NO318426B1

NO318426B1 - Et materiale for a senke konsentrasjonen av patogene tarmpeptider

Info

Publication number: NO318426B1
Application number: NO20014788A
Authority: NO
Inventors: Karl-Ludvig Reichelt; Erik Slinde; Gunnar O Bronstad
Original assignee: Neurozym Biotech As
Priority date: 2001-10-02
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2005-04-18
Also published as: EP1448211B1; NO20014788L; DE60227552D1; US20040247581A1; EP1448211A1; WO2003028745A1; NO20014788D0; ATE400282T1; US7662371B2

Description

Området for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk, veterinærisk eller næringsmateriale. Materialet kan anvendes for å forebygge og/eller behandle en sykdom eller tilstand forårsaket eller opprettholdt av før høyde nivåer av et sykdomsfremkallende peptid i tarmen. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å utvelge bakterier som kan benyttes i materialet ifølge oppfinnelsen.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Etiologi og patogenese for schizofreni, autisme og alvorlige stemningsleiesykdommer er fortsatt uklar. Genetiske faktorer spiller sikkert en viktig rolle i utvikling og patogenese av disse sykdommene. Imidlertid bidrar også miljøfaktorer, og en kombinasjon av disse virker trolig sammen, slik en ofte ser det.

Et typisk eksempel på en kombinert genetisk og diettbasert sykdom er Føllings sykdom, hvor en genetisk defekt i metabolismen av fenylalanin fører til en alvorlig feilutvikling av hjernen. Diettreduksjon av fenylalanin vil imidlertid forhindre at sykdommen utvikler seg, forutsatt at den startes straks etter fødselen. På denne bakgrunn pågår en intens søkning etter miljøfaktorer, og påvisning av slike faktorer ville kunne bedre behandlingen av disse ødeleggende sykdommene betydelig. Slike miljøfaktorer kan være infeksiøse, diettrelaterte eller begge deler.

For ca 20 år siden diskuterte FC Dohan (Dohan, F.C (1983), More on celiac disease as a model for schizophrenia, Biological psychiatry, 18;561-564; and Dohan, F.C (1988), Genetic hypothesis of idiopathic schizophrenia: its exorphin connection, Schizophrenia Bull, 14:489-494)) en mulig sammenheng mellom cøliaki og schizofreni. Cøliaki er en inflammatorisk tarmsykdom som skyldes en intoleranse overfor peptider som dannes fra glutenproteiner. Denne tilstanden ledsages i blant av psykiatriske eller nevrologiske symptomer. En sammenheng mellom cøliaki og psykiatriske og nevrologiske sykdommer understøttes av flere arbeider publisert den senere tid (KnivsBerg, Ann-Mari, Wiig,Kirsti, Lind, G. Nødland, M., Reichelt, K.L

(1990), Dietary Intervention in Autistic Syndromes Brain Dysfunct, 3, 315-327; KnivsBerg, A.M. Reichelt, K.L , G. Nødland, M., Høyen,T (1990), Autistic Syndromes and Diet: a follow-up study, Scandinavian Journal of Educational Research; 39, 223-236; Whitley, P., Rodgers,J., Savery,D. and Shattock, p. (1999), An gluten-free diet as an intervention for autism and associated disorders: perliminary findings., Autism; 3: 45-65; Hadjivassilou,M., Grunewald, R.A, Chattopadhyay,A.K et al (1998), Clinical, radiological, neurophysiological, and neuropathological characteristics of gluten ataxia., The Lancet: 352, 1582-1586).

I 1979 lanserte Panksepp den såkalte "opiod exess"-teorien hvor han antok at en forstyrrelse av endogene opioide peptider kunne være en del av patogenese i autisme. På samme tid isolerte K.L Reichelt og medarbeidere (Hole, et al 1979) biologisk aktive peptider fra urin hos schizofrene pasienter. Drysdale (1982) påviste en peptidholdig fraksjon i plasma fra schizofrene pasienter som kunne binde seg til opiate reseptorer, og som induserte hyperaktivitet i rotter. Begge gruppene fant at de prinsippene de hadde isolert både hadde opioid og dopaminerg aktivitet. De best karakteriserte peptidene en har funnet forhøyede nivåer av hos psykiatriske pasienter er exorfiner dannet fra gluten og fra bovine caseiner.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har sammenlignet urinpeptidmønstre hos normale og autistiske individer, og funnet høyere nivåer hos autistiske barn.

Glutenavledete exorfiner

I løpet av de siste årene er det blitt klart at exorfiner, som er en gruppe korte biologisk aktive peptider, dannes enzymatisk i fordøyelseskanalen fra glutenproteiner (Fukodome et al 1993, 1996, Froetshel 1996). Disse peptidene som er 4-5 aminosyrer lange har opioid aktivitet og er relativt spesifikke for 5-reseptorer.

