JP5410759B2 - 抗原に対する粘膜寛容の誘導 - Google Patents
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Description
免疫系は、自己と非自己とを識別する課題を有する。呼吸器、消化器および尿生殖器に沿って存在する粘膜免疫系は、食物、空気中の抗原または共生細菌フロラなどの多数の細菌および無害な抗原と共に共存する追加の負担を負う。粘膜免疫系の主要な特徴は、それがこれらの抗原に対して寛容であり続けるが、効果的に病原体を忌避する能力を保持できることである。注射によろうと損傷によろうと、抗原の導入は、全身的に炎症細胞の局所浸潤および特異的免疫グロブリン産生に至る。対照的に、消化管および尿生殖器などの粘膜表面に導入された抗原は、それらの抗原に対する免疫反応の能動的な阻害を全身的に誘発する。消化管を介した抗原の投与によるこれらの調節された反応の特異的誘導は、経口寛容として公知である。抗原の経口投与は、全身不反応性に至ることがあり、(ステロイドのように)望まれない副作用を有する免疫抑制性医学発明物の魅力的な代替物である。本発明は、特に、低用量の抗原への繰り返し曝露により得られる低用量寛容の分野にある。粘膜を介する寛容の誘導は、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患および炎症性疾患に対する処置戦略として提案されてきた。
経口寛容は1911年に最初に記載されたが、研究者が、関係するメカニズムに取り組み始めたのは1970年代後半になってからであった(Mayer and Shao, 2004a)。経口寛容の発生には、抗特異的T細胞の除去、過大な免疫偏向、およびアネルギーの誘導からTregによる抑制までいくつかのメカニズムが提案されてきた(Mucida et al., 2005)。大部分の研究者は、経口寛容を得る二つの別個の方法があることに意見が一致しており、それらは、抗原の単回高用量後に得られる、アネルギーおよび/または除去に基づく高用量寛容(Friedman and Weiner, 1994)ならびに低用量の抗原への繰り返し曝露によって得られる、Foxp3+、IL−10および/またはTGF−β産生調節性T細胞を含めたCD4+T細胞による免疫反応の能動的な抑制によって仲介される低用量寛容である。重要なことに、粘膜寛容により誘導される調節性T細胞は、あるタンパク質に特異的な調節性細胞が別のタンパク質に対する近くのエフェクター細胞の反応を抑制する過程であるバイスタンダー抑制を仲介することが示された。器官特異的自己免疫を誘導する抗原のプールが主として未知であることから、バイスタンダー抑制は抗原誘導性抑制の重要な特徴であり、これはエピトープスプレッディングの現象を無効にする。エピトープスプレッディングは、初期の免疫反応が時間と共に拡大し、他の抗原に対する反応を含むようになる、自己免疫性疾患およびアレルギー性疾患の合併症である。
驚くことに本発明者らは、免疫モデュレーション化合物産生微生物の粘膜デリバリーと組み合わせた抗原の粘膜デリバリーが、好ましくは当該抗原が微生物により発現され、好ましくは当該粘膜デリバリーが経口的に行われるならば、安定な粘膜寛容反応を誘導することができることを見い出した。本発明者らは、抗原発現微生物単独の粘膜デリバリーに比べて、そのような組み合わせの粘膜デリバリーの方が抗原特異的免疫反応の有意に良好な抑制を与えることを観察した。なおさらに驚くことに、抗原の経口デリバリーとの組み合わせであろうとなかろうと、遊離の免疫モデュレーション化合物の経口デリバリーに比べて、本発明により得られる免疫抑制の方が有意に有効である。
この開示全体にわたり、様々な公報、特許および公開された特許明細書は、確認引用文献により参照される。これらの公報、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術の現状をさらに完全に説明するために、これによって本開示への参照により組み入れられる。
本発明の実施は、特に示さない限り、当該技術の熟練の範囲内である有機化学、薬理学、分子生物学(リコンビナント技法を含む)、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技法を採用する。そのような技法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition(Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)のシリーズ; "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987および定期刊行物); "Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); および "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)などの文献に十分に説明されている。
本明細書に使用するある用語は以下の特定の意味を有することがある。明細書および特許請求の範囲に使用する単数形「a」「an」および「the」は、状況が明らかに別のものを指示しない限り複数の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。同様に、本明細書に記載される処置または薬剤の調製のための「化合物」の使用は、状況が明らかに別のものを指示しない限り、そのような処置または調製のために本発明の一つまたは複数の化合物を使用することを考えている。
実施例A:in situデリバリーされたIL−10と組み合わせた、卵アルブミンを分泌しているL.lactisの経口投与後の前記卵アルブミンに対する寛容の誘導
実施例への材料および方法
細菌およびプラスミド
L.lactis MG1363株をこの研究にわたり使用した。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)中で培養した。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロールに入れて−20℃で保存した。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で500倍に希釈し、30℃でインキュベーションした。これらは16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mlの飽和密度に達した。この研究にわたり、混合した細菌懸濁液を使用した。したがって、混合しなければならない細菌を遠心分離により採集し、両細菌培養物のペレットをBM9培地に入れて10倍濃縮した(Schotte, et al., 2000)。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液100μlの投与を受けた。
7週齢雌性Balb/cマウスは、Charles River Laboratories(Italy)から得た。これらのマウスをSPF条件で飼育し、標準的な実験室用飼料および水道水を自由摂取させた。動物実験は、Ghent大学、the Department for Molecular Biomedical Researchの倫理委員会により承認された。
マウスは、第−46から−42、−39から−35、−32から−28、−25から−21、−18から−14、−11から−7、−4から−1日に混合L.lactis懸濁液の投与を受け、LL−pT:LL−pT1NX(ベクター対照)およびLL−pT1NXの混合細菌懸濁液;LL−OVA:卵アルブミンを分泌しているL.lactis株およびLL−pT1NXの混合細菌懸濁液;LL−OVA+LL−mIL10:LL−OVAおよびマウスインターロイキン10を分泌しているL.lactis株の混合細菌懸濁液。経口寛容誘導のための二つの陽性対照をこの研究に含めた。陽性対照1は、第−7日にBM9培地100μl中の卵アルブミン20mgの投与を受けた。陽性対照2は、L.lactis補給と同じ日にBM9培地100μl中の卵アルブミン1μgの投与を受けた。マウスは、カテーテルにより胃内に補給を受けた。対照マウスは経口処置しなかった。第0日に、M.tuberculosis H37RA(Difco)100μgを含む完全フロイントアジュバント中に1:1で乳化させたOVA 100μgをマウスにs.c.免疫した。免疫の11日後に腸間膜リンパ節(MLN)ならびに膝窩および鼠径リンパ節(PLN/ILN)を採取し、OVA特異的増殖およびサイトカイン産生について細胞を評価した。
所属膝窩および鼠径リンパ節の単細胞懸濁液を調製した。細胞を計数し、10%ウシ胎仔血清(FCS)、10U/mlペニシリン、10μg/mlストレプトマイシン、2mM L−glutamax、0.4mMピルビン酸ナトリウムを含む、単独または11、33、100もしくは300μg/ml OVA存在下のいずれかのRPMI−1640(RPMI完全培地)200μlの中に2×105細胞となるように再懸濁した。細胞は、37℃の5%CO2加湿インキュベーター中でU底96ウェル組織培養プレート(Becton Dickinson)に入れて90時間培養した。増殖は、1μCi/ウェルの[3H]チミジンの添加により培養の最終18時間に評価した。DNAに結合した放射能は、ガラス繊維製フィルターマット(Perkin Elmer)上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。
