência: mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissmappasppaspktpiekkhad eidkyiqgldynknnvlvyhgdavtn vpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdv lpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvknatks nvnnavntlverwnekyaqaypnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvn fgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrp srffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsg ksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiid gnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytdgki nidhsggyvaqfniswdevnydpegneivqhknw sennksklahftssiylpgnarninvyakectglawewwrtviddrnlplvknrnisiw gttlypkysnkvdnpie (No. de Acesso GenBank P13128; SEQ ID NO: 8; a sequência de ácido nucleico é apresentada em N° de Acesso GenBank X15127). Numa forma de realização, os primeiros 25 AA da proproteína correspondente a esta sequência são a sequência de sinal e são clivados de LLO quando é segregada pela bactéria. Assim, de acordo com esta forma de realização, a proteína LLO ativa de comprimento total é de 504 resíduos. Noutra forma de realização, a sequência acima é utilizada como a fonte do fragmento LLO incorporado numa vacina da presente invenção. Noutra forma de realização, uma sequência LLO AA de composições da presente invenção é um homólogo da SEQ ID NO: 8. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é uma variante da SEQ ID NO: 8. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é um fragmento da SEQ ID NO: 8. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é uma isoforma da SEQ ID NO: 8.
Noutra forma de realização, um fragmento de proteína LLO é utilizado em composições e utilizações médicas da presente invenção. Noutra forma de realização, o fragmento LLO é um fragmento N-terminal. Noutra forma de realização, o fragmento LLO N-terminal tem a sequência: mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissvappasppaspktpiekkhad eidkyiqgldynknnvlvyhgdavtn vpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdv lpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvknatks nvnnavntlverwnekyaqaysnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvn fgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrp srffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsg ksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiid gnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytdgki nidhsggyvaqfniswdevnyd (SEQ ID NO: 9) . Noutra forma de realização, uma sequência LLO AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é um homólogo da SEQ ID NO: 9. Noutra forma de realização, a LLO A sequência AA é uma variante da SEQ ID NO: 9. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é um fragmento da SEQ ID NO: 9. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é uma isoforma da SEQ ID NO: 9.
Noutra forma de realização, o fragmento LLO tem a sequência: mkkimlvfitlilvslpiaqqteakdasafnkensissvappasppaspktpiekkhad eidkyiqgldynknnvlvyhgdavtn vpprkgykdgneyivvekkkksinqnnadiqvvnaissltypgalvkanselvenqpdv lpvkrdsltlsidlpgmtnqdnkivvnatks nvnnavntlverwnekyaqaysnvsakidyddemaysesqliakfgtafkavnnslnvn fgaisegkmqeevisfkqiyynvnvneptrp srffgkavtkeqlqalgvnaenppayissvaygrqvylklstnshstkvkaafdaavsg ksvsgdveltniiknssfkaviyggsakdevqiid gnlgdlrdilkkgatfnretpgvpiayttnflkdnelaviknnseyiettskaytd (SEQ ID NO: 10). Noutra forma de realização, uma sequência LLO AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é um homólogo da SEQ ID NO: 10. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é uma variante da SEQ ID NO: 10. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é um fragmento da SEQ ID NO: 10. Noutra forma de realização, a sequência LLO AA é uma isoforma da SEQ ID NO: 10.
Noutra forma de realização, o fragmento LLO de composições da presente invenção compreende um domínio semelhante a PEST. Noutra forma de realização, um fragmento LLO que compreende uma sequência PEST é utilizado como parte de uma composição ou nas utilizações médicas da presente invenção.
Noutra forma de realização, o fragmento LLO não contém o domínio de ativação no terminal carboxi. Noutra forma de realização, o fragmento LLO não inclui cisteína 484. Noutra forma de realização, o fragmento LLO é um fragmento não hemolítico. Noutra forma de realização, o fragmento LLO é tornado não hemolítico por deleção ou mutação do domínio de ativação. Noutra forma de realização, o fragmento LLO é tornado não hemolítico por deleção ou mutação da cisteína 484. Noutra forma de realização, uma sequência LLO é tornada não hemolítica por deleção ou mutação em outro local.
Noutra forma de realização, o fragmento LLO consiste em cerca dos primeiros 441 AA da proteína LLO. Noutra forma de realização, o fragmento LLO compreende aproximadamente o primeiro 400-441 AA da proteína LLO de tamanho completo 529 AA. Noutra forma de realização, o fragmento LLO corresponde a AA 1-441 de uma proteína LLO aqui revelada. Noutra forma de realização, o fragmento LLO consiste em aproximadamente os primeiros 420 AA de LLO. Noutra forma de realização, o fragmento LLO corresponde a AA 1-420 de uma proteína LLO aqui revelada. Noutra forma de realização, o fragmento LLO consiste em cerca de AA 20-442 de LLO. Noutra forma de realização, o fragmento LLO corresponde a AA 20-442 de uma proteína LLO aqui revelada. Noutra forma de realização, qualquer ALLO sem o domínio de ativação compreendendo cisteína 484 e, em particular, sem cisteína 484, são adequados para os usos e composições da presente invenção.
Em outra forma de realização, o fragmento LLO corresponde aos primeiros 400 AA de uma proteína LLO, ou os primeiros 300 AA de uma proteína LLO, ou os primeiros 200 AA de uma proteína LLO, ou os primeiros 100 AA de uma proteína LLO, ou o fragmento LLO corresponde aos primeiros 50 AA de uma proteína LLO, que numa forma de realização, compreende uma ou mais sequências semelhantes a PEST.
Noutra forma de realização, o fragmento LLO contém resíduos de uma proteína LLO homóloga que corresponde a uma das gamas AA acima. Os números de resíduo não precisam, em outra forma de realização, corresponderem exatamente com os números de resíduo enumerados acima; por exemplo, se a proteína LLO homóloga tiver uma inserção ou deleção, em relação a uma proteína LLO aqui utilizada.
Noutra forma de realização, os homólogos de LLO de outras espécies, incluindo lisinas conhecidas, tais como estreptolisina O, perfringolisina O, pneumolisina, etc., ou fragmentos destes, podem ser utilizados como não VEGFR2.
Noutra forma de realização de composições e utilizações médicas da presente invenção, um fragmento de uma proteína ActA é fundido com o fragmento VEGFR2. Noutra forma de realização, o fragmento de uma proteína ActA tem a sequência:
MRAMMWFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETA
REVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGA
DR
PAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADA
SES
DLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAG
LI
DQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDE
ELRLA LPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAIN RHSQNF SDFPPIPTEEELNGRGGRP (SEQ ID NO: 11). Noutra forma de realização, uma sequência ActA AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 11. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é um homólogo da SEQ ID NO: 11. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é uma variante da SEQ ID NO: 11. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é um fragmento da SEQ ID NO: 11. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é uma isoforma da SEQ ID NO: 11.
Noutra forma de realização, o fragmento ActA é codificado por um nucleótido recombinante compreendendo a sequência: aaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccag agacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatca gaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgcttt gccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgcta catcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatc atccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttaca agaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctga tttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggag aggcggtagacca (SEQ ID NO: 12). Noutra forma de realização, o nucleótido recombinante tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 12. Noutra forma de realização, um nucleótido que codifica ActA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 12. Noutra forma de realização, o nucleótido codificador de ActA é um homólogo da SEQ ID NO: 12. Noutra forma de realização, o nucleótido codificador de ActA é uma variante da SEQ ID NO: 12. Noutra forma de realização, o nucleótido codificador de ActA é uma isoforma da SEQ ID NO: 12.
Noutra forma de realização das composições da presente invenção, um fragmento de uma proteína ActA é fundido com o fragmento VEGFR2. Noutra forma de realização, o fragmento de uma proteína ActA tem a sequência tal como estabelecida na N° de Acesso Genbank AAF04762. Noutra forma de realização, uma sequência ActA AA de composições da presente invenção compreende a sequência apresentada no N° de Acesso Genbank AAF04762. Noutra forma de realização, a sequência de ActA AA é um homólogo do N° de Acesso Genbank AAF04762. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é uma variante do número de acesso Genbank AAF04762. Noutra forma de realização, a sequência ActA AA é um fragmento do número de acesso Genbank AAF04762. Em outra forma de realização, a sequência ActA AA é uma isoforma do N° de Acesso Genbank AAF04762.
Noutra forma de realização, o fragmento ActA é codificado por um nucleótido recombinante compreendendo a sequência tal como estabelecido no número de acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, o nucleótido recombinante tem a sequência apresentada no N° de Acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, um nucleótido codificador de ActA das composições da presente invenção compreende a sequência apresentada no N° de Acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, o nucleótido que codifica ActA é um homólogo do número de acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, o nucleótido codificador de ActA é uma variante do número de acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, o nucleótido que codifica ActA é um fragmento do número de acesso Genbank AF103807. Noutra forma de realização, o nucleótido que codifica ActA é uma isoforma do N° de Acesso Genbank AF103807.
Noutra forma de realização das composições e utilizações da presente invenção, uma sequência AA tipo PEST é fundida com o fragmento VEGFR2. Noutra forma de realização, a sequência PEST-AA é KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID NO: 13). Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é KEN SIS SMAP P AS P PAS PK (SEQ ID NO: 14) . Noutra forma de realização, a fusão de um antigénio a qualquer sequência LLO que inclui uma das sequências de AA tipo PEST enumeradas aqui pode aumentar a imunidade mediada por células contra VEGFR2.
Noutra forma de realização, a sequência AA tipo PEST é uma sequência semelhante a PEST de uma proteína Listeria ActA. Noutra forma de realização, a sequência PEST é KTEEQPSEVNTGPR (SEQ ID NO: 15), KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK (SEQ ID NO: 16), KNEEVNASDFPPPPTDEELR (SEQ ID NO: 17), ou RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR (SEQ ID NO: 18). Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é uma variante da sequência semelhante a PEST descrita acima, o qual, numa forma de realização, é KESWDASESDLDSSMQSADESTPQPLK (SEQ ID NO: 19), KSEEVNASDFPPPPTDEELR (SEQ ID NO: 20), ou RGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR (SEQ ID NO: 21). Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é de Listeria seedigeri cytolysin, codificada pelo isogene. Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é RSEVTISPAETPESPPATP (SEQ ID NO: 22). Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é da proteína estreptolisina O de Streptococcus sp. Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é de estreptolisina O Streptococcus pyogenes, por exemplo, KQNTASTETTTTNEQPK (SEQ ID NO: 23) a AA 35-51. Noutra forma de realização, a sequência do tipo PEST é de estreptolisina O Streptococcus eguisimilis, por exemplo, KQNTANTETTTTNEQPK (SEQ ID NO: 24) a AA 38-54. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é outra sequência AA tipo PEST derivada de uma proteína de um organismo procariótico, que em uma forma de realização é uma proteína ActA, e noutra forma de realização, é uma proteína de citolisina que, numa forma de realização, é listeriolisina, e em outra forma de realização, é a estreptolisina.
A identificação de sequências semelhantes a PEST é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Rogers S et al (Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234(4774):364-8) and Rechsteiner M et al (PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21 (7):267-71) . "Sequência de tipo PEST" refere-se, em outra forma de realização, a uma região rica em resíduos de prolina (P), ácido glutâmico (E), serina (S) e treonina (T). Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é flanqueada por um ou mais grupos que contêm vários aminoácidos carregados positivamente. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST medeia a rápida degradação intracelular de proteínas que o contêm. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST adapta-se a um algoritmo divulgado em Rogers et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST adapta-se a um algoritmo divulgado em Rechsteiner et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST contém um ou mais locais de fosforilação interna, e a fosforilação nestes locais precede a degradação da proteína.
Numa forma de realização, as sequências semelhantes a PEST de organismos procarióticos são identificadas de acordo com métodos tais como descrito por, por exemplo, em Rechsteiner and Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271) para LM e em Rogers S et al (Science 1986; 234(4774):364-8). Alternativamente, as sequências de AA tipo PEST de outros organismos procarióticos também podem ser identificados com base neste método. Outros organismos procarióticos em que as sequências de AA tipo PEST deveriam incluir, mas não estão limitadas a outras espécies de Listeria. Numa forma de realização, a sequência semelhante a PEST adapta-se a um algoritmo divulgado em Rogers et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST adapta-se a um algoritmo divulgado em Rechsteiner et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é identificada usando o programa PEST-find.
Noutra forma de realização, a identificação de motivos PEST é conseguida por uma varredura inicial para AA R, H e K carregados positivamente dentro da sequência de proteína especificada. Todos os AA entre os flancos carregados positivamente são contados e apenas esses motivos são considerados mais adiante, que contêm um número de AA igual ou superior ao parâmetro do tamanho da janela. Noutra forma de realização, uma sequência tipo PEST deve conter, pelo menos, 1 P, 1 D ou E, e, pelo menos, 1 S ou T.
