BRPI0619206A2 - indução de toleráncia de mucosa aos antìgenos - Google Patents

Abstract

INDUçãO DE TOLERáNCIA DE MUCOSA AOS ANTìGENOS. A presente invenção se refere à indução de tolerância aos antígenos, pela mucosa, preferivelmente por administração oral do antígeno em combinação com um microorganismo que produz um composto imunomodulador. Mais especificamente, a invenção se relaciona à indução de Foxp3^ +^ e/ou IL-10 e/ou TGF-<225>; produzindo as células T reguladoras, capazes de suprimir respostas imunes indesejadas para um antígeno, pela administração oral do dito antígeno em combinação com um microorganismo que produz uma citocina imunossupressora.

Description

INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA DE MUCOSA AOS ANTÍGENOS

A presente invenção se relaciona à indução de tolerância aos antígenos, pela mucosa, preferivelmente pela administração oral do antígeno em combinação com um microorganismo que produz um composto imunomodulador. Mais especificamente, a invenção se relaciona à indução de Foxp3+ e/ou IL-IO e/ou TGF-β; produzindo as células T reguladoras, capazes de suprimir respostas imunes indesejadas para um antígeno, pela administração oral do dito antígeno em combinação com um microorganismo que produz uma citocina imunossupressora.

CAMPO DA INVENÇÃO

O sistema imune tem a tarefa de distinguir entre o próprio e o não próprio. 0 sistema imune de mucosas presente ao longo dos tratos respiratórios gastrointestinal e genito-urinário possui uma carga adicional de coexistência com abundância de bactérias e antígenos inócuos, tais como nos alimentos, antígenos do ar ou flora bacteriana que convivem comensalmente. Uma característica chave do sistema imune de mucosas é sua capacidade de permanescer tolerante a estes antígenos ao reter a capacidade de repelir eficazmente os patogênios. A introdução do antígeno sistematicamente, se por injeção ou por ferimento, conduz a infiltração local de células inflamatória e da produção específica de imunoglobulina. Por outro lado, os antígenos introduzidos nas superfícies da mucosa, tais como os tratos gastrointestinal e genito- urinário, elicíam a inibição ativa da resposta imunitária àqueles antígenos sistematicamente. A indução específica destas respostas reguladas pela administração do antígeno através do intervalo gastrointestinal é conhecida como tolerância oral. A administração oral do antígeno pode conduzir a uma resposta não sistêmica e é uma alternativa atrativa às invenções médicas imunosupressiva que têm efeitos colaterais indesejáveis (tais como esteroídes). A invenção se fundamenta particularmente no campo da tolerância a baixa dosagem, obtida pela exposição repetida a baixas doses de antígeno. As induções da tolerância através da mucosa foram propostas como uma estratégia do tratamento contra as doenças auto-imunes, alérgicas e inflamatórias.

ESTADO DA TÉCNICA

Embora a tolerância oral fosse descrita primeiramente em 1911, somente após os anos 70 que os estudos começaram se dirigir aos mecanismos envolvidos (Mayer e Shao, 2004a). Diversos mecanismos foram propostos para o desenvolvimento da tolerância oral, variando da deleção das células T antiespecíficas, desvio imune excedente e indução de anergia à supressão por Tregs (Mucida et al., 2005). A maioria dos pesquisadores concorda que há duas maneiras distintas de obter a tolerância oral, a tolerância a doses elevadas, obtida após uma dose única elevada de antígeno que é baseada na energia e/ou na deleção (Friedman e Weinerf 1994), e a tolerância de baixa dosagem obtida pela exposição repetida a baixas doses de antígeno, mediada pela supressão ativa de respostas imunes por células T CD4+ , incluindo Foxp3+, IL-10 e/ou por TGF-β produzindo células T reguladoras. De modo importante, as células T reguladoras induzidas através da tolerância mucosal têm mostrado à supressão intermediária do tecido vizinho, um processo através das quais as células reguladoras específicas para uma proteína suprem a resposta das células causadora próximas a uma outra proteína. A supressão do tecido vizinho é uma característica importante da supressão do antígeno induzido porque o pool de antígenos que induzem a auto-imunidade a um órgão específico é bastante desconhecido, afastando o fenômeno de espalhamento de epítopos. O espalhamento de epítopos é uma complicação das doenças auto-imunes e alérgicas pelo qual inicia a resposta imunitária que se expande com tempo de incluir respostas a outros antígenos.

O papel de células dendríticas na indução da tolerância oral induziu aos estudos diretos que mostram a tolerância oral melhorada seguindo Flt3L-driven expasion of DC (Viney et al. 1998) e RANK-L-mediate DC activation (Williamson et al., 2002) in vivo. Particularmente, as células dendríticas imaturas podem mediar a tolerância, presumidamente pela indução de células T reguladoras. Além disso, IL-10 pode modular a função de células dendríticas imaturas e inibir sua diferenciação terminal, amplificando a presença local de tolerância das células dendríticas envolvidas na indução de células T reguladoras (De Smedt et de al. 1997).

A indução de tolerância de mucosa foi avaliada em numerosos modelos experimentais de doenças auto-imunes e alérgicas, mas os dados clínicos das experimentações em seres humanos foram de modo geral decepcionantes. Numerosas tentativas de entregar antígenos foram feitas, se ou não em combinação com um composto imunomodulador, com objetivo de conseguir uma tolerância oral, mas o efeito na maioria dos casos não foi significativo. Em nenhum momento, os resultados não foram suficientes para que os métodos fossem traduzidos aos seres humanos. 0 problema principal em todas estas experiências é que nenhuma supressão ativa está sendo observada com a indução de células T CD4+ e a produção subseqüente de células T reguladoras específicas do antígeno. Somente, foi observado que uma supressão ativa e verdadeira de resposta imunitária aos antígenos pode ser obtida nos seres humanos.

A entrega mais eficiente e rotulada de moléculas para aplicações terapêuticas e profiláticas é uma prioridade para a indústria farmacêutica. As estratégias eficazes devem reduzir a dose requerida, aumentar a segurança e melhorar a eficácia focalizando moléculas no local desejado da ação. As rotas da mucosa da entrega da droga e da vacina oferecem um número de vantagens logísticas e biológicas comparadas com a injeção. A administração oral é particularmente atrativa e em conseqüência facilita a administração. Entretanto, a degradação gastrointestinal e os baixos níveis de absorção rendem geralmente esta rota do peptídeo e a ineficácia da entrega da droga-proteína. As rotas da mucosa alternativas tais como as rotas nasal, retal, pulmonar e ocular também estão sendo investigadas. A administração por mucosa de proteína e pelos antígenos das vacinas de peptídeo geralmente estimula respostas imunes fracas e pode induzir a tolerância imunológica.

A administração pela mucosa de IL-4, TGF-β, IL-1O (Slavin et al. , 2001) e anti-IL-12 tendo sido hipotetizada para aumentar a tolerância. Interleukin-10 (IL-10) possui um papel crítico no desenvolvimento da tolerância de baixa dosagem (Slavin et al., 2001; Mauer et al., 2003). Mostrou- se que o tratamento em camundongos com proteína básica de mielina de baixa dosagem oral e IL-10 oral simultaneamente reduz a severidade e a incidência de encefalomielites auto- imune experimental, mas o efeito terapêutico é baixo e longe de ser suficiente e eficaz no ser humano. Nestas experiências a quantidade de IL-1 0 é alta (1 ug a 10 μg), mostrando que administrar doses mais altas é mais eficazes. Embora, um efeito supressivo fosse observado de 0,1 μg IL- 10 in vitro na proliferação, IL-I 2 e secreção IFN-γ, nenhum efeito de 0,1 μg IL-10 mais o tratamento MBP foi visto sob a doença. As mesmas experiências em camundongos foram feitas com administração oral de IL-10 combinado com baixa dosagem de glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG), que resultou em reicindência reduzidas em um modelo de rato MOG-induzido. Também aqui o efeito terapêutico é baixo e a quantidade alta de alimento IL-10, configura que usar doses elevadas é mais eficaz. Em ambas as experiências não há, ou é pelo menos insuficiente, a supressão ativa de uma resposta imunitária através de uma tolerância imunológica de longa duração eficaz em seres humanos. Particularmente, para confirmar um efeito terapêutico real, suficiente para ser traduzido aos seres humanos, uma indução do antígeno específico das células T CD4+ deve ser observada, finalmente tendo como resultado uma produção de células T reguladoras. Somente tal mecanismo poderá suprimir ativamente a resposta imunitária nos seres humanos. Em todos os exemplos acima mencionados nenhuma indução de células T CD4+ foi observada.

De modo geral concorda se que a microflora possui um papel na indução da tolerância oral (Moreau e Corthier, 1988; Gaboriau-Routhiau et al. , 2003). Di Giacinto et al. (2005) sugere que o probiótico pode induzir IL-IO e IL-IO- dependent TGF-β- mantendo células reguladoras. Entretanto, como este efeito exercido não está muito claro, e a simples presença de microorganismos no intestino não é suficiente (Rask et al. , 2005) . Além disso, embora os probióticos possam melhorar os sintomas da alergia e asma, os resultados não são sempre desambíguos e o uso do probiótico sozinho não é suficiente para induzir uma resposta de tolerância oral confiável. Diversas tentativas foram feitas para entregar antígenos de baixa dosagem via bactérias do ácido lático para impedir uma resposta imune alérgica (Daniel et al. , 2006) e que conduziu a redução do alergênico específico IgE e aumentou as respostas do alergênico específico IgA secretório. Embora um deslocamento desejado na avaliação da imunidade da resposta do tipo T auxiliar-2 para uma resposta de T auxiliar-1 esteja sendo obtida no rato, não há nenhuma melhoria significativa sobre a entrega de alergênicos livres. Em general, tal aproximação de uma única entrega dos alergênicos não será suficiente para obter o mesmo resultado nos seres humanos. Isto se deve ao fato de que tais estratégias requerem um período muito longo de tratamentos intermitentes, quando uma indução de células T reguladoras não é obtida, ou pelo menos não instala suficientemente um compartimento regulador para conseguir um efeito de tolerância de imunidade de longa duração ativo e verdadeiro. Em um outro exemplo, a administração oral do lactobacilli recombinante que expressa antígenos da mielina resultou em uma encefalomielites auto-imune experimental reduzida em um modelo de rato (Maassen et al. , 2003). Entretanto, o efeito terapêutico é considerado ser baixo e não suficiente para ser traduzido aos seres humanos. Particularmente, porque par assegurar um efeito terapêutico real suficiente para ser traduzido aos seres humanos, uma indução de células T específicas do antígeno CD4+ deve ser observada, finalmente tendo por resultado uma produção de células T reguladoras. Somente, tal mecanismo poderá suprimir ativamente a resposta imunitária nos seres humanos. Em todos os exemplos acima mencionados, nenhuma indução de células T CD4+ foi examinada. Permanescendo, assim um problema na arte para induzir eficazmente a tolerância dos antígenos.

RESUMO DA INVENÇÃO

Surpreendentemente, nós encontramos que a administração pela mucosa de um antígeno em combinação com a administração pela mucosa do microorganismo que produz um composto imunomodulador pode induzir uma resposta estável da tolerância da mucosa, preferivelmente se tal antígeno for expresso por um microorganismo e preferivelmente se tal administração pela mucosa for feita oralmente. Nós observamos que a administração pela mucosa de tal combinação resulta em uma supressão significativamente melhor da resposta imunitária antígeno-específica em comparação a única administração pela mucosa do antígeno que expressa o microorganismo. Ainda mais surpreendentemente, a supressão imune obtida com a invenção é significativamente mais eficaz do que comparada à administração oral de compostos imunomoduladores livres ou em combinação com a administração oral de antígenos.

Nós demonstramos que a invenção pode induzir a tolerância oral com eficiência muito mais elevada do que com monoterapia com antígeno ou IL-IO produzindo L. Iactis sozinho, ou do que o antígeno combinado com o IL-IO administrado oralmente livre. A ativação in vivo de células T reguladoras antígeno-específicas foi fortemente realçada. Estas células transferem a tolerância dominante aos receptores immuno-competentes e mediam a supressão uniforme do tecido vizinho. A eficácia da invenção foi demonstrada em modelos de rato para doença alérgica e auto-imnune, bem como no contexto da inativação imune do efeito terapêutico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

Durante toda a revelação, várias publicações, patentes e pedidos de patente publicados são referenciados por uma indicação de identificação. As divulgações destas publicações, patentes e relatórios de patente publicados estão incorporados aqui como referência na presente divulgação para descrever inteiramente o estado da arte a que esta invenção pertence.

A. Técnicas Gerais

A prática da presente invenção empregará, a menos que indicadas de outra maneira, técnicas convencionais de química orgânica, farmacologia, biologia molecular (incluindo técnicas recombinante), biologia da célula, bioquímica, e imunologia, que estão dentro da capacidade da arte. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura, como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); the series "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackpoço, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & Μ. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al. , eds., 1987, and periodicals) "Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al. , eds., 1994); and "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

B. Definições Como usados aqui, determinados termos podem ter os seguintes significados definidos. Como usado no relatório e reivindicações, as formas singulares de "a", "uma" inclui referências plurais, a menos que o contexto ditar claramente de outra forma. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas destas. Similarmente, o uso de "um composto" para o tratamento ou preparação de medicamentos como descrito aqui contemplam usar este ou mais compostos desta invenção para tal tratamento ou preparação a menos que o contexto disser claramente de outra forma.

Como usado aqui, o termo "compreendendo" pretende significar que as composições e os métodos incluem elementos recitados, mas sem excluir os outros. "consistindo essencialmente em" quando usado definir composições e métodos, significará excluir outros elementos de qualquer significado essencial â combinação. Assim, uma composição que consiste essencialmente de elementos como definidos aqui não excluiria traços contaminantes do método de isolamento e purificação e portadores farmaceuticamente aceitáveis, tal como o tampão fosfato salino, conservantes, e similares.

"consistindo de" deve significa excluir mais do que os elementos traço de outros ingredientes e as etapas substanciais do método para administrar as composições desta invenção.

As modalidades definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopo desta invenção. Um primeiro aspecto da invenção é um método para induzir a tolerância imunológica a um antígeno, compreendendo a administração pela mucosa de dito antígeno, em combinação com a administração pela mucosa do microorganismo que produz um composto imunomodulador.

Preferivelmente, a presente invenção se relaciona ao uso de um . microorganismo que produz um composto imunomodulador em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento para a administração pela mucosa para induzir a tolerância imunológica.

Preferivelmente, a dita tolerância imunológica é induzida em um animal. 0 dito animal é um mamífero, e preferivelmente escolhido do grupo que consiste de camundongo, rato, porco, vaca, ovelhas, cavalos e ser humano. Preferivelmente, o dito mamífero é humano.

Preferivelmente, a dita tolerância imunológica é tolerância mucosal.