Noen representative glutenexorfiner har følgende aminosyresekvens:

DeScant et al (1997) har vist tilbakegang av schizofrene symptomer og SPECT (Single Photon Computer Tomography) forandringer i en pasient med cøliaki etter en glutenfri diett. En rolle for glutenpeptider ved nevrologisk sykdom er nylig vist ved cøliakiataxi, noe som ytterligere understøtter nevropatologiske effekter av slike substanser (Hadjuvassilou et al 1998). Videre har Wakefield nylig funnet en sammenheng mellom ileal-lymfoid-nodulær hyperplasi, uspesifikk kolitt og PDD hos en gruppe barn. Reichelt et al, 1998 har vist øket peptidutskillelse i urin ved cøliaki. Derfor tyder påvisning av glutenderiverte peptider i urin hos pasienter med schizofreni, autisme og manisk depressive tilstander sterkt på en årsaksmessig sammenheng, noe som ytterligere støttes av diettunder-søkelser.

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på disse funn, dvs. at enkelte spesifikke peptider finnes i høyere konsentra-sjoner enn normalt, og at dette er korrelert til ulike sykdommer eller symptomer. For å forebygge eller behandle slike tilstander forventes det derfor at materialer som er i stand til å senke disse forhøyede peptidnivåene vil ha en effekt på sykdomstilstanden.

Casomorfiner

I løpet av siste tiår er det vist at peptidsekvenser avledet av ufullstendig katabolisme av melkeproteiner har opioid aktivitet (Teschemacher, 1997). Kaseiner brytes ned til peptider med 3-20 aminosyrer benevnt casomorfiner

Representative eksempler på aminosyresekvensen til noen casomorfiner:

Nylig har Sun et al (1999) vist at fJ-casomorfin 1-7, som er et av peptidene isolert fra urin fra pasienter med schizofreni og autisme, gir atferdsforandringer hos rotter. Dette peptidet induserer også Fos-lignende aktivitet i bestemte hjerneområder som er relevante for schizofreni og autisme (Sun et al 1999).

Intakte peptider absorberes fra tynntarmen (Gardner, 1984). Hos menneske ble det vist at bovint casein frisetter peptider som går over i blodet under fordøyelse av melk og yoghurt (Chabance et al, 1998). Hos normale individer synes det imidlertid som om peptidasene i tarmen og i blodet bryter ned peptidene hurtig {Teschemacher, 1997). Dette synes imidlertid ikke å være tilfellet for pasienter som lider av medisinske tilstander som beskrevet ovenfor, hvor man tror at en utilstrekkelig nedbrytning eller katabolisme av disse bestemte matavledete peptider bidrar til utviklingen og alvorlighetsgraden av slike sykdommer.

Klinisk bedring hos autistiske barn er påvist i kliniske studier hvor enten gluten, melk eller melkeprodukter er fjernet fra dietten (Reichelt, et al, 1990, Lucarelli 1995, Knivsberg et al, 1997, Whitley et al, 1999). I tilegg foreligger en rekke rapporter som støtter effekten av glutenfri eller caseinfri diett hos disse pasientene.

Videre viste Singh og Kay i 1976 at hvetegluten kunne være en patogenetisk faktor i schizofreni, og Reichelt et al

(1990) har vist at en gluten-fri diett påvirker den urinære peptidsekresjon og kliniske tilstand til schizofrene pasienter.

Hyperpeptiduri, dvs. øket konsentrasjon av peptider i urinen finnes ved autisme, schizophreni, og ved alvorlige depressive tilstander (Reichelt, W.H, Knivsberg, A.M., Nødland, M., Stensrud, M. and Reichelt, K.L.(1997), Urinary peptide level and patterns in autistic children from seven countries, and the effect of dietary intervention after 4 years., Dev. Brain Dysfunct ; 10: 44-55; Whitley, P., Rodgers,J., Savery,D. and Shattock, p. (1999), An gluten-free diet as an intervention for autism and associated disorders: perliminary findings. Autism; 3: 45-65; Reichelt, K.L., Sagedal, E, Landmark, J., Sangvik, B.T., Eggen, 0., and Scott, H. (1990), The effect of gluten-free diet on urinary peptide secretion and clinical state in schizophrenia.. Journal of Orthomolecular medicine, 5: 223; Reichelt, K.L., Ekrem,J. and Scott, H. (1990), Gluten, milk proteins and autism: dietary intervention effects on behavior and peptide secretion., Journal of applied nutrition; 42: 1-11; Sun, Z. And Cade, J.R (1999), A peptide found in schizophrenia and autism cause behavioral changes in rats. Autism; 3: 85-95; Wakefield, A.J. et al.(1998), Ileal-lymphoid-nodular hyperplasia, non-specific colitis, and pervasive developmental disorder in children, The Lancet 351: 637-641; Reichelt, K.L and Stensrud, M

(1998) Increase in urinary peptides prior to the diagnosis of schizophrenia, Schizophrenia Research;1998; 34: 211-213). Peptidmønsteret varierer betydelig mellom pasientene, noe som kan skyldes tilstedeværelse av diettpeptider uten biologiske effekter, og uten relasjon til enzymdefekter ved psykiatriske tilstander. Imidlertid kan også peptider uten annen biologisk aktivitet virke som peptidasehemmere. Under diettbehandling og etter bruk av neuroleptiske medikamenter blir peptidmønsteret i urinen normalisert. Andre substanser som kommer fra tarmen kan også spille en rolle, idet Shattock har funnet at indolyl-acryloylglycin (IAG) er tilstede i urinen hos autistiske barn, samt at Friedman har påvist peptidet dermorfin, som ikke dannes hos mennesker.