Em outra forma de realização, a qualidade de um motivo PEST é refinada por meio de um parâmetro de pontuação baseado no enriquecimento local de AA crítico, bem como a hidrofobicidade de motivos. 0 enriquecimento de D, E, P, S e T é expresso em percentagem em massa (p/p) e corrigido para 1 equivalente de D ou E, 1 de P e 1 de S ou T. Em outra forma de realização, o cálculo da hidrofobia segue em princípio o método de J. Kyte e RF Doolittle (Kyte, J e Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982). Para cálculos simplificados, os índices de hidropatia de Kyte-Doolittle, que originalmente variaram de-4,5 para arginina a +4,5 para isoleucina, são convertidos em inteiros positivos, usando a seguinte transformação linear, que gerou valores de 0 para arginina para 90 para isoleucina. índice de hidropatia=10*Kyte-índice de hidropatia Doolittle+45
Noutra forma de realização, uma hidrofobicidade potencial de motivos PEST é calculada como a soma sobre os produtos de percentual molar e índice de hidrofobicidade para cada espécie AA. 0 resultado PEST desejado é obtido como combinação do termo de enriquecimento local e termo de hidrofobicidade, conforme expresso pela seguinte equação:
Resultado PEST = 0,55*DEPST-0,5*índice de hidrofobicidade.
Noutra forma de realização, "sequência PEST", "sequência semelhante a PEST" ou "péptido de sequência semelhante a PEST" refere-se a um péptido com uma pontuação de, pelo menos, +5, utilizando o algoritmo acima. Noutra forma de realização, o termo refere-se a um péptido possuindo uma pontuação de, pelo menos, 6. Numa outra forma de realização, o péptido tem uma pontuação de, pelo menos, 7. Numa outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 8. Numa outra forma de realização, a pontuação é Pelo menos 9. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 10. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 11. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 12. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 13. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 14. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 15. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 16. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 17. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 18. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 19. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 20. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 21. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 22. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 24. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 25. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 26. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 27. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 28. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 29. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 30. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 32. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 35. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 38. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 40. Em outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 45.
Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é identificada usando qualquer outro método ou algoritmo conhecido na técnica, por exemplo, o CaSPredictor (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. 2005 Jun;21 Suppl 1:Í169-76). Noutra forma de realização, o seguinte método é utilizado:
Um índice PEST é calculado para cada trecho de comprimento apropriado (por exemplo, um alongamento de 30-35 AA), atribuindo um valor de 1 ao AA Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn ou Gin. O valor do coeficiente (CV) para cada um dos resíduos PEST é 1 e para cada um dos outros AA (não PEST) é 0. "Fusão para uma sequência semelhante a PEST" refere-se, noutra forma de realização, à fusão para um fragmento de proteína compreendendo uma sequência semelhante a PEST. Noutra forma de realização, o termo inclui casos em que o fragmento de proteína compreende sequência circundante diferente da sequência semelhante a PEST. Noutra forma de realização, o fragmento de proteína consiste na sequência de tipo PEST. Assim, noutra forma de realização, a "fusão" refere-se a dois péptidos ou fragmentos de proteínas ligados entre si nas suas extremidades respetivas ou embutidos um no outro.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona estirpes de Listeria que expressam um polipéptido recombinante compreendendo o fragmento do polipéptido receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), ligado operativamente a um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST.
Numa forma de realização, "proteína" ou "polipéptido" refere-se a uma cadeia de aminoácidos compreendendo subunidades de péptidos múltiplos e pode, numa forma de realização, incluir uma proteína de comprimento total, oligopéptidos e seus fragmentos, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Numa forma de realização, uma proteína pode compreender um polipéptido da presente invenção. Numa forma de realização, uma proteína é uma estrutura multimérica.
Numa forma de realização, um polipéptido "recombinante" refere-se a um polipéptido que é derivado de ADN recombinante, o qual, numa forma de realização, é uma forma de ADN sintético que combina sequências de ADN que normalmente não ocorreram juntas na natureza. Numa forma de realização, um polipéptido recombinante pode ser referido como um polipéptido manipulado ou geneticamente modificado. 0 termo "nativo" ou "sequência nativa" refere-se a um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido que ocorre na natureza. Considera-se que um polipéptido é "nativo" de acordo com a presente invenção independentemente do seu modo de preparação. Assim, tal polipéptido de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. Os termos "nativo" e "sequência nativa" englobam especificamente as formas truncadas ou segregadas de ocorrência natural (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas alternadas emendadas) e variantes alélicas de ocorrência natural de um polipéptido.
Tal como aqui utilizado na especificação e na secção de exemplos que se segue, o termo "péptido" inclui péptidos nativos (produtos de degradação, péptidos sintetizados sinteticamente ou péptidos recombinantes) e peptidomiméticos (tipicamente, péptidos sintetizados sinteticamente), tais como peptoides e semipeptoides que são análogos de péptidos, que podem ter, por exemplo, modificações que tornam os péptidos mais estáveis num corpo ou mais capazes de penetrar em células bacterianas. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a modificação do terminal N, modificação do terminal C, modificação da ligação peptidica, incluindo, mas não limitado a CH2-NH, CH2-S, CH2-S = 0, 0 = C-NH, CH2- 0, CH2-CH2, S = C-NH, CH = CH ou CF = CH, modificações de estrutura e modificação de resíduos. Métodos para preparar compostos peptidomiméticos são bem conhecidos na técnica e são especificados em, por exemplo, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Mais detalhes a este respeito são fornecidos a seguir.
As ligações peptídicas (-C0-NH-) dentro do péptido podem ser substituídas, por exemplo, por ligações N-metiladas (-N (CH3)-C0-), ligações éster (-C (R) HCOOC (R) -N-), ligações de cetometileno (-C0-CH2-), ligações a-aza (-NH-N (R) -C0-, em que R é qualquer alquilo, por exemplo, ligações metilo, carba (-CH2-NH-), ligações hidroxietileno (-CH (OH) -CH2-), ligações de tioamida (-CS-NH-), ligações duplas olefínicas (-CH = CH-), ligações retro-amida (-NH-C0-), derivados peptídicos (-N (R) -CH2-C0-), em que R é a cadeia lateral "normal", naturalmente apresentada no átomo de carbono.
Estas modificações podem ocorrer em qualquer uma das ligações ao longo da cadeia peptidica e mesmo em vários (2-3) ao mesmo tempo.
Os aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substituídos por ácido não natural sintético tal como TIC, naf talilandina (Nol), derivados de metilamina do anel de Phe, derivados halogenados de Phe ou o-metil-Tyr.
Além dos acima mencionados, os péptidos da presente invenção também podem incluir um ou mais aminoácidos modificados ou um ou mais monómeros não aminoácidos (por exemplo, ácidos gordos, carboidratos complexos, etc.)·
Tal como aqui utilizado na especificação e na secção de reivindicações abaixo, entende-se que o termo "aminoácido" ou "aminoácidos" inclui os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente; esses aminoácidos são frequentemente modificados pós-tradução in vivo, incluindo, por exemplo, hidroxiprolina, fosfosserina e fosforotonina; e outros aminoácidos incomuns incluindo, mas não limitado a ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina e ornitina. Além disso, o termo "aminoácido" inclui os aminoácidos D e L.
Os aminoácidos de ocorrência natural e os aminoácidos não convencionais ou modificados que podem ser utilizados com a presente invenção são bem conhecidos na técnica.
Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere-se quer à forma de estereoisómero D ou L do aminoácido, a menos que designado de outro modo especificamente. Também abrangidos no âmbito desta invenção são proteínas equivalentes ou péptidos equivalentes, por exemplo, possuindo a atividade biológica de proteína supressora de tumor de tipo selvagem purificado. "Proteínas equivalentes" e "polipéptidos equivalentes" referem-se a compostos que se afastam da sequência linear das proteínas ou polipéptidos que ocorrem naturalmente, mas que possuem substituições de aminoácidos que não alteram biologicamente a atividade. Estes equivalentes podem diferir das sequências nativas pela substituição de um ou mais aminoácidos com aminoácidos relacionados, por exemplo, aminoácidos carregados de forma semelhante, ou a substituição ou modificação de cadeias laterais ou grupos funcionais. O polipéptido da presente invenção pode ser de qualquer tamanho. Como é de se esperar, os polipéptidos podem exibir uma grande variedade de pesos moleculares, alguns que excedem 150 a 200 kilodaltons (kD) . Tipicamente, os polipéptidos podem ter um peso molecular que varia de cerca de 5000 a cerca de 100000 Dalton. Ainda outros podem cair em uma faixa mais estreita, por exemplo, cerca de 10 000 a cerca de 75 000 Dalton, ou cerca de 20 000 a cerca de 50 000 Dalton. Numa forma de realização, os polipéptidos têm um peso molecular entre 19 e 51 kD. Numa forma de realização, um polipéptido da presente invenção é de 298 aminoácidos. Noutra forma de realização, um polipéptido da presente invenção é de 396 aminoácidos. Noutra forma de realização, um polipéptido da presente invenção é de 301 aminoácidos. Numa forma de realização, um polipéptido da presente invenção tem entre 250 e 450 resíduos de aminoácidos de comprimento. Noutra forma de realização, um polipéptido da presente invenção tem entre 200 e 500 resíduos de aminoácidos de comprimento. Noutra forma de realização, um polipéptido da presente invenção está entre 275 e 425 resíduos de aminoácidos por muito tempo. Noutra forma de realização, um polipéptido da presente invenção está entre 100 e 600 resíduos de aminoácidos de comprimento.
Numa forma de realização, "variante" refere-se a uma sequência de aminoácido ou ácido nucleico (ou em outras formas de realização, um organismo ou tecido) que é diferente da maioria da população, mas ainda é suficientemente semelhante ao modo comum a ser considerado como sendo um deles, por exemplo, variantes de junção. Numa forma de realização, a variante pode ser uma variante conservative da sequência, enquanto que noutra forma de realização, a variante pode ser uma variante conservative funcional. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição de 1 aminoácido. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção, substituição ou combinação dos mesmos de 2 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 3 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou sua combinação de 4 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 5 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 7 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 10 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou sua combinação de 2-15 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 3-20 aminoácidos. Numa forma de realização, uma variante pode compreender uma adição, deleção ou substituição, ou a sua combinação de 4-25 aminoácidos.
As variantes da sequência de aminoácidos podem ser utilizadas nas composições da presente invenção. Numa forma de realização, as variantes da sequência de aminoácidos podem ser produzidas por meio da expressão da sequência de ADN subjacente numa célula hospedeira recombinante adequada, ou por sintese in vitro do polipéptido desejado, conforme discutido acima. A sequência de ácido nucleico que codifica uma variante de polipéptido é, numa forma de realização, preparada por mutagénese dirigida ao local da sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido nativo (por exemplo, humano) correspondente. Noutra forma de realização, a mutagénese dirigida ao sitio utilizando a amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) (ver, por exemplo, a Patente US 4683195 concedida em 28 de julho de 1987; e Current Protocols In Molecular Biology, Chapter 15 (Ausubel et al., ed., 1991). Outras técnicas de mutagénese dirigidas pelo local também são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, nas seguintes publicações: Current Protocols In Molecular Biology, supra, Chapter 8/Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd edition (Sambrook et al., 1989); Zoller et al., Methods Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller &amp; Smith, DNA 3:479-488 (1984); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487); Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646 (1984); Botstein et al., Science 229:1193 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987), Adelman et al., DNA 2:183 (1983); and Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986). Cassette mutagenesis (Wells et al., Gene 34:315 [1985]) e mutagénese de seleção de restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 [1986]) também podem ser usados.
As variantes de sequências de aminoácidos com mais de uma substituição de aminoácidos podem ser geradas de várias maneiras. Se os aminoácidos estão localizados próximos uns dos outros na cadeia polipeptidica, podem ser mutados simultaneamente, usando um oligonucleótido que codifica para todas as substituições de aminoácidos desejadas. Se, no entanto, os aminoácidos estão localizados a alguma distância um do outro (por exemplo, separados por mais de dez aminoácidos), é mais difícil gerar um único oligonucleótido que codifique todas as mudanças desejadas. Em vez disso, um dos dois métodos alternativos pode ser empregue. No primeiro método, um oligonucleótido separado é gerado para cada aminoácido a ser substituído. Os oligonucleótidos são então recozidos ao ADN modelo de cadeia simples simultaneamente e a segunda cadeia de ADN que é sintetizada a partir do modelo codificará todas as substituições de aminoácidos desejadas. O método alternativo envolve duas ou mais rodadas de mutagénese para produzir o mutante desejado.