Mucosa como usado aqui pode ser qualquer mucosa tal como, mucosa oral, mucosa retal, mucosa da ureta, mucosa vaginal, mucosa ocular, mucosa oral, mucosa pulmonar e mucosa nasal. Administração pela mucosa como usado durante todo o pedido abrange a administração à mucosa. A administração pela mucosa oral inclui rotas de administração oral, sublingual e gengival. Desta forma, a presente invenção se relaciona ao método em que a dita administração pela mucosa é escolhida do grupo que consiste da administração retal, bucal, pulmonar, ocular, nasal, vaginal e oral. Preferivelmente, a dita administração pela mucosa é a administração oral e a dita tolerância é a tolerância oral.

Tolerância mucosal como usado aqui ao longo de todo o pedido é a inibição da receptividade imune específica a um antígeno em um animal (incluindo seres humanos), após esse dito animal tem sido exposta ao dito antígeno através da rota mucosal. Preferivelmente, a dita tolerância da mucosa é a tolerância sistêmica. A exposição subseqüente do antígeno pode ser cada exposição conhecida a uma pessoa versada na arte, tal como a exposição pela injeção parenteral, pela administração na mucosa, ou pela produção de endógenos como no caso de auto-antígenos. A tolerância oral é a inibição da receptividade imune específica a um antígeno em um animal (incluindo seres humanos), após o dito animal ter sido exposto ao dito antígeno através da rota oral. A tolerância oral de baixa dosagem é a tolerância oral induzida por baixa dosagem de antígenos, e conhecida pela supressão imune ativa, mediada pelas células T reguladoras sensíveis de ciclofosfamida que podem transferir a tolerância aos hospedeiros que nunca receberam tratamento. Tolerância oral a elevada dosagem é tolerância oral induzida por doses elevada de antígenos, é não sensível ao tratamento de ciclofosfamida, e prosegue à indução de hipo-reação da célula T através de anergia e/ou ao apagamento das células T do antígeno específico. A diferença na sensibilidade a ciclofosfamida pode ser usada para fazer uma distinção entre a tolerância à baixa dosagem e a alta dosagem (Strobel et al., 1983). Preferivelmente, a dita tolerância oral é a tolerância oral de baixa dosagem como descrita por Mayer e Shao (2004b).

A presente invenção se relaciona assim a um método ou a uso como descrito aqui, onde a dita indução da tolerância imunológica é pelo menos 1,5, preferivelmente 2, mais pref erivelmente 3 vezes maior ou mais em relação a antes da dita indução. Alternativamente, o dito antígeno é tolerado pelo menos 1,5, 2, 3 vezes maior ou mais em relação a antes da dita indução. A indução de tolerância imunológica pode ser medida pelos métodos conhecidos na arte. Preferivelmente, a dita indução da tolerância imunológica pode ser medida pela modulação do nível de citocina no dito animal. Para tal, a modulação pode ser um aumento do nível de citocina, por exemplo, o dito aumento do nível de citocina é pelo menos 1,5, 2, 3 vezes maior ou mais em relação a antes da dita indução. Alternativamente, a dita modulação é uma diminuição de um nível do nível de citocina em particular, por exemplo, a dita diminuição do nível de citocina é pelo menos 1,5, 2, 3 vezes maior ou mais em relação a antes da dita indução. As citocinas podem ser escolhidas de qualquer citocinas relevantes,

preferivelmente as ditas citocinas são escolhidos do grupo que consiste de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN- γ, IFN-α, MCP-I, TGFp, RANK-L e Flt3L.

Um antígeno pode ser qualquer antígeno conhecido à pessoa versada na arte. Um antígeno como usado aqui ao longo de todo o pedido é preferivelmente qualquer substância que provocar uma resposta imunitária quando introduzida no corpo de um animal, onde a dita resposta imunitária pode ser célula T mediada e/ou uma resposta mediada pela célula Β. A célula T mediada responde a Thl e/ou responde a Th2. 0 antígeno pode ser qualquer antígeno, tal como, mas não limitado aos alergênicos (incluindo alimentos alergênicos), allo-antígenos, próprio-antígenos, auto-antígenos, e moléculas terapêuticas ou antígenos que induzem uma resposta imunitária. Preferivelmente, o dito antígeno é envolvido na indução de doenças relacionadas à resposta imunitária. Ainda mais preferivelmente, o dito antígeno é envolvido na indução de asma alérgica, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, uveitis auto-imune, tireoidite auto-imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, alergia ao alimento, doença celíaca ou doença do enxerto-versus-hospedeiro.

Resposta imunitária relacionada a doenças como usada aqui é uma doença causada por uma resposta imunitária não desejada do corpo contra um antígeno, pela qual o dito antígeno pode ser um antígeno heterõlogo ou um auto- antígeno. As doenças relacionadas da resposta imunitária incluem, mas não estão limitadas à reação alérgicas incluindo alergia do alimento, doença celíaca, asma alérgica, uveitis auto-imune, tireoidite auto-imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, diabetes do tipo I e esclerose múltipla. As doenças relacionadas à resposta imunitária incluem também reações imunes não desejadas, tais como doença do enxerto-versus-hospedeiro ou a immuno-ativação da medicação tal como, a produção de anticorpos contra o fator não endógenos VIII. Preferivelmente, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma alérgica, alergia do alimento, doença celíaca, diabetes do tipo I e inativação imune de terapêuticos. Assim será apreciado que as doenças relacionadas à resposta imunitária incluem, mas não estão limitadas as reações alérgicas incluindo alergia do alimento, doença celíaca, asma alérgica, uveitis auto- imune, tireoidite auto-imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, diabetes do tipo I e esclerose múltipla. As doenças relacionadas à resposta imunitária incluem também reações imunes não desejadas tais como, doença do enxerto-versus-hospedeiro ou a immuno-ativação da medicação tal como, a produção de anticorpos contra o fator não- endógenos VIII. Preferivelmente, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma alérgica, alergia do alimento, doença celíaca, doença do enxerto-versus-hospedeiro, diabetes do tipo I e inativação imune de terapêuticos.

Em uma modalidade adicional, o dito antígeno é entregue por um antígeno que expressa o microorganismo. 0 dito antígeno é entregue preferivelmente por um antígeno que produz ou mostra o microorganismo. Assim, a invenção relata um método como descrito aqui, onde o dito antígeno é mostrado na superfície do dito antígeno que expressa o microorganismo ou onde o dito antígeno é expressado. 0 composto imunomodulador e o antígeno podem ser entregues pelo mesmo microorganismo, ou pode ser um microorganismo diferente.

Vista ao acima, assim será apreciado que a presente invenção se relaciona ao método ou uso como descritos aqui, onde o dito método ou uso são terapêuticos e/ou profiláticos.

Composto significa qualquer produto químico do composto biológico ou complexo, incluindo moléculas orgânicas e inorgânicas simples ou complexas, peptídeos, peptídeos miméticos, proteínas, complexos de proteínas, anticorpos, carboidratos, ácidos nucléicos ou derivados destes. Um composto imunomodulador é um composto que modifica a função do sistema imune. Um composto imunomodulador como usado aqui é uma tolerância que induz o composto; a indução da tolerância pode ser obtida, como um exemplo, não limitativo, em uma maneira direta pela indução das células T reguladoras tais como, Treg, Trl ou Th3, ou deslocando o equilíbrio Thl/Th2 para Thl, ou de uma maneira indireta, pela ativação das células dendríticas imaturas para a tolerância das células dendríticas e/ou inibir a resposta imune de Th2 que induz a expressão de fatores de "co-estimulação" em células dendríticas maduras. Compostos imunomodulador e immuno-suprimido são conhecidos por pessoas versadas na arte e incluem, mas não estão limitados aos metabólitos bacterianos tais como, os metabólitos de espergualina, fungos e estreptomicinas tais como, tacrolimus ou ciclosporina, citocinas imunossupressoras tais como, IL-4, IL-IO, IFNa, TGFP (como adjuvante seletivo para células T reguladoras) Flt3L, TSLP e Rank-L (como estimuladores de tolerogênicos seletivos DC) , anticorpos e/ou antagonistas tais como, anti-CD40L, anti-CD25, anti- CD20, anti-lgE, anti-CD3 e proteínas, peptídeos ou proteína da fusão tais como, CTL-4 Ig ou a proteína da fusão do agonista CTLA-4. Assim, o composto imunomodulador pode ser qualquer composto imunomodulador conhecido para uma pessoa versada na arte. Preferivelmente, o dito composto imunomodulador é um composto imunossupressor, ainda mais preferivelmente o dito composto é uma citocina ou um anticorpo imunossuprimido. Preferivelmente, a dita citocina imunossupressora é uma citocina ou um anticorpo com tolerância melhorada. Citocinas immunossupessoras são conhecidos por pessoas versadas na arte, e incluem, mas não estão limitadas a IL-4, IL-10, IFNa e ΤΘΡβ, como adjuvante seletivo para células T reguladoras; e Flt3L, TSLP e Rank- L, como estimuladores de tolerogênicos seletivos DC. Preferivelmente, a dita citocina imunossupressora é selecionada do grupo que consiste de IL-4, IL- 10, IFNa e Flt3L. Será apreciado por uma pessoa versada na arte que a presente invenção se relaciona também aos homólogos funcionais destes. Um homólogo funcional conota uma molécula que tem essencialmente a mesma função ou uma similar, pelo menos para as finalidades pretendidas, mas que podem diferir estruturalmente. Mais preferivelmente, a dita citocina imunossuprimida com tolerância melhorada é IL-10, ou uma função homóloga desta. Preferivelmente, o dito anticorpo imunossuprimido é escolhido do grupo que consiste de anti-IL-2, anti-IL12, anti-IL6, anti-IFN-γ.

Administração como usada aqui significa qualquer método de administração conhecido por uma pessoa versada na arte e inclui, mas não estão limitada-s as formulações farmacêuticas revestidas ou não revestidas do composto para entregar, cápsulas, lipossomas, corpos de óleo, partículas de polímero que compreendem ou que carregam o composto para entregar ou produzir os microorganismos, mostrando ou acumulando o composto para a administração, opcionalmente na presença dos compostos que podem aumentar a administração pela mucosa e/ou absorção da mucosa.

Os compostos ou composições descritos aqui podem ser administrados na forma pura, combinados com outros ingredientes ativos, ou combinados com os excipientes ou portadores não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. As composições orais irão geralmente incluir um portador inerte diluente ou portador comestível. Os agentes obrigatórios farmaceuticamente compatíveis, e/ou os materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Tabletes, pílulas, cápsulas, comprimidos e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante tal como, celulose microcristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente dispersante tal como, ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante tal como, estearato de magnésio; glidante tal como, dióxido de sílica coloidal; um agente adoçante tal como, sacarose ou sacarina; ou um agente saborizante tal como, hortelã- pimenta, salicilato de metila, ou saborizante de laranja. Quando a forma da unidade de dosagem é uma cápsula, pode conter, além do material do tipo acima, um portador líquido tal como, óleo graxo. Adicionalmente, as formas da unidade da dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma laca, ou agentes entéricos. Adicionalmente, um xarope pode conter, além dos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e determinados conservantes, tinturas, colorações, e saborizantes. Será apreciado que a forma e a característica do portador farmaceuticamente aceitável são ditados pela quantidade de ingrediente ativo com que este deve ser combinado, a rota de administração e de outras variáveis bem conhecidas. 0(s) portador(es) deve(m) ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletério ao receptor deste. As preparações alternativas para a administração incluem soluções estéreis, suspensões, e emulsão aquosa ou não aquosa. Exemplos de solventes não-aquosos são dimetilsulfóxido, álcoois, glicol de propileno, glicol de polietileno, óleos vegetais tais como, óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como, etil oleato. Os portadores aquosos incluem misturas de álcoois e água, meios tamponados e fisiológicos. Os veículos intravenosos incluem os repositores de fluidos e nutrientes, repositores eletrolíticos, tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer, e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes em, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelatantes, gases inertes, e similares. As várias formulações líquidas são possíveis para estes métodos de entrega, incluindo soro fisiológico, álcool, DMSO, e soluções à base de água.

A dita citocina imunossupressora citocina imunossupressora é preferivelmente expressa em baixas quantidades, preferivelmente 0,1 μg ou menos por dose de bactérias administradas em um grupo experimental de camundongos, as quantidades da dose são traduzidas para o âmbito da doença em seres humanos. Nós demonstramos que a invenção pode induzir a tolerância oral com muito mais eficiência do que com a monoterapia com antígeno ou IL-IO que produz microorganismo, tal como L. Iactis sozinho, ou do que o antígeno combinado com IL-IO administrado livremente por via oral. A ativação das células T reguladoras antígeno-específicas in vivo foi fortemente realçada. Estas células transferem a tolerância dominante aos receptores immuno-competentes e mediam a supressão uniforme do tecido vizinho. A eficácia da invenção foi demonstrada em modelos de camundongos com doenças alérgicas e auto-imunes, bem como no contexto da inativação imune a terapêuticos.

Os termos "tratamento", "tratando", e similares, como usados aqui incluem a melhora ou a eliminação de uma doença ou condição mental desenvolvida, uma vez estabelecida ou aliviado os sintomas característicos de tal doença ou condição. Como usado aqui, estes termos também abrangem, dependendo da condição do paciente, a prevenção do início de uma doença ou condição ou dos sintomas associados com estes, incluindo reduzir a severidade de uma doença ou de uma condição ou os sintomas associados a estes antes da aflição com a dita doença ou condição. Tal prevenção ou redução antes da aflição se refere à administração do composto ou composição da invenção a um paciente que não está sofrendo no momento da administração com a doença ou a circunstância. "Impedir" abrange também impedir o retorno ou a prevenção relapsa de uma doença ou circunstância ou dos sintomas associados com estes, por exemplo, após um período de melhoria. Deve estar claro que as circunstâncias mentais podem ser responsáveis por queixas físicas. A este respeito, o termo "tratando" inclui também a prevenção de uma doença ou circunstância ou melhora física ou eliminação da doença ou condição física desenvolvida, uma vez estabelecida ou aliviado os sintomas característicos de tais condições.

Como usado aqui, o termo "medicamento" abrange também os termos "droga", "terapêutico", "poção" ou outros termos que são usados no campo da medicina para indicar uma preparação com o efeito terapêutico ou profilático.

Será apreciado que os compostos da invenção, isto é o antígeno e a molécula imunomoduladora, são entregues ou expressos em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa referir-se a uma quantidade de um composto ou composição da presente invenção que eliciará um efeito terapêutico ou profilático desejado ou uma resposta quando administrada de acordo com o regime de tratamento desejado. Preferivelmente os compostos ou composições, são fornecidos em forma de dosagem única, por exemplo, um tablete, uma cápsula ou uma dose medida de aerossol, de modo que uma dose única seja administrada ao sujeito, por exemplo, um paciente.