Disse funn tyder på at der er en sammenheng mellom forhøyede nivåer av noen bestemte peptider og utviklingen av visse sykdommer, og da spesielt neuropsykiatriske tilstander. Videre er det klart vist at noen av disse "patogene peptider" dannes fra matproteiner som for eksempel kasein og gluten.

Det er videre holdepunkter for genetiske endringer i plasma dipeptidyldipeptidase IV enzymaktivitet ved depresjon og schizofreni (Maes et al, 1994, 1996) som også kan påvirke intestinal enzymaktivitet. En defekt metabolisme av peptider dannet i tarmen avspeiles også i utskillelses-mønsteret til ulike substanser.

Som konklusjon støtter disse undersøkelsene sterkt ideen om at symptomer ved psykiatriske sykdommer som schizofreni, autisme og depresjoner, i hvert fall delvis skyldes ufullstendig nedbrytning og/eller øket opptak av matavledete peptider.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er således å senke konsentrasjonen av slike "patogene peptider" ved å øke peptidaseaktiviteten i tarmen.

Begrepet "patogene peptider" er ment å skulle bety peptider som spiler en rolle for utvikling, progresjon og alvorlighetsgraden av en sykdom.

Med begrepet "peptider" forstås peptider med en sekvens av aminosyrer fortrinnsvis i området 2-20 aminosyrer, eller fortrinnsvis mindre enn 10 aminosyrer.

Det er viktig å understreke at de matproteinene dette gjelder først blir brutt ned av proteinaser til slike peptider, og at en annen type hydrolytiske enzymer, peptidasene er ansvarlig for den videre nedbrytning av peptidene til aminosyrer, som fungerer som byggesteiner i proteinsyntesen.

En foretrukket utførelse av denne oppfinnelsen vedrører en senkning av konsentrasjonen av peptider dannet fra proteiner i kosten, dvs. matproteinene gluten og kasein.

Det grunnleggende konsept for den foreliggende oppfinnelse er å benytte mikroorganismer som er i stand til å bryte ned slike peptider i tarmen.

En for tiden foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse består i å benytte melkesyrebakterier. Disse bakteriene inneholder fortrinnsvis peptidaser som er i stand til å hydrolysere peptider. Videre kan disse peptidasene frisettes til tarmlumen fra døde bakterier og derved bryte ned uønskede peptider.

Biologisk aktive peptider av typen exorfiner kan brytes ned av forskjellige typer peptidaser som finnes både i animalske celler og i mikroorgansimer. Hos menneske finnes peptidaser i de fleste vev, men enzymer i tarm og blod kan være de viktigste i forhold til de ovenfor nevnte psykiatriske sykdommer.

EP 969015 beskriver diagnostiske markører som omfatter isolerte peptider som opprinnelig finnes i humant vev og som oppviser opiat-lignende aktivitet.

Publikasjonen "Purification and characterization of an X-Prolyl-Dipeptidyl Peptidase from Lactobacillus sakei" av Yolanda Sanz, Applied and Enviornmental Microbiology, vol. 67, no. 4, 2001, beskriver en peptidase isolert fra L. sakei.

Publikasjonen "The effect of Gliadin peptides on rat-liver lysosomes in relatetion to the pathogenesis of coeliac disease", Clinica Chinica Acta, 49 81973), beskriver pankreatiske proteaseoppkutt evaluert for deres effekt på lysosomer fra rottelever.

Publikasjonen "(J-Casomorphin 4 from milk fermented by a mutant of Lactobacillus helveticus", nt. Dairy Journal 6

(1996), beskriver hydrofobe peptider isolert fra melk fermentert med en villtype stamme en mutant stamme av L. helveticus som mangler X-propyl-dipeptidyl aminopeptidase.

Publikasjonen "Bioactive peptides encrypted in milk proteins: proteolytic activation and thropho-functional properties", Hans Meisel et al., Antonie van Leeuwenhoek, vol. 76 (1-4), 1999, beskriver at bioaktiviteten av peptider kan være skjult i melkeproteiner og at disse er latente inntid de frigjøres og aktiveres av enzymatiske proteolyse.

De nevnte publikasjoner beskriver bakgrunnsteknologi for foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse er imidlertid karakterisert ved at den omfatter et farmasøytisk, veterinærisk eller næringsmateriale, kjennetegnet ved at det omfatter en eller flere bakterier som 1) har evnen til å adhere til tarmen, og som 2) er i stand til å senke konsentrasjonen av patogene peptider, hvor adhesjonsevnen bestemmes som bakterienes evne til å adhere til cellelinjene Caco 2 eller Hep-2 med minst 8% adhesjon, og hvor den peptidsenkende aktivitet måles som en peptidaseaktivitet hvor minst 2,5 nmol av et substrat valgt blant Gly-Pro-pNA, Gly-pNA eller Pro-PNA omdannes per min. per mg. protein.