CD4+T細胞は、CD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用してPLN/ILN由来の全細胞調製物から精製した。2×105個のCD4+T細胞は、抗原提示細胞として作用する、OVAをロードされたマイトマイシンC処理脾臓細胞と共に、1/3、1/1、1/0.3、1/0.1および1/0のCD4+T細胞/APC比でRPMI完全培地200μlに入れて培養した。これらの細胞は、37℃の5%CO2加湿インキュベーター中のU底96ウェル組織培養プレート(Becton Dickinson)に入れて90時間培養した。増殖は、培養の最終18時間に1μCi/ウェルの[3H]チミジンの添加により評価した。DNAに結合した放射能をガラス繊維製フィルターマット(Perkin Elmer)上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で測定した。
腸間膜リンパ節(MLN)ならびに所属膝窩および鼠径リンパ節由来のリンパ節細胞を調製し、2×106細胞/mlで再懸濁し、部分量100μlを、300μg/ml OVAと共にU底96ウェル組織培養プレートに入れて72時間培養した。マウス炎症キットを使用したCytometric Bead Array(BD Bioscience)によりサイトカインレベルを定量するまで、上清を−20℃で保存した。
経口寛容の誘導を研究するために、GM L.lactis(LL−pt:LL−pT1NX[全](=ベクター対照)およびLL−pT1NXの混合細菌懸濁液;LL−OVA:OVAを分泌しているL.lactis[全てイタリック]およびLL−pT1NXの混合細菌懸濁液;LL−OVA+LL−mIL−10:OVAを分泌しているL.lactisおよびマウスIL−10を分泌しているL.lactisの混合細菌懸濁液)を連続する5日間に6回(第−46から−42、−39から−35、−32から−28、−25から−21、−18から−14、−11から−7、および−4から−1日)、または−7日にOVA単回量20mg(陽性対照1)またはL.lactis補給と同じ日にOVA1μgを多回量(陽性対照2)マウスに経口補給した。対照マウスは経口処置しなかった。0日目に、完全フロイントアジュバント中のOVAをマウスにs.c.免疫し、PLN/ILN細胞のOVA特異的増殖を11日目に評価した。LL−IL−10の添加はOVAへの寛容誘導を有意に高めた。それは、LL−OVA[全]+LL−mIL−10群におけるPLN/ILN細胞のOVA特異的増殖反応(図1)が、対照群およびLL−ova群に比べて有意に減少したからであった。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実施例1)のようにGM L.lactisまたはOVAをマウスに経口補給し、続いて完全フロイントアジュバント中のOVAをs.c.免疫した。免疫の11日後に、MLNおよびPLN/ILN中のOVAに反応したサイトカイン産生は、マウス炎症キットを使用したCytometric Bead Arrayにより定量した。MLNにおいて、炎症性サイトカインであるIL−12,TNF−α、IFN−γおよびIL−6の産生は、LL−ova群に比べてLL−ova+LL−mIL−10群では検出されないか、または強く減少し、LL−ova群ではこれらの炎症性サイトカインの強い産生が観察された(図2A)。PLNでは、LL−ova+Ll mIL−10群における炎症性サイトカインTNF−α、IFN−γ、MCP−1およびIL−6の産生が、LL−ova群に比べて強く減少し、この群においてTNF−α、MCP−1およびIL−6レベルは対照群で観察されるレベルよりも低い(図2B)。
経口寛容の誘導がCD4+[全]T細胞により仲介されたかどうかを評価するために、MLNおよびPLN/ILNにおけるOVA特異的増殖CD4 T細胞反応を研究した。したがって、上に示した日にGM L.lactisまたはOVAをマウスに経口補給した(実施例1)。第0日に完全フロイントアジュバント中のOVAをマウスにs.c.免疫し、11日後にMLNおよびPLN/ILNからCD4 T細胞を精製し、続いてOVAをロードされたマイトマイシンC処理脾臓細胞の存在下で培養した。LL−ova+LL−mIL−10群におけるOVA特異的CD4 T細胞反応は、LL−ova群および対照群に比べて有意に減少した(図3)。
緒言
インターフェロン、第VIII/IX因子、および抗体(レミケード)などのいくつかの治療用(リコンビナント)タンパク質は、長期処置期間にわたり高用量で投与される。しかし、その使用に伴う合併症は、抗体などのタンパク質特異的免疫反応の発生である。阻害物質とも呼ばれるこれらの抗体(Ab)は、治療用タンパク質をあまり有効でないようにする。例には、血友病における第VIII/IX因子、慢性腎不全の治療を受けている患者におけるエリスロポイエチン(Epo)、および多発性硬化症のための治療を受けている患者におけるIFN−βに対する阻害物質の形成が含まれる。ここでは、IL−10産生L.lactisと組み合わせた第VIII因子(および第IX因子)の経口デリバリーが、抗原特異的CD4+調節性T細胞の誘導により前記因子に対する阻害物質の形成を抑制することを実証する。
細菌およびプラスミド
L.lactis MG1363株をこの研究全体にわたり使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)中で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロールに入れて−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。これらは16時間以内に2×109コロニー形成単位(cfu)/mlの飽和密度に達する。この研究にわたり、混合した細菌懸濁液を使用する。したがって、混合した細菌を遠心分離により採集し、両細菌培養物のペレットをBM9培地に入れて10倍濃縮する(Schotte, Steidler et al. 2000)。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液100μlの投与を受ける。
それぞれLL−FVIIIおよびLL−IX由来のFVIIIまたはFIXは、以前に記載されたヒトFVIIIおよびFIX特異的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)(Chuah et al., 2003)を使用して判定する。リコンビナントタンパク質は、記載されたようにウエスタンブロット分析およびCOATestおよびaPTTアッセイ(Chuah et al., 2003; VandenDriessche et al., 1999)によっても分析する。このタンパク質のNH2末端は、自動エドマン分解により判定する。FVIIIおよびFIXは、肝臓に通常発現し、そこでそれらは大規模な翻訳後修飾を受けることから、操作されたL.lactisから産生された凝固因子は、生物学的に不活性なおそれがある。しかし、これらの翻訳後の差は、これらのL.lactisに産生されたリコンビナントタンパク質が免疫寛容を誘導する能力に影響をもたない見込みがある。実際に、これまでに詳細に特徴づけられた大部分の阻害物質は、典型的にはグリコシル化部分よりもアミノ酸残基を認識する(Villard et al., 2003)。
Biら(1995)およびWangら(1997)により記載されたように、ES細胞における相同組換えを使用してマウスFVIIIまたはFIX遺伝子をノックアウトすることによって得た血友病AまたはBマウスは、研究室で繁殖させる。これらのレシピエントマウスは、CFAの存在下で精製リコンビナントFVIIIまたはFIX抗原を用いてチャレンジしたときに中和抗体を産生する(Mingozzi et al., 2003)。この阻害物質の状態は、Bethesdaアッセイまたは抗FVIII/抗FIX特異的ELISAを使用して経時的にモニターすることができる。FVIIIまたはFIX(+CFA)を用いてチャレンジされたレシピエントマウスは、典型的には抗原チャレンジの2〜3週間後に阻害物質を発生する。
4〜6週齢のマウスに、LL−FVIII、LL−FIXもしくはLL−pT1NXまたはLL−OVA(無関係の抗原)の投与を、陰性対照として、またはLL−IL10もしくはIL−10タンパク質(1または10μg)と組み合わせて、または組み合わせずに受けさせる。寛容誘導のための陽性対照として、肝細胞特異的プロモーターからFIXを発現しているアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)をマウスに注射する。レシピエント動物は、FIX+CFAを用いたその後のチャレンジの際の抗FIX抗体の誘導を防止するFIX特異的免疫寛容を発生する。
脾臓およびリンパ節の単細胞懸濁液は、細胞に70μmフィルター細胞ストレーナー(Becton/Dickinson Labware)を通過させることにより調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることによって、脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。
マウスにおける抗体形成の能動的な抑制を試験するために、異なる実験のL.Lactis処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製CD4+T細胞、CD4+CD25-T細胞またはCD4+CD25+T細胞をナイーブC3H/HeJマウスに養子移入する。未処置マウスを対照として使用する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、または正の選択をされたCD4+細胞ならびにCD4+CD25-T細胞およびCD4+CD25+T細胞について107個である。養子移入の36時間後にcFA中のhF.IX 5μgをレシピエントマウス(実験コホートあたりn=4〜5)に皮下注射した。免疫の2.5週間後に血漿中の抗hF.IX IgG力価を測定した。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。LL−IL−10の添加は、FVIIIおよびFIXに対する寛容誘導を有意に高める。それは、対照およびLL−FVIII/IX群に比べてLL−FVIII/FIX+LL−mIL−10群において脾臓細胞の因子特異的増殖反応が有意に減少するからである。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるFVIIIおよびFIX特異的抗体ならびに前記因子に反応したサイトカインの産生は、上記のように定量する。対照群およびLL−FVIII/IX群に比べてLL−FVIII/FIX+LL−mIL−10群では、阻害物質の形成および炎症性サイトカインであるIFN−γの産生は強く減少し、免疫抑制サイトカインであるIL−10およびTGF−βは有意に増加する。