Em combinação com, como usado ao longo de todo o pedido implica, em um determinado momento, na presença simultânea do antígeno e do composto imunomodulador no nível da mucosa. Não implica que o antígeno e o composto imunomodulador necessitam sempre estar presentes simultaneamente no nível da mucosa. Conseqüentemente, o método cobre a administração simultânea do antígeno e do composto imunomodulador que produz microorganismos, bem como pela administração seqüencial do antígeno e do microorganismo que produz o composto imunomodulador, ou qualquer combinação destes.

Em uma modalidade adicional, o dito antígeno é entregue simultâneo com seqüencialmente ao composto imunomodulador que produz microorganismo e ao dito antígeno.

Uma modalidade preferida é administração simultânea do antígeno e do microorganismo que produz o composto imunomodulador. Neste caso, o antígeno e o microorganismo que produz o composto imunomodulador podem ser compreendidos na mesma formulação farmacêutica, ou em mais de uma formulação farmacêutica, tomadas juntas. Uma modalidade preferida é administrada por um microorganismo que produz tanto o antígeno como o composto imunomodulador.

Quando o antígeno e o composto imunomodulador que expressa o microorganismo ou a composição que compreendem ambos os elementos são administrados simultaneamente, os compostos ou os ingredientes ativos podem estar presentes em uma única composição ou formulação farmacêutica.

Alternativamente os compostos ou ingredientes ativos são administrados em composições farmacêuticas separadas ou formulações para o uso simultâneo ou separado. A invenção assim se relaciona também às composições farmacêutica que compreendem o antígeno e a molécula imunomoduladora que expressa o microorganismo da invenção e o uso destas composições farmacêuticas.

No caso da administração seqüencial, tanto o antígeno quanto o microorganismo que produz o composto imunomodulador podem ser administrados primeiro. No caso de administração seqüencial, o tempo entre a administração do antígeno e microorganismo que produz o composto imunomodulador deve preferivelmente não ultrapassar mais de 3 horas, mais preferivelmente ainda, não deve ultrapassar mais de duas horas, e muito mais preferivelmente ainda não deve ultrapassar mais de uma hora.

Os ingredientes ativos podem ser administrados de 1 a 6 vezes um dia, o que é suficiente para exibir a atividade desejada. Estas doses diárias podem ser dadas em uma dose única por dia, ou podem ser dadas em duas doses menores no mesmo instante ou em diferentes horários, que no total chegue à dose diária especificada. Preferivelmente, o ingrediente ativo é administrado uma ou duas vezes ao dia.

Contempla-se que ambos os agentes ativos fossem administrados ao mesmo tempo, ou em um tempo muito próximo. Alternativamente, um composto pode ser tomado pela manhã e na parte mais tarde do dia. Ou em outra situação, um composto poderia ser tomado duas vezes por dia e o outro uma vez ao dia, tanto com duas doses juntas ao mesmo tempo com a outra sozinha, quanto em horários diferentes. Preferivelmente, ambos os compostos devem ser tomados juntos ao mesmo tempo e ser administrado como uma mistura. Em uma modalidade, o segundo composto é administrado simultâneo, separado ou seqüencialmente com o dito primeiro composto.

Em todos os aspectos da invenção, a dose diária de manutenção pode ser dada ao paciente por um período clinicamente desejável, por exemplo, de 1 dia até diversos anos (por exemplo, para por toda a vida do mamífero) ; por exemplo, de aproximadamente (2 ou 3 ou 5 dias, 1 ou 2 semanas, ou 1 mês) para e/ou por exemplo até aproximadamente (5 anos, 1 ano, 6 meses, 1 mês, 1 semana, ou 3 ou 5 dias) . A administração da dose diário da manutenção Poe cerca de 3 a aproximadamente 5 dias ou para cerca de 1 semana a aproximadamente 1 ano é típica. Outros constituintes das formulações líquidos podem incluir conservantes, sais inorgânicos, ácidos, bases, tampões, nutrientes, vitaminas, ou outros farmacêuticos.

O microorganismo que secreta o composto imunomodulador e/ou o antígeno podem ser entregues em uma dose de pelo menos 104 de unidades formadoras de colônias (CFU) a IO12 cfu por dia, preferivelmente entre 106 cfu a 1012 cfu por dia, mais pref erivelmente entre 109 cfu a 1012 cfu por dia. De acordo com o método como descrito em Steidler et al. (Science 2000), o composto imunomodulador de, por exemplo, IO9 cfu são secretados em pelo menos de 1 ng a 100 ng. Com ELISA, é conhecido a uma pessoa versada na arte, o antígeno de, por exemplo, IO9 cfu são secretados de pelo menos 1 ng a 100 ng; a pessoa versada na arte pode calcular a faixa de secreção do composto e/ou do antígeno imunomodulador em relação a qualquer outra dose de cfu.

O antígeno pode ser entregue na dose que induz uma resposta de baixa dosagem. Preferivelmente, o dito antígeno é entregue em uma dose de pelo menos 10 fg a 100 μg por dia, preferivelmente entre Ipg e 100 ug por dia, e mais preferivelmente entre 1 ng e 100 μg por dia. O composto imunomodulador da invenção pode ser entregue em uma dose de pelo menos 10 fg a 100 pg por dia, pref erivelmente entre Ipg e 100 ug por dia, e mais pref erivelmente entre 1 ng e 100 ug por dia.

Preferivelmente os compostos ou a composição são fornecidos em forma de dosagem única de, por exemplo, tabuleta, solução, cápsula ou dose medida de aerossol, de modo que uma dose única seja administrada ao sujeito, por exemplo, um paciente.

Dependendo da modalidade da administração, por exemplo, oral, ou quaisquer umas das descritas acima, o profissional hábil na arte saberá definir ou calcular a dose real a ser administrada a um paciente. A pessoa versada na arte terá conhecimento para ajustar as doses dependendo do paciente, microorganismo, vetor e etc.

Os compostos da presente invenção também podem ter a forma de um sal, hidrato, solvato, ou metabólito farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais básicos de ácidos orgânicos e inorgânicos, incluindo, mas não limitados, ao ácido clorídrico, ácido bromico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido metanosulfônico, ácido ethanosulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftaleno sulfônico, ao ácido málico, ácido acético, ao ácido oxálico, ácido tartárico, ácido citrxco, ácido lático, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maléico, ácido salicílico, ácido benzóico, ácido fenilacético, ácido mandélico e similares. Quando os compostos da invenção incluem uma função ácida, tal como um grupo carboxi, então a os pares de cátion apropriados farmaceuticamente aceitáveis para o grupo carboxi são bem conhecidos para aqueles versados na arte e inclui alcalinos, alcalinos terrosos, amônio, cátions quaternários de amônio e similares.

0 microorganismo pode ser qualquer microorganismo, incluindo bactérias, fermentos ou fungos, apropriados para a administração pela mucosa. Preferivelmente, o dito microorganismo é um microorganismo não patogênico, ainda mais preferivelmente o dito microorganismo é um microorganismo probióticos. Organismos probióticos são conhecidos por pessoas versadas na arte. Os organismos probióticos incluem, mas não estão limitados, as bactérias tais como lactobacilos sp., Lactococcus sp., Bifidobacterium sp. e fermentos tais como Saccharomyces cerevisiae subespécie boulardii. Preferivelmente, a dita bactéria é uma bactéria do ácido lático; ainda mais preferivelmente, a dita bactéria do ácido lático é escolhida do grupo que consiste de Lactobacilos, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Earnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, e Weisella. Em uma outra modalidade preferida, o dito microorganismo é Lactococcus laetis. Em uma outra modalidade preferida, o dito microorganismo é Saccharomyees cerevisiae.

Em uma modalidade preferida, a citocina imunossupressora é combinada com os anticorpos antagonistas contra citocinas imuno induzidas, tais como anti-IL-2, anti-IL-12 e/ou anti-IFNY; e moléculas de co-estimulação, tais como anti-CD40L e anti-CD3. Alternativamente, os compostos podem ser entregues para estimular a produção das citocinas imunossupressoras, tais como a subunidade da toxina B da cólera; e moléculas que estimulam a função células T reguladoras, tais agonistas ICOS e CTLA-4. Como descrito acima, preferivelmente, o dito microorganismo é um microorganismo não patogênico, ainda mais preferivelmente ele é um microorganismo probióticos. Os organismos probióticos são conhecidos por pessoas versadas na arte, e incluem, mas não estão limitados, as bactérias tais como lactobacilos sp., Lactococcus sp. , Bifidobacterium sp. e fermentos, tais como Saccharomyces cerevisiae subespécie Boulardii.

Em uma modalidade preferida, o dito microorganismo é Lactococcus lactis. Em uma outra modalidade preferida, o dito microorganismo é Saccharomyces cerevisiae. O dito microorganismo probióticos e mais preferivelmente uma bactéria do ácido lático, quando a entrega de proteínas heterólogas (isto é proteínas bacterianas do ácido não lático) pelas bactérias do ácido lático na mucosa, incluindo tanto a administração oral e quanto a vaginal, foi descrita (Steidler e Rottiers, 2006; Liu et al. , 2006), a qual faz estas bactérias do ácido lático extremamente apropriadas para a entrega do antígeno e composto imunossupressor.

Um outro aspecto da invenção é o uso microorganismo que produz um composto imunomodulador, em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento para tratar doenças relacionadas às respostas imunitárias. Preferivelmente, o dito composto imunomodulador é uma citocina imunossupressora. Preferivelmente7 o dito antígeno é entregue por um microorganismo que secreta o antígeno. 0 composto imunomodulador e o antígeno podem ser entregues pelo mesmo microorganismo, ou pode ser um microorganismo diferente. Preferivelmente, a dita citocina imunossupressora é uma citocina com tolerância melhorada imunossupressora. As citocinas com tolerância melhorada imunossupressoras são conhecidas por uma pessoa versada na arte, e inclui, mas não está limitada ao IL-4, IL-IO, IFNa e TGFβ, Flt3L e RANK-L. Pref erivelmente, a dita citocina imunossupressora é selecionada do grupo que consiste de IL- 4, IL-10, IFNa e Flt3L. Mais preferivelmente, a dita citocina imunossupressora é IL-10, ou uma função homóloga desta. Em uma modalidade preferida, a citocina imunossupressora é combinada com os anticorpos antagonistas contra citocinas imunoinduzidas, tais como anti-IL-2, anti- IL-12 e/ou anti IFNy e moléculas de co-estimulação, tais como anti-CD40L e anti-CD3. A dita citocina imunossupressora é preferivelmente expressa em baixas quantidades, pref erivelmente 0,1 μ5 ou menos em um grupo experimental de camundongos, tais quantidades são traduzidas em um ajuste humano da doença.

Será apreciado que os compostos e composições da invenção podem ser usados como alimento nutracêuticos, funcionais ou médicos, ou como aditivos no dito alimento nutracêutico, funcional ou médico. Uma outra modalidade fornece um alimento ou bebida, preferivelmente produzida para o consumo humano que é compreendido de um agente nutracêutico e saborizante, onde o nutracêutico é compreendido de um extrato de um produto agrícola.

Nutracêuticos, se na forma de um extrato líquido ou de composição seca, são comestíveis e pode ser ingerido diretamente por seres humanos, mas é fornecido preferivelmente aos seres humanos na forma de aditivos ou suplementos nutritivos, por exemplo, na forma de tabletes do tipo vendido em lojas de alimentos saudáveis, ou como ingredientes em sólidos comestíveis, mais preferivelmente produtos alimentícios processados tais como cereais, pães, tofu, bolinhos, creme de gelo, bolos, batata chips, pretzels, queijo, etc., e líquidos bebíveis, por exemplo, tais como o leite, refrigerantes, repositores energéticos, e sucos de fruta. Assim, em uma modalidade um método é fornecido para aumentar o valor nutritivo de um alimento ou bebida misturando alimento ou bebida com um nutracêutico em uma quantidade que seja eficaz para aumentar o valor nutritivo do alimento ou bebida.

Uma outra modalidade fornece um método para aumentar o valor nutritivo de um alimento ou bebida que compreenda misturar um alimento ou bebida com um nutracêutico para produzir um alimento ou bebida nutritiva melhorada, onde o nutracêutico é misturado em uma quantidade eficaz para aumentar o valor nutritivo do alimento ou bebida, onde o nutracêutico é compreendido de um extrato de uma cultura que compreende os antígenos da presente invenção, e onde o alimento ou bebida com mais nutrientes podem também compreender um agente saborizante. Os agentes saborizante preferidos incluem adoçantes tais como o açúcar, xarope de milho, frutose, dextrose, maltodextrina, ciclamatos, sacarina, fenilalanina, xilitol, sorbitol, maltitol, e adoçantes herbal, por exemplo, stevia.

Os nutracêuticos descritos aqui são pretendidos para o consumo humano e os processos para obtê-los são assim preferivelmente conduzidos de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP) e qualquer regulamentação governamental aplicável para tais processos. Especialmente, os processos preferidos utilizam somente solventes derivados naturalmente. Os nutracêuticos descritos aqui contêm preferivelmente níveis relativamente elevados de substâncias que melhoram a saúde. Nutracêuticos podem ser misturados com um outro para aumentar seus efeitos de melhoria da saúde.

Por outro lado, os nutracêuticos chamados "alimentos médicos" não significa que são usados pelo público geral e não estão disponíveis nas lojas ou nos supermercados. Os alimentos médicos não são aqueles alimentos incluídos dentro de uma dieta saudável para diminuir o risco de doenças, tais como alimentos com baixo teor de gordura ou alimentos com baixo teor de sódio, nem são aqueles produtos para perder peso. Um médico prescreve um alimento médico quando um paciente tem necessidades nutrientes especiais a fim controlar uma condição de saúde ou doença, e o paciente está sob cuidados do médico. 0 rotúlo deve claramente indicar que o produto é pretendido para ser usado no controle de uma desordem ou uma condição médica específica.

Um exemplo de um alimento médico é um alimento médico diverso nutritivamente projetado para fornecer sustentação nutritiva direcionada para pacientes com condições inflamatórias crônicas. Os compostos ativos deste produto são, por exemplo, um ou mais dos compostos descritos aqui.

Os alimentos funcionais podem abranger aqueles alimentos incluídos dentro de uma dieta saudável para diminuir o risco da doença, tal como com gorduras reduzidas ou alimentos com baixo teor de sódio, ou produtos para perda do peso. Assim, a presente invenção contempla um alimento ou bebida que compreendem um nutracêutico de acordo com a invenção.

A presente invenção se relaciona assim ao uso de um microorganismo que produz um composto imunomodulador em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento, alimento médico ou nutracêutico para induzir a tolerância imunológica ou tratar doenças relacionadas às respostas imunitárias. Preferivelmente, a presente invenção se relaciona ao uso de uma composição para a preparação e/ou fabricação de um medicamento, alimento médico ou nutracêutico para tratar, previnir e/ou aliviar uma doença ou uma desordem envolvendo doenças relacionadas as respostas imunitárias, onde o dito composto compreende pelo menos um microorganismo que secreta um composto imunomodulador e um antígeno.