Ytterligere utførelser av materialet ifølge oppfinnelsen er angitt i underkravene 2-22.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av et materiale i samsvar med oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk materiale eller kostblanding for å forebygge og/eller behandle en sykdom eller tilstand forårsaket eller opprettholdt av forhøyde nivåer av et (sykdomsfremkallende) peptid i tarmen.

Vider omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte, kjennetegnet ved at de forskjellige bakterier i materialet ifølge oppfinnelsen utvelges basert på følgende trinn: a) bestemmelse av konsentrasjonen av de forskjellige peptidene i en biologisk prøve som for eksempel urin

eller blod,

b) bestemme om noen av disse peptidene er involvert eller er årsak til en medisinsk sykdom eller tilstand,

og

c) velge ut én eller flere bakteriestammer som har vist preferanse for nevnte peptid i en in vitro

peptidaseanalyse.

Den foreliggende oppfinnelsen består således av en blanding av én eller flere bakteriestammer som er i stand til å bryte ned uønskede peptider i tarmen. En foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse består i en blanding av flere bakterier, og hvor den kombinerte peptidaseeffekten har en substratpreferanse mot de ovenfor beskrevne peptider.

Melkesyrebakterienes peptidasesystem

Melkesyrebakterier (MSB) lever i forskjellige typer miljøer slik som i tarmsystemet, ulike mat og drikkeprodukter som for eksempel meieriprodukter, kjøtt, viner og i døende plante- og dyremateriale. Slike bakterier kan kolonisere tarmslimhinnen og de spiller en viktig rolle for den normale tarmfunksjonen.

Enkelte typer MSB vokser godt i melkeprodukter og anvendes i stor utstrekning i produksjon av meieriprodukter. Proteiner og peptider tjener som nitrogenkilde, og metaboliseres av flere enzymsystemer i melkesyrebateriene som beskrevet av Pritchard and Coolbear (1993) and Yamamoto et al (1993).

Et proteinspaltende enzym (protease) er lokalisert i celleveggen til MSB, forankret i plasmamembranen. For eksempel vil kasein splittes i oligopeptider på 3-20 eller flere aminosyrer av dette enzymet.

Ulike typer MSB har forskjellig preferanse for kaseiner, og proteinasene og peptidasene har forskjellig substratspesifisitet. Proteinasene fra L. Lactis subsp. cremoris viste en markert preferanse for 5-kasein, mens proteinasene fra L. Lactis subsp. lactis bryter ned a- og (3-kasein.

Oligopeptidproduktene som dannes av proteinasene tas opp av spesifikke transportsystemer og blir videre brutt ned av intracellulære peptidaser til di- og tri-peptider, og til slutt til aminosyrer. Aminosyrene blir videre benyttet til syntese av nye bakterieproteiner. Disse nedbrytnings-prosessene er godt beskrevet for melkeavledete proteiner, men mindre er kjent om degradering av andre diettproteiner som for eksempel glutenproteiner.

For å finne frem til bakterier som er i stand til å bryte ned skadelige peptider som har en funksjon i psykiatriske tilstander som beskrevet over, har oppfinnerne av det foreliggende patent søkt etter bakterier som inneholder enzymsystemer som er i stand til å bryte ned slike peptider på en effektiv måte. En effektiv nedbrytning involverer flere faktorer som nevnt ovenfor;

1) frisetting av peptidaser fra døde MSB og en ekstern

aktivitet av disse,

2) et effektivt opptakssystem for slike peptider og

3) en effektiv intracellulær katabolisme av slike peptider.

Siden det synes som om enzymsystemet i tarmen ikke er tilskrekkelig effektivt til å byte ned disse korte peptidene som er involvert i de psykiatriske tilstandene som er beskrevet ovenfor, er et hovedformål med den forliggende oppfinnelsen å finne frem til en sammensetning som kan forsterke den peptidsenkende aktiviteten, fortrinnsvis i tarmsystemet.

Fortrinnsvis skal disse patogene peptider brytes ned fullstendig til aminosyrer. Som vist i den eksperimentelle delen har vi testet flere bakterier for deres evne til å degradere peptider som en antar kan være involvert i nevnte sykdommer. En kan derfor forvente at ved å kombinere flere bakteriestammer, fortrinnsvis MSBer, vil en oppnå en peptidaseblanding som er i stand til å eliminere disse skadelig peptidene fra tarmen, og således lindre og/eller behandle disse sykdomstilstandene. Nevnte bakteriesammen-setning kan også muligens benyttes som et forbyggende middel for slike sykdommer.