CD4+T細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節における因子特異的増殖性CD4+T細胞反応を研究する。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるように因子特異的CD4+T細胞増殖を判定する。LL−FVIII/FIX+LL−mIL−10群における因子特異的CD4 T細胞反応は、対照群およびLL−FVIII/IX群に比べて有意に減少する。
LL−IL10がIL−10と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節における因子特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。LL−FVIII/FIX+LL−mIL−10群における因子特異的増殖性CD4 T細胞反応は、LL−FVIII/IX+IL−10群に比べて有意に減少する。
経口寛容プロトコールで処置されたマウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、上記の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する(in vivo T調節性活性アッセイ)。対照およびLL−FVIII/IX群に比べて、抗因子IgGの形成はLL−FVIII/FIX+LL−mIL−10群で有意に減少し、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性CD4+T細胞の活性化を示している。
緒言
アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性障害である。アレルギー性喘息は、可逆性気道閉塞、アレルゲン特異的免疫グロブリンEの血清レベルの上昇、粘液の過剰分泌、および気管支痙攣原性刺激に対する気道反応亢進(AHR)を特徴とする。その症状は、患者が感作されたアレルゲン(例えば樹木、草、雑草の花粉、塵、塵性ダニ、カビ、動物のフケ)への曝露により悪化する。2型Tヘルパー(Th2)リンパ球は、この疾患の開始、進行および持続に重大な役割を果たす。現在のデータは、アレルゲンに対するTh2反応が通常は調節性T細胞により抑制されることを示唆している。さらにアレルギーの個体では、このサブセットによる抑制は減少する。ここでは、IL−10産生L.lactisと組み合わせたアレルゲンの経口デリバリーが、抗原特異的CD4+調節性T細胞の誘導により喘息様反応を抑制することを実証する。
ヒト疾患を模倣するアレルギー性喘息の二つのマウスモデルは、Ovaアレルゲンモデルおよびヒト化SCIDモデルである。
ヒトアレルギー性喘息に高度に特徴的な所見であるTh2サイトカイン依存性好酸球性気道炎症、気管支反応性亢進、およびIgE産生に至るOVAエアロゾルを用いてOVA感作マウスを吸入チャレンジする(Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy 24:73; Kips et al. 1996, Am J Respir Crit Care Med 153:535; Brusselle et al. 1995, Am J Respir Cell Mol Biol 12:254)。
この研究にわたりL.lactis MG1363株を使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロールに入れて−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。これらは16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mLの飽和密度に達する。細菌は遠心分離により採集し、BM9培地に入れて10倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液100μlの投与を毎日受ける。
Gallus gallus卵アルブミンをコードしているmRNA配列はGenbank(アクセッション番号AY223553)から検索する。総RNAはニワトリ子宮部から単離し、cDNAは、体積25μl中の総RNA 2μg、2μMオリゴdTプライマー(Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands)、0.01mM DTT(Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands)、0.5mM dNTP(Invitrogen, Merelbeke, Belgium)、Rnasin(Promega Incorporation Benelux)20U、およびsuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)100Uを使用して合成する。OVA cDNAフラグメントは、以下の条件を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅させる:以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて94℃2分に続いて94℃45秒、62℃30秒、および72℃90秒を30サイクル
LL−OVAからのOVAは社内で開発したOVA特異的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
マウス
BALB/cマウス(6から8週齢)は、Charles River Laboratories(Calco, Italy)から購入する。マウスは、特定病原体未感染の状態で維持する。
水酸化アルミニウム(ミョウバン)2mg中のOVA(グレードV;Sigma-Aldrich)2μgをマウスにi.p.免疫する。この免疫は、10日感覚で繰り返す(0日および10日)。対照マウスは、OVA/ミョウバン溶液の代わりに生理食塩水の注射を受ける。免疫の7日後に、感作されたマウスは、3%OVAのエアロゾル化PBS溶液を10分間吸入する。OVAの吸入は、3日連続で行う(18日、19日および20日)。対照マウスは実験群に使用するものと同じ条件でPBS単独を吸入する。
単独またはIL−10(1または10μg)もしくはLL−IL10と組み合わせたLL−OVA、LL−IL10単独、IL−10単独(1または10μg)、LL−pT1NX、または水(非補給対照)の投与をマウスに受けさせる。予防の設定では、二つの異なる方式の間の最初のi.p免疫の前にマウスを補給する。補給方式1および2は、5日間の毎日投与と2日間の非投与が交互になったそれぞれ4および6サイクルからなる。経口寛容誘導のための陽性対照として、胃内カテーテルによる最初の免疫(合計5回の補給)の10から2日前まで1日おきにOVAの1mg(低用量)または30mg(高用量)をマウスに補給し、その補給は気管支好酸球および気道反応性亢進を減少させ、高用量補給の方が低用量補給よりも有効である。
最後の吸入(21日目)の24h後に、メタコリン誘導性気流閉塞により気道反応性亢進を評価する。噴霧した生理食塩水(Otsuka Pharmaceutical)にマウスを2.5min曝露し、続いて漸増する用量(1〜30mg/ml)の噴霧したメタコリンに曝露する。噴霧後にこれらのマウスを体プレチスモグラフに2.5min入れ、Biosystem XA WBPシステム(Buxco Electronics)を使用してPenh(enhanced pause)を測定する。「Penh」は肺気流閉塞を表し、次式を使用して計算される:Penh=((Te−Tr)/(Tr×PEF/PIF))[ここで、Penh=enhanced pause(無次元)、Te=呼気時間(秒)、Tr=緩和時間(秒)、PEF=最大呼気流量(ミリリットル/秒)、およびPIF=最大吸気流量(ミリリットル/秒)である]。ほぼ5秒毎にPenhを測定し、平均し、累積値を各時点についてのPenhの値として平均する。気道反応性亢進はPC200Mch(メタコリン誘発濃度200%)として表現し、これは、ベースラインのPenh値を2倍にしたメタコリン濃度である。
気道反応性亢進の測定後に、気管支肺胞洗浄液試料を得る。100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンのi.p.注射によりマウスを麻酔し、それから生理食塩水0.5mlで4回肺を洗浄する。洗浄液を遠心分離し、1%BSAを有する生理食塩水1mlに細胞を再懸濁する。総細胞数は、血球計数器を使用して計数する。サイトスピン試料は、この懸濁液を300rpmで5分間遠心分離することによって調製する。好酸球を好中球とはっきりと識別するために、三つの異なる染色、すなわちDiff-Quick、メイ−グリュンワルト−ギムザ、およびハンセル(エオシン)染色を適用する。標準的な形態基準に基づき、少なくとも300個の白血球を光学顕微鏡により識別する。BALF中のIL−13、IL−4およびIL−5レベルは、製造業者の説明書通りにCytometric Bead Assay(BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)により検出する。