Em um aspecto mais adicional, a presente invenção se relaciona ao uso pelo menos de um microorganismo que produz um composto imunomodulador e um antígeno para tratar, previnir e/ou aliviar uma doença ou uma desordem que envolve doenças relacionadas à resposta imunitária. Assim, a presente invenção se relaciona também a um método para tratar doenças relacionadas às respostas imunitárias em um animal na necessidade desta, compreendendo a administração pela mucosa de um antígeno em combinação com a administração pela mucosa de um microorganismo que produz um composto imunomodulador.

Em uma modalidade adicional a invenção se relaciona a uma composição que compreende um microorganismo que secreta um composto imunomodulador em combinação com um antígeno. Preferivelmente, a dita composição é uma composição farmacêutica. Preferivelmente, o dito antígeno é um alergênico, aloantígenos, antígeno próprio ou auto- antigeno. Ainda mais preferivelmente, o dito antígeno é envolvido na indução da asma alérgica, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, uveitis auto-imune, tireoidite auto- imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, alergia ao alimento ou doença celíaca. Em uma modalidade preferida, o dito antígeno é um antígeno terapêutico, preferivelmente Anti-CD3. Preferivelmente, o antígeno de acordo com a invenção é entregue por um antígeno que expressa o microorganismo. Neste caso, o antígeno pode ser indicado na superfície do dito antígeno que expressa o microorganismo ou pode ser secretado elo dito organismo. Preferivelmente, a dita composição é apresentada em um pulverizador, cápsula, aerossol, pastilhas, pílulas, tabletes, saches, líquido, suspensão, emulsão ou comprimidos, preferivelmente em forma de dosagem única, por exemplo, um tablete, cápsula ou dose medida de aerossol. Preferivelmente, o composto imunomodulador da composição, de acordo com a invenção, é um anticorpo ou composto imunossupressor. Em uma modalidade preferida o dito composto imunossupressor é uma citocina que melhora a tolerância ou um anticorpo que melhora a tolerância, mais preferivelmente é escolhido do grupo que consiste de IL-4, ILlO, IFNa, Flt3L, TGFp e RANK-L. Em uma outra modalidade preferida o dito composto imunossupressor é um anticorpo imunossuprimido e é escolhido do grupo que consiste de anti-IL-2, anti-IL12 e anti-IFNa. Em uma modalidade preferida, o composto imunomodulador que produz microorganismo e um antígeno da composição, de acordo com a invenção é um microorganismo probióticos. Em uma outra modalidade preferida, o microorganismo que secreta um composto imunomodulador da composição, de acordo com a invenção é uma bactéria ou fermento, a dita bactéria é preferivelmente uma bactéria do ácido lático, ainda mais preferivelmente é uma bactéria do ácido lático escolhida do grupo que consiste de lactobacilos, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Atreptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, e Weisella, mais preferivelmente o dito Lactococcus é Lactococcus lactis. Preferivelmente, o dito fermento é Saccharomyces cerevisiae. Preferivelmente, o dito antígeno e o dito composto imunomodulador da composição de acordo com a invenção são expressos pelo mesmo microorganismo. Preferivelmente, a composição, de acordo com a invenção é compreende ainda um adjuvante, um portador farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente. Preferivelmente, a composição de acordo com a invenção compreende também um composto que estimula a produção de citocina imunossupressoras, preferivelmente o dito composto que estimula a produção de citocinas imunossupressoras é uma subunidade da toxina B da cólera. Preferivelmente, na composição de acordo com a invenção o dito antígeno e/ou o composto imunomodulador que produz microorganismo e o dito antígeno estão presentes em uma dose de pelo menos 10 femtograma a 100 mg.

Em uma modalidade final, a presente invenção se relaciona a um medicamento, nutracêutico, ou alimento médico para tratar, previnir e/ou aliviar uma doença ou uma desordem que envolve doenças relacionadas às respostas imunitárias que compreende pelo menos um antígeno em combinação com um microorganismo que secreta um composto imunomodulador.

Aqueles versados na arte apreciarão que as diversas mudanças e modificações podem ser feitas nas modalidades preferidas da invenção e que tais mudanças e modificações podem ser feitas sem fugir do espírito da invenção. Conseqüentemente, pretende-se que as reivindicações anexas cubram todas as variações equivalentes caindo dentro do verdadeiro espírito e escopo da invenção.

Adicionalmente, todos os termos usados na descrição dos compostos da presente invenção têm seus significados bem conhecidos na arte.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1, respostas imunes proliferativas no gânglio poplíteo e gânglio inguinal (PLN/ILN) seguido de alimentação oral com GM L.Iactis ou proteína ovalbumina (OVA) para camundongos BALB/C. As respostas proliferativas específicas-OVA foram medidas 11 dias após o desafio subcutâneo (no dia 0) dos camundongos com OVA no adjuvante completo de freund. Os camundongos receberam suspensão misturada de L. Iactis em dias de 42 até 46, 35 até 39, 28 até 32, 21 até 25, 14 até 18, 7 até 11, 1 até 4. LL-pT: suspensão bacteriana misturada de LL-pTINX (vetor de controle) e LL-pTINX; LL-OVA: suspensão bacteriana misturada da ovalbumina produtora da cepa de L. Iactis produz ovalbumina e LL-pTINX; LL-OVA+LL- mlLlO: a suspensão bacteriana misturada de LL-OVA e cepa de L. Iactis produz a interleucina-10 murina. O controle positivo 1 recebeu 20 mg OVA em 07 dias. O controle positivo 2 recebeu 1 ug OVA nos mesmos dias da alimentação com L. Lactis. Os resultados mostrados são os meios da incorporação de [3H]-timidina em com (± SD) para triplicar as culturas de células agrupadas dos grupos com 4 camundongos.

A figura 2 respostas de citocina no MLN e no PLN/ILN seguindo a alimentação oral com GM L. Iactis ou OVA para camundongos BALB/C. A secreção de IL12p70 (a), TNF-a(b) , ΙΡΝγ (c) , MCP-1 (d) , IL-10 (e) e IL-6 (f) no controle de camundongos e alimentação dos camundongos com GM L. Iactis ou OVA foi avaliada. Os sobrenadantes da cultura de célula de MLN (A) e PLN/ILN (B) as células foram testadas depois da reest imulação com 300 μ9/m1 OVA in vitro, para a presença de citocinas por CBA (BD Biociência), usando o kit de inflamação para camundongo. Os resultados mostrados são as produções de citocinas por células agrupadas dos grupos com 4 camundongos.

A figura 3 respostas proliferativas OVA-específicas da célula T CD4+ no PLN/ILN seguindo a alimentação oral com GM L. lactis ou a proteína ovalbumina (OVA) para os camundongos BALB/C. As respostas proliferativas OVA- específicas foram medidas 11 dias após o desafio subcutâneo (no dia 0) dos camundongos com OVA adjuvante completo de freund. Os camundongos receberam suspensão misturada de L. lactis. 42 até 46, 35 até 39, 28 até 32, 21 até 25, 14 até 18, 7 até 11, 1 até 4. LL-pT: suspensão bacteriana misturada de LL-pTINX (vetor de controle) e LL-pTINX; LL- OVA: suspensão bacteriana misturada da ovalbumina produtora da cepa de L. lactis produz ovalbumina e LL-pTINX; LL- OVA+LL- mlL10: a suspensão bacteriana misturada de LL-OVA e cepa de L. lactis produz a interleucina-10 murina. O controle positivo 1 recebeu 20 mg OVA em 07 dias. O controle positivo 2 recebeu 1 μg OVA nos mesmos dias da alimentação de L. lactis. Os resultados mostrados são os meios da incorporação de [3H] -timidina em com (± SD) para triplicar as culturas de células agrupadas dos grupos com 4 camundongos. EXEMPLOS

Exemplo A: A indução de tolerância a ovalbumina seguindo a administração oral de L. Iactis que secreta a dita ovalbumina em combinação com IL-IO entregue in si tu.

Material e métodos para os exemplos

Bactérias e plasmídios

A cepa de L.Iactis MG1363 foi usada durante todo este estudo. As bactérias foram cultivadas no meio GM17, isto é M17 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões conservadas de todas as cepas foram armazenadas em -20 °C em 50% de glicerol em GMl7. Para inoculações intragãstricas, as suspensões armazenadas em estoque foram diluídas em 500 vezes em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ 10^9 unidades formadoras de colônia (CFU) por ml dentro de 16 horas. Durante todo este estudo, as suspensões bacterianas misturadas foram usadas. Conseqüentemente, as bactérias que foram misturadas e colhidas por centrifugação e pelotas de ambas as culturas bacterianas foram concentradas 10 vezes no meio BM9 (Schotte, et. al.,2000). Para o tratamento, cada camundongo recebeu 100 μl desta suspensão pelo catéter intragástrico.

A seqüência de mRNA que codifica Gallus gallus Ovalbumina foi recuperada de Genbank (número de acesso ΑΥ223553). O RNA total foi isolado do útero da galinha e o DNA sintetizado usando 2 ug do RNA total, os primer oligo- dT de 2μΜ (Promega Corporation Benelux, Leiden, Países Baixos), 0,01 mM de DTT (sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Baixos), 0,5 mM de dNTP (Invitrogen, Merelbeke, Belgium), 20 U de Rnasin (Promega Corporation, Bélgica) e 100 U do sobrescrito II por transcrição reversa (Invitrogen) em um volume de 25 μΐ. 0 fragmento de DNA OVA foi amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) que usa as seguintes condições: 94°C por 2 minutos seguidos por 30 ciclos a 94°C por 45 segundos, 62°C por 30 segundos e a 720C por 90 segundos, com os primers no sentido direto e reverso.

5'-GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3' e 5'-ACTAGTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGAAGAGAA-3*.

O fragmento amplificado é fundido ao sinal de secreção do Usp45 do vetor pTINX resistente a eritromicina, a jusante do promotor Pl lactococcal. As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam o cDNA OVA e IL-10 foram designadas L. Iactis que produz OVA (LL-OVA) e LL-ILlO. 0 L. Iactis-pTINX, que é MG1363 contendo o vetor vazio, pTINX, servido como o controle (LL-pTINX).

Animais

Ratas Balb/c com sete semanas de idade foram obtidas do laboratório Charles River (Itália). Estas ratas foram mantidas sob condições do SPF e foram tratadas com alimentação padrão do laboratório e beberam água potável a vontade. Os estudos dos animais foram aprovados pelo comitê de ética do departamento de pesquisa biomedical molecular da universidade de Ghent.

Indução e avaliação da tolerância oral

Os camundongos receberam suspensão de L. Iactis nos dias de 24 até 46, 35 até 39, 28 até 32, 21 até 25, 14 até 18, 7 até 14, 1 até 4. LL-pT: suspensão bacteriana misturada de LL-pTINX (vetor de controle) e LL-pTINX; LL- OVA: suspensão bacteriana misturada da cepa de L. Iactis que produz ovalbumina e LL-pTINX; LL-OVA+LL-mlLlO: suspensão bacteriana misturada de LL-OVA e da cepa de L. lactis que produz interleucina-10 murina. Dois controles positivos para a indução da tolerância oral foram incluídos no estudo. O controle positivo 1 recebeu 20 mg de ovalbumina em 100 μl no meio BM9 no dia 7. O controle positivo 2 recebeu 1 μl de ovalbumina em 100 ug no meio BM9 nos mesmos dias que alimentados de L. Iactis. Os camundongos receberam alimentação intragástrica por catéter. Os camundongos do controle não foram tratados oralmente. No dia 0, os camundongos foram imunizados com 100 μ9 de OVA emulsionada a 1:1 no adjuvante completo de freund contendo 100 ug M. tuberculosis H37 RA (Difco) . Onze dias após a imunização, o gânglio inguinal mesentérico (MLN) e o gânglio inguinal poplítea e inguinal (PLN/ILN) foram colhidos e as células foram avaliadas para proliferação especifica de OVA e produção de citocina.

Proliferação específica da OVA in vitro

A suspensão da célula única da drenagem do gânglio linfático inguinal e poplíteo foi preparada. As células foram contadas e resuspensas em 2 χ 10^5 células em 200 μl RPMI-1640 contendo 10% do soro fetal bovino (FCS) , 10 U/ml de penicilina, 10 μg/ml de estreptomicina, 2 mM de L- glutamax, 0,4 mM de piruvato de sódio (RPMI completo) sozinho ou com 11, 33, 100 ou 300 pg/ml de OVA. As células foram cultivadas por 90 horas em placas de cultura do tecido de 96 poços com fundo em U (Becton Dickinson) a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2. A Proliferação foi avaliada pela adição de luCi/poço [3H] -timidina nas últimas 18 horas da cultura. O limite de radioatividade DNA foi colhido em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer) e na incorporação da timidina medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Proliferação específica da OVA de células T purificada CD4 in vitro.

Células T CD4+ foram purificadas das preparações inteiras da célula PLN/ILN usando o kit de isolamento da célula T CD4+ (Miltenyi Biotec) . 2 χ 10^5 células T CD4 + foram cultivadas em 200 μΐ RPMI completados com mitomicina C tratadas carregada de esplenócitos com OVA, agindo como antígeno que apresenta células em células T CD4+/APC em razões de 1/3, l/l, 1/0,3, 1/0,1 e 1/0. As células foram cultivadas por 90 horas em placas de cultura do tecido de 96 poços com fundo em U (Becton Dickinson) a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2. A proliferação foi avaliada pela adição de luCi/poço [3H]-timidina para as últimas 18 horas de cultura. 0 limite de radioatividade do DNA foi colhido em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer) e na incorporação da timidina medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Medição da produção de citocina de OVA-específicas Células dos gânglios linfáticos e gânglios inguinais mesentéricos (MLN) e a drenagem de gânglio linfático poplíteo e inguinal foram preparadas e resuspensas em 2 χ IO6 células/ml e 100 μΐ alíquotas cultivadas em placas de cultura do tecido de 96 poços com fundo em U por 72 horas com 3 00 μg/ml OVA. Sobrenadantes foi armazenado em -20 0C até que os níveis de citocina foram quantificados pelo ensaio citométrico de grânulos usando o kit de inflamação para rato (BD Biociência).

Exemplo Al: LL-IL10 melhora significativamente a capacidade de indução de LL-Ova. Para estudar a indução da tolerância oral, camundongos foram oralmente alimentados GM L. Iactis [LL-pT: suspensão bacteriana misturada do LL- pT1NX [all] (= vetor de controle) e LL-pT1NX; LL-OVA: suspensão bacteriana misturada com L. Iactis para produzir OVA [all italics] e LL-pT1NX; LL-OVA+LL-mlL-10: suspensão bacteriana misturada de L.Iactis que produz OVA e L.lactis que produz IL-10 murina]; 6 vezes em 5 dias consecutivos (nos dias 42 até 46, 35 até 39, 28 até 32, 21 até 25, 14 até 18, 7 até 11 e 1 até 4) ou uma dose única de 20 mg de OVA no dia 7 [o controle positivo 1] ; ou doses freqüentes de 1 ug OVA no mesmo dias quando alimentado de L. Iactis [controle positivo 2]. Os camundongos do controle não foram tratados oralmente. No dia 0, os camundongos foram imunizados com OVA no adjuvante completo de freund e a proliferação específica da OVA das células PLN/ILN foi avaliada no dia 11. A adição de LL-IL-10 aumentou significativamente a indução de tolerância para OVA quando a resposta proliferativa OVA específica das células PLN/ILN (Figura 1) foi significativamente reduzida no grupo de LL- OVA [ali]+LLmlL-10 em comparação ao controle e grupos de LL-ova.