Et formål med den forliggende oppfinnelse er således å identifisere en kombinasjon av bakterier, fortrinnsvis MSBer, som oppfyller disse krav.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelsen er å modulere forskjellige bakteriestammer slik at de oppviser den ønskede peptidaseaktivitet, og den foreliggende oppfinnelsen består således også av genmodifiserte organismer.

Den økede utskillelsen i urin av peptider ved visse psykiatriske tilstander synes å avhenge av et øket opptak fra tarmen. Det er ikke kjent hva som er den primære årsak til dette, men en reduksjon i tarmens peptidaseaktivitet kan forklare det økede opptaket. Uansett hva som er årsaken til det økte opptaket i tarmen, må en kunne anta at opptaket avhenger av peptidnivået i tarminnholdet. En må derfor kunne forvente at nedbrytning av patogene peptider i tarmen vil redusere peptidopptaket, og det postuleres at dette vil forebygge og/eller behandle sykdommer forårsaket av disse peptider. Videre vil dette kunne ses som en redusert utskillelse av peptider i urinen. Melkesyrebakterienes peptidaser i samsvar med foreliggende oppfinnelse må derfor være i stand til å bryte ned peptider av typen casomorfiner og gluteomorfiner. Det er vist at Lactobacillus casei in vitro kan bryte ned casomorfin 1-7 vha sin aminopeptidase IV. Høyt peptidaseinnhold er vist i forskjellige typer av Lacobacillus heleveticus.

Bakteriene ifølge den foreliggende oppfinnelsen vil bli tilveiebrakt som en farmasøytisk sammensetning, som et veterinærisk materiale eller som et næringstilskudd, og gitt til pasienter med behov for en slik behandling, fortrinnsvis som en oral sammensetning eller som et tilsetningsstoff i matprodukter.

Bakteriestammene må ha egenskaper som gjør dem aktive i tarmsystemet, ved at de fysisk adhererer til og koloniserer tarmslimhinnen, og ved at de har effektive opptaks-mekanismer og høy intracellulær degraderingsevne, slik at peptidene brytes hurtig ned etter matinntak. Frigjøring av peptidaser til tarminnholdet vil ytterligere kunne øke peptidnedbrytningen, enten fra levende eller døde bakerier.

En fortrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen er å fremskaffe bakterier som er i stand til å kolonisere tarmslimhinnen, i hvert fall for en begrenset periode.

Videre er det essensielt at bakteriestammene som skal anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse er aktive i tarmmiljøet som er karakterisert ved lav pH og høy konsentrasjon av galle.

Anvendelse av bakterielle peptidaser for nedbryting av peptider i tarmen i forbindelse med allergiske forstyrrelser og cøliakisykdom.

Preparater i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan også anvendes ved cøliaki og allergiske tilstander og andre ikke neurologiske sykdommer. Disse tilstandene innebærer reaksjoner mot fremmede peptider og proteiner. En komplett eller øket nedbrytning i tarmen vil eliminere eller redusere opptaket av sykdomsfremmende peptider, og kunne anvendes enten som profylakse eller som behandling for de ovenfor nevnte tilstander. En fortrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen består av et produkt som er en kapsel son inneholder 2-4 stammer av frysetørkede levende bakterier.

En foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen vedrører et fermentert melkeprodukt eller en tyggetablett. Bakteriene skal ha en preferanse for og en øket nedbrytingsaktivitet mot patogene bakterier i tarmen.

Fortrinnsvis må noen av bakteriestammene i nevnte preparat ha evne til å adherer til slimhinneoverflaten, formere seg og bli en del av tarmfloraen, og bakteriene i produktet må beholde enzymaktiviteten in vivo.

EKSPERIMENTELL DEL

Denne delen inneholder eksperimenter som viser hvilke egenskaper probiotiske mikroorganismer må ha for å bryte ned patologiske peptider tarmen. Alle probiotiske organismer må være sikre. Effektive probiotiske organismer må inneholde peptidaser som er i stand til å hydrolysere de aktuelle peptider med patologiske egenskaper. For å overleve under betingelser i magesekk og tynntarm må de være i stand til å tolerere sure betingelser og gallesyrer. For å ha varige effekter må de kunne adherere til, og i hvert fall for en viss tid kunne kolonisere slimhinneoverflaten. I tillegg må mikrobielle probiotiske stammer vokse godt i en fermentor av hensyn til produksjonen.

Materialer og metoder

De isolerte bakterier ble klassifisert som melkesyrebakterier, siden de var gram-positive, produserer syre under dyrkning, og at de vokser i nærvær av NaN3. Bakterier som ble klassifisert som melkesyrebakterier ble videre testet med API-testen for å bestemme stamme.

Bakteriestammer

Alle MSB-stammene ble dyrket fra forråder lagret i væske-formig N2 (i 30% glycerol). Stammene ble dyrket i Man, Rogosa and Snarpe (MRS, Merck) broth ved 37°C.