21日目に、麻酔下で眼窩後静脈叢(retro-orbital sinus)から血液試料を得る。試料が完全に凝固した後で、試料を遠心分離し、血清を収集し、使用まで−80℃で保存する。総IgEは、ペアAb(BD Pharmingen)を使用して製造業者の説明書通りにELISAによりアッセイする。血清中のOVA特異的IgE、IgG1およびIgG2aを測定するために、マイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc, VWR International, Haasrode, Belgium)を2μg/ml OVAでコーティングする。その後、ウェルをPBS中の0.1%カゼインで遮断し、その後、ヤギ抗マウスIgG2a−HRP[Southern Biotechnology Associates (SBA), Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen, Belgium、1:5000希釈]、ヤギ抗マウスIgG1−HRP、またはヤギ抗マウスIgE−HRP(SBA、1:5000希釈)と共に0.1%カゼインおよび0.05%Tween20を含むPBS(PBS−CT)で1:10から1:20480希釈したマウス血清試料と共に、そのプレートをインキュベーションする。洗浄後、基質[3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基質試薬、Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]を各ウェルに加える。最後に、ウェルに1M H2SO4を加えることによって反応を停止させる。450nmで吸光度を読み取る。ELISAスコアは、計算されたカットオフ値よりも高いOD450をまだ有した最高希釈の逆数である力価として表現する。カットオフは、5匹の非免疫マウスの平均OD450にSDの3倍を加えたものとして計算する。
肺胞洗浄液試料を得た後に、生理食塩水で肺を潅流し、マウスから切除する。この肺を中和緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。切片(厚さ3μm)をH&Eまたは過ヨウ素酸−シッフ(PAS)で染色する。肺における組織学的変化の強度は、1)上皮剥離または気管支上皮細胞核の凹凸、2)杯細胞数の増加、3)血管から気管支および気管支周囲間質の粘膜および粘膜下領域への炎症細胞の浸潤、ならびに4)平滑筋細胞層の肥大および肥厚という所見の分布および強度にしたがって、四つの等級スコア(0:炎症なし、1:微弱/軽度、2:中度、および3:重度)で評価する。
生理食塩水で潅流後に肺を取り出し、製造業者の説明書通りにISOGEN(Nippon Gene)を使用して総RNAを抽出する。総RNA(10μg)は、オリゴ(dT)15プライマー(Promega)およびSuperscript II Rnase H逆転写酵素(Invitrogen Life Technologies)を使用して42℃で2時間逆転写する。各試料が同量のcDNAを含んでいたことを確認するために、β−アクチン特異的プライマーを使用して各試料のβ−アクチンcDNA濃度を最初に判定する。適切なサイクル数の間増幅させることによって、これらの試料はPCR産物の量が増幅曲線の直線部に残った。PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム染色により視覚化した。以下の特異的プライマーセットを使用してIL−13、エオタキシン、IL−10、IFN−γおよびTGF−βのレベルを判定する。
βアクチンについてのセンスプライマー
アンチセンスプライマー
アンチセンス
アンチセンスプライマー
アンチセンス
アンチセンス
アンチセンス
最後の吸入(第21日)の1日後に、細胞に70μmフィルター細胞ストレーナー(Becton/Dickinson Labware)を通過させることにより、脾臓および縦隔リンパ節の単細胞懸濁液を調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることにより脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。それぞれCD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)またはCD4+CD25+調節性T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)、およびMACSカラム(midiMACS; Miltenyi Biotec)を使用して、CD4+T細胞およびCD4+CD25-T細胞を濃縮する。
最後の吸入(第21日)の1日後に、処置マウスの脾臓を0.1%コラゲナーゼ(Sigma-Aldrich)を用いて37℃で20分間消化する。一部の実験では、全脾臓細胞の単細胞懸濁液を調製し、ConA(2μg/ml; Sigma-Aldrich)と共に48h培養する。細胞を収集し、107個をナイーブBALB/cマウスにi.v.で養子移入する。負の選択のために、ビオチン化抗マウスCD4、CD8、CD11c、CD19およびCD11b mAb(BD Pharmingen)を有する磁気ビーズ(MACS; Miltenyi Biotec)を製造業者の説明書通りに使用して、全脾臓細胞からCD4+、CD8+、CD11C+、CD19+またはCD11b+細胞を枯渇させる。枯渇の効率は、フローサイトメトリーにより調べる(>99%)。CD4+T細胞単離キット、調節性T細胞単離キットを製造業者の説明書通りに使用してCD4+細胞、CD4+CD25-細胞を精製する。正の選択をされた細胞の純度は、フローサイトメトリーを使用してチェックする。細胞移入実験のために、OVA/ミョウバンを用いたそれらの最初の免疫の直前またはそれらの2回目の免疫の直後にBALB/cマウスに尾静脈から細胞を移入する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、または正の選択をされたCD4+細胞およびCD4+CD25-細胞について107個である。
このモデルでは、屋内塵性ダニ(HDM)アレルゲンであるDer p1に対するアレルギー性免疫反応を研究することができる。HDMアレルギー患者からのPBMCを用いてi.p.再構成し、続いてHDMエアロゾルに曝露した当該hu−SCIDマウスはヒトIgEを産生し、活性化T細胞およびDCを含む肺浸潤液を発生し、気管支収縮剤に反応してAHRを示す(Pestel et al. 1994, J Immunol, 153:3804; Duez et al., Am J Respir Crit Care Med, vol 161 , ppp 200-206, 2000)。
この研究にわたりL.lactis MG1363株を使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロール中に入れて−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。これらは16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mLの飽和密度に達した。細菌を遠心分離により採集し、BM9培地に入れて10倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液100μLの投与を毎日受ける。
222アミノ酸残基の球状糖タンパク質であるDer p1は、Dermatophagoides pteronyssinus(Dpt)ダニ由来の主要アレルギンの一つである。Der p1タンパク質をコードしている、最適のL.lactisコドン利用を有するDNA配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスP1プロモーター下流でエリスロマイシン耐性pT1NXベクターのUsp45分泌シグナルに融合させる。マウスIL−10、Der p1、Der p1 aa52−71およびDer p1 aa117−133 cDNAを保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたMG1363株は、LL−IL10、LL−Derp1、LL−Derp1 aa52−71、およびLL− Derp1 aa117−133と呼ぶ。空のベクターpT1NXを有するMG1363であるLL−pT1NXは対照として役立つ。
LL−Derp1由来のDer p1は、社内で開発したDer p1特異的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
血液は、屋内塵性ダニに感受性または非感受性のドナーから収集する。アレルギー患者は、屋内塵性ダニ感作の通常の特徴を提示する。Dermatophagoides pteronyssinus(Dpt)アレルゲンに関する皮膚穿刺試験(Stallergenes, Fresnes, France)(直径≧10mm)は陽性であり、全ての患者は血清中特異的IgE抗体を有する。総IgE濃度は150IU/ml(150〜1600IU/ml)を超える。健康なドナーは陰性対照として試験する(合計IgEレベルは150IU/ml未満であり、彼らは通常に吸入されたアレルギンに関して陰性の皮膚穿刺試験を有する)。
遠心分離(120×g、15分間)後に血小板に富む血漿を得て、捨てる。それから血球をRPMI1640(Life Technologies, Paisley, Scotland)(vol/vol)で希釈し、Ficoll勾配(Pharmacia, Uppsala, Sweden)の上に重層する。遠心分離(400×g、30分間)後に、界面でPBMCを採集し、滅菌RPMI培地で3回洗浄してから移し替える。
C.B.−17 SCIDマウス(6〜8週齢)を、特定動物施設の中で無菌床敷を有する隔離飼育器で維持する。ELISAによりマウス血清免疫グロブリンの不在についてSCIDコロニーを定期的にチェックする。