Exemplos A2: LL-IL10 potencializa a tolerância oral em associação com a produção reduzida de citocinas proinflamatória em resposta a Ova.

Estudar a indução da tolerância oral, camundongos foram alimentados oralmente com GM L. lactis ou OVA como descrito acima (exemplo 1) e subseqüentemente foram imunizados com OVA adjuvante completo de freund. Onze dias passados da imunização, a produção de citocina em resposta a OVA no MLN e PLN/ILN foi quantificada pelo ensaio citométrico de grânulos, usando o kit de inflamação para camundongos. No MLN, a produção de citocinas proinflamatória, IL-12, TNF-α, IFNy e IL-6 não foram detectados nem foram fortemente reduzidos no grupo LL- ova+LL-mlL-10 em comparação ao grupo de LL-ova em que uma forte produção destas citocinas proinflamatória foi observada (Figura 2A) . No PLN, a produção de citocinas proinflamatória, TNF-α, IFNy, MCP-I, e IL-6 são fortemente reduzidos no grupo de LL-ova+LI mlL-10 em comparação ao grupo de LL-ova e neste grupo os níveis de TNF-α, MCP-I e IL-6 são mais baixos do que aqueles observados no grupo de controle (Figura 2B) .

Exemplo A3 : LL- ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se a indução da tolerância oral foi mediada pelas células T [ali] CD4+; a resposta prolif erativa das células T CD 4 a OVA específica foram estudadas no MLN e PLN/ILN. Conseqüentemente, os camundongos foram alimentados oralmente com GM L. Iactis ou OVA nos dias indicados acima (exemplo 1) . Os camundongos foram imunizados com OVA no adjuvante completo de freund no dia 0 e 11 mais tarde as células T CD4 foram purificadas do MLN e PLN/ILN e foram subseqüentemente cultivadas na presença de mitomicina C tratadas carregada de esplenócitos com OVA. A resposta OVA-específica da célula T CD4 no grupo LL-ova+LL-mlL-10 foi significativamente reduzida em comparação a LL-ova e grupos de controle (Figura 3).

Exemplo Β: A indução de tolerância à coagulação do fator VIII e fator IX seguido da administração oral do L. Iactis que produz os ditos fatores em combinação com a entrega in situ de 11-10.

Introdução

Diversas proteínas terapêuticas (recombinantes) , tais como do interferon, fator VIII/IX e os anticorpos (Remicade) são administrados em altas doses por prolongados períodos de tratamento. Entretanto, uma complicação associada com seu uso é o desenvolvimento de respostas imunes de proteína-específicas, tais como anticorpos. Estes anticorpos (abs), chamados também de inibidores, rendem as proteínas terapêuticas menos eficácia. Os exemplos incluem a formação de inibidores para o fator VIII/IX na hemofilia, no eritropoetina (Epo) nos pacientes que se submetem à terapia para falha renal crônica, e no IFN-β nos pacientes que sob tratamento para esclerose múltipla. Aqui, nós demonstramos que a administração oral do fator VIII (e fator IX) em combinação com IL-10 que produz L. Iactis suprime a formação inibidora do dito fator através da indução de células T reguladoras antígeno-específicas CD4+.

Material e Métodos para os exemplos

A cepa de L. Iactis MG1363 é usada ao longo deste estudo. As bactérias são cultivadas em meio GM17, isto é M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são armazenadas em -20 0C com 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas são diluídas em 200-dobras em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Alcançam uma densidade de saturação de 2 χ IO9 unidades formadoras de colônias (CFU) por ml dentro de 16 horas. Durante todo este estudo, as suspensões bacterianas misturadas são usadas. Conseqüentemente, as bactérias que são misturadas são colhidas por centrifugação e pelotas de ambas as culturas bacterianas são concentradas 10 vezes no meio BM9 (Schotte, Steidler et al. 2000). Para o tratamento, cada camundongo recebe 100 μΐ desta suspensão pelo catéter intragástrico.

Fragmentos cDNA ou FIX cDNA e FVIII humano, representando epítopos para as células T CD4+ especificas FIX e FVIII, são amplificados fundindo ao sinal de secreção Usp45 do vetor pTINX resistente a eritromicina, a jusante do promotor Pl lactococcal.

As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam IL-10 murina, FVIII (e/ou fragmento do epitope), FIX (e/ou fragmento do epitope), foram designados L. Iactis que produz ILlO, LL-ILlO, LL-FVIII, LL-FIX, LL-pTINX, que é MG1363 contendo o vetor vazio pTINX, servindo como controle.

Quantificação de FVIII e FIX FVIII ou LL-FIXFVIII e LL-IX, respectivamente é determinada usando ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) especifico FVIII e FIX humanos que têm sido descritos previamente (Chuah et al. , 2003). As proteínas recombinantes são analisadas também por Western blot analysis e COATests e pelos ensaio aPTT, como descrito em (Chuah et al. , 2003 ; VandenDriessche et al. , 1999). 0 terminal NH2 desta proteína é determinado pela degradação automatizada de Edman. Tendo em vista que FVIII e FIX são normalmente expressos no fígado onde se submetem as modificações pós-traducionais extensivas, os fatores de coagulação produzidos do L. Iactis projetado podem ser biolologicamente inativos. Entretanto, estas diferenças modificações pós-traducionais não terem provavelmente nenhum repercurssão na capacidade destas proteínas recombinantes que produzem L. Iactis de induzir a tolerância imunológica. Certamente, a maioria dos inibidores tem se caracterizado particularmente para tipicamente reconhecer os resíduos do aminoacido (Villard et al., 2003), ao invés de porções glicosilada. Animais

Camundongos com hemofilia A ou B obtidas pela destruição dos genes murina de FVIII ou FIX usando a recombinação homologa em células ES, como descrito por (Bi et al., (1995) e Wang et al., (1997), são produzidos no laboratório. Estes camundongos receptores geram anticorpos neutralizantes quando desafiados com o antígeno FVIII ou de FIX recombinantes purificados na presença de CFA (Mingozzi et al., 2003). A situação do inibidor pode ser monitorada sobre o tempo usando ensaios de Bethesda ou anti- FVIIl/anti-FIX específicos por ELISAs. Os camundongos receptores desafiados com FVIII ou FIX (+CFA) normalmente desenvolvem inibidores de 2 a 3 semanas após o desafio antigênico.

Grupo experimental

Os camundongos de 4 a 6 semana de idade recebem LL- FVIII, LL-FIX, ou LL-pTINX ou LL-OVA (um antígeno irrelevante) como os controles negativos, combinados ou não com a proteína LL-ILlO ou IL-I0 (1 ou 10ug). Como um controle positivo para a indução de tolerância, nós injetamos camundongos com os vetores virais adeno- associados (AAV) que expressam FIX de um promotor específico de hepatócito. Os animais receptores desenvolvem a tolerância imunológica específica ao FIX que impede a indução anticorpos anti-FIX em cima do desafio subseqüente com FIX+CFA.

Em um ajuste profilático, LL-FVIII, LL-FIX sozinho ou junto com LL-ILlO ou IL-IO são administrados oralmente aos camundongos com hemofilia A ou B usando um cateter gástrico, usando diferentes intervalos de tratamento e doses. Estes camundongos receptores são subseqüentemente desafiados com o antígeno recombinante purificado FVIII ou FIX, na presença de CFA (Mingozzi et al., 2003). Os animais do controle são expostos a LL-pTINX e LL-OVA. 0 plasma é colhido pelo sangramento retro-orbital. 0 desenvolvimento dos anticorpos direcionado contra FVIII ou FIX é avaliado usando ensaios de Bethesda (Kasper et al. , 1975) ou usando um anti-FVIII ou anti-FIX específico modificado ELISA (VandenDriessche et al. , 1999) em diferentes intervalos de tempo.

Em um ajuste terapêutico, camundongos com hemofilia A ou B são imunizados primeiramente com FVIII ou FIX, como descrito (Mingozzi et al., 2003). A situação do inibidor é monitorada sobre o tempo usando ensaios de Bethesda ou específico ELISAs de anti-FVIII/anti-FIX. Os camundongos com títulos baixos ou elevados do inibidor são subseqüentemente tratados com LL-FVIII, LL-FIX sozinho ou junto com LL-ILlO ou IL-10 usando diferentes tratamentos e doses e títulos do inibidor são determinados sobre o tempo.

A especifidade da tolerância imunológica possível é avaliada pelo desafio, os camundongos que recebem LL-FVIII, LL-FIX sozinho ou junto com LL-ILlO com um antígeno irrelevante (toxóide do tétano em Ova) . Como um controle positivo, os camundongos são expostos oralmente a FVIII ou FIX purificados.

Culturas de célula, proliferação e ensaio de citocina 70 μM de suspensão da célula única do baço e os gânglios linfáticos são preparados para passar as células através de filtros coadores de célula (Becton/Dickinson Labware). Os eritrócitos são removidos das suspensões da célula do baço pela incubação da célula vermelha no tampão de lise.

Os ensaios de proliferação da população total de esplenócito, 2 χ IO5 células são cultivadas nas placas 96 poços com fundo em U em um volume total de 2 00 μΐ, um meio completo ou sozinho com FVIII ou FIX purificado, e com anti-IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. FVIII e FIX são adicionados em concentrações que variam de 1 a 100 μg/ml. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 ug/ml. Para ensaios de proliferação das populações das células T CD4+ e células T CD4+CD25~, 0,2x IO5 células T das células CD4+ ou células T CD4+CD25~ são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em Ulx IO5 células CD4" irradiada, agindo como células que apresenta antígeno, e FVIII ou FIX (0 ou 100 ug/ml) em um volume total de 200 μl completa o meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 horas a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 μCi/poço [3H]-timidina. O limite de radioatividade do DNA é colhido de 16 a 18 horas mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Para medidas da citocina, os sobrenadantes das culturas de células usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 horas de cultura e congeladas em -20°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA). Testes de atividade reguladora T in vivo A fim de testar a supressão da ativa da formação de anticorpo nos camundongos, esplenócitos, células T CD4+ conta purificada, células CD4+CD25" ou CD4+CD25+ isoladas dos diferentes grupos expermentais de L. Lactis tratado são transferidos adotivamente aos camundongos C3H/HeJ. Os camundongos não tratados são usados como controle. O número de células transferidas é de IO7 para células inteiras do baço, depleção de subpopulações de células do baço, ou células CD4+ positivamente selecionadas e células T células CD4+CD2 5" ou CD4+CD2 5+. Os camundongos receptores (n=4-5 por cohort experimental) foram injetados subcutaneamente com 5 pg hF.IX em cFa 36 horas após transferência adotiva. Os títulos de Anti-hF.IX IgG no plasma foram medidos 2,5 semanas após a imunização.

Exemplo BI: LL-ILlO aumenta significativamente a capacidade de indução de tolerância LL-FVIII e LL-IX em camundongos com hemofilia A ou B.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A adição de LL-IL-10 aumenta significativamente a indução de tolerância para FVIII e FIX enquanto a resposta proliferativa do fator-específico dos esplenócitos é significativamente reduzida no grupo LL- FVIIl/FIX+LL-mll-10 em comparação ao controle e aos grupos LL-FVIII/IX.

Exemplo B2 : LL-I LlO potencializa a tolerância oral em associação com títulos específicos reduzidos de FVIII e FIX e IFN-γ e mais produção de ILlO e TGF-β em resposta ao dito fator. Para estudar a indução da tolerância oral, camundongos foram alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). Anticorpos específicos FVIII e FIX produção de citocina em resposta do dito fator nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos quantificados como descritos acima. A formação inibidora e a produção de citocina proinflamatória, IFN-γ é fortemente reduzido e as citocinas imunosupressiva IL-IO e TGF-β são aumentadas significativamente no grupo de LL- FVIII/FIX+LL-mlL-10 em comparação ao controle e grupos de LL-FVIII/IX.

Exemplo B3: LL-ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se as células T CD4+ mediam a indução da tolerância oral, a resposta proliferativa ao fator específico das células T CD4+ é estudada nos esplenócitos e gânglios linfáticos. Conseqüentemente, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental) e a proliferação do fator específico da célula T CD4+ é determinado como descrito em culturas de célula, proliferação e em ensaios de citocina. A resposta ao fator específico da célula T CD4 no grupo de LL- FVIII/FIX+LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao controle e aos grupos LL-FVIII/IX.

Exemplo B4: IL-10 é menos eficaz do que LL-ILlO na potencialização da tolerância oral

Aliviar se LL-IL10 é tão eficaz quanto IL-10, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental). A resposta proliferativa do fator específico da célula T CD4 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. A resposta ao fator específico da célula T CD4 no grupo de LL-FVIII/FIX+LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao grupo LL- FVI11/IX+IL-10.

Exemplo B5: células T reguladoras antígeno-induzidas que seguem a combinação da terapia LL-FVIII/FIX - LL-ILlO pode transferir a proteção da formação inibidora in vivo

Para testar a supressão ativa da formação do anticorpo nos camundongos tratados com o protocolo de tolerância oral, nós transferimos adotivamente esplenócitos dos diferentes grupos tratados como descritos acima (no ensaio da atividade reguladora T in vivo). Comparado com os controles e grupos LL-FVIII/IX, a formação do antifator IgG é significativamente reduzida no grupo de LL- FVIII/FIX+LL- mlL-10, indicando a ativação das células reguladoras T CD4+ em nosso protocolo de tolerância oral da combinação.

Exemplo C: A indução de tolerância a um alergênico,

Der ρ 1 seguindo a administração oral L. Iactis que produz o dito alergênico em combinação com in situ IL-IO entregue.

Introdução

A asma alérgica é uma desordem inflamatória crônica das vias respiratórias. Ela é caracterizada pela obstrução das vias respiratórias reversíveis, em elevados níveis de soro por imunoglobulina E alergênicos específicos, por hipersecreção da mucosa e por hiperresponsividade das vias aéreas (AHR) ao estímulo espasmogênico. Seus sintomas são piores pela exposição a um alergênico (por exemplo, árvore, pólen de flores e erva daninha, poeira e ácaros da poeira, molde, caspas de animal) o qual o paciente pode ser sensível. O linfõcito tipo 2 T-auxiliar (Th2), possui um papel crucial na iniciação, progressão e persistência da doença. Os dados presentes sugerem que as respostas Th2 aos alergênicos são normalmente suprimidas por células T reguladoras. Além disso, a supressão por este subconjunto é diminuída em indivíduos alérgicos. Aqui, nós demonstramos que a administração oral do alergênico em combinação com IL-10 produzindo L. Iactis suprime resposta semelhantes à asma através da indução das células reguladoras T CD4+ antígeno-específicas.