Noutra forma de realização, as proteínas de fusão do preparado são preparadas por um processo que compreende a subclonagem de sequências apropriadas, seguida da expressão do nucleótido resultante. Noutra forma de realização, as subsequências são clonadas e as subsequências apropriadas clivaram utilizando enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos são então ligados, em outra forma de realização, para produzir a sequência de ADN desejada. Noutra forma de realização, o ADN que codifica a proteína de fusão é produzido utilizando métodos de amplificação de ADN, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR). Primeiro, os segmentos do ADN nativo de cada lado do novo terminal são amplificados separadamente. A extremidade 5' da única sequência amplificada codifica o ligante peptídico, enquanto a extremidade 3' da outra sequência amplificada também codifica o ligante peptídico. A extremidade 5' do primeiro fragmento é complementar à extremidade 3'do segundo fragmento, os dois fragmentos (após purificação parcial, por exemplo, em agarose LMP) podem ser usados como um modelo de sobreposição numa terceira reação de PCR. A sequência amplificada conterá codões, o segmento no lado carboxi do local de abertura (agora formando a sequência amino), o ligante e a sequência no lado amino do local de abertura (agora formando a sequência carboxil). 0 inserto é então ligado a um plasmídeo. Noutra forma de realização, uma estratégia semelhante é utilizada para produzir uma proteína em que um fragmento VEGFR2 é incorporado dentro de um péptido heterólogo.
Noutra forma de realização, um polipéptido recombinante na Listeria e as composições da presente invenção compreendem uma sequência de sinal. Noutra forma de realização, a sequência de sinal é do organismo utilizado para construir o vetor de vacina. Noutra forma de realização, a sequência de sinal é uma sequência de sinal LLO. Noutra forma de realização, a sequência de sinal é uma sequência de sinal ActA. Noutra forma de realização, a sequência de sinal é uma sequência de sinal Listeria.
Noutra forma de realização, Listeria e as composições da presente invenção utilizam uma molécula quimérica, compreendendo uma fusão de um polipéptido quimérico recombinante com um polipéptido de marcação que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo anti-etiqueta pode se ligar seletivamente. A etiqueta do epitopo é colocada, noutras formas de realização, no terminal amino ou carboxilo da proteína ou numa localização interna no mesmo. A presença de tais formas marcadas com epitopo do polipéptido quimérico é detetada, noutra forma de realização, utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Noutra forma de realização, a inclusão da marca de epitopo permite que o polipéptido quimérico recombinante seja prontamente purificado por purificação por afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador de epitopo. Vários polipéptidos de marcação e seus respetivos anticorpos são conhecidos na técnica. Os exemplos incluem etiquetas de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); 0 polipéptido de marca HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Célula. Biol., 8: 2159-2165 (1988)); a marca c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)); e a etiqueta da glicoproteína D do vírus Herpes Simplex D (gD) e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)). Outros polipéptidos de marcação incluem o péptido-bandeira (Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)); o péptido do epitopo KT3 (Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)); um péptido de epitopo de tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)); e a etiqueta de péptido de proteína do gene T7 10 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 87: 6393-6397 (1990)). Os métodos para a construção de proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em LaRochelle et al., J. Cell Biol., 139 (2): 357-66 (1995); Heidaran et al., FASEB J., 9 (1): 140-5 (1995); Ashkenazi et al., Int. Rev. Immunol., 10 (2-3): 219-27 (1993) E Cheon et al., PNAS USA, 91 (3): 989-93 (1994).
Noutra forma de realização, a Listeria pode expressar um péptido que é homólogo a um péptido aqui enumerado. Os termos "homologia", "homóloga", etc., quando em referência a qualquer proteína ou péptido, referem, numa forma de realização, a uma percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de um polipéptido nativo correspondente, Depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a percentagem máxima de homologia e não considerar quaisquer substituições conservatives como parte da identidade da sequência. Métodos e programas informáticos para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. A homologia é, noutra forma de realização, determinada pelo algoritmo do computador para o alinhamento da sequência, por métodos bem descritos na técnica. Por exemplo, a análise de algoritmos computacionais de homologia de sequência de ácido nucleico pode incluir a utilização de qualquer número de pacotes de software disponíveis, como, por exemplo, os pacotes BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT e TREMBL.
Noutra forma de realização, "homologia" ou "homóloga" refere-se a uma partilha de sequência superior a 70% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 72% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 75% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 78% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 80% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 82% de identidade com uma segunda sequência. Em outra forma de realização, "homologia" refere-se a uma sequência que compartilha maior que 83% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 85% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 87% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência maior que 88% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência maior que 90% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 92% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência maior que 93% de identidade com uma segunda sequência. Em outra forma de realização, " Refere-se a uma sequência que compartilha maior que 96% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 97% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma sequência de partilha de identidade superior a 98% com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma partilha de sequência superior a 99% de identidade com uma segunda sequência. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade de 100% de identidade com uma segunda sequência.
Noutra forma de realização, a homologia é determinada através da determinação da hibridação da sequência candidata, cujos métodos estão bem descritos na técnica (veja, por exemplo, "Nucleic Acid Hybridization "Hames, BD e Higgins SJ, Eds. (1985); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY.; e Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, NY) . Em outras formas de realização, os métodos de hibridação são realizados sob condições moderadas a rigorosas, ao complemento de um ADN que codifica um péptido caspase nativo. As condições de hibridação são, por exemplo, incubação durante a noite a 42°C numa solução compreendendo: 10-20% de formamida, SSC 5 X (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5 X solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e cortado. A homologia de proteína e/ou péptido para qualquer sequência de AA aqui indicada é determinada, noutra forma de realização, por métodos bem descritos na técnica, incluindo a análise de imunotransferência, ou através de análise de algoritmos computacionais de sequências de AA, utilizando qualquer um de vários pacotes de software disponíveis, através de métodos estabelecidos. Alguns desses pacotes incluem os pacotes FASTA, BLAST, MPsrch ou Scanps e, em outra forma de realização, empregam o uso dos algoritmos Smith e Waterman e/ou alinhamentos globais/locais ou BLOCKS para análise.
Tal como aqui utilizado, uma "variante" é um péptido ou proteína que difere de outro péptido ou proteína de uma maneira menor, o qual, numa forma de realização, refere-se a uma mutação numa região que não afeta a função do péptido ou proteína, e noutra forma de realização, uma mutação conservadora que não afeta a função do péptido ou proteína.
Tal como aqui utilizado, "isoforma" refere-se a uma versão de uma molécula, por exemplo, uma proteína, com apenas pequenas diferenças para outra isoforma da mesma proteína. Numa forma de realização, as isoformas podem ser produzidas a partir de genes diferentes, mas relacionados, ou noutra forma de realização, podem surgir a partir do mesmo gene por splicing alternativo. Noutra forma de realização, as isoformas são causadas por polimorfismos de nucleótidos únicos.
Numa forma de realização, um fragmento de um polipéptido VEGFR2, que numa forma de realização, é um fragmento Flkl, mantém a sua atividade biológica. Numa forma de realização, um fragmento de um polipéptido não VEGFR2, por exemplo, uma sequência ActA, LLO ou semelhante a PEST, mantém a sua capacidade para aumentar a imunogenicidade do antigénio ou polipéptido ao qual está fundido. Noutra forma de realização, um fragmento de um polipéptido não VEGFR2, por exemplo, uma sequência ActA, LLO ou semelhante a PEST, mantém a sua capacidade de liar o fagosoma da célula hospedeira, ou noutra forma de realização, para polimerizar a actina do hospedeiro ou, em outra forma de realização, servem como sinais proteolíticos.
Tal como aqui utilizado, "imunogénico" refere-se à capacidade de uma substância (numa forma de realização, um antigénio) para induzir uma resposta imune.
Tal como aqui utilizado, uma "célula hospedeira" inclui uma célula ou cultura celular individual que pode ser ou foi um recetor de qualquer vetor da presente invenção. As células hospedeiras incluem a progenitura de uma única célula hospedeira, e a progenitura pode não ser necessariamente completamente idêntica (na morfologia ou no complemento de ADN total) à célula original por causa da mutação e/ou alteração natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas ou infectadas in vivo com um vetor compreendendo um ácido nucleico da presente invenção.
Em algumas formas de realização, qualquer dos polipéptidos ou ácidos nucleicos e para utilização na Listeria da presente invenção compreenderá um fragmento de polipéptido VEGFR2 ou um ácido nucleico isolado que codifica o referido fragmento de polipéptido VEGFR2, em qualquer forma ou forma de realização tal como aqui descrito. Em algumas formas de realização, qualquer dos polipéptidos ou ácidos nucleicos e para utilização na Listeria da presente invenção consistirá num fragmento de polipéptido VEGFR2 ou num ácido nucleico isolado que codifica o referido fragmento de polipéptido VEGFR2 da presente invenção, em qualquer forma ou como descrito aqui. Em algumas formas de realização, os polipéptidos ou ácidos nucleicos consistirão essencialmente num fragmento de polipéptido VEGFR2 ou num ácido nucleico isolado que codifica os referidos componentes da presente invenção, em qualquer forma ou forma de realização tal como aqui descrito. Em algumas formas de realização, 0 termo "compreender" refere-se à inclusão de outros fragmentos, outros anticorpos, polipéptidos adicionais, bem como a inclusão de outras proteínas que podem ser conhecidas na técnica. Em algumas formas de realização, o termo "constituído essencialmente por" refere-se a um polipéptido ou ácido nucleico, que possui o polipéptido ou fragmento VEGFR2 específico. No entanto, outros péptidos podem ser incluídos que não estão envolvidos diretamente na utilidade da toxina. Em algumas formas de realização, o termo "consistindo" refere-se a uma toxina que possui o polipéptido ou fragmento VEGFR2 especifico da presente invenção, em qualquer forma ou forma de realização tal como aqui descrito.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, descrita aqui, para utilização na direção da vasculatura do tumor de um crescimento de tumor ou cancro num indivíduo.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe de Listeria recombinante da invenção como aqui descrita para utilização na prevenção da recorrência de um tumor ou para utilização na inibição de metástases de um tumor ou cancro num indivíduo. É aqui divulgado um método para induzir uma resposta imune anti-VEGFR2 num sujeito, compreendendo administrar ao referido sujeito uma composição compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um polipéptido do recetor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) ou um seu fragmento imunogénico.
Também é revelado aqui um método de tratamento de um cancro num indivíduo, compreendendo o passo de administração ao referido sujeito, uma composição compreendendo uma estirpe Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico.
Também é revelado aqui um método de inibição ou supressão de um cancro num indivíduo, compreendendo o passo de administrar ao referido sujeito uma composição compreendendo uma estirpe Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico.
Também é revelado aqui um método para prevenir a recorrência de um tumor num indivíduo, compreendendo o passo de administrar ao referido sujeito uma composição compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico. A eficácia de uma estirpe recombinante de Listeria que expressa um fator angiogénico que previne a recorrência de um tumor é demonstrada na Figura 4.
Também é revelado aqui um método de inibição da metástase de um tumor num indivíduo, compreendendo o passo de administração ao referido sujeito, uma composição compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições para utilização no tratamento de um cancro num indivíduo, compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um recetor de fator de crescimento endotelial vascular-2 (VEGFR2) Flk-l-El ou polipéptido Flk-1-11, como descrito aqui.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições para utilização na inibição ou supressão de um cancro num indivíduo, compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) Flk-l-El ou um polipéptido Flk-l-Il, conforme descrito aqui.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições para utilização na prevenção da recorrência de um tumor num indivíduo, compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) Flk-l-El ou um polipéptido Flk-l-Il, como aqui descrito.
Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona composições para utilização na inibição de metástases de um tumor num indivíduo, compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante que expressa um receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) Flk-l-El ou um polipéptido Flk-l-Il, conforme descrito aqui.
Noutra forma de realização, o receptor-2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2) Flk-l-El ou o polipéptido Flk-l-Il podem estar operativamente ligados a um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição para utilização no tratamento, inibição ou supressão de cancro ou metástase tumoral em que o sujeito monta uma resposta imune contra o polipéptido VEGFR2. Noutra forma de realização, o sujeito monta uma resposta imune contra um antigénio tumoral expresso pelo tumor através da propagação do epítopo.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção são para utilização em indivíduos humanos, enquanto noutra forma de realização, são para utilização em indivíduos de mamífero. Numa forma de realização, o sujeito é um sujeito animal que, em uma forma de realização, é murino, bovino, canino, felino, equino, porcino, etc. Em uma forma de realização, o termo "mamífero" ou "mamíferos" refere-se a qualquer animal classificado como Um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e gato, e zoológicos, desportivos ou animais de estimação, como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, bem como roedores, como ratinhos e ratos, etc. Numa forma de realização, as composições e os usos médicos da presente invenção são eficazes em indivíduos do sexo masculino. Noutra forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção são eficazes em indivíduos do sexo feminino.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção são utilizadas para tratar, impedir, suprimir, inibir ou prevenir qualquer das doenças, distúrbios, sintomas ou efeitos secundários acima descritos. Numa forma de realização, "tratamento" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto é prevenir ou diminuir a condição ou distúrbio patológico alvo como descrito acima. Assim, numa forma de realização, o tratamento pode incluir afetar diretamente ou curar, suprimir, inibir, prevenir, reduzir a gravidade de, retardar o aparecimento de, reduzir sintomas associados com a doença, desordem ou condição ou uma combinação destes. Assim, em uma forma de realização, "tratar" refere-se, inter alia, a atrasar a progressão, acelerar a remissão, induzir remissão, aumentar a remissão, acelerar a recuperação, induzindo regressão, aumentando a eficácia ou diminuindo a resistência a terapêuticas alternativas, ou uma combinação delas. Em uma forma de realização, "prevenir" ou "impedir" refere-se, inter alia, a atrasar o aparecimento de sintomas, prevenir a recaída de uma doença, prevenir a recorrência de uma doença, diminuir o número ou frequência de episódios de recaída, aumentar a latência entre episódios sintomáticos, ou uma combinação destes. Numa forma de realização, "supressão" ou "inibição", refere-se a diminuir o número ou a frequência dos episódios de recaída, aumentando a latência entre episódios sintomáticos ou uma combinação destes. Numa forma de realização, "supressão" ou "inibição", refere-se a diminuir o número ou a frequência dos episódios de recaída, aumentando a latência entre episódios sintomáticos ou uma combinação destes. Numa forma de realização, "supressão" ou "inibição", refere-se, inter alia, reduzir a gravidade dos sintomas, reduzir a gravidade de um episódio agudo, reduzir o número de sintomas, reduzir a incidência de sintomas relacionados à doença, reduzir a latência dos sintomas, melhorar os sintomas, reduzir os sintomas secundários, reduzir infeções secundárias, prolongar a sobrevivência do paciente, ou uma combinação destes.