SCIDマウスは、細胞移入時に6から8週齢である。アレルギー患者または健康ドナーからの単核細胞10×106個をRPMI 400μlに入れたものを23ゲージの針を通して腹腔内注射することにより、マウスを再構成する。同じ日に、これらのマウスに2反応性指数[IR]ユニットのDptの投与を腹腔内に受けさせる。細胞の再構成の4日後に、100IRユニットのDpt(100IRユニットはDpt抽出物に含まれるタンパク質約200μgに等しい)を含むアレルゲンエアロゾルにSCIDマウスを連続4日間毎日曝露する(第0日から第4日)。対照群はDptに曝露しない。気道反応性の測定(第35日および第60日)の1日前に、100IRユニットのDpt溶液の別のエアロゾルにhu−SCIDマウスを曝露する。
Der p1または陰性対照として無関係の抗原(OVA)を発現するように操作されたL.lactisを、LL−IL10またはIL−10タンパク質(1または10μg)と組み合わせるか、または組み合わせずにマウスに投与を受けさせる。
操作されたL.lactis細菌は、PBMC再構成の1日後に開始して、異なる処置間隔および用量を使用して胃内カテーテルを使用してSCIDマウスに経口投与する。経口寛容の誘導は、ヒト血清IgE抗体の測定、肺浸潤の分析、AHRの測定、ならびにBALF中の細胞集団およびサイトカイン産生の分析により評価する。さらに、寛容の誘導は、Der p1に対する増殖T細胞反応の分析により評価する。
気道反応性(肺抵抗に50%の増加を引き起こすカルバコールの誘発用量として表現)は、Duezら(2000)により記載されたように第35日または第60日に測定する。
ヒト細胞の移植の数日後に、エーテル麻酔下でマウスの眼窩後静脈叢から採血する。ε鎖に特異的な二つの異なるマウスmAb(Immunotech International, Luminy, France)を使用して二部位免疫放射定量法によりヒトIgEを研究する。少なくとも20μlの血清を2回繰り返しの試験に使用する。方法の感度は、0.1IUiml(0.24ng/ml)の検出を許す。
肺を35日目に切除し、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋用に加工する。パラフィン組織切片は、ヒトCD45+細胞の検出用に染色し、その後、マウス肺切片上のヒト細胞は、Duezら(2000)に記載されたように組織スコア付けにより定量した。
OVAアレルゲンモデルに記載したようにBALFを分析する。
脾臓の単細胞懸濁液は、細胞に70μmのフィルター細胞ストレーナー(Becton/Dickinson Labware)を通過させることによって調製する。赤血球は、赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることによって脾臓細胞懸濁液から除去する。CD4+T細胞およびCD4+CD25-T細胞は、それぞれヒトCD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)またはヒトCD4+CD25+調節性T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)、およびMACSカラム(midiMACS; Miltenyi Biotec)を使用して濃縮する。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。LL−IL−10の添加はOVA/Derp1への寛容誘導を有意に高める。それは、対照群およびLL−OVA/Derp1群に比べてLL−OVA/Derp1+LL−mIL−10群において脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応が有意に減少するからである。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。前記因子に反応したAHR、好酸球のBALF浸潤、IgE力価、およびサイトカイン産生を判定する。LL−OVA/Derp1+LL−mIL−10群では、対照およびLL−OVA/Derp1群に比べてAHR、好酸球BALF浸潤、IgE力価は大きく減少し、IL−13、IL−4およびIL−5は有意に低下する。
CD4 T細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるようにアレルゲン特異的CD4+T細胞増殖を判定する。LL−OVA/Derp1+LL−mIL−10群におけるアレルゲン特異的CD4 T細胞反応は、対照群およびLL−OVA/Derp1群に比べて有意に減少する。
LL−IL10がIL−10と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。LL−OVA/Derp1+LL−mIL−10群におけるアレルゲン特異的CD4 T細胞反応は、LL−OVA/Derp1+IL−10群に比べて有意に減少している。
経口寛容プロトコールで処置されたマウスにおける喘息様反応の能動的な抑制について試験するために、上記(in vivo T調節性活性アッセイ)の異なる処置群由来の脾臓細胞を養子移入する。対照群およびLL−OVA群と比べて、喘息様反応は、LL−OVA+LL−mIL10群において有意に減少しており、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性CD4+T細胞の活性化を示している。
緒言
セリアックスプルーまたはグルテン過敏性腸症としても知られているセリアック病は、グルテンを含む特定の食用穀類に対する免疫反応を発生する慢性炎症性疾患である。セリアックは、ヒト白血球抗原変異体HLA−DQ2またはHLA−DQ8をコードする遺伝子と強く関連する複合多遺伝子障害である。セリアックの病因の最も重要な局面の一つは、Tヘルパー1型免疫反応の活性化である。これは、HLA−DQ2/DQ8分子を発現する抗原提示細胞がCD4(+)T細胞に毒性グルテンペプチドを提示するときに生じる。グリアジンおよびグルテニンという両方のクラスのグルテンタンパク質は、DQ2およびDQ8と結合するペプチドを含む。セリアック病患者の小腸においてグルテン特異的T細胞からのIFN−γ産生などの免疫反応が、粘膜の破壊をトリガーすることが一般に受け入れられている。したがって、セリアック病患者の腸における有害な免疫T細胞反応の活性化は、この疾患の開始および進行に重要と思われる。
細菌
この研究全体にわたりL.lactisMG1363株を使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)中で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロール中で−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。それらは、16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mLの飽和密度に達した。遠心分離により細菌を採集し、BM9培地に入れて10倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液の100μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。
α−グリアジンタンパク質をコードしている、最適なL.lactisコドン利用を有するDNA配列(Triticum aestivumの配列AJ133612に基づく)、HLA−DQ8(UniProtKB/TrEMBLエントリーQ9M4L6の残基203〜220の配列
LL−HLA/DQ8およびLL−HLA/DQ8d由来のHLA−DQ8およびHLA−DQ8dは、社内で開発したELISAを使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
HLA−DQ8トランスジェニックマウス(Senger et al. 2003)は、無グルテン食で特定病原体未感染の状態で維持し、8〜14週齢で使用する。CFA(Difco; BD)50μl中の粗グルテン(Sigma-Aldrich)50μgを足底内注射によりマウスに免疫する。
寛容化実験のために、免疫の前後に、異なる処置間隔および用量を使用してLL−HLA/DQ8、LL−HLA/DQ8dを単独またはIL−10(1または10μg)もしくはLL−IL10と組み合わせたもの、LL−IL10単独、IL−10単独(1または10μg)、LL−pT1NX、または水(無補給対照)を投与する。経口寛容誘導のための陽性対照として、免疫(第0日)前の第−7、−6、−5、−4日に、保存溶液から水に溶解させた小麦グリアジンまたはリコンビナントα−グリアジンの50mg用量をマウスに補給する。
粗グリアジン(Sigma-Aldrich)をメタノールに10mg/mlで再懸濁し、それから1μg/mlの濃度で無水エタノールに希釈する。1μg/mlグリアジンのエタノール溶液100μlをImmulon2プレート(Fisher Scientific International Inc.)の各ウェルに入れ、それからフードの下で乾燥させる。それから、プレートを4%BSA/PBSで37℃で2時間遮断する。プレートを1×PBS、0.05%Tween20で洗浄する。試料血清は、0.1%BSA/PBSに1:200、1:400および1:800希釈し、37℃で1時間インキュベーションする。検出抗体は、Accurate Chemical & Scientific Corp.からのビオチン化ラット抗マウスIgAおよびJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.からのビオチン化抗マウスIgGである。酵素コンジュゲートはストレプトアビジン−HRPであり、基質はTMBである。