Material e Métodos para os exemplos

Dois modelos de rato da asma alérgica que imita a doença humana são os modelos do alergênico Ova e o modelo humanizado SCID.

O modelo alergênico Ova

Os camundongos sensibilizados com OVA são submetidos à inalação com aerossol de OVA que leva a inflamação eosinofílica da vias aéreas citocina Th2 dependente, hiperreatividade brônquica, e produção de IgE, encontrando altas característica de asma alérgica humana (Brusselle, 1994, Clin Exp allergy 24:73; Kips et al. 1996, Am J Respir Crit Care Med 153:535; Brusselle et al. 1995, Am J Respir Cell Mol Biol 12:254). Bactérias

A cepa L. Iactis MG1363 é usadas durante todo este estudo. As bactérias são cultivadas no meio GM17, isto é Ml7 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são guardadas em -20°C em 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas são diluídas em 200-dobras em GM17 fresco e incubadas a 30 °C. Alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ 1O9 unidades formadoras de colônias (CFU) por mL dentro de 16 horas. As bactérias são colhidas por centrifugação e concentradas 10 vezes no meio BM9. Para o tratamento, cada camundongo recebe 100 uL desta suspensão diariamente pelo catéter intragástrico.

Plasmidios

A seqüência de mRNA que codifica a ovalbumina do Gallus gallus são recuperados de Genbank (número de acesso AY223553) . 0 RNA total é isolado do útero da galinha e o cDNA é sintetizado usando 2 μg do RNA total, 2μΜ do primer oligo-dT (Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands) , 0,01 mM DTT (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 0,5mM de dNTP (Invitrogen, Merelbeke, Belgium), 20 U Rnasin (Promega Incorporation Benelux) e 100 U do sobrescrito II em transcrição reversa (Invitrogen) em um volume de 25 μl. 0 fragmento de cDNA OVA é amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) que usa as seguintes condições: 94°C por 2 minutos seguido por 30 ciclos a 94°C por 45 segundos, a 62°C por 30 segundos e a 72°C por 90 segundos, com os seguintes primers no sentido direto e reversos

51 -GGCTCCATCGGTGCAGCAAGCATGGAATT-3' e 5 ' -ACTAGTTAAGGGGAAAC-ACATCTGCCAAAGAAGAGAA- 3 ' .

O fragmento amplificado é fundido ao sinal de secreção do Usp45 do vetor pTINX resistente a eritromicina, a jusante do promotor Pl lactococcal.

As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam murina IL-10 e cDNA OVA e IL-10 são designadas LL-IL10 e LL-OVA. LL-pTINX, que é MG1363 contendo vetor vazio pTINX, serve como controle.

Quantificação de OVA

OVA de LL-OVA e determinada usando o ensaio imunoabsorvente intralaboratorial ligado à enzima OVA- específica (ELISA). A produção das proteínas recombinantes também é avaliada pela análise de Western blot.

Modelo alergênico Ova

Camundongos

Camundongos BALB/c (6 a 8 semanas da idade) são comprados do Charles River Laboratories (Calco, Italy). Os camundongos são mantidos sob circunstâncias livres de patogênicos específicos. Imunização de Camundongos

Camundongos são imunizados i.p. com 2 pg de OVA (classe V; Sigma-Aldrich) em 2 mg de hidróxido de alumínio. Esta imunização é repetida após um intervalo de 10 dias (nos dias O e 10) . Os camundongos do controle recebem uma injeção de soro fisiológico em vez da solução de OVA/alum. Sete dias após a imunização, os camundongos sensibilizados inalaram por aerosol uma solução de 3% de OVA dissolvida em PBS por 10 minutos. A inalação de OVA é conduzida por 3 dias em uma seqüência (dias 18, 19, e 20) . Os camundongos do controle inalam PBS sozinho sob as mesmas circunstâncias usadas para o grupo experimental.

A indução da tolerância oral

Camundongos recebem LL-OVA sozinho ou combinado com IL-10 (1 ou IOug) ou LL-IL10, LL-ILlO sozinho, IL-IO sozinho (1 ou 10 ug) , LL-pTINX ou água (sem controle de alimentação). Em um ajuste profilático, os camundongos são alimentados durante 2 regimes diferentes antes da primeira imunização i.p.. Os regimes de alimentação 1 e 2 consistem de 4 e 6 ciclos da administração diária por 5 dias, alternando com um período 2 dias sem administração, respectivamente. Como controles positivos para a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados 1 mg (baixa dose) ou 30 mg (alta dose) de OVA cada outro dia de 10 a 2 dias antes da primeira imunização (cinco alimentações no total) pelo catéter intragástrico que reduz eosinofilia nos brônquios e a hiperresponsividade das vias aéreas, com alimentação de alta dosagem sendo mais eficazes do que a alimentação de baixa dosagem.

Em um ajuste terapêutico, os camundongos são alimentados diariamente com as mesmas cepas de L. Iactis como descritos para o ajuste profilático, somente partindo da primeira imunização para 8 dias após a imunização.

Como controle positivo para indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados com 30 mg de OVA.

Medida de hiperresponsividade das vias aéreas (AHR) 24 h após o final da inalação (dia 21), a hiperresponsividade das vias aéreas é avaliada pela metacolina-induzida para obstrução das vias áereas. Os camundongos são expostos por 2,5 minutos a nebulização por soro fisiológico (Otsuka Pharmaceutical), seguido por doses incrementais (1-30 mg/ml) de metacolina nebulizada. Estes camundongos são colocados em um pletismografia de corpo inteiro por 2,5 min seguido de nebulização, e pausa realçada (Penh) é medida usando Biosystem XA WBP system (Buxco Electronics). "Penh" representa a obstrução pulmonar das vias áereas e é calculado usando a fórmula: Penh = ((Te Tr)/(Tr X PEF/PIF)), onde Penh = pausa realçada (adimensional), Te = tempo expiratório (segundos), Tr = tempo de relaxamento (segundos), PEF = pico de fluxo (mililitros por segundo) , PIF = pico de fluxo expiratório (mililitros por segundo). Penh é medido e calculado a aproximadamente cada 5 s, e os valores cumulativos são calculados em média como o valor Penh para cada ponto de tempo. A hiperresponsividade das vias aéreas é expressa como PC200Mch (200% da concentração provocativa da metacolina), que é a concentração de metacolina que dobrou o valor Penh da linha base.

Análise do líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) Após a medida da hiperresponsividade das vias aéreas, amostras da lavagem broncoalveolar são obtidas. Os camundongos anesteziados por uma injeção i.p. de quetamina de 100 mg/kg e de um xilazina de 10 mg/kg, e então os pulmões são lavados com 0,5 ml de soro fisiológico por quatro vezes. O líquido de lavagem centrifugado e as células resuspensas em 1 ml de soro fisiológico com 1% BSA. O número de células total é contado usando um hemocitômetro. As amostras de Cytospin são preparadas centrifugando suspensões em 300 RPM por 5 minutos. Para distinguir claramente os eosinófilos dos neutrófilos, três diferentes corantes são aplicados: Diff-Quick, May- Grünwald-Giemsa, e Hansel (eosin). Pelo menos 300 leucócitos são diferenciados pela luz microscópica baseada nos critérios morfológicos padrões. O nível de IL-13, de IL-4 e de IL-5 em BALF é detectado pelo ensaio citométrico de grânulos (BD biosciences, Mountain View, CA, USA) seguindo as instruções do fabricante.

Medida total do soro IgE e Ig OVA específica

No dia 21, amostras de sangue são obtidas por punção do plexo venoso retro-orbitário com os animais anestesiados. Depois que as amostras coagularam totalmente, elas foram centrifugadas, e os soro são coletados e armazenados a 80° C até o uso. IgE total é testado por ELISA usando Abs emparelhado (BD Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir IgE, IgGl, e lgG2a OVAs especificas em soro, as placas microtiter (Maxisorp, Nunc, VWR internacional, Haasrode, Bélgica) são revestidas com 2 μg/ml de OVA. Subseqüentemente, os poços são obstruídos com 0,1% de caseina em PBS, depois disto as placas incubadas com amostras de soro do rato diluídas 1:10 a 1:20480 em PBS contendo 0,1% de caseina e 0,05% Tween 20 (PBS-CT), com anti-camundongo lgG2a-HRP de cabra [Southern Biotechnology (SBA), Imtec ITK Diagnostic, Antwerpen, Bélgica, diluição 1:5000], anti-camundongo IgGl-HRP de cabra (SBA, diluição 1:5000). Após a lavagem, substrato [3, 3', 5 , 5' tetrametilbenzidina (TMB) substrato reagente, Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]; é adicionado a cada poço. Finalmente, as reações são interrompidas adicionando IM de H2SO4 aos poços. As absorbâncias são lidas em 450 nm. As contagens de ELISA são expressas como títulos, que são o inverso da diluição mais elevada que ainda tem OD450 maior do que o valor calculado da interrupção. A interrupção é calculada como meio OD450 de camundongos não imunizados aumentado em três vezes o SD.

Exame histológico do tecido de pulmão

Após as amostras da lavagem broncoalveolar serem obtidas, os pulmões foram perfundidos com soro fisiológico e retirado dos camundongos. Os pulmões foram reparados com formalina em tampão neutralizado e embebidos em parafina. As seções (3-um de espesssura) são coradas com H&E ou ácido periódico de Shiff (PAS). A intensidade das mudanças histological nos pulmões é avaliada com os quatro graus de contagem (0, nenhuma inflamação; 1. leve/branda; 2. moderada; e 3, severa) , de acordo com a distribuição e a intensidade encontrada a seguir: 1) derramamento ou ondulação dos núcleos das células do epitélio respiratório, 2) aumento no número de células caliciformes, 3) infiltração de células inflamatórias dos vasos na área da mucosa e submucosa do brônquio e do intersticial peribronquial, e 4) hipertrofia e espessura epitelial da camada da célula do músculo liso.

RT-PCR para a análise da expressão do gene da citocina e chemokine no pulmão

Os pulmões são removidos após a perfusão com o soro fisiológico, e o RNA total é extraído usando ISOGEN (Nippon gene) de acordo com as instruções do fabricante. 0 RNA total (10 ug) é reverso transcrito usando oligo(dT)15 primer (Promega) e sobrescrito II por transcrição reversa Rnase H (Invitrogen Life Technologies) em 42°C por 2 h.

Para assegurar-se de que cada amostra contenha a mesma quantidade de cDNA, a concentração de β-actin cDNA de cada amostra é determinada primeiramente usando primers β-actin específicos. Estas amostras são amplificadas para o número apropriado de ciclos, tais que a quantidade do produto PCR permanesça na parte linear da curva de amplificação. Os produtos PCR são eletroforado com 2% de um gel de agarose foram visualizados por corante de brometo de etídeo. Os níveis de eotaxina, IL-13, IL-10, IFN-γ, e TGF- β são determinados usando os seguintes conjuntos de primer específicos.

O primer sense para β-actin 5'-ACGACATGGAGAAGATCTGG-31 , e o antisense 51-TCGTAGATGGGCACAGTGTG-3'.

O primer sense para IL-13 5'-TCTTGCTTGCCTTGGTGGTCTCGC- 3·, e o antisense 51-GATGGCATTGCAATTGGAGATGTTG-3'.

O primer sense para eotaxina 51 - GGGCAGTAACTTCCATCTGTCTCC-3 1 , e o antisense 5'- CACTTCTTCTTGGGGTCAGC-31.

O primer sense para IL-IO 51-TACCTGGTAGGAGTGATGCC-3' , e o antisense 51 -GCATAGAAGCATACATGATG-3' .

O primer sense para IFN-γ 5'-CATAGATGTGGAAGAAAAGA-3', e o antisense 5'-TTGCTGAAGAAGGTAGTAAT-3'.

O primer sense TGF- β 51-CTTTAGGAAGGACCTGGGTT-31 , e ο antisense 5'-CAGGAGCGCACAATCATGTT-3'.

Culturas de célula, proliferação e ensaio de citocina

Um dia após a inalação (dia 21) a suspensão de célula única do baço e dos gânglios linfáticos mediastinal são preparados passando 70 μπι das células através dos filtros coadoreses de célula (Becton/Dickinson Labware). Os eritrócitos são removidos das suspensões da célula do baço pela incubação da célula vermelha no tampão de Iise. As células T CD4+ e células T CD4+CD25" são enriquecidas usando o kit de isolamento da célula T CD4+ (Miltenyi Biotec, Germany) ou kit de isolamento da célula reguladora T CD4+CD25+ (Miltenyi Biotec, Germany), respectivamente e colunas MACS (midiMACS; Miltenyi Biotec).

Os ensaios de proliferação do volume de esplenócito e das populações LN7 2 χ IO5 células são cultivados em placas de 96 poços com fundo em U em um volume total de 200 μΐ completo do meio sozinho ou com OVA purificada, e com ou sem anti-IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. A OVA é adicionada em concentrações que variam de 1 a 100 μg/ml. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 pg/ml. Para ensaios de proliferação de populações das células T CD4+ e célula T CD4+CD25~, 2 χ IO5 células T CD4+ ou células T CD4+CD25" são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em U os esplenócitos tratados mitomicina que são carregados com 1 mg/ml OVA por 16 h, agindo como células que apresenta antígeno, na relação de célula T CD4+ ou célula T CD4+CD25~ /APCs 1/1, 1/0,3, 1/0,1, 1/0,03, l/O em um volume total de 200 μΐ completo do meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 h a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 uCi/poço [3H]-timidina. 0 limite de radioatividade DNA é colhido 18 h mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Para medidas de citocina, os sobrenadantes das culturas de célula usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 h de cultura e congelados a -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA).

Testes de atividade reguladora T in vivo Um dia após a inalação final (dia 21), 0,1% de colagenase (Sigma-Aldrich) a 37°C por 20 minutos são digeridos pelos baços dos camundongos. Em algumas experiências, as suspensões célula única de células inteiras do baço são preparadas e cultivadas com Con A (2 μ9/ml; Sigma-Aldrich) por 48 h. As células são coletadas, e 107 células são transferidas por adoção i.v. em camundongos domesticados BALB/c. Para a seleção negativa, as células de CD4 +, de CD8+, CDllC+, CD19+, ou CDllb+ são consumidas pelas células inteiras do baço usando grânulos magnéticos (MACS; Miltenyi Biotec) com biotinilado o anti-camundongo CD4, CD8, CDllc, CD19, e CDllb mAb (BD Pharmingen), de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência do consumo é examinada pela citometria de fluxo (> 99%) . CD4+, células CD4+CD25~ purificada usando o kit de isolamento da célula T CD4+. Kit de isolamento da célula reguladora T seguindo as instruções do fabricante. A pureza das células selecionadas positivamente é verificada usando a citometria de fluxo. Para experiências de transferência de células, as células são transferidas em camundongo BALB/c das veias da cauda imediatamente antes da sua primeira imunização ou imediatamente após a sua segunda imunização com OVA/alum. 0 número de células transferidas é IO7 para células inteiras do baço, depleção de subpopulações de células do baço, ou células positivamente selecionadas de CD4+ e células CD4+CD2 5-.