For metabolsk radioaktiv merking ble 40 ul <3>H-adenine tilsatt 20 ml bakteriesuspensjon i MRS broth og inkubert i 16-18 timer. For å fjerne overskuddsradioaktivitet etter dyrkning, ble bakteriene sentrifugert (2000 rpm) og pelleten ble vasket to ganger med fosfatbufret saltvann(PBS, pH 7,2). Optisk tetthet ved 600 nm av bakteriesuspensjonen ble justert til 1.0 for å gi ca 6xl0<B >til 2xl0<9> colony forming units (CFU) ml"<1>.

Caco- 2 cellekulturer

Cellelinjen Caco-2 (ATCC CRL-2102) ble innkjøpt fra The American Type Culture Collection. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 4 med mer L-glutamin, justert til å inneholde 4,5 g/l glukosse, 1,5 g/l natriumbikarbonat, 1,0 mM natriumpyruvat og 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin ved 37°C og med en atmosfære på 5 % CO2/95 % luft.

For adhesjonsanalyse ble Caco-2 cellene dyrket i 96-brønners mikrotiterplate. Cellene ble sådd ut i en konsentrasjon av 5xl0<4> celler ml<-1> (200 ul i hver brønn) og dyrket i to uker før de ble brukt i adhesjonsanalysen. Cellekulturmediet ble byttet annenhver dag, i tillegg til 2 timer før adhesjonsanalysen.

HEp- 2 cellekulturer

HEp-2 cellene ble innkjøpt fra ATCC, og de ble opprinnelig isolert fra en pasient med et larynxcarcinom. Denne cellelinjen er benyttet mye som modell i studier av bakteriell adhesjon. Både grampositive og gramnegative bakterier har blitt studert med hensyn på HEp-2 celleadhesjon.

Cellene ble dyrket i 75 cm<2> flasker i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium med 4 mM L-glutamin, justert til å inneholde 4,5 g/L glukose, 1,5 g/L natrium bikarbonat, 1,0 mM natrium pyruvat, 10 % føtalt kalveserum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin ved 37°C og i en atmosfære med 5 % C02/95 % luft.

HEp-2 cellene ble dyrket til de var konfluente. Cellene ble trypsinert 48 timer før adhesjonsforsøkene og sådd ut i 96-brønners mikrotiterplater med 200 (il per brønn fra en cellsuspensjon med 2.5 x 10^ celler/ml, som gir 5x10^ celler per brønn.

In Vitro Adhesjonsanalyse

Adhesjon av bakteriestammer til Hep-2 eller Caco-2 cellekulturer ble undersøkt ved å tilsette 200 ul av den radioaktivt merkede bakteriesuspensjonen til brønnene. Før bakteriene ble tilsatt ble de suspendert i MEM-Earle tilsatt 0,5 % FBS, 1 % L-glutamin and 0,1 % NEA, og alle brønnene ble vasket 2 ganger med dette mediet. Etter inkubering i 1-3 timer ble Caco-2 cellekulturene vasket med 3x250 ul buffer saltvannsløsning (BSS) i en Multiwash4" platevasker (Labsystems) og behandlet med 150 (il 2 % SDS i 0,01 M NaOH i 20 minutter for å lysere bakteriene. De lyserte bakteriene ble deretter blandet med scintillasjons-væske, og radioaktiviteten ble målt i en scintillasjons-teller. Adhesjonsforholdstallet (%) ble kalkulert ved å sammenligne radioaktiviteten i den opprinnelige bakteriesuspensjon som ble tilsatt med de endelige tellingen i de lyserte cellene.

Peptidaseaktivitet

pNA-merkede substrater ble benyttet til å måle peptidaseaktivitet i de forskjellige bakteriestammene. Bakteriene ble høstet i sen logfase, og det ble laget et cellefritt ekstrakt som inneholdt peptidasene. Peptidaseekstraktet ble inkubert med de merkede substratene, og reaksjonen ble synlig som en fargeforandring. Peptidaseaktiviteten ble beregnet og er oppgitt som nmol produkt per min per mg protein.

Bakteriene ble høstet i sen logfase ved sentrifugering ved 7500 g ved 4°C i 10 minutter. Etter vask to ganger med 50 mM Hepes pH 7,0, og med 15 mM CaCl2 for å hindre auto-protolyse, ble bakteriene resuspendert i 1 ml av denne buffer. Cellefritt ekstrakt ble laget ved å knuse cellen med sonikering ved 4°C i 5 minutter, og så sentrifugere ved 15300 rpm ved 4°C i 10 minutter. Peptidaseekstraktet ble oppbevart ved 4°C. Proteinmengden ble bestemt med et BCA protein kitt ved 562 nm.

Reaksjonen mellom substratet og peptidasen fant sted i 300 ul mikrotiterplatebrønner (NUNC) ved 37°C. Fargeforandring-en i en blanding av 100 ul substrat og 100 ul av peptidaseekstraktet ble fulgt med en automatisk mikroplateleser ved 414 nm ved hjelp av Genesis Software.