脾臓および縦隔リンパ節の単細胞懸濁液は、細胞に70μmフィルター細胞ストレーナー(Becton/Dickinson Labware)を通過させることにより調製する。赤血球は赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることにより脾臓細胞懸濁液から除去する。それぞれCD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)またはCD4+CD25+調節性T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)およびMACSカラム(midiMACS; Miltenyi Biotec)を使用して、CD4+T細胞およびCD4+CD25-T細胞を濃縮する。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(経口寛容の誘導)のようにマウスに経口補給する。LL−IL−10の添加は、HLA−DQ8dへの寛容誘導を有意に高める。それは、LL−HLA/DQ8d+LL−mIL−10群における脾臓細胞のHLA−DQ8d特異的増殖反応が、対照群およびLL−HLA/DQ8d群に比べて有意に減少するからである。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(経口寛容の誘導)のようにマウスに経口補給する。HLA−DQ8dに反応したサイトカイン産生は、上記(細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ)のように定量する。脾臓細胞およびリンパ節において、LL−HLA/DQ8d+LL−mIL−10群における炎症性サイトカインIFN−γの産生は、対照群およびLL−HLA/DQ8d群に比べて強く減少する。
CD4 T細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるDQ8特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。したがって、上記(経口寛容の誘導)のようにマウスに経口補給し、DQ8特異的CD4+T細胞の増殖は「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるように判定する。LL−HLA/DQ8d+LL−mIL−10群におけるDQ8特異的CD4 T細胞反応は、対照群およびLL−HLA/DQ8d群に比べて有意に減少する。
LL−IL10がIL−10と同様に有効かどうかを評価するために、上記(経口寛容の誘導)のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるDQ8特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。LL−HLA/DQ8d+LL−mIL−10群におけるDQ8特異的CD4 T細胞反応は、LL−HLA/DQ8d+IL−10群に比べて有意に減少する。
食物アレルギーは、人口の約2%から5%を苦しめる疾患である。ヒトでは、高いIgE抗体およびIL−4産生抗原特異的Tリンパ球の存在はTh2偏向メカニズムを示唆する。
細菌およびプラスミド
L.lactis MG1363株をこの研究にわたり使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロールに入れて−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。それらは、16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mLの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、BM9培地に入れて10倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液の100μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。ウシβ−ラクトグロブリンcDNAを増幅させ、ラクトコッカスP1プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性pT1NXベクターのUsp45分泌シグナルに融合させる。マウスIL−10またはBLGを保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたMG1363株は、LL−IL10およびLL−BLGと呼ぶ。空のベクターpT1NXを含むMG1363であるLL−pT1NXは対照として役立つ。
LL−BLG由来のBLGは、社内で開発したBLG特異的酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)およびウエスタンブロット分析を使用して判定する。
L.lactisの防御効果を探求するために使用する食物アレルギーのマウスモデルは、Frossardら(J Allergy Clin Immunol 113:958-964, 2004)に記載された食物誘導IgE型反応のマウスモデルである。マウスは、LL−IL10またはリコンビナントIL−10(1または10μg)と組み合わせてまたは組み合わせずに、LL−BLGまたは陰性対照として無関係の抗原(OVA)の投与を受ける。寛容誘導の陽性対照として、飲料水に入れた高用量のBLGの投与をマウスに受けさせ、その飲料水はBLGの経口チャレンジの際のアナフィラキシーからマウスを予防する。
0.2mol/L NaHCO3中のBLG(Sigma)20mgおよびList Biological Laboratoriesから購入したCTX 10μgを、第0、7、14および21日目に5週齢雌性C3H/HeOuJマウス(Charles River)に胃管栄養により免疫する。陽性対照群(寛容化マウス)は飲料水に入れた0.8mg/mL BLGを4週間自由に与えられる。与えるタンパク質の合計量(22.4mg)は感作されたマウスに投与されたBLGの合計量と類似している。この寛容化手順が永続的に末梢性免疫系もまた活性化し、粘膜免疫系だけを活性化するわけではないことを実証するために、ミョウバン1mgに吸着させたBLG 80μgを寛容化マウスの群に第28日および第42日に2回注射する。
第28日に、0.2mol NaHCO3 0.4ml中のBLG 100mgを用いて全てのマウスを胃内強制投与によりチャレンジする。アナフィラキシーを観察し、他(Frosssard et al., 2001)に詳細に記載された反応スコア(0:無反応〜3:重度の反応または死亡)を使用することにより等級分けする。中核体温は、チャレンジ前および強制投与の30分後に耳で赤外線により測定する。動物を屠殺し、心穿刺により血液をEDTA含有試験管に収集し、市販のELISAキット(Immunotech, Marseille, France)によるヒスタミン測定のために血漿を得る。
脾臓、腸間膜リンパ節およびPPの単細胞懸濁液は、Frossardら(2004)により記載されたように調製する。CD4+T細胞およびCD4+CD25-T細胞は、それぞれCD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)またはCD4+CD25+調節性T細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Germany)およびMACSカラム(midiMACS; Miltenyi Biotec)を使用して濃縮する。
マウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、異なる実験のL.Lactis処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製CD4+T細胞、CD4+CD25-T細胞またはCD4+CD25+T細胞をナイーブC3H/HeOuJマウスに養子移入する。未処置マウスは対照として使用する。移入した細胞数は、全脾臓細胞、亜集団を枯渇させた脾臓細胞、または正の選択をされたCD4+細胞ならびにCD4+CD25-T細胞およびCD4+CD25+T細胞について107個である。Tregが関係しているならば、BLG抗原を用いたこれらのマウスのその後のチャレンジは、BLGに対する体液性免疫反応およびアナフィラキシーの誘導を予防するはずである。
第0、7、14、21および28日目の尾採血から血清を得る。同時に便を得て、ペプスタチン1:1000(Fluka)を0.1mg/mL補充したPBS+1%FCS(Life technologies)に再懸濁する。試料を機械的に脱凝集させ、2分間ボルテックス処理し、続いて14000rpmで4℃で20分間、2回の遠心分離を行う。
腸管からパイエル板を機械的に切除し、5mmol EDTA(Life Technologies)を補充したHBSS培地中で30分間インキュベーションする。同様に、Peyer板および腸間膜リンパ節を穏やかに破砕し、70μmのナイロンフィルターを通して濾過する。脾臓細胞は、トリス緩衝NH4Cl中で5分間予備インキュベーションして赤血球を除去する。リンパ芽球は、Percollの60%/66%勾配(Amersham)で単離する。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。LL−IL−10の添加はBLGへの寛容誘導を有意に高める。それは、LL−BLG+LL−mIL−10群における脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応は対照群およびLL−BLG群に比べて有意に減少するからである。
経口寛容の誘導を研究するために、上記のようにマウスを経口補給する(実験の設定)。BLG特異的抗体反応および前記因子に反応したサイトカイン産生は上記のように判定する。LL−BLG+LL−mIL−10群におけるBLG特異的抗体レベルおよびIL−4は、対照群およびLL−BLG群に比べて有意に低下する。