Numa forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção erradicam completamente um tumor existente, enquanto que noutra forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção induzem a regressão tumoral, enquanto que noutra forma de realização, as composições e os usos médicos da presente invenção controlam o crescimento tumoral.
Numa forma de realização, os sintomas são primários, enquanto noutra forma de realização, os sintomas são secundários. Numa forma de realização, "primário" refere-se a um sintoma que é um resultado direto de uma doença ou distúrbio particular, enquanto numa forma de realização, "secundário" refere-se a um sintoma que é derivado ou consequente de uma causa primária. Numa forma de realização, os compostos para utilização na presente invenção tratam sintomas primários ou secundários ou complicações secundárias relacionadas ao cancro, o qual, numa forma de realização, é cancro da mama. Em outra forma de realização, "sintomas" podem ser qualquer manifestação de uma doença ou condição patológica.
Numa forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção inibem a angiogénese. Noutra forma de realização, as composições e as utilizações médicas da presente invenção diminuem a densidade microvascular, que numa forma de realização é a densidade microvascular de um tumor.
Numa forma de realização, as composições e os usos médicos da presente invenção são para o tratamento de cancro. Numa forma de realização, o cancro é cancro da mama. Noutra forma de realização, o cancro é o cancro colorretal, que numa forma de realização, é cancro colorretal metastático.
Numa forma de realização, o cancro é um cancro que expressa Her-2/neu.
Numa forma de realização, a metástase é um processo pelo qual o cancro se espalha do local em que ocorreu pela primeira vez como um tumor primário para locais distantes no corpo. Numa forma de realização, um cancro da presente invenção é uma metástase de cancro da mama. Noutra forma de realização, um cancro da presente invenção é uma metástase de melanoma. Numa forma de realização, o cancro metastizou para o cérebro. Em outra forma de realização, o cancro metastizou para o pulmão. Em outra forma de realização, o cancro metastizou para o rim. Em outra forma de realização, o cancro metastizou para o cólon. Em outra forma de realização, o cancro, que numa forma de realização, é um cancro da mama, metatizou para o peito ou a área onde a mama costumava ser, a parede torácica, os gânglios linfáticos, os ossos, os pulmões ou ao redor dos pulmões, fígado, cérebro ou uma combinação destes.
Em uma forma de realização, outras metástase de cancros, bem como órgãos secundários prováveis em que os cancros metastáticos crescerão são conhecidos na técnica.
Numa forma de realização, as composições e os usos médicos da presente invenção são para o tratamento de um tumor, o qual, numa forma de realização, é um tumor sólido. Numa forma de realização, o tumor é um melanoma. Noutra forma de realização, o tumor é um sarcoma. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma. Em outra forma de realização, o tumor é um mesotelioma (por exemplo, mesotelioma maligno). Noutra forma de realização, o tumor é um glioma. Noutra forma de realização, o tumor é um tumor de células germinativas. Noutra forma de realização, o tumor é um coriocarcinoma.
Noutra forma de realização, o tumor é um cancro do pâncreas. Noutra forma de realização, o tumor é cancro do ovário. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro gástrico. Em outra forma de realização, o tumor é uma lesão carcinomatosa do pâncreas. Noutra forma de realização, o tumor é adenocarcinoma pulmonar. Noutra forma de realização, o tumor é adenocarcinoma colorrectal. Noutra forma de realização, o tumor é adenocarcinoma escamoso pulmonar. Noutra forma de realização, o tumor é adenocarcinoma gástrico. Noutra forma de realização, o tumor é uma neoplasia epitelial da superfície do ovário (por exemplo, uma variedade benigna, proliferativa ou maligna). Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma de células escamosas orais. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma de pulmão de células não pequenas. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma endometrial. Noutra forma de realização, 0 tumor é um cancro da bexiga. Em outra forma de realização, o tumor é um cancro da cabeça e pescoço. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma da próstata.
Noutra forma de realização, o tumor é um cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Noutra forma de realização, o tumor é um tumor de Wilms. Em outra forma de realização, o tumor é um tumor desmoplásico de pequena célula redonda. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro do cólon. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro do pulmão. Em outra forma de realização, o tumor é um cancro do ovário. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro uterino. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro da tireoide. Em outra forma de realização, o tumor é um carcinoma hepatocelular. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro do fígado. Noutra forma de realização, o tumor é um cancro renal. Em outra forma de realização, o tumor é uma capose. Noutra forma de realização, o tumor é um sarcoma de capose.
Em outra forma de realização, o tumor é um tumor de mama. Numa forma de realização, as composições e usos médicos da presente invenção são para tratar o adenocarcinoma, que numa forma de realização, se desenvolve em tecido glandular. Numa forma de realização, as composições e usos médicos da presente invenção são para tratar um carcinoma ductal in situ (DCIS), que numa forma de realização, se desenvolve nos duetos do leite e, noutra forma de realização, é uma forma precoce de cancro da mama.
Noutra forma de realização, as composições e usos médicos da presente invenção são para tratar um carcinoma ductal invasivo (IDC), que numa forma de realização, é o tipo mais comum de cancro da mama, desenvolve a partir de DCIS, se espalha através das paredes do dueto e invade o tecido mamário. Noutra forma de realização, as composições e usos médicos da presente invenção são para tratar um carcinoma lobular invasivo, que numa forma de realização, se origina nas glândulas do leite e representa 10-15% dos cancros da mama invasivos. Outros tipos de cancro da mama que podem ser tratados usando composições da presente invenção incluem: inflamatório (onde, numa forma de realização, o tecido mamário é quente e aparece vermelho, tende a se espalhar rapidamente), o carcinoma medular (que, em uma forma de realização, se origina em tecido central do peito), carcinoma mucoso (onde, numa forma de realização, é invasivo; geralmente ocorre em mulheres pós-menopáusicas), a doença de Paget do mamilo (que, n uma forma de realização, se origina nos duetos do leite e se espalha na pele dos mamilos ou aréola), o tumor de Phyllodes (que, numa forma de realização, é caracterizado por um tumor com uma aparência semelhante a uma folha que se estende para os duetos, raramente metastiza) e o carcinoma tubular (que, numa forma de realização, é um pequeno tumor que geralmente é indetetável por palpação). As composições da presente invenção também podem ser utilizadas para tratar sarcomas (numa forma de realização, cancro do tecido conjuntivo) e linfomas (numa forma de realização, cancro do tecido linfático) que se desenvolvem no tecido mamário.
Noutra forma de realização, as composições e os usos médicos da presente invenção são tratar condições relacionadas com a mama em homens, que numa forma de realização, é ginecomastia, cancro da mama lobular (LBC) e carcinoma ductal infiltrante (ou invasivo) (IDC) que numa forma de realização, é a forma mais comum de cancro da mama masculino e representa 80 a 90 por cento dos diagnósticos de cancro da mama de todos os homens. Numa forma de realização, IDC origina-se no dueto e invade, o tecido adiposo circundante. Numa forma de realização, o IDC pode ser contido apenas dentro da mama, ou, noutra forma de realização, pode metastizar (espalhar) para outras partes do corpo.
Numa forma de realização, esta invenção proporciona composições e usos médicos para prevenir o cancro em populações que estão predispostas ao cancro ou em populações que apresentam alto risco para o cancro, o que, numa forma de realização, pode ser uma população de mulheres com mutações brcal ou brca2, cuja população numa forma de realização, é suscetível ao cancro da mama.
Noutra forma de realização, a resposta imunitária provocada pelas composições da presente invenção é uma resposta imune mediada por células. Noutra forma de realização, a resposta imune é uma resposta imune mediada por células T. A resposta imune mediada por células T induzida por composições da presente invenção compreende, noutra forma de realização, um CTL. Noutra forma de realização, a célula T envolvida na resposta imune mediada por células T é um CTL.
Noutra forma de realização, a resposta imune mediada por células T compreende uma célula auxiliar T. Noutra forma de realização, a célula T envolvida na resposta imune mediada por células T é uma célula auxiliar T.
Numa forma de realização, uma composição da presente invenção leva a uma infiltração de células T CD8+ ao redor de vasos sanguíneos e no estroma de tumores a partir de ratinhos imunizados. Numa forma de realização, a presença de linfócitos infiltrantes de tumor correlaciona-se com as respostas clínicas na imunoterapia do cancro. Conforme descrito abaixo, apesar do seu efeito na vasculatura, as composições da presente invenção não conduzem a toxicidade, tais como problemas de cicatrização de feridas, gravidez ou fertilidade associados com danos nos vasos sanguíneos em ratos imunizados com uma vacina da presente invenção.
Numa forma de realização, as composições da presente invenção compreendem ainda um antigénio tumoral. Numa forma de realização, o antigénio tumoral é o antigénio associado ao melanoma com alto peso molecular (HMW-MAA) . Numa forma de realização, o antigénio tumoral é uma proteína NY-ESO- 1. Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é uma proteína E7 do vírus do papiloma humano (HPV). Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é uma proteína de recetor de células B (BCR). Noutra forma de realização, o péptido heterólogo de interesse é um péptido antigénico. Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um péptido NY-ESO-1. Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um péptido E7 de vírus do papiloma humano (HPV). Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um péptido de recetor de células B (BCR). Noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um virus do papiloma humano (HPV)-16-E6, HPV-16-E7, HPV-18-E6, HPV-18-E7, um antigénio Her/2-neu, um antígeno prostático específico (PSA), um antígeno de células estaminais da próstata (PSCA), um antígeno de enzima quimiotritica de Stratum Corneum (SCCE), antígeno de tumor de Wilms 1 (WT-1), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), proteinase 3, proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2), sarcoma sinovial, X (SSX)-2, antígeno carcinoembrionário (CEA), MAGE-A, recetor de interleucina-13 alfa (IL13-R alfa), anidrase carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 ou péptido de testosterona. Em outra forma de realização, o antigénio tumoral é a alfa-fetoproteina, A3, antigénio específico para o anticorpo A33, Ba 733, antigénio BrE3, CA125, CDl, CDla, CD3, CD5, CDl 5, CDl 6, CD1 9, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD74, CD79a, CD80, CDl 38, antígeno-p específico do cólon (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, CSAp, EGFR, EGP-I, EGP- 2, Ep-CAM, FIt-I, Flt-3, recetor de folato, HLA-DR, gonadotropina coriónica humana (HCG) e suas subunidades, HER2/neu, fator induzível de hipoxia (HIF-I), la, IL-2, IL-6, IL-8, fator de crescimento de insulina-1 (IGF-I), antigénio KC4, antigénio KS-I, KS 1-4, Le-Y, fator de inibição de macrófagos (MIF), MAGE, MUC1, MUC2, MUC3 , MUC4, NCA66, NCA95, NCA90, antigénio específico para o anticorpo PAM-4, fator de crescimento placentário, p53, fosfatase ácida prostática, PSMA, RS5, SlOO, TAC, TAG-72, tenascina, recetores TRAIL, antígeno Τη, antigénios Thomson-Friedenreich, antigenos de necrose tumoral, VEGF, fibronectina ED-B, antígeno 17-1A, marcador de angiogénese, marcador oncogene ou um produto oncogene. Outros antigénios tumorais são descritos em Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11: 992-97); Hatfield et al., (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5: 229-48); Vallbohmer et al. (2005, J. Clin. Oncol. 23: 3536-44); eRen et al. (2005, Ann. Surg. 242: 55-63).
Numa forma de realização, o antigénio tumoral é o antigénio associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), enquanto que noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um fragmento de HMW-MAA, tal como descrito em Maciag et al, Cancer Res. 1 de outubro 2008; 68 (19): 8066-75).
Numa forma de realização, as composições da presente invenção compreendem HMW-MAA ou um seu fragmento, Her-2/neu ou um seu fragmento, e Flk/VEGFR2, ou um seu fragmento. Numa forma de realização, HMW-MAA tem como alvo pericites, numa forma de realização, Her-2/neu segmenta células tumorais, e numa forma de realização, Flk/VEGFR2 alveja células endoteliais.