No modelo humanizado SCID (hu-SCID) (como descrito por Duez et al., 2000; Hammad et al, 2000)

Neste modelo, a resposta imunitária alérgicas do alergênico dos ácaros da poeira domiciliar (HDM) alergênio Der pl pode ser estudados. Tais camundongos hu-SCID reconstituído i.p. com PBMC dos pacientes alérgicos a HDM e subseqüentemente exposto aos aerossóis de HDM produz o IgE humano, desenvolvem uma infiltração pulmonar composta de células T ativadas e DCs, e exibem AHR em resposta aos agentes brônquios constrictores (Pestel et al. 1994, J Immunol, 153:3804; Duez et al., Am J Respir Crit Care Med, vol 161, ppp 200-206, 2000) .

Bactérias

A cepa L. Iactis MG13 63 é usadas durante todo este estudo. As bactérias são cultivadas no meio GM17, isto é M17 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são armazenadas a -200C em 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas em estoque são diluídas em 200 dobras em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Elas alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ IO9 unidades formadoras de colônias (CFU) por ml dentro de 16 horas. As bactérias são colhidas por centrifugação e concentradas 10 vezes no meio BM9. Para o tratamento, cada camundongo recebe 100 μΐ desta suspensão diariamente pelo catéter intragástrico.

Plasmídios

Der ρ 1, um resíduo de 222 glicoproteína globular do aminoacido, é um dos alergênicos principais dos ácaros dermatofagoides pteroníssinus (Dpt). A seqüência do DNA com o uso ótimo do codon L. Iactis codificando a proteína Der ρ 1 é sintetizada, amplificada e fundida ao sinal de secreção Usp45 do vetor pT1 NX resistente do eritromicina a jusante do promotor P1 lactococcal . As cepas MG13 63 transformadas com os plasmídios que carregam IL-IO murina, Der p 1, Der ρ 1 aa52-71 e Der ρ 1 aall7-133 cDNA são designadas LL-IL10, LL-Derpl, LL-Derplaa52-71 e LL- Derplaal 17-133, LL-pTINX, que é MG13 63 contendo o vetor vazio pTINX , serve como controle.

Quantificação de Der p 1

Der p 1 de LL-Derpl é determinada usando um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima especifica Der ρ 1 (ELISA). A produção das proteínas recombinantes é também avaliada pela análise de Western blot. Pacientes

O sangue é coletado dos doadores sensíveis ou não sensíveis aos ácaros da poeira domiciliar. Os pacientes alérgicos apresentam características usuais da sintetização do ácaro da poeira domiciliar. Os testes de prick para o alergênico do dermatofagoides pteroníssinus (Dpt) (Stalergènes, Fresnes, France)(diâmetro ≥ 10 mM) são positivos, e todos os pacientes têm o soro dos anticorpos IgE específicos. As concentrações totais de IgE são maiores do que 150 IU/ml (150-1600 IU/ml). Os doadores saudáveis são testados como controles negativos (os níveis totais de IgE são menores do que 150 IU/ml, e têm testes negativos de prick da pele geralmente para alergênicos inalamd).

Preparação mononuclear das células sangüíneas perifericas humana

O plasma rico em plaquetas é obtido após a centrifugação (120 x g, 15 minutos) e descartado. As células sangüíneas são então diluídas em RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Scotland) (vol/vol) e mergulhadas sobre um gradiente de Ficoll (Pharmacia, Upsala, Sweden). Após a centrifugação (400 x g, 30 minutos) , PBMCs é colhido na interface e lavado três vezes no meio estéril de RPMI antes da transferência.

Camundongos

Camundongos C.B.-17 SCID (6-8 semanas de idade) são mantidos nos isoladores com fundo esterelizado em um ambiente especifico para animais. A colônia SCID é regularmente verificada para ver se há ausência de immunoglobulinas no soro do rato por ELISA.

Transferência mononuclear das células sangüíneas perifericas humana em camundongos SCID: Camundongos PBMC hu-SCID

Camundongos SCID estão entre 6 e 8 semanas de idade no momento da transferência da célula. Os camundongos são reconstituídos por injeção intraperitoneal de 10 χ IO6 células mononucleares de pacientes alérgicos ou doadores saudáveis em 400 μΐ de RPMI através de uma agulha 23 gauge. No mesmo dia, eles receberam intraperitonealmente 2 indíces de reactividade [IR] ; unidades Dpt. Quatro dias após a reconstituição da célula, os camundongos SCID são expostos diariamente aos aerossóis do alergênico que contêm 100 unidades IR de Dpt (100 unidades IR equivalente a aproximadamente 200 pg da proteína contida no extrato de Dpt) por 4 dias consecutivos (dia 0 ao dia 4) . 0 grupo de controle não é exposto a Dpt. Um dia antes da medida de receptividade das vias aéreas (dia 35 e dia 60) , os camundongos hu-SCID são expostos a um outro aerossol de 100 unidades IR da solução Dpt.

Ajuste experimental

Os camundongos recebem L. Iactis projetado para expressar Der ρ 1 ou um antígeno irrelevante (OVA) como controle negativo, combinado ou não com proteína LL-IL10 ou IL-10 (1 ou 10 μg) . As bactérias L. Iactis projetadas são administradas oralmente aos camundongos SCID usando um cateter gástrico, usando diferentes intervalos de tratamento e as doses que começam um dia após a reconstituição de PBMC. A indução da tolerância oral é avaliada medindo anticorpos IgE do soro humano, análise da infiltração pulmonar, medida de AHR e análise das populações da célula e produção de citocina no BALF. Além disso, a indução de tolerância é avaliada pela análise da resposta proliferativa da célula T contra a Der ρ 1.

Avaliação da receptividade das vias aéreas (AHR) da receptividade das vias aéreas (expressado como dose provocativa do carbacol que causa um aumento de 50% na resistência do pulmão) é medida no dia 35 ou dia 60, como descrito por Duez et al.. 2000.

Medidas IgE humanas

Vários dias após o transplante com células humanas, a colheita de sangue dos camundongos foi realizada por punção do plexo venoso retro-orbitário com os animais anestesiados com éter. O IgE humano total é investigado por um método imuno-radiométrico em dois-locais com o uso de dois camundongos diferentes mAbs específicos para ε-cadeia (Immunotech internacional, Luminy, France). Pelo menos 20 μl de soro é usado em um teste duplicado. A sensibilidade do método permite a detecção de 0,1 IUiml (0,24 ng/ml).

0 IgE Ab específico contra o alergênico Dpt é quantificado por ELISA. Momentaneamente, tubos plásticos (Maxisorb Startube, Nunc, Dinamarca) são revestidos durante a noite com o alergênico Dpt no tampão de 0,1 M carbonato/bicarbonato (pH 9,6) a 4°C e saturado com 1% BSA em 0,1 M PBS (pH 7,4) por 2 h em temperatura ambiente. Após a lavagem, os tubos são incubados por 2 h em temperatura ambiente e durante a noite em 4 0C com o soro dos camundongos Hu-SCID diluído em PBS contendo BSA (1%) e Tween (0,01%). Após lavagens extensivas, um IgE anti-humano HRP-etiquetado Ab é adicionado. Após a lavagem, o substrato [3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB) substrato reagente, Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]; é adicionado a cada poço. Finalmente, as reações são interrompidas adicionando IM de H2SO4 aos poços. As absorbâncias são lidas em 450 nm.

Exame histologico do pulmão.

Os pulmões foram excisionados no dia 3 5 e são reparados no paraformoldeído e processado embebido em parafina. As seções do tecido de parafina são coradas para a detecção de células humanas CD45+ depois disto as células humanas nas seções murina do pulmão foram quantificadas pela contagem histologica como descritas por Duez et al. 2000 .

A análise do líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) BALF é analisada como descrita no modelo alergênico

Ova.

Culturas de célula, Proliferação e Ensaios de citocina:

As suspensões únicas da célula do baço são preparadas passando as células através de 70 μπι das células através dos filtros coadoreses de célula (Becton/Dickinson Labware). Os eritrócitos são removidos das suspensões da célula do baço pela incubação da célula vermelha no tampão de Iise. As células T CD4+ e células T CD4+CD25" são enriquecidas usando o kit de isolação humano da célula T CD4+ (Miltenyi Biotec, Alemanha) ou kit de isolação humano da célula reguladora T CD4+CD25+ (Miltenyi Biotec, Alemanha), respectivamente e colunas MACS (midiMACS; Miltenyi Biotec).

Os ensaios de proliferação do volume de esplenócito, 2 χ 10^5 células são cultivadas nas placas 96 poços com fundo em U em um volume total de 2 00 μl em um meio completo ou sozinho com Der ρ 1 purificado, e ainda com ou sem anti- IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. Der ρ 1 é adicionado nas concentrações que variam de 1 a 100 μg/ml. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 ug/ml. Para ensaios de proliferação das populações das células humanas T CD4+ e células humanas CD4+CD25-, 0,2x 10^5 de células, células T CD4+ ou células T CD4+CD25- são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em U com PBMC mitomicina humana tratada que são carregados com 1 mg/ml Der ρ 1 por 16 h, agindo como células que apresenta antigeno, na razão de célula T CD4+ ou células T CD4+CD25- /APCs 1/1, 1/0,3, 1/0,1, 1/0,03, l/O em um volume total de 200 μl completo do meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 horas a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 uCi/poço [3H]-timidina. 0 limite de radioatividade do DNA é colhido 18 horas mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Para medidas da citocina, os sobrenadantes das culturas de células usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 horas de cultura e congeladas em -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA) .

Exemplo Cl: LL-ILlO aumenta significativamente a capacidade de indução de LL-OVA e LL-Der ρ 1 em OVA- e modelo de rato huSCID para asma, respectivamente.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A adição de LL-IL-10 aumenta significativamente a indução de tolerância para OVA/Derpl enquanto a resposta proliferativa alergênico-específica dos esplenócitos é significativamente reduzida no grupo LL- OVA/Derpl+LL-mlL-lO em comparação ao controle e aos grupos LL-OVA/Derpl.

Exemplo C2: LL-ILlO potencializa a tolerância oral em associação com AHR reduzido, infiltração eosinofílica, níveis de IgE do soro, e produção abaixada da citocina IL- 13, IL-4 e IL-5 em resposta ao dito alergênico.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). AHR, infiltração eosinofílica de BALF, titer de IgE bem como a produção de citocina em resposta do dito fator é determinado como descrito acima. AHR, infiltração eosinofílica de BALF, titer de IgE é reduzido fortemente, e IL-13, IL-4 e IL-5 são significativamente abaixados no grupo de LL-OVA/Derpl+LL- mlL-10 em comparação com o controle e grupos de LL- OVA/Derpl.

Exemplo C3 : LL-ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se as células T CD4 mediam a indução da tolerância oral, a resposta proliferativa alergênico- específica da célula T CD4 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. Conseqüentemente, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental) e a proliferação de alergênicos específicos da célula T CD4+ é determinado como descrito em Culturas de célula, Proliferação e Ensaios de citocina. A resposta alergênico-específica da célula T CD4 no grupo LL-OVA/Derpl + LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao controle e aos grupos de LL-OVA/Derpl.

Exemplo C4: IL-IO é menos eficaz do que LL-ILlO na potencialização da tolerância oral.

Para avaliar se LL-ILlO é tão eficaz quanto IL-IO, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima {grupo experimental). A resposta proliferativa alergênico- específica da célula T CD4 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. A resposta alergênico-específica da célula T CD4 no grupo de LL-OVA/Derpl + LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao LL-OVA/Derpl + IL- 10 grupos.

Exemplo C5: As células T reguladoras antigeno- induzidas seguindo a combinação da terapia LL-OVA - LL-IL10 pode transferir a proteção de respostas similares à asma in vivo. Para testar a supressão ativa de respostas similares à asma nos camundongos tratados com o protocolo de tolerância oral, nós transferimos adotivamente esplenócitos dos diferentes grupos tratados como descritos acima {no ensaio de atividades reguladoras T in vivo) . Comparado com os controles e os grupos de LL-OVA, respostas similares à asma são significativamente reduzidos no grupo LL-OVA + LL- mlL-10, indicando a ativação das células reguladoras T CD4+ em nosso protocolo de tolerância oral da combinação.

Exemplo D: Indução de tolerância ao alfa-gliadina seguindo a administração oral de L. Iactis que secreta o dito alergênico em combinação com entrega IL-IO in si tu.

Introdução

Doença celíaca também conhecida como o sprue celíaco ou enteropatia por sensibilidade ao glúten, é uma doença inflamatória crônica que desenvolve de uma resposta imunitária específica para grãos dietéticos que contêm glúten. Celíaca é uma desordem complexa e multigênica que é fortemente associada com os genes que codificam as variantes do antígeno humanos leucocitário HLA-DQ2 ou HLA- DQ8. Um dos aspectos dos mais importantes na patogênese celíaca é a ativação de uma resposta imunitária de um T- auxiliar 1. Isto surge quando as células apresentado antígenos que expressam as moléculas HLA-DQ2/DQ8 apresentam os peptídeos tóxicos do glúten para as células T CD4(+). Ambas as classes de proteínas do glúten, gluteninas e gliadinas, contêm os peptídeos que ligam DQ2 e DQ8. Aceita- se geralmente que a resposta imunitária, tal como a produção de IFN-γ das células T especificas do glúten, provoca a destruição da mucosa no intestino pequeno de pacientes de doença celíaca. Assim, a ativação de uma resposta imunitária prejudicial da célula T no intestino de pacientes com doença celíaca parece ser chave na iniciação e progressão da doença.

Aqui, nós demonstramos que a administração oral de peptídeos da gliadina em combinação com IL-IO que produz L. lactis suprime as respostas imunes gliadina-específicas através da indução das células T reguladoras CD4+ antígeno- específicas.

Material e métodos para os exemplos

As cepas L. lactis MG1363 é usada durante todo este estudo. As bactérias são cultivadas no meio, i.e. M17 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são armazenadas em -20 °C em 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas em estoque são diluídas em 200-dobras em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Elas alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ 10^9 unidades formadoras de colônias (CFU) por ml dentro de 16 horas. As bactérias são colhidas por centrifugação e concentradas 10 vezes no meio BM9. Para tratamento, cada camundongo recebe 100 μl desta suspensão diariamente pelo catéter intragástrico.