CD4 T細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるようにアレルゲン特異的CD4+T細胞増殖を判定する。LL−BLG+LL−mIL−10群におけるアレルゲン特異的CD4 T細胞反応は、対照群およびLL−BLG群に比べて有意に減少する。
LL−IL10がIL−10と同様に有効かどうかを評価するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。LL−BLG+LL−mIL−10群におけるアレルゲン特異的CD4 T細胞反応は、LL−BLG+IL−10群に比べて有意に減少する。
経口寛容プロトコールで処置したマウスにおけるアレルギー様反応の能動的な抑制について試験するために、上記(in vivo T調節性活性アッセイ)の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する。LL−BLG+LL−mIL−10群におけるアレルギー様反応は、対照群およびLL−BLG群に比べて有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性CD4+T細胞の活性化を示している。
緒言
自己免疫は、自発性の炎症性組織損傷およびセルフ抗原に対する寛容の欠如に起因する生理学的機能不全を特徴とする。自己免疫は、部分的に活動しすぎる免疫系と関連し、その免疫系は、過剰のTヘルパー(Th)細胞を特徴とする。感受性遺伝子などの素因および環境因子は影響することが困難であるため、免疫療法を開発する近年の努力は、病原性エフェクター細胞を枯渇させ、かつ/または免疫調節性T細胞を高めることにより、前者細胞と後者細胞との間の機能的均衡を再樹立することに向けられている。膵島β細胞の自己免疫性破壊は、1型糖尿病(T1D)の主要な原因である。この破壊は、いくつかのβ細胞自己抗原に対する細胞性および体液性免疫反応と関連し、両方の免疫反応が疾患の臨床的発症に先行することがある。
細菌およびプラスミド
この研究全体にわたりL.lactis MG1363株を使用する。細菌は、GM17培地、すなわち0.5%グルコースを補充したM17(Difco Laboratories, Detroit, MI)で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、GM17中の50%グリセロールに入れて−20℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮GM17で200倍に希釈し、30℃でインキュベーションする。それらは、16時間以内に2×109コロニー形成単位(CFU)/mLの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、BM9培地に入れて10倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液100μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。ヒトプロインスリンII B24−C36ペプチド(hpIIp)、ブタインスリンおよび免疫優性ペプチドInsB9-23(B9-23は、ヒト、ラットおよびマウスという多種にわたり本質的に同一である)をコードしている、最適のL.lactisコドン利用を有するDNA配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスP1プロモーターの下流で、エリスロマイシン耐性pT1NXベクターのUsp45分泌シグナルに融合させる。
雌性および雄性非肥満糖尿病(NOD)マウスおよびNOD−重症複合免疫不全(SCID)(Balb/cバックグラウンド)マウスは、Jackson laboratoryから購入する。Balb/c野生型(WT)マウスは、Charles River Italyから購入する。マウスは、特定病原体を除去した中央動物施設で維持する。施設のガイドラインに沿ってマウスを処置および使用する。
予防の設定では、LL−hpIIp、LL−insulin、LL−InsB9-23を単独で、またはLL−IL10またはリコンビナントマウスIL−10(1〜10μg)と共に、21日齢(離乳)から開始して、最適な補給方式を使用して、または(大部分のマウスが糖尿病を発生する)100日齢までNODマウスに経口投与する。加えて、LL−pT1NXを陰性対照として経口投与する。陽性(寛容化)対照群について、3週齢のNODマウスをヒトインスリン0.8mgで週3回2または4週間経口処置する。糖尿病の発生は、週3回および血中グルコースレベルの糖尿モニタリングの場合に、尿グルコースレベルの連続モニタリングにより判定する。12〜23週および実験の終了時(35週)に膵臓を収集し、連続切片をヘマトキシリン/エオシンで染色し、単核細胞の浸潤を評点するか、または免疫組織化学によりT細胞の浸潤を分析する。治療の設定では、LL−hpIIp、LL−insulin、LL−InsB9-23を、単独またはLL−IL10もしくはリコンビナントマウスIL−10と共に、安定した糖尿および高血糖を示している糖尿病NOD雌に経口投与する(12〜23週)。加えて、陰性対照としてLL−pT1NXを経口投与する。陽性(寛容化)対照群について、Bressonら(2006)に記載されたように糖尿病NODマウスを処置する。完全寛解は、糖尿の消失および正常血糖への復帰と定義する。
グルコースのモニタリング:尿グルコースはDiastix(Miles)により測定し、血中グルコースモニタリングシステムOneTouch Ultra(LifeScan Inc.)を用いた血中グルコース測定により確認する。糖尿病は、250mg/dlを超える2回の連続する血中グルコース値として定義する。
膵臓β細胞におけるインスリン、CD4およびCD8の発現を検出するために、一次Ab(Dakoからのモルモット抗ブタインスリン[希釈1:300]、抗CD4 RM4.5、およびBD Biosciencesからの抗CD8a IHC[希釈1:50])を、Christenら(2004)に記載されたように凍結組織切片に適用する。
脾臓、腸間膜LN(MLN)およびPLNの単細胞懸濁液を調製する。総脾臓細胞集団の増殖アッセイ、2×105個の細胞は、完全培地単独あるいは段階濃度(1〜100μg/ml)の精製ヒトインスリンまたはCD4 T細胞もしくはCD8 T細胞に特異的なペプチド(それぞれInsB9-23(H−2dまたはH−2g拘束性)およびInsB15-23(Kd拘束性))(Sigma)の存在下で、かつ抗IL−10または抗TGF−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積200μlの完全培地に入れて、96ウェルU底プレート中で培養する。中和抗体は、1、0.1および0.01μg/mlで加える。総CD3+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞およびCD4+CD25-T細胞集団の増殖アッセイのために、0.2×105個のT細胞は、インスリンまたはGAD65またはCD4+T細胞もしくはCD8+T細胞に特異的なペプチドをロードされたWT Balb/cマウスからの照射した脾臓細胞1×105個と共に、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積200μl完全培地に入れて96ウェルU底プレート中で培養する。37℃の5%CO2加湿インキュベーター中で72hr後に、1μCi/ウェルの[3H]チミジンの添加により増殖を評価する。DNAに結合した放射能を16〜18hr後にガラス繊維製フィルターマット(Perkin Elmer, Boston, USA)上に採集し、シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)でチミジンの取込みを測定する。T細胞は、CD3+、CD4+またはCD8+単離キット(MACS; Milteny Biotec, Auburn, CA)を使用した磁気ビーズ分離による負の選択によりPLNまたは脾臓から精製する。CD4+T細胞は、総細胞として使用するか、またはCD25+単離キット(Milteny Biotec)を使用したMACSによりCD25+およびCD25-にさらに分離する。細胞集団の純度(>90%)は、フローサイトメトリー分析により判定する。
最近糖尿病になった雌性NOD(8〜12週)から単離した精製総脾臓CD4+CD25-T細胞2×104個は、WT Balb/cマウス由来の、T細胞を枯渇され、放射線照射され、インスリンまたはペプチドをロードされた脾臓細胞2×104個の存在下で、異なる実験群からの脾臓、MLNまたはPLNから単離した様々な数のCD8+T細胞集団、CD4+T細胞集団およびCD4+CD25-T細胞集団と共に、共培養する。37℃の5%CO2加湿インキュベーター中で72hr後に、1μCi/ウェルの[3H]チミジンの添加により増殖を評価する。DNAに結合した放射能を、16〜18hr後にガラス繊維製フィルターマット(Perkin Elmer, Boston, USA)上に採集し、シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)でチミジンの取込みを測定する。
使用するリンパ芽球ターゲットは、Balb/cマウスからのConA活性化脾臓細胞である。合計106個のターゲット細胞を100μCiの51Cr(Amersham International, Buckinghamshire, U.K)で37℃で90minラベルし、3回洗浄し、それから1μg/mlのペプチド(InsB15-23または無関係のペプチド)と共に37℃で1hインキュベーションする。ターゲット細胞を2回洗浄し、104個/ウェルで蒔く。脾臓、MLNおよびPLNから単離したCD8+T細胞を各ウェルに3回の繰り返しで様々なエフェクター:ターゲット(E:T)比で加える。プレートを500rpmで2min遠心分離し、37℃で4hインキュベーションする。インキュベーション後に、51Crの放出[%溶解=100×(試験cpm−自発cpm)/(総cpm−自発cpm)]の判定のために上清を収集する。間接的殺滅アッセイのために、CD8+T細胞は、エフェクターと共にインキュベーションする前に5μg/ml抗CD3抗体(クローン145−2C11、Pharmingen)と共にインキュベーションする。