Numa forma de realização, o antigénio tumoral é Her-2/neu, enquanto que noutra forma de realização, o antigénio tumoral é um fragmento Her-2/neu.
Numa forma de realização, o fragmento VEGFR2 e o antigénio tumoral são expressos pelo mesmo vetor, enquanto em outra forma de realização, são expressos por diferentes vetores. Numa forma de realização, o fragmento VEGFR2 e o antigénio tumoral são expressos pela mesma Listeria, enquanto noutra forma de realização são expressos por Listeria diferente.
Numa forma de realização, o antigénio tumoral é expresso como um polipéptido de fusão com um polipéptido contendo PEST, como descrito acima. Numa forma de realização, o antigénio tumoral está operacionalmente ligado a um polipéptido compreendendo uma sequência semelhante a PEST, como descrito acima. Numa forma de realização, o polipéptido contendo PEST é um polipéptido de listeriolisina não-hemolítico (LLO), um polipéptido de Act A N-terminal ou uma sequência PEST.
Composições farmacêuticas e rotas de administração "Composição farmacêutica" refere-se, noutra forma de realização, a uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente ativo, isto é, o péptido ou vetor recombinante compreendendo ou codificando o mesmo, em conjunto com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se, noutra forma de realização, a essa quantidade que proporciona um efeito terapêutico para uma determinada condição e regime de administração.
As composições farmacêuticas que contêm o ingrediente ativo podem ser, noutra forma de realização, administradas a um indivíduo por qualquer via conhecida por um especialista na técnica, tal como por via parentérica, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intra-peritoneal, intra-ventricular, intracranial, intravaginal ou intra-tumoralmente.
Noutra forma de realização da presente invenção, as composições farmacêuticas devem ser administradas por via oral, e são assim formuladas numa forma adequada para administração oral, isto é, como uma preparação sólida ou líquida. As formulações orais sólidas adequadas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, drageias e semelhantes. As formulações orais líquidas adequadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e semelhantes. Noutra forma de realização da presente invenção, o ingrediente ativo é formulado numa cápsula. De acordo com esta forma de realização, as composições da presente invenção compreendem, além do composto ativo e do veículo ou diluente inerte, uma cápsula de gelificação dura.
Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas devem ser administradas por injeção intravenosa, intraarterial ou intramuscular de uma preparação líquida. As formulações líquidas adequadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e semelhantes. Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas devem ser administradas por via intravenosa e são assim formuladas numa forma adequada para administração intravenosa. Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas devem ser administradas intra-arterialmente e são assim formuladas numa forma adequada para administração intraarterial. Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas devem ser administradas intra-muscularmente e são assim formuladas numa forma adequada para administração intramuscular.
Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas devem ser administradas topicamente às superficies do corpo e são assim formuladas numa forma adequada para administração tópica. As formulações tópicas adequadas incluem géis, unguentos, cremes, loções, gotas e semelhantes. Para administração tópica, o péptido ou vetor recombinante é preparado e aplicado como uma solução, suspensão ou emulsão num diluente fisiologicamente aceitável com ou sem um veiculo farmacêutico.
Noutra forma de realização, o ingrediente ativo é administrado numa vesícula, por exemplo, um lipossoma.
Em outras formas de realização, os veículos ou diluentes utilizados nas composições da presente invenção incluem, mas não estão limitados a uma goma, um amido (por exemplo, amido de milho, amido pré-geletanizado), um açúcar (por exemplo, lactose, manitol, sacarose, dextrose), um material celulósico (por exemplo, celulose microcristalina), um acrilato (por exemplo, polimetilacrilato), carbonato de cálcio, óxido de magnésio, talco ou suas misturas.
Em outras formas de realização, transportadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis, tais como, oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meio tamponado. Exemplos de óleos são de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de figado de peixe, outro óleo marinho ou um lipido de leite ou ovos.
Noutra forma de realização, os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos Ringer lactados e fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos, como os que se baseiam na dextrose de Ringer e outros. Exemplos são líquidos estéreis, tais como, água e óleos, com ou sem adição de um tensioativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, a solução de água, solução salina, dextrose aquosa e açúcares relacionadas, e glicóis, tais como, propileno glicóis ou polietilenoglicol são veículos líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, outro óleo marinho ou um lipido de leite ou ovos.
Noutra forma de realização, as composições farmacêuticas aqui proporcionadas são composições de libertação controlada, isto é, composições em que o ingrediente ativo é libertado durante um período de tempo após a administração. As composições de libertação controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos lipofílicos (por exemplo, ácidos gordos, ceras, óleos). Noutra forma de realização, a composição é uma composição de libertação imediata, isto é, uma composição na qual todo o ingrediente ativo é libertado imediatamente após a administração.
Numa forma de realização, é impulsionada a resposta imunitária secundária a um antigénio tumoral, que numa forma de realização, é Her-2/neu. Numa forma de realização, isso proporcionaria proteção adicional contra células tumorais residentes ou células estaminais tumorais, pois Her-2/neu também está altamente expresso sobre esses tipos de células. Assim, numa forma de realização, contemplada como parte da presente invenção, é uma vacinação primária com uma composição da presente invenção e um impulso com uma vacina compreendendo um antigénio tumoral relacionado ao tumor a ser tratado, de tal modo que o efeito do epitopo que se espalha a partir da primeira vacinação primária é reforçada pelo impulso.
Numa forma de realização, o uso de imunoterapia para direcionar a vasculatura apresenta várias vantagens em relação à administração passiva de anticorpos purificados, sendo uma a capacidade de aumentar a resposta imune inicial ao longo do tempo e o custo da vacinação. No entanto, apresentado aqui, é o novo uso de uma proteína de fusão recombinante que expressa o vetor Listeria monocytogenes, que apresenta várias vantagens sobre o uso de outros vetores bacterianos. Numa forma de realização, as estirpes de Lm-LLO-Flk-1 aumentaram a imunogenicidade do fragmento Flk-1 por fusão para LLO, são altamente atenuadas e primariamente replicadas nos macrófagos e nas células dendríticas. Assim, numa forma de realização, tanto a resposta inflamatória à infeção com Listeria e as respostas adicionais induzidas por nossas construções de proteína de fusão têm o poder de reduzir simultaneamente os números de células reguladoras de T no local do tumor enquanto induzem potentes CTL anti tumorais.
Numa forma de realização, o cancro da mama metastático é especialmente suscetível ao tratamento anti-angiogénese porque as metástases precisam recrutar novos vasos quando se estabelecem em locais distantes do local do tumor primário. Numa forma de realização, as micrometástases podem existir num estado estático de crescimento com cerca de 1-3 mm de diâmetro e alimentadas pelo movimento passivo das moléculas. No entanto, para apoiar o crescimento tumoral além de 3mm, é necessária a nova síntese de uma rede vascular. Assim, numa forma de realização, as vacinas anti-VEGFR2 da presente invenção serão especialmente eficazes para romper a propagação do cancro da mama metastático uma vez que o crescimento do tumor é de 3 mm ou superior.
Na medida em que os seguintes exemplos não se relacionam com estirpes Listeria recombinantes que expressam os polipéptidos VEGFR2 Flk-l-El ou Flk-l-Il que são úteis para tratar um tumor ou cancro, são exemplos comparativos.
EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS Ratos. Fêmeas FVB/N foram adquiridas aos laboratórios Charles River. Os ratinhos transgénicos FVB/N Her-2/neu foram alojados e criados no centro do núcleo animal na Universidade da Pensilvânia. Os ratos tinham seis a oito semanas de idade no início das experiências, que foram feitas de acordo com os regulamentos pelo Comité Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade da Pensilvânia.
Peptídeos e anticorpos. 0 CD31 anti-rato, o CD8a-PE anti-rato, os controlos de isotipo IgG 2a -PE de rato foram adquiridos de BD Biosciences (San Jose, CA). 0 anticorpo policlonal antissoro de coelho anti-Listeria, sorotipos 1, 4 foi adquirido de
Difco BD Biosciences. 0 coelho anti-HIF-la foi adquirido da Novus Biologicals (Littleton, CO). 0 anticorpo secundário de cabra anti-Rabbit-Alexa-488 foi adquirido da
Invitrogen. DAPI foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO) . 0 IFN-g de rato anti-rato (clone AN18) foi adquirido de MABTECH (Mariemont, OH). 0 IFN-g anti-rato anti-rato (clone XMG1.2) foi adquirido da eBioscience (San Deigo, CA). Os anticorpos utilizados no Western blot para a expressão da proteina de fusão era um soro policlonal de coelho elevado aos trinta primeiros resíduos (PEST) da proteína LLO (Sewell et al., 2004, Cancer research. 64:8821-8825) ou um anticorpo de rato anti-LLO, específico para LLO de comprimento total, gerado a partir de sobrenadante de hibridoma, clone # B5-19 (Edelson et al., 2001, Immunity. 14: 503-512). Todos os péptidos foram adquiridos de EZBiolabs (Westfield, IN) . Os tetrâmeros foram fornecidos pelo Dr. Amy Stout do Programa de Reagente de Pesquisa e Referência de Institutos Nacionais de Saúde. Os tetrâmeros utilizados eram todos Η-2ϋ'ϊ conjugados com PE e continham péptidos para a região EC1 de Her-2/neu (ASPETHLDML; SEQ ID NO: 25) ou EC2 (PDSLRDLSVF; SEQ ID NO: 26) ou IC1 (GSGAFGTVYK; SEQ ID NO: 27). Os péptidos utilizados nestes estudos foram os seguintes: Flk-El2io-219 (TYQSIMYIV; SEQ ID NO: 28), Flk-E26i3-622 (MFSNSTNDI; SEQ ID NO: 29), Flk-Ilgo6-9i5 (PGGPLMVIV; SEQ ID NO: 30), Flk-Il839-848 (GRGAFGQVI; SEQ ID NO: 31); (Her2-pECl302-3io (PYNYLSTEV; SEQ ID NO: 32), Her2-pEC242o-429 (PDSLRDLSVF; SEQ ID NO: 33), Her2-pICl732-74i (GSGAFGTVYK; SEQ ID NO: 34); HIV-pGag (AMQMLKETI; SEQ ID NO: 35). ELISpots A secreção de IFN-g por esplenócitos de rato em resposta à estimulação peptídica foi testada por ensaio de imunossupressão enzimática (ELISpot). Nós preferimos usar ELISpots em relação a outros ensaios devido ao nível de sensibilidade que poderia ser obtido para células de baixa frequência, antígenos específicos e também porque poderíamos testar células T específicas anti-Her-2/neu e anti-Flk-1 diretamente ex vivo sem manipulação in vitro.
Resumidamente, os esplenócitos isolados foram plaqueados a 1 x 106 Células por poço ou titulados através de uma placa de 96 poços revestida com 7 pg/ml de anticorpo de IFN-γ de rato anti-rato (clone AN18, MABTECH, Mariemont, OH) , na presença de péptido 10 pg/ml e 5 U/ml de IL-2. O anticorpo secundário, biotinilado, anti-IFN-g (clone XMG1.2, eBioscience) foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 2 pg/ml. Após uma incubação durante a noite a 37°C, as placas foram desenvolvidas durante 1 hora à temperatura ambiente com estreptavidina-peroxidase de rábano (diluição 1:1000) seguida do substrato TMB (Laboratórios Vector, kit ABC). Os pontos foram contados usando o scanner Immunospot CTL e o software de contagem (CTL, Cleveland, OH).
Linhas celulares
Os meios de cultura celular e suplementos foram adquiridos a Gibco (Invitrogen). As células NT-2 e J774A.1 foram mantidas como descrito anteriormente. Todas as culturas de células foram mantidas a 37°C e 5% de CO2. As células 4T1 e 4T1 que expressam de forma estável o gene da luciferase do vaga-lume (4T1-Luc) foram uma doação do Dr. Ellen Pure (Instituto Wistar) e foram mantidas em meio de cultura de células.
Construção de vacinas Lm-LLO-Flk-1.