Opptak og metabolisme av peptider hos melkesyrebakterier

Bakteriene ble høstet i sen logfase med sentrifugering ved 7500 g ved 4°C i 10 minutter. Før transportanalysen ble utført ble cellene vasket to ganger med 100 mM MES-KOH {kalium-2-(N-morpholino)-etansulfonsyre), 2 mM CaCl2, pH 6,5 {alle buffere ved 4°C) . Celler (A66o =25) ble de-energisert med 10 mM 2-deoxyglucose i 20 min ved 37°C, og vasket to ganger med 100 mM MES-KOH, pH 6,5.

I transportanalysen ble cellene (A6eo = 10) pre-inkubert i 3 min i MES-KOH, med 25 mM glukose, deretter ble 0,5 mM peptid tilsatt.

Løsningen med peptider og bakterier ble inkubert ved 37°C. Prøver ble tatt ut etter 0, 5, 10, 15, 30, 60 and 120 minutter. Cellene ble fjernet vha sentrifugering og supernatanten ble analysert med RP-HPLC.

Intracellulære peptider ble extrahert, ved å tilsette 300 ul av en suspensjon av 5 % perklorsyre and 10 mM Na-EDTA til pelleten, og inkubert i 30 minutter. Fra denne suspen-sjonen ble 110 (il overført til et eppendorfrør med 1 M KOH-KHC03 •

Prøvene (100 ul) ble analysert på en AKTA Purifier fra Pharmacia Biotech, med en UV-900 deteksjonsenhet. Det ble benyttet en Vydac 218TP54 C-18 kolonne. Peptidene ble eluert med en gradient fra 0-35 % B, i løpet av 100 minutter. Buffer A var 0,1 % TFA i vann, og buffer B var 0,1 % TFA i 60 % acetonitril. Gjennomstrømningshastigheten var 1 ml/min, og peptidene ble detektert ved 215 nm.

Opptak av peptider i Caco- 2 celler

Caco-2 celler ble benyttet som et modellsystem for tarmslimhinnen. 24-brønners dyrkningsplater ble benyttet. Lb. acidophilus ble tilsatt til halvparten av brønnene. Dette er en melkesyrebakterie som adhererer til Caco-2 celler. Til alle brønnene ble det tilsatt p-casomorphine-7, og konsentrasjonen av p-casomorphine-7 ble målt ved tidene 0, 60 and 120 minutter etter tilsetning av peptidet.

Brønnene ble vasket to ganger med 500 ul 0,5% medium uten antibiotika. Alt medium ble fjernet fra brønnene før bakterier/medium ble tilsatt og inkubert i en time ved 37°C i en atmosfære med 5 % C02/95 % luft. Brønnene ble vasket fire ganger med BSS. Peptidet (0,25 mM) ble tilsatt i medium uten antibiotika eller serum.

Prøvene (100 ul) ble analysert på en AKTA Purifier fra Pharmasia Biotech.

RESULTATER

In vitro adhesjonsanalyse

Flere bakteriestammer ble testet for deres evne til å adhere til Caco-2 cellelinjer og Hep-2 celler. Eksempel på adhesjon av noen bakterier er gitt i tabell 1.

Peptidaseaktivitet

Flere bakteriestammer ble testet med henblikk på peptidaseaktivitet med Gly-Pro-pNA som substrat, som gir en indikasjon på Pep-X aktivitet. Eksempel på peptidaseaktivitet for enkelte bakterier er vist i tabell 2.

Transportanalyse

Opptak og nedbrytning av peptidene dermorfin, p-casomorfin-8, p-casomorfim-7 og exorfin A5 ble studert i en Lb. helveticus bacteria and en Lb. acidophilus. Tabell 3 viser hvordan forskjellige bakteriestemmer degraderer enkelte bestemte peptider.

Enkelte av resultatene gitt i tabell 3 er summert i figur 1 og 2. Figur 1 viser den extracellulære degraderingen av p-casomorfin 8, p-casomorfin 7 og exorfin A5 i Lb. helveticus ATCC 15009. Konsentrasjonen ved 0 minutter tilsvarer 100 %. Lb. helveticus 300 bryter ned de tre peptidene svært raskt, selv om peptidene har ulik aminosyresekvens. Dette stemmer overens med at denne bakterien inneholder flere peptidaser, noe som gir en kombinert bred substratspesifisitet. Figur 2 viser nedbrytningen av p-casomorfin 7 og exorfin A5 i Lb. helveticus 302. Konsentrasjonen ved 0 minutter tilsvarer 100 %.

Denne bakterien har ingen aktivitet mot substratet Gly-Pro-pNA (tabell 2): Denne bakterien har imidlertid den høyeste aktiviteten mot exorphin A5.

2-deoxy-glukose ble benyttet for å tømme bakteriene for aminosyrer og peptider, og en antar derfor at de intracellulære peptidene som er tilstede stammer fra de tilsatte peptidene. Figur 3 viser den intracellulære konsentrasjonen av p-casomorphin 7 og exorphin A5 i Lb. helveticus 300.

Opptak av peptider i Caco- 2 celler

Konsentrasjonen av p-casomorphin-7 ble senket raskere når Lb. acidophilus ble inkubert sammen Caco-2 celler sammenlignet med Caco-2 celler uten bakterier.