8〜10wkのNOD−SCIDマウスに、糖尿病雌性NODマウス(6週、12週および18週)から単離した脾臓細胞2×107個をi.v.で、または5×106個をi.p.で、異なるL.lactis処置実験群から単離した、段階数のビーズ精製CD3+T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、CD4+CD25-T細胞、またはCD4+CD25+T細胞と組み合わせて、または組み合わせずに注射する。未処置マウスを対照として用いる。糖尿病の発症を週に3回、血中グルコースレベルの連続モニタリングにより決定する。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。LL−hpIIp/insulin/InsB9-23+LL−mIL−10群における脾臓細胞の自己抗原特異的増殖反応は、対照群およびLL−hpIIp/insulin/InsB9-23群に比べて有意に減少することから、LL−IL10の添加は、自己抗原への寛容誘導を有意に高める。
経口寛容の誘導を研究するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。膵島炎の存在、β細胞破壊速度、および前記自己抗原に対するサイトカイン産生は、上記のように判定する。組織学的分析は、対照群およびLL−hpIIp/insulin/InsB9-23群に比べてLL−hpIIp/insulin/InsB9-23+LL−mIL−10群において有意に低度の膵島炎およびβ細胞破壊、ならびにIL−10産生増加を示す。
CD4 T細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節における自己抗原特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給し、自己抗原特異的CD4+T細胞増殖を上記(in vitro増殖アッセイ)の様に判定する。対照群およびLL−hpIIp/insulin/InsB9-23群に比べたLL−hpIIp/insulin/InsB9-23+LL−mIL−10群における自己抗原特異的CD4 T細胞反応。
LL−IL10がIL−10と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記(実験の設定)のようにマウスに経口補給する。脾臓およびリンパ節における自己抗原特異的増殖性CD4 T細胞反応を研究する。LL−hpIIp/insulin/InsB9-23+IL−10群に比べたLL−hpIIp/insulin/InsB9-23+LL−mIL−10群における自己抗原特異的CD4 T細胞反応。
本発明者らの組み合わせアプローチが、バイスタンダー抑制メカニズムにより糖尿病をモデュレーションすることができる抑制性CD4+T細胞を誘導するかどうかを調べるために、CD8+自己攻撃性T細胞が受ける効果を分析する。抗原特異的自己攻撃性CD8+T細胞の率および/または活性は、組み合わせ治療後に強く減少する。
経口寛容プロトコールで処置したマウスにおける糖尿病様反応の能動的抑制を試験するために、上記のように異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する(糖尿病の養子移入)。対照およびLL−InsB9-23群に比べて、LL−InsB9-23+LL−mIL−10群では、糖尿病様反応は有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性CD4+T細胞の活性化を示している。
Claims (22)
- 哺乳動物において免疫寛容を誘導するためまたは抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患を処置するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルを調製するための、抗原と組み合わせたIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)の使用であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原であり、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である、使用。
- 抗原が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギーまたはセリアック病の誘導に関与する、請求項1記載の使用。
- 直腸デリバリー、頬デリバリー、肺デリバリー、眼デリバリー、鼻デリバリー、膣デリバリーおよび経口デリバリーからなる群より選択される粘膜デリバリーのための、請求項1又は2記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、口中錠、ボーラス、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤またはトローチ剤によりデリバリーされる、請求項1から3のいずれか記載の使用。
- ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)である、請求項1から4のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項1から5のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、コレラ毒素Bサブユニットをさらに含む、請求項1から6のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、少なくとも10フェムトグラム/日から100mg/日の用量でデリバリーされる、請求項1から7のいずれか記載の使用。
- IL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)を抗原と組み合わせて含む、抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および/もしくは緩和するための組成物であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原である、組成物。
- ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)である、請求項9記載の組成物。
- 免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項9または10記載の組成物。
- コレラ毒素Bサブユニットをさらに含む、請求項10または11記載の組成物。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、少なくとも10フェムトグラムから100mgの用量で存在する、請求項10から12のいずれか記載の組成物。
- 抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および/もしくは緩和するための、または免疫寛容を誘導するための、少なくとも抗原をIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)と組み合わせて含む薬剤。
- 哺乳動物において抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および/もしくは緩和するための、または免疫寛容を誘導するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルを調製するための、組成物の使用であって、該組成物が、少なくともIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)および抗原を含むことを特徴とする使用であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原である、使用。
- 抗原が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギーまたはセリアック病の誘導に関与する、請求項15記載の使用。
- 直腸デリバリー、頬デリバリー、肺デリバリー、眼デリバリー、鼻デリバリー、膣デリバリーおよび経口デリバリーからなる群より選択される粘膜デリバリーのための、請求項15又は16記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、口中錠、ボーラス、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤またはトローチ剤によりデリバリーされる、請求項15から17のいずれか記載の使用。
- ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)である、請求項15から18のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項15から19のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、コレラ毒素Bサブユニットをさらに含む、請求項15から19のいずれか記載の使用。
- 抗原および/またはIL−10分泌ラクトコッカス(Lactococcus)が、少なくとも10フェムトグラム/日から100mg/日の用量でデリバリーされる、請求項15から21のいずれか記載の使用。
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