A fonte do gene Flk-1 era um plasmideo de vacina de ADN genericamente fornecido pelo Dr. Ralph Reisfeld (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) . Os fragmentos correspondentes aos resíduos 68 a 1081 foram amplificados por PCR utilizando os seguintes iniciadores: Flk-El (F): 5'-GGG CTCGAG CGTGATTCTGAGGAAAGGGTATT-3' (SEQ ID NO: 36), Flk-El (R): 5' GGG ACTAGT TTA CCCGGTTTACAATCTTCTTAT-3'(SEQ ID NO: 37), (AA 68-277); Flk-E2 (F) : 5'- GGG CTCGAG GTGATCAGGGGTCCTGAAATTA-3'(SEQ ID NO: 38), Flk-E2 (R) : 5'-GGG ACTAGT TTA GCCTCCATCCTCCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 39), (AA 545-730); Flk-Il (F) : 5'-GGG CTCGAG GAAGGGGAACTGAAGACAGCC-3 '(SEQ ID NO: 40), Flk-Il (R): 51-GGG ACTAGT TTATGTGTATACTCTGTCAAAAATGGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 41), (AA 792-1081). Sequência de Xho I subjugada para o iniciador direto (F) , a sequência Spe I subjugada para iniciador reverso (R), codão de parada em negrito. O produto de PCR foi ligado ao plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen), confirmado por sequenciação e posteriormente excisado por digestão dupla com Xho I e Spe I (New England Biolabs) . O fragmento foi ligado a um plasmídeo baseado em pGG34 a jusante e fundido a um gene que codifica para os primeiros 441 resíduos da proteína LLO, cuja expressão é conduzida pelo promotor hly. A construção do plasmídeo pGG34 foi descrita em detalhes em outro lugar. O plasmídeo resultante foi eletroporado no Lm defeituoso de PrfAEstirpe XFL-7, que é derivada da estirpe Lm 10403S. Os clones positivos foram selecionados em placas de Infusão de Coração Cerebral (BHI, Difco) suplementadas com 34 pg/ml de cloranfenicol e 250 pg/ ml de estreptomicina. As manchas resultantes foram denominadas Lm -LLO-Flk-El, Lm -LLO-Flk-E2 e Lm -LLO-Flk-II.
Crescimento e preparação de doses de vacina Lm
As reservas de vacina foram mantidas a -80°C em 10% de glicerol em 1 X PBS. Cada reserva foi varrida sobre uma placa de cloranfenicol/estreptomicina e crescido durante a noite. Utilizou-se uma única colónia para crescimento numa cultura durante a noite de meio de BHI de 5 ml sob seleção de antibióticos. Esta cultura foi expandida adicionalmente durante 4 horas numa incubadora de agitação a 37°C e cresceu até a densidade microbiana atingir 0.4-0.8 Οϋβοο, altura em que os micróbios foram lavados e congelados sob esterilidade em 10% de glicerol e mantidos a -80°C até ao uso. As ações foram tituladas para cada lote gerado. Foram utilizados lotes únicos para uma experiência contínua, foram utilizados lotes diferentes para cada repetição, não foi observada variação de lote a lote. Cada lote foi verificado para a expressão da proteína de fusão por Western Blot com um anticorpo anti-PEST e anti-LLO. Para cada dose, um frasco é selecionado, descongelado e lavado duas vezes em PBS IX antes da diluição e uso; os micróbios não utilizados são descartados.
Efeito das vacinas Lm-LLO-Flk-1 no crescimento tumoral 1 x 106 de células tumorais NT-2 foram injetadas sc em 200 μΐ de PBS no flanco de ratos FVB/N. No dia 4 após a inoculação do tumor, os ratinhos foram imunizados ip com 5 x 108 UFC de Lm -LLO-Flk-El, Lm-LLO-Flk-E2 ou Lm -LLO-Flk-Il. Esta dose foi determinada como um décimo da dose mínima observada para ter efeitos adversos sobre os ratinhos e foi utilizada em todas as experiências. As imunizações foram repetidas semanalmente totalizando 3 doses da vacina para todas as experiências. Nos grupos de controlo, os ratinhos receberam uma vacina de controlo Lm-Lm -LLO-NY-ESO-lioi-156 - Lm -LLO-NY-ESO-lioi-i56 atua como irrelevante ou terceira vacina Lm para controlar as respostas imunes ao LLO ou a infeção por listeria, geralmente usamos essa vacina como controlo em concentrações comparáveis à vacina de teste. Os tumores foram medidos a cada 3 dias com calibradores e os diâmetros de superfície mais curtos (largura) e maiores foram registados para cada tumor individual. Os volumes de tumor calculados foram realizados utilizando a seguinte equação: [(largura)2 x comprimento x 0,52]. Os ratos foram sacrificados se desenvolverem feridas abertas ou os tumores atingiram 20 mm de diâmetro. Os ratinhos sobreviventes isentos de tumores desafiados com NT-2 foram re-desafiados no flanco oposto com a mesma linha celular pelo menos 10 semanas após a primeira inoculação.
Imunofluorescêncla tumoral
No dia 64 após a inoculação pós-tumor, os ratos foram sacrificados e os tumores NT-2 foram excisados cirurgicamente, criopreservados em meio de congelação OCT e criosecocados para fornecer seções de 8 a 10 mm de espessura. Para imunofluorescência, as amostras foram descongeladas e fixadas usando 4% de formalina. Após o bloqueio (meio condicionado 2,4G2/FBS a 10%/5% de soro normal de ratinho e rato), as secções foram coradas com anticorpos primários em solução de bloqueio numa câmara humidificada a 37°C durante 1 hora. As amostras foram coradas com anticorpo secundário seguindo o mesmo procedimento utilizado para a coloração primária. A coloração DAPI (Invitrogen) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A coloração intracelular para HIF-la foi feita em PBS/0,1% de Tween/solução de BSA a 1%. As lâminas foram cobertas com uma solução de montagem (Biomeda) com agentes anti- desvanecimento, definido por 24 horas e mantido a 4°C até se obterem imagens com o Spot Image Software (vs. 2006) e um microscópio fluorescente Olympus da série BX51. As imagens foram mescladas usando Spot Image Software e a quantificação foi realizada depois que um ROI foi fechado usando Image Pro Software (vs. 2006). Todas as imagens são uma série mesclada de três canais diferentes capturados para o mesmo tempo de exposição. Para a quantificação da densidade microvascular usando anti-CD31, baseamos a nossa análise em obras previamente publicadas usando estratégias similares para medir MVD em modelos de tumor de rato (33-35).
Estudos de metástases e imagens bioluminescentes
Os ratos receberam um total de três vacinas antes da injeção intravenosa, 7 dias após a vacinação pós-final, com 50000 células 4T1 expressando o gene repórter de luciferase integrado (4T1-Luc). 0 substrato correspondente, D-Luciferina foi injetado ip a 5-10 mg/rato em 200ul de PBS antes da imagem. Os ratos foram colocados na câmara escura de um sistema Xenogen IVIS (X-100) (Xenogen Corporation, Alameda, CA) , sob anestesia após injeção ip de cetamina (80mg/kg)/xilazina (12mg/kg) (Sigma, St. Louis, MO). As imagens fotográficas e de luminescência foram capturadas com uma câmara CCD e a intensidade da luminescência foi quantificada usando o software Living Image (versão 2.11) da Xenogen de acordo com as instruções do fabricante. A imagem longitudinal foi realizada semanalmente até, pelo menos, 4 semanas após a inoculação do tumor. Todos os ratos foram fotografados pela mesma exposição e tempo. As imagens mostram gráficos normalizados. Para o estudo de patologia, realizou-se uma experiência idêntica, exceto que o tecido pulmonar foi perfundido, extraído, embebido em cera e corado com H + E antes de ser contado (à mão) para tumores.
Estudos de segurança de gravidez e cicatrização de feridas
Os ratos fêmeas FVB/N de seis a oito semanas de idade foram imunizados três vezes consecutivas semanalmente com uma vacina Lm de controlo ou vacinas Lm-LLO-Flk-1. Na quarta semana, foram realizados estudos de segurança. Para gravidez e fertilidade, 5 ratinhos por grupo foram autorizados a acasalar com machos alojados individualmente. 0 coito foi monitorizado e confirmado pela presença de um exsudado vaginal. Foram medidos o tempo de gestação, o peso do ratinho no nascimento e o tamanho total. 0 ensaio de cicatrização de feridas utilizado neste estudo foi feito de acordo com métodos previamente descritos. Resumidamente, os ratos foram anestesiados, os pelos removidos e limpos com uma limpeza asséptica. Duas feridas circulares de 3 mm de diâmetro foram perfuradas da pele usando uma ferramenta de biópsia de pele estéril (Acuderm). As feridas não foram tratadas e nenhuma infeção foi observada. 0 tempo médio para o fechamento da ferida foi monitorizado e considerado completo quando uma cicatriz foi formada sem qualquer casca visível.
Análise estatística e métodos de quantificação.
Os dados foram analisados utilizando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. 0 teste log-rank chi-squared foi utilizado para todos os dados de sobrevivência. Toda análise estatística foi feita com o software Prism, vs. 4.0a (2006). O significado estatístico foi baseado num valor de p ^ 0,05. Em todos os estudos não transgénicos, incluímos, pelo menos, 8 ratos por grupo. Todos os estudos foram repetidos pelo menos uma vez. EXEMPLO 1 CONSTRUÇÃO DE CONSTRUÇÕES LLO-FLK-1
Um total de três construções foram testadas, cada uma contendo uma região diferente de Flk-1: El (AA 68-277), E2 (AA 545-730) e II (792-1081) (Figura IA). As regiões foram selecionadas com base em epítopos previstos. Uma vez que estávamos interessados em testar essas vacinas no modelo de cancro da mama com base em FVB/N, decidimos clonar fragmentos que seriam mais apropriados para o modelo de haplótipo usado para testes (ou seja, FVB/N, H21?) . Os domínios El, E2 e II selecionados continham vários epítopos potenciais para o haplótipo MHC I do rato H-2^ (Figura 2A).
Cada fragmento foi clonado como uma proteína de fusão com a proteína LLO truncada (Figura IA). Para testar se as proteínas de fusão LLO-Flk-1 foram produzidas e segregadas pelas contruções de Lm-LLO-Flk-1, analisamos a proteína de sobrenadantes de cultura por Western-Blot (Figura 1B) usando um anticorpo policlonal anti-PEST (Figura 1B inferior) ou anticorpo anti-LLO (Figura 1B superior). Uma banda para cada construção de fusão foi detetada, LLO-Flk-El (~81 kDa), LLO-Flk-E2 (~78 kDa) e LLO-Flk-Il (~89 kDa). A banda em torno de 60-70 kDa é LLO endógena; a proteína de fusão truncada LLO é encontrada em torno de 60-50 kDa. A mancha anti-LLO foi utilizada como um controlo para mostrar que nossas proteínas de fusão estão LLO-Flk ligadas. Todas as três construções foram capazes de infetar, crescer e escapar do fagolisossoma como evidenciado pela replicação em macrófagos J774A.1 (Figura 2D). Além disso, cada vacina foi capaz de imunizar ratinhos contra regiões Flk-1 clonadas como mostrado pelas respostas de esplenócitos IFN-g ex vivo(Figura 1C). Os péptidos utilizados para re-desafio nessas experiências FVB/ N ELISPOT foram originalmente mapeados no H2d do rato Balb/ c como epitopos imunodominantes do Flk-1. Rotineiramente utilizar epitopos H2d mapeados em modelos Η2^ como epitopos H2d identificadas também podem servir como epitopos H2^ presumivelmente devido à elevada homologia de moléculas H2d e Η2<ϊ. EXEMPLO 2
EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE VACINAS LM-LLO-FLK-1 NUM MODELO TUMOR QUE EXPRESSA HER-2/NEU