Tabell 4 viser konsentrasjonen (uM) av p-casomorphin-7 når Caco-2 celler ble inkubert med eller uten Lb. acidophilus. Disse resultatene er også vist i figur 4, som viser den extracellulære konsentrasjon av p-casomorfin 7 i kultur-mediet til Caco-2 cellene med og uten en adherert probiotisk stamme.

Claims

1. Et farmasøytisk, veterinærisk eller næringsmateriale, karakterisert ved at det omfatter én eller flere bakterier som 1) har evnen til å adhere til tarmen, og som 2) er i stand til å senke konsentrasjonen av patogene peptider, hvor adhesjonsevnen bestemmes som bakterienes evne til å adhere til cellelinjene Caco 2 eller Hep-2 med minst 8% adhesjon, og hvor den peptidsenkende aktivitet måles som en peptidaseaktivitet hvor minst 2,5 nmol av et substrat valgt blant Gly-Pro-pNA, Gly-pNA eller Pro-PNA omdannes per min. per mg. protein.

2. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at peptidene fra tarmsystemet er patogene og er opphav til symptomer forbundet med adferdsfor-styrrelser eller psykiatriske lidelser, slik som autisme, ADHD, sinnslidelser, schizofreni, gjennomgripende ut-viklingslidelser, spaltet sinn og depresjoner.

3. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at peptider som virker patogent i tarmen er virksomme agens for sykdommer eller forstyrrelser utvalgt fra gruppen som omfatter allergiske lidelser, cøliaki og multiple sklerose.

4. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det virksomme peptid er avledet fra proteiner i maten.

5. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det virksomme peptid skyldes mikrobiell aktivitet i tarmen.

6. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det virksomme peptid er et exorfin.

7. Materiale i samsvar med krav 6, karakterisert ved at det virksomme exorfin er valgt fra en gruppe bestående av:

8. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det virksomme peptid er et casomorfin.

9. Materiale i samsvar med krav 8, karakterisert ved at casomorfinet er utvalgt fra en gruppe bestående av: (J-casomorf in 1-8 (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro)

10. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at peptidet er desmorfin, eller andre peptider av bakteriell opprinnelse.

11. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at peptidet er hemopektin avledet fra hemoglobin.

12. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at én eller flere av de virksomme bakteriestammer er en melkesyrebakteriestamme.

13. Materiale i samsvar med krav 12, karakterisert ved at materialet omfatter en melkesyrebakterie utvalgt fra gruppen som omfatter, Lb, helveticus, Lb. acidophilusf Lb. lactis, Lb casei, streptococcus, bifidobacterium eller micrococcus.

14. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved en av materialet omfatter én eller flere genetisk modifiserte bakteriestammer.

15. Materialet i samsvar med krav 1, karakterisert ved at materialet i blandingen omfatter bakterier som er i stand til å vokse ved de betingelser som en møter ved passasje gjennom mage/ tarm-systemet.

16. Materialet i samsvar med krav 15, karakterisert ved at minst én av bakteriestammene har følgende egenskaper: a) opprettholder stabilitet og utøver peptidaseaktivitet i tarmsystemet, b) er motstandsdyktig mot proteolytisk nedbrytning c) er aktiv i det sure miljøet i tarmsystemet d) er motstandsdyktig mot gallesyrene

17. Materiale i samsvar med krav 15, karakterisert ved at minst noen av bakteriene har evne til å binde seg til tarmepitelium, og/eller kan kolonisere epitelium.

18. Materiale i samsvar med krav 15, karakterisert ved at én av nevnte bakteriestammer er i stand til å kolonisere og vokse i tarmmukosa.

19. Materiale i samsvar med krav 15, karakterisert ved at minst en av bakteriestammene har økt retensjonstid i tramsystemet.

20. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den aktuelle bakteriestamme foreligger i lyofilisert form.

21. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at nevnte materiale foreligger i en kapsel, løsning eller drikkbar oppløsning, eller som et pudder i en pose.

22. Materiale i samsvar med krav 1, karakterisert ved at materialet inneholder fra IO<7> til IO<9 >celler av hver stamme i hver enkelt dose.

23. Anvendelse av et materiale i samsvar med et av kravene 1-22, for fremstilling av et farmasøytisk materiale, veterinærisk materiale eller et næringsmateriale for å forebygge og/eller behandle en sykdom eller tilstand forårsaket eller opprettholdt av forhøyde nivåer av et (sykdomsfremkallende) peptid i tarmen.

24. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-22, karakterisert ved at de forskjellige bakterier i materialet velges ut basert på følgende trinn: a) bestemmelse av konsentrasjonen av de forskjellige peptidene i en biologisk prøve som for eksempel urin eller blod, b) bestemme om noen av disse peptidene er involvert eller er årsak til en medisinsk sykdom eller tilstand, og c) velge ut én eller flere bakteriestammer som har vist preferanse for nevnte peptid i en in vitro peptidaseanalyse.