Para testar a capacidade das nossas vacinas para induzir a regressão dos tumores de mama Her-2/neu+, utilizamos o modelo de tumor NT-2, que sobre-expressa o rato Her-2/neu como transgene e foi originalmente derivado de um tumor mamário espontâneo no rato transgênico FVB/N Her-2/neu. A linha celular NT-2 não expressa a molécula Flk-1 e, portanto, o nosso antigeno de interesse só está localizado na vasculatura do hospedeiro. As células foram cultivadas in vitro e transplantadas subcutaneamente para dentro do flanco de ratos FVB/N. No dia 4, quando foram formados tumores palpáveis (~ 4-5mm de diâmetro), os ratos foram vacinados e depois aumentaram semanalmente para um total de três vacinas. As vacinas Flk-El e Flk-Il foram capazes de induzir regressão e, em alguns ratos, a erradicação completa (Flk-El: 2/8; Flk-Il: 2/8) de tumores transplantados no dia 64 após a inoculação (Figura 3A). No entanto, Flk-E2 foi incapaz de controlar o crescimento do tumor, que era semelhante ao grupo tratado com o controlo Lm. Os ratos com tumores completamente regredidos foram re-desafiados com NT-2 no lado contra lateral em 100 dias após a inoculação pós-tumor e o recrescimento do novo tumor não foi observado sugerindo imunidade anti tumoral de longa duração (Figura 4A e B). A densidade microvascular (MVD) dos tumores do dia 64 foi avaliada por coloração com o marcador CD31 da célula pan-endotelial e contrastada com o marcador nuclear DAPI. Como esperado, o MVD em tumores do grupo tratado com Flk-E2 assemelhava-se aos de ratos tratados com controlo. No entanto, foi observada uma redução na densidade de vasos CD31+ em ratos tratados com Flk-Il e uma redução adicional foi observada usando a vacina Flk-El (Figura 3C) . Esta redução nos vasos CD31+ correlacionou-se com um aumento na coloração para o marcador hipóxico nuclear, Hypoxia Inducible Factor-la (HIF-la) nos grupos tratados Flk-El e Flk-Il, mas não para o grupo de controlo (Figura 3D) . É possível hipotetizar que a regressão destes tumores Her-2/neu+, além da redução do MVD do tumor, foram devidos a células T citotóxicas anti-VEGFR2 que mataram células endoteliais envolvidas na angiogénese tumoral, possivelmente causando danos ao tumor ou restrição de crescimento, resultando na regressão observada. Posteriormente, os detritos de tumor fagocitados podem ser apresentados de forma cruzada por células dendríticas locais na drenagem de gânglios linfáticos e apresentados aos CTL anti-Her-2/neu, cujos epítopos foram previamente mapeados no rato FVB/N. Se este espalhamento de epítopo intermolecular ocorresse, esperamos que os ratos que exibiram a maior regressão também tenham alta frequência de células T CD8+anti-Her-2/neu. Para testar esta hipótese, colhemos esplenócitos dos ratos do dia 64 e realizamos um ELISpot IFN-g, re-desafiando com três epitopos conhecidos de três regiões diferentes de Her-2/ neu. Nós decidimos usar um teste ELISpot para medir as respostas anti-Her-2/neu porque já havia mapeado os epítopos CTL para diferentes regiões da molécula Her-2/neu e o teste ELISpot é sensível o bastante para detetar uma baixa frequência de células T específicas, ao contrário de vários ensaios citotóxicos que requerem estimulação e expansão in vitro. Descobrimos que Flk-El e Flk-Il mostraram o maior espalhamento de epítopos, enquanto o Flk-E2 mostrou o mínimo (Figura 3B, * p <0,05), forte correlação com a extensão da regressão tumoral encontrada in vivo (Figura 3A) . EXEMPLO 3
A REGRESSÃO DE TUMOR INDUZIDA POR ΑΝΤΙ-ANGIOGENÉSE É DEPENDENTE DA EXPOSIÇÃO DE EPITÓPIO A UM ANTIGÉNIO DE TUMOR ENDÓGENO A presença de espalhamento de epítopos Her-2/neu sugeriu que a regressão tumoral não dependeria apenas de eventos anti-vasculares, mas também da resposta imune ao antígeno tumoral HER-2/neu. Para testar esta hipótese, repetimos a mesma experiência usando as duas vacinas mais potentes, Flk-El e Flk-Il, mas, além da inoculação de ratinhos FVB/N de tipo selvagem, também injetamos as células NT-2 subcutaneamente na sua estirpe sinegénica progenitora, FVB/N Her-2/neu transgénico, que exibe uma profunda tolerância à molécula de rato Her-2/neu. Novamente, Flk-El e Flk-Il diminuíram o crescimento dos tumores NT-2 em ratos FVB/N de tipo selvagem, conforme demonstrado anteriormente (Figura 5A, painel esquerdo). No entanto, no hospedeiro transgénico onde as respostas anti-HER-2/neu são limitadas pela tolerância, observamos a superação de todos os tumores (Figura 5A, painel direito). Ambos os resultados refletiram o espalhamento do epitopo observado em relação à proteína endógena Her-2/neu demonstrada no baço (Figura 5B) e no local do tumor como mostrado para a vacina Flk-El (Figura 5C). Isso sugere que os eventos anti vasculares não são suficientes para a regressão tumoral, mas o efeito combinado na vasculatura do tumor e diretamente nas células tumorais é necessário para a morte do tumor e, em última instância, a regressão. EXEMPLO 4
VACINAÇÃO COM FRAGMENTOS DE VACINA DE LM-LLO-FLK-1 PODE PREVENIR O CRESCIMENTO DE METÁSTASES EXPERIMENTAIS
Um uso importante para vacinas anti-angiogénese pode ser para o tratamento ou prevenção de metástases de cancro da mama. As células tumorais que apresentam metástases são altamente dependentes do desenvolvimento de novos vasos, embora os tumores menores não dependam completamente da nova vasculatura. No entanto, tem sido a hipótese de que, uma vez que cresceram para além de um determinado tamanho, os tumores tornam-se altamente dependentes da formação de novos vasos e assim se tornam um alvo possível para CTL anti-VEGFR2. Para testar se as nossas vacinas poderiam proteger contra a disseminação do tumor mamário, utilizamos um sistema experimental de metástase envolvendo a inoculação direta in vitro de células de tumor cultivadas na veia da cauda de ratinhos, permitindo a rápida colonização de vários órgãos a jusante, especialmente o pulmão. Uma vez que após a vacinação da veia da cauda, o modelo NT-2 não coloniza o pulmão (dados não apresentados), usamos 4T1, que é uma linha celular agressiva de carcinoma de mama do rato em ratinhos Balb/c. Os ratinhos Balb/c foram imunizados três vezes ao longo de três semanas com Lm-LLO-Flk-El ou Lm -LLO-Flk-Il ou uma vacina de controlo Lm. Os ratos foram então injetados com 50000 células 4T1 iv e também sc dentro do mesmo animal. A injeção do local sc foi realizada de modo que pudéssemos medir o crescimento primário do tumor, enquanto a injeção iv imitava a metástase. Os ratos tratados com as vacinas Flk-1 apresentaram crescimento prolongado do tumor, diminuíram o tamanho do tumor primário sc, aumentaram a sobrevida e reduziram a morbidade em comparação com os ratinhos de controlo (Figura 6). Ao contrário das respostas pobres vistas contra o tumor primário 4T1, a taxa de semeadura e as metástases totais encontradas em cada animal foi significativamente menor nos animais tratados em comparação com os ratos de controlo (Figura 7A). Foi observado um baixo nivel de epitopo que se espalhou para Her-2/neu (Figura 7B), provavelmente porque ο 4T1 expressa fracamente o Her-2/neu do rato.
Para testar mais rigorosamente a hipótese de que a imunização contra o Flk-1 pode impedir a semeadura de tecido pulmonar com metástases experimentais, utilizamos um modelo bioluminescente em que células e massas tumorais individuais podem ser visualizadas usando imagens não invasivas. Os ratos foram injetados iv com 50000 células 4T1 que expressam o gene da luciferase do vaga-lume (4T1-Luc) após várias rodadas de vacinação com vacinas Lm-Flk-El e II. Semanalmente, os ratos foram anestesiados e injetados com um substrato de luciferase (D-Luciferina) e imagens. A semeadura de pulmão foi aparente no dia 11 e os ratos tratados com controlo rapidamente se colonizaram com células 4T1-Luc no dia 25, enquanto nenhum dos ratinhos tratados com Lm-LLO-Flk-El e Lm-LLO-Flk-Il mostraram sinais de semeadura pulmonar até, pelo menos, o dia 32, em que ponto os ratinhos tratados com controlo ficaram doentes e foram sacrificados (Figura 7C) . No dia 32, apenas 25% dos ratos vacinados com Flk-1 apresentaram tumores pulmonares. É possível que as massas tumorais fossem indetetáveis nesse ponto de tempo por este método bioluminescente, uma vez que um sinal para células tumorais foi observado no dia 25, mas não no dia 32 para o grupo tratado com Lm-Flk-El. Este sinal muito pequeno no dia 25 está abaixo do limiar da célula 1000 e pode ter perdido alguma massa celular dentro da semana seguinte para cair abaixo do limite de deteção para o sistema. Os ratos imunizados com o controlo Lm rapidamente se tornaram doentes por tumores pulmonares, mas as vacinas Flk-El e Flk- II Lm atrasaram a carga tumoral, o tempo até a progressão (dia 25 para controlo tratado versus dia 32 para Flk-1) e eventual doença (redução da morbidade como mostrado na Figura 6) . EXEMPLO 5
IMUNIZAÇÃO COM FLK-1 NÃO TEM IMPACTO NA CURA DE FERIDAS, GRAVIDEZ OU FERTILIDADE EM RATINHOS
Para avaliar se as vacinas Lm -LLO-Flk-1 causam toxicidade associada à inibição da angiogénese, estudamos a cicatrização de feridas, gravidez e fertilidade em ratinhos imunizados. Os ratinhos foram imunizados três vezes com Lm-LLO-Flk-El, Lm -LL0-Flk-E2, Lm -LLO-Flk-Il, controlo Lm ou soro salino sozinho antes de ser acasalado ou terem sida provocadas feridas estéreis. Nós observamos ratinhos que foram acasalados durante o periodo de gestação do coito, massa média de filhotes no termo e tamanho total da liteira. As feridas eram estéreis, mas os ratos estavam enjaulados juntos. A técnica de cicatrização de feridas foi seguida de acordo com métodos previamente descritos. Cinco ratos de cada grupo de imunização foram raspados e receberam feridas esterilizadas, dois por animal, então permitiram curar ao longo do tempo. Foi medido o tempo de fechamento da ferida. A cicatrização completa de ferida foi considerada completa, não foram deixadas escamas no momento do fechamento da ferida. Imunização com Lm -LLO-Flk-El, Lm -LL0-Flk-E2 ou Lm-LLO-Flk-Il não teve impacto sobre a fertilidade, a duração da gestação ou o peso dos ratinhos no nascimento (Figura 8A) . Da mesma forma, a imunização não teve impacto significativo no tempo necessário para o fechamento da ferida (Figura 8B).
Para avaliar se as respostas imunitárias a Her-2/neu observadas após a imunização de Flk-Il foram devidas a reatividade cruzada entre epitopos compartilhados entre Flk- I e Her-2/neu, os ratos FVB/N imunizados com a vacina Flk- II foram avaliados para imunidade a FLK-I1839-848/ que é reativa ao epítopo Her-2/neu de rato G S GAFG T V Y K (SEQ ID NO: 42). A vacinação de ratos com Lm -LLO-Flk-Il conduz a respostas excelentes contra o epitopo Flk-Il previamente mapeado PGGPLMVIV (SEQ ID NO: 43) . No entanto, não foram observadas respostas significativas contra o epitopo Flk-11839-848 do rato ou o epitopo homólogo Her-2/neu ICI732-741 (Figura 9) . Assim, as respostas imunitárias ao Her-2/neu observadas após a imunização Flk-Il foram provavelmente devido ao espalhamento do epitopo e não devido à reatividade cruzada entre os epitopos compartilhados.
Em conjunto, as vacinas Lm-LLO-Flk-1 foram capazes de erradicar alguns tumores de mama estabelecidos, reduzir a densidade microvascular nos tumores restantes, proteger contra o re-desafio tumoral e metástases experimentais e induzir o espalhamento de epitopos para várias regiões do antigeno associado ao tumor Her-2/Neu. Verificou-se que a erradicação de tumores é dependente do epitopo que se espalha para HER-2/neu e não se deve apenas à redução da vasculatura tumoral. No entanto, a eficácia da vacina não afetou a cicatrização normal das feridas nem os efeitos colaterais tóxicos na gravidez. Assim, uma vacina anti-angiogénese pode superar a tolerância ao vaso de hospedeiro que conduz o epitopo espalhando-se para uma proteína tumoral endógena e conduz a regressão do tumor ativo. Portanto, apresentado aqui é um novo método de segmentação tanto da vasculatura tumoral quanto de um antigeno tumoral endógeno (Her-2/neu) usando uma única vacina. EXEMPLO 6 MUTAÇÕES SURGEM EM MUTANTES DE ESCAPE Ratos
Os ratinhos transgénicos FVB/ N Her-2/neu foram alojados e criados no centro do núcleo animal na Universidade da Pensilvânia. Os ratos tinham seis a oito semanas de idade quando utilizados no início das experiências, que foram feitos de acordo com os regulamentos do Comité Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade da Pensilvânia.
Estirpes da vacina Listeria.
As estirpes utilizadas foram Lm-LLO-Flk-El e Lm-LLO-Flk-II. A linhagem Lm-LL0-NYES01 foi utilizada como uma vacina de controlo de terceiros para a especificidade do antigeno. As bactérias foram selecionadas em placas de infusão de coração cerebral (BHI, Difco) suplementadas com 34 pg/ml de cloranfenicol e 250 pg/ml de estreptomicina, depois cultivadas em cultura líquida e congeladas em alíquotas de 1 ml a -80°C. Para injeção, as vacinas foram lavadas duas vezes com PBS estéril antes da administração.
Proteção de tumor autóctone.
Para testar a capacidade das vacinas listeria anti-Flk-lpara impactar em tumores que surgiram espontaneamente usamos o rato fêmea transgénico Her-2/neu de FVB/N que sobre-expressa a molécula Her-2/neu do rato e desenvolve espontaneamente tumores mamários. Para esses estudos de proteção a longo prazo, vacinamos ratos fêmeas (N = 15) um total de seis vezes a partir das 6 semanas de idade e imunizando IP a cada três semanas até as 21 semanas de idade. As vacinas Lm-LLO-Flk-El, Lm-LLO-Flk-Il ou Lm-LLO-NYESO-1 foram injetadas a 0,1 DL50 suspensas em PBS. A carga tumoral foi seguida semanalmente. Uma vez que os tumores tinham mais de 10 mm de tamanho, os animais foram sacrificados e os tumores foram removidos para análise. A análise estatística das diferenças no crescimento do tumor autóctone foi feita usando o teste de log-rank Kaplan-Meier usando GraphPad Prism Software,
Análise e mapeamento de mutações.
Os tumores foram extraídos frescos e colocados na solução RNAlater, armazenados a 4°C durante menos de 2 semanas. Extraímos o mRNA de tumores armazenados usando um kit de mRNA Qiagen (Invitrogen) , em seguida, gerou o cADN via PCR. As amostras de PCR individuais foram ainda divididas para permitir o sequenciamento de cada fragmento individual de Her-2/neu em trechos de 500 a 800 pb cada (EC1, EC2, EC3, IC1, IC2) como descrito em outro lugar (Singh, 2007) . O sequenciamento feito pelo Hospital de Crianças da Filadélfia (CHOP) Sequencing Facility e depois analisado usando o software 4Peaks 1.7.2. Mutações que não ocorreram em quatro ou mais reações individuais de PCR e sequenciamento foram descartadas como mutações induzidas por PCR. A modelagem molecular foi feita usando MacPyMol.
Sequências de iniciadores de PCR: EC1 FP: AGGGCTGTCAGGTAGTGC (SEQ ID NO: 44) EC1 RP: TGACCTCTTGGTTATTCG (SEQ ID NO: 45) EC2 FP: ACCTGCCCCTACAACTAC (SEQ ID NO: 46) EC2 RP: GACGCCCTCTACAGTTGC (SEQ ID NO: 47) EC3 FP: GTGGATTGGCTCTGATTC (SEQ ID NO: 48) EC3 RP: TGAGTTACAGACCAAGCC (SEQ ID NO: 49) IC1 FP: CAAACGAAGGAGACAGAAG (SEQ ID NO: 50) IC1 RP: CACCATCAAACACATCGG (SEQ ID NO: 51) IC2 FP: CACTGCTGGAAGATGATG (SEQ ID NO: 52) IC2 RP: TTTGTGGCGATGGAGACC (SEQ ID NO: 53)
Os ratinhos transgénicos FVB/N que expressam Her-2/neu de rato foram vacinados com Flk-El, Flk-Il ou controlo Lm a cada 3 semanas a partir das 6 semanas de idade e os tumores foram medidos semanalmente após a vacinação final. A vacinação com Flk-El e Flk-Il aumentou a percentagem de ratinhos isentos de tumor em comparação com a vacinação de controlo Lm. Entre a semana 35 e 40, havia vários ratos nos ratos vacinados Flk-El e Flk-Il que desenvolveram tumores. Os tumores de cada rato foram examinados para a mensagem mutada Her-2/neu. A mensagem ARN foi recolhida, cADN sintetizado e sequenciado. A sequência resultante foi emparelhada ao lado da sequência do tipo selvagem para determinar os resíduos mutados. Somente as mutações que surgiram 4 vezes ou mais foram consideradas mutações verdadeiras (Figura 10A). Vários dos resíduos mutados dentro dos "hot-spots" ou sequências de caracteres de resíduos mutados estavam dentro de epítopos de CTL previamente mapeados. Um desses epítopos mostra mutações em aminoácidos chave responsáveis pela ancoragem do epítopo à molécula H2Dq MHC I (Figura 10B). EXEMPLO 7
DESAFIO DE METÁSTASES DA MAMA E MELANOMA CEREBRAL
As experiências foram realizadas utilizando os métodos como descrito acima.
Os ratinhos Balb/c foram imunizados três vezes com cada vacina, quer anti-humano Her-2/neu ou vacinação de controlo NYESOl. As células de carcinoma de mama murino que expressam de forma estável o gene da luciferase de vaga-lume (células EMT6-Luc do laboratório de John Ohlfest na Universidade de Minnesota) foram cultivadas in vitro e injetadas no cérebro de ratinhos anestesiados a 5000 células por rato. As células EMT6-Luc expressam níveis baixos de Her-2/neu do rato (dados não mostrados). As células foram autorizadas a crescer antes de serem fotografadas nos dias indicados. Enquanto as metástases cerebrais foram claramente observadas em ratos vacinados com NYES01, os tumores cerebrais controlados contra vacinação Her-2/neu anti-humano nos dias 3, 8 e 11 após a indução experimental de metástases (Figura 11A).
Os ratinhos C57B1/6 foram imunizados três vezes com cada vacina, seja HMWMAA-C anti-humano ou vacinação de controlo NYES01. As células de melanoma de ratinho B16F10-Luc (do laboratório de Jeff Miller na UCSF) foram cultivadas in vitro e injetadas no cérebro de ratinhos anestesiados a 5000 células por rato. A linha parental B16F10 não expressa HMWMAA (comunicação pessoal), portanto, a única fonte de HMWMAA está em pericites e células gliais. A vacinação de ratos com HMW-MAA-C anti-humano reduziu os tumores cerebrais nos dias 11 e 15 após a indução experimental de metástases (Figura 11B). Assim, a vacinação com HMW-MAAC ou Her-2/neu é protetora contra metástases cerebrais, mesmo que as células tumorais não expressem HMW-MAA. EXEMPLO COMPARATIVO 8
CONSTRUÇÃO DE NOVA VACINA TERAPÊUTICA BASEADA EM ANTI-CD105/ ENDOGLINA LISTERIA
Uma construção de uma estirpe de Lm que expressou um fragmento bastante grande de endoglina (Figura 12) não segregou o fragmento quando fundido em LLO, portanto, foi redesenhado para duas novas construções de Lm, Lm-LLO-CD105A (aal7-319) e Lm -LLO-CD105B (359-588) que abrangem quase todo o gene da endoglina (Figura 13A; SEQ ID NO: 62) e incluem epitopos CTL putativos, determinados usando RANKpep, que se encontram fora da região da endoglina previamente alvejada (Figura 12) . Por potencialmente incluindo mais epitopos imunodominantes dentro dessas construções novas, a expansão do grupo de epitopos CTL foi utilizada para aumentar a eficácia da vacina. Além disso, tornando as proteínas de fusão menores e removendo regiões de alta hidrofobicidade das construções, essas proteínas de fusão foram melhor segregadas por Lm. Os genes que codificam estes fragmentos foram clonados em CDl05pGG-34 (Figura 13B). EXEMPLO COMPARATIVO 9
IMPACTO DE LM-LLO-CD105A E B NO CRESCIMENTO PRIMÁRIO E METASTÁTICO DO TUMOR DE MAMA 4T1 NO RATO BALB/C 0 tumor de mama 4T1 do rato BALB/c, o mais maligno dos nossos modelos de tumor de mama, uma vez que se metastiza rapidamente quando implantado na glândula mamária, foi escolhido como o primeiro teste das vacinas mostradas no Exemplo 8. Foram implantadas 2 x 105 células 4T1 na almofada de gordura mamária em ratinhos Balb/c. Os ratinhos foram vacinados com 2 x 108 ufc de cada vacina nos dias 1, 8 e 15 ou nos dias 4, 11 e 18. Ambos os regimes de vacinas apresentaram uma desaceleração significativa do crescimento tumoral em comparação com ratinhos inoculados ou controlados por vacinação (Figura 16). No dia 32, os ratos foram sacrificados e os seus pulmões foram removidos e examinados para disseminação metastática. Curiosamente, apenas Lm-LLO-CD105B mostrou uma redução estatisticamente significativa nas metástases pulmonares superficiais (Figura 17).
Em seguida, as respostas CTL nestes ratos foram examinadas. Como uma tentativa inicial de determinar as regiões imunogénicas da molécula de endoglina que poderiam ser reconhecidas pelas células T CD8+, os dois fragmentos foram submetidos a análise por RANKpep
(http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/) e SYFPEITHI (Http://www.syfpeithi.de/). A partir destes, os dois péptidos mais promissores para CD105A: AGPRTVTVM (SEQ ID NO: 59) (um aglutinante Dd) e para CD105B: AYSSCGMKV (SEQ ID NO: 60) (um aglutinante Kd) foram selecionados. As suas posições na sequência de endoglina estão sublinhadas na Figura 13A.
Estes dois péptidos foram utilizados em análises ELISpot para estimular esplenócitos retirados de ratinhos mostrados na Figura 16B, que foram vacinados nos dias 4, 11 e 18, quatro dias após a última vacinação. No entanto, não estimularam as células T para segregar o interferão-gama, em comparação com um péptido controlado de H-2d de HIV Gag, o que sugere que não são epítopos CTL (Figura 7) . 0 epitopo que se espalhou para dois antigenos tumorais endógenos expressos em níveis baixos por 4T1 também foi analisado. A primeira é uma glicoproteína do envelope, gp70, do vírus da leucemia murina ecotrópica endógena. Um epitopo, designado AHl, SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 61), frpm gp70, com restrição Ld, foi mapeada para o rato BALB/c. Curiosamente, descobriu-se que ambos Lm-LLO-CD105A e B induziram epitopo espalhando para este antígeno. Epitopo que se espalhou para HER-2/neu, também foi investigado. Foram utilizados dois epítopos conhecidos no domínio extracelular de HER-2/neu, EC1 e EC2 e um do domínio intracelular. Embora não tenha sido observado aumento significativo de IFN-gamma ELISpots contra IC1 para qualquer vacina de endoglina em comparação com a vacina de controle Lm-LLO-NY-ESO-1, o espalhamento para EC1 e EC2 usando a vacina Lm-LLO-CD105A foi testemunhado (Figura 17).
Os tumores dos ratinhos foram examinados para células T infiltrantes específicas de antigénio, das quais os esplenócitos foram colhidos para células T específicas de HER-2/neu e gp70 utilizando análise de FACS e tetrâmeros. Foram observados aumentos significativos nas células T específicas de EC1, EC2 e AHl em tumores e também foram observados aumentos modestos nas células T específicas de IC1, de ratinhos vacinados com Lm-LLO-CD105 em comparação com os vacinados com Lm-LLO-NY-ESO-1 (Figura 18). EXEMPLO COMPARATIVO 10
ESTUDOS SOBRE O USO DE LM-LLO-CD105A E B PARA IMPACTO NO CRESCIMENTO DO TUMOR DE MAMA NT2 HER-2/NEU POSITIVO DERIVADO DO RATO TRANSGÉNICO FVB EER-2/NEU
As vacinas de endoglina foram testadas em outro modelo de tumor de mama no rato FVB utilizando o tumor transplantável NT2 HER-2/neu. Além disso, 1 x 106 células tumor ais foram implantadas subcutaneamente em ratinhos FVB, e foram imunizados com Lm-LLO-CD105 A e B nos dias 4, 11 e 18, com 2 x 10® ufc de cada vacina. Lm-LLO-NY-ESG-1 foi utilizado como vacina de controlo. Ambas as vacinas impactaram significativamente o crescimento do tumor (Figura 19) e no dia 60, 50% dos ratos imunizados com Lm-LLO-CD105A eram livres de tumor e 25% dos ratos vacinados com Lm-LLO'-CDlOSB· eram livres de tumor em comparação com nenhum no grupo não vacinado ou no grupo vacinado com Lm-LLO-NYESQl.
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Estirpe de Listeria recombinante que expressa um fator angiogénico, em que o referido fator angiogénico é um polipéptido receptor-2 (VEGFR2) do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR2), em que o referido polipéptido VEGFR2 é um fragmento fetal de fígado quinase-1 (Flk-1) -El compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou uma sequência uma sequência que compartilha uma identidade maior que 83%, um fragmento Flk-l-Il compreendendo a SEQ ID NO: 7, ou uma partilha de sequência maior que 95% de identidade com a mesma, ou uma combinação destes em que o referido fator angiogénico é uma molécula envolvida na formação de novos vasos sanguíneos.
  2. 2. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fator angiogénico é fundido com um polipéptido adicional, em que o referido polipéptido adicional é a) um LLO não hemolítico, b) uma AA N-terminal ou c) uma sequência PEST.
  3. 3. Estipe de Listeria recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido fator angiogénico é expresso a partir de um promotor hly, um promotor prfA, um promotor actA ou um promotor p60.
  4. 4. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido fator angiogénico é expresso a partir de um vetor episomal ou do cromossoma Listeria.
  5. 5. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com a reivindicação 2, em que o referido polipéptido adicional aumenta a imunogenicidade do referido fator angiogénico.
  6. 6. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida estirpe de Listeria recombinante é uma estirpe recombinante de Listeria monocytogenes.
  7. 7. Vacina compreendendo uma estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer reivindicação anterior e um adjuvante.
  8. 8. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma vacina de acordo com a reivindicação 7, para utilização no tratamento, inibição ou supressão de crescimento de um tumor ou cancro num indivíduo.
  9. 9. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma vacina de acordo com a reivindicação 7, para utilização na direção da vasculatura tumoral de um crescimento tumoral ou cancro num indivíduo.
  10. 10. Estirpe de Listeria recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, ou uma vacina de acordo com a reivindicação 7, para utilização na prevenção da recorrência de um tumor ou cancro, ou para utilização na inibição de metástases de um tumor ou cancro num indivíduo.
  11. 11. Estirpe de Listeria recombinante ou vacina para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, em que o referido tumor ou cancro é um tumor da mama ou cancro da mama, uma metástase cerebral ou um tumor ou cancro que expressam Her-2/neu.
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