Plasmídios

A seqüência do DNA com o uso ótimo do codon L. lactis codificando a proteína alfa-gliadina (baseada na seqüência de Trticum aestivum, AJ133612), HLA-DQ8 (correspondem aos resíduos 203-220, a seqüência QYPSGQGSFQPSQQNPQA de UniProtKB/TrEMBL entrada Q9M4L6) e HLA-DQ8 na forma desamidada (correspondente aos resíduos 203-220, seqüência QYPSGEGSFQPSQENPQA de UniProtKB/TrEMBL de entrada Q9M4L6) pepetídeos gliadinas são sintetizados, amplificados e fundidos ao sinal de secreção Usp4 5 do vetor pTINX resistente do eritromicina, a jusante do promotor Pl actococcal. As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam IL-IO murina, alfa-gliadina, HLA-DQ8, e HLA- DQ8 desamidada são designadas LL-ILlO, LL-HLA/DQ8, LL- HLA/DQ8d. LL-pTINX, que é MG1363 contendo o vetor vazio pTINX, serve como controle.

Quantificação de HLA-DQ8 e DQ8d

HLA-DQ8 e HLA-DQ8d de LL-HLA/DQ8 e LL-HLA/DQ8d e determinada usando ELISA, desenvolvidos em labotatório. A produção das proteínas recombinantes é também avaliada pela análise de Western blot.

Camundongos

Camundongos trangênicos HLA-DQ8 (Senger et al. 2003) são mantidos sob condições livres de patogênicos específicos em uma dieta livre de glúten e usados na idade de 8-14 semanas. Os camundongos imunizados por injeções intrafoodpad com 50 ug de glúten bruto (Sigma-Aldrich) em 50 μl CFA (Difco; BD) .

A indução da tolerância oral

Para experiências de tolerância, LL-HLA/DQ8, LL- HLA/DQ8d sozinho ou combinado com IL-IO (1 ou 10 μg) ou LL- ILlO, LL-ILlO sozinho, IL-IO sozinho (1 ou 10 ug) , LL-pTINX ou água (sem controle de alimentação) é administrado antes e depois da imunização usando diferentes intervalos de tratamento e doses. Como controles positivos para a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados com doses de 50 mg de gliadina de trigo ou alf a-gliadina recombinantes, dissolvidos em água da solução resevada, nos dias 4, 5, 6, e 7 antes da imunização (dia 0) .

Medida do soro IG de gliadina específica

A gliadina bruta (Sigma-Aldrich) é resuspensas em 10 mg/ml de metanol, e é então diluída no etanol absoluto em uma concentração de 1 μg/ml. Cem microlitros de 1 μg/ml da solução de etanol de gliadina são colocados em cada poço de placa Immulon 2 (Fisher Scientific International Inc.) e é reservado então para secar sob uma capa. A placa é então obstruída com 4% BSA/PBS por 2 horas a 37°C. A placa é lavada com 1 PBS, 0,05% Tween-20. As amostras de soro são diluídas em 0,1% BSA/PBS 1:200, 1:400, e 1:800 e incubadas por 1 hora a 37°C. Os anticorpos de detecção são biotinilado o anti-camundongo IgA do rato de Accurate Chemical & Scientific Corp., e biotinilado anti-camundongo IgG de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 0 conjugado da enzima eestreptavidinaa-HRP, e o substrato é TMB.

Culturas de célula, Proliferação e Ensaios de citocina

As suspensões únicas da célula do baço e gânglios linfáticos mediastinal são preparados passando as células através de 70 μπι das células através dos filtros coadoreses (Becton/Dickinson Labware). Os eritrócitos são removidos das suspensões da célula do baço pela incubação da célula vermelha no tampão de Iise. As células T CD4+ e células T CD4+CD25~ são enriquecidas usando o kit de isolação da célula T CD4+ (Miltenyi Biotec, Alemanha) ou kit de isolação da célula reguladora T CD4+CD25+ (Miltenyi Biotec, Alemanha), respectivamente e colunas MACS (midiMACS; Miltenyi Biotec).

Os ensaios de proliferação do volume de esplenócito e populações LNi 2 χ IO5 células são cultivadas nas placas 96 poços com fundo em U em um volume total de 20 0 μΐ em um meio completo ou sozinho com gliadina bruta ou HLA-DQ8/DQ8d sintético, e ainda com ou sem anti-IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. Antigenos são adicionados em concentrações que variam de 1 a 100 μg/ml. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 μg/ml. Para ensaios de proliferação de células T CD4+ e populações de células T CD4+CD25", 2 χ IO5 de células T CD4+ ou células T CD4+CD25" são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em U com esplenócito tratado mitomicina que são carregados com 1 mg/ml de gliadina bruta ou HLA- DQ8/DQ8d sintético por 16 h, agindo como células que apresenta antígeno, na razão de célula T CD4+ ou células T CD4+CD2 5~/APCs 1/1, 1/0,3, 1/0,1, 1/0,03, 1/0 em um volume total de 200 μl completo do meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 horas a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 μCi/poço [3H]-timidina. 0 limite de radioatividade do DNA é colhido 18 horas mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston7 EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Para medidas da citocina, os sobrenadantes das culturas de células usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 horas de cultura e congeladas em -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA).

Exemplo Dl: LL-ILlO aumenta significativamente a capacidade de indução de LL-HLA/DQ8d

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (indução da tolerância oral). A adição de LL-IL-10 aumenta significativamente a indução da tolerância para HLA-DQ8d enquanto a resposta proliferativa especifica de HLA-DQ8d- dos esplenócitos é significativamente reduzida no grupo LL- HLA/DQ8d+LL-mlL-10 em comparação ao controle e aos grupos de LL-HLA/DQ8d. Exemplo D2: LL-ILlO potencializa a tolerância oral em associação com produção reduzida de IFN-γ em resposta ao dito alergênico.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (Indução da tolerância oral). A produção de citocina em resposta a HLA-DQ8d é quantificada como descrita acima (Culturas de célula, Proliferação e Ensaios de citocina). Nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos, a produção de citocina proinflamatória IFN-γ é fortemente reduzida no grupo de LL-HLA/DQ8d+LL- mlL-10 em comparação ao controle e aos grupos de LL-HLA/DQ8d.

Exemplo D3: LL-ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se as células T CD4 mediam a indução da tolerância oral, a resposta proliferat iva especifica da célula T CD4 DQ8 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. Conseqüentemente, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (indução da tolerância oral) e a proliferação da célula especifica T CD4 DQ8 é determinado como descrito em Culturas de célula, em Proliferação e Ensaios de citocina. A resposta especifica da célula T CD4 DQ8 no grupo LL-HLA/DQ8d+LL-mlL- 10 é significativamente reduzida em comparação ao controle e aos grupos de LL-HLA/DQ8d. Exemplo D4: IL-1O é menos eficaz do que LL-IL1O na potencialização da tolerância oral

Para avaliar se LL-ILlO é tão eficaz quanto IL-10, os camundongos são allimentados oralmente como descrito acima (indução da tolerância oral). A resposta proliferativa especifica da célula T CD4 DQ8 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. A resposta especifica da célula T CD4 DQ8 no grupo de LL-HLA/DQ8d+LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao grupo LL- HLA/DQ 8 d + IL-10.

Exemplo Ε: A indução de tolerância ao alergênico do alimento BLG seguindo a administração oral L. lactis que produz o dito alergênio em combinação com a entrega de IL- 10 in si tu

Introdução

Alergia ao alimento é uma doença que afeta aproximadamente 2% a 5% da população. Em seres humanos, os anticorpos IgE elevados bem como a presença da produção de IL-4, linfócitos T antígeno específicos sugerem um mecanismo Th2-skewed.

Aqui, nós demonstramos que a administração oral de um alergênico do alimento em combinação com IL-10 que produz L. Iactis suprime respostas específicas imunes alergênico através da indução de células T reguladoras antígeno específicas CD4+. Material e Métodos para exemplos

As cepas L. Iactis MG1363 é usada durante todo este estudo. As bactérias são cultivadas no meio, i.e. M17 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são armazenadas a -20°C em 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas em estoque são diluídas em 200-dobras em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Elas alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ IO9 unidades formadoras de colônias (CFU) por ml dentro de 16 horas. As bactérias são colhidas por centrifugação e concentradas 10 vezes no meio BM9. Para tratamento, cada camundongo recebe 100 μΐ desta suspensão diariamente pelo catéter intragástrico.

O cDNA β -lactoglobulina dos bovídeos é amplificado e fundido ao sinal de secreção Usp45 do vetor pTINX resistente eritromicina, a jusante do promotor Pl lactococcal. As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam murina IL-10 ou BLG, são designadas LL-IL10 e LL-BLG. LL-pTINX, que é MG1363 contendo o vetor vazio pTINX , serve como controle.

A quantificação de β-lactoglobulina dos bovídeos (BLG)

BLG de LL-BLG e determinada usando ensaio imunoabsorvente intralaboratorial ligado â enzima BLG- específica (ELISA) e análise Western blot.

Ajuste experimental

O modelo murina de alergia ao alimento usado para explorar o efeito protetor L. Iactis é um modelo do rato de resposta ao alimento induzido tipo IgE como descrito por Frossard et al. (J. Allergy Clin Immunol 113:958-964, 2004) . Os camundongos recebem LL-BLG ou um antígeno irrelevante (OVA) como controle negativo, combinado ou não com LL-ILlO ou IL-IO recombinantes (1 ou 10 pg) . Como um controle positivo para a indução de tolerância, os camundongos receberam uma alta dose de BLG na água para impedir que os camundongos sofram anafilaxia no desafio oral com BLG.

Em um ajuste profilático, as bactérias L. Iactis projetadas que produzem BLG são administradas oralmente aos camundongos usando um cateter gástrico, usando diferentes tratamentos e doses. Subseqüentemente, estes camundongos receptores são desafiados oralmente com o antígeno BLG purificado, na presença de toxina da cólera. Os animais do controle são expostos a L. Iactis projetado com um vetor de controle que não expresse BLG (mas preferivelmente OVA) . A indução de tolerância é avaliada pela análise da anafilaxia após o desafio intragástrico do antígeno, medindo BLG- específico IgGl, IgG2a e títulos IgE no soro e nas fezes, determinando o número de células produtora de anticorpo no baço e PP, pela análise da produção da proliferação e da citocina da célula T em MLN, PP e baço.

Para avaliar se a indução de tolerância imunológica para BLG poderia ser realçada por IL- 10, os camundongos são administrados com LL-BLG junto com LL-ILlO.

Sensibilização oral a BLG.

Ratas de quatro a cinco semanas C3H/HeOuJ (Charles River) imunizados nos dias 0, 7, 14, e 21 por gavagem intragástrica com o 2 mg de BLG (Sigma) e 10 yg de CTX, comprado do List Biological Laboratories em 0,2mol/L NaHCO3. 0 grupo de controle positivo (camundongo tolerizados) recebe 0,8 mg/mL BLG em seu bebedouro por 4 semanas. A quantidade total de proteína dada (22,4 mg) é similar à quantidade total de BLG dado aos camundongos sensibilizados. Para demonstrar que o procedimento de tolerância também ativa continuamente o sistema periférico e não somente o sistema imune de mucosas, duas injeções de 80 ug de ip BLG absorvido a 1 mg alum foi dada em um grupo de camundongo tolerizados nos dias 28 e 42.

O desafio do antígeno No dia 28, todos os camundongos foram desafiados por gavage intragástrica com 100 mg de BLG em 0,4 mL 0,2mol de NaHC03. A anafilaxia ê observada e classificada usando uma contagem de reação (0, sem reação, a 3, diversas reações ou mortes) descrita em detalhe em outra parte (Frosssard et al. , 2001) . A temperatura interna do corpo é medida por infravermelho na orelha antes do desafio e 3 0 minutos após o gavage. Os animais são exterminados, e o sangue é coletado pela punctura cardíaca nos tubos contendo EDTA, e o plasma é obtido para a medida de histamina pelo kit comercial ELISA (Immunotech, Marselha, France).

Culturas de célula, proliferação e ensaio de citocina Suspensões de células única do baço, os gânglios inguinais mesentéricos e PP são preparados como descritos por Frossard et al. . (2004). As células T CD4+ e células T CD4+CD25~ são enriquecidas usando o kit de isolamento da célula T CD4+ (Miltenyi Biotec, Germany) ou kit de isolamento da célula reguladora T CD4+CD25+ (Miltenyi Biotec, Germany), respectivamente e colunas MACS (midiMACS; Miltenyi Biotec) .

Os ensaios de proliferação do volume de esplenócito e das populações LN, 2 χ IO5 células são cultivados em placas de 96 poços com fundo em U em um volume total de 2 00 μΐ completo do meio sozinho ou com BLG purificada, e com ou sem anti-IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. BLG é adicionado em concentrações que variam de 1 a 100 ug/ml. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 ug/ml. Para ensaios de proliferação de populações das células T CD4+ e célula T CD4+CD25", 2 χ IO5 células T CD4+ ou células T CD4+CD25" são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em U os esplenócitos tratados mitomicina que são carregados com 1 mg/ml BLG por 16 h, agindo como células que apresenta antígeno, na relação de célula T CD4+ ou célula T CD4+CD25~ /APCs 1/1, 1/0,3, 1/0,1, 1/0,03, 1/0 em um volume total de 200 μl completo do meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 h a 37°C em um incubador humidifiçado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 μCi/poço [3H]-timidina. 0 limite de radioatividade DNA é colhido 18 h mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Para medidas de citocina, os sobrenadantes das culturas de célula usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 h de cultura e congelados a -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA).

Testes de atividade reguladora T in vivo

Para testar a supressão ativa da formação do anticorpo nos camundongos, os esplenócitos, grânulos purificados células T CD4 +, CD4+CD25" ou células T CD4+CD25+ isoladas dos diferentes grupos expermentais de L. Lactis tratado são transferidos adotivamente aos camundongos C3H/He0uJ. Os camundongos não tratados são usados como controle. 0 número de células transferidas é IO7 para células inteiras do baço, depleção de subpopulações de células do baço, ou células positivamente selecionadas de CD4+ e células T CD4+CD25~ ou CD4+CD25+. Se Tregs forem implicadas, o desafio subseqüente destes camundongos com antígeno BLG deve impedir a indução de respostas imunes humoral contra a BLG e a anafilaxia.

Imunoensaios ligado à enzima para anticorpos BLG específico do soro e fezes.

Os soros são obtidos do sangramento da cauda no dia 0, 7, 14, 21 e 28. As fezes são obtidas no mesmo tempo e resuspensas em PBS mais 1% de FCS (Life Technologies) suplementados com o pepstatina 1:1000 (Fluka) em 0,1 mg/mL. As amostras mecanicamente desagregadas e turbilhonadas por 2 minutos, seguida por duas centrifugações a 4°C por 20 minutos a 14.000 RPM.

Os soro e as fezes testadas para níveis de anticorpos IgE, IgGl, e lgG2a e/ou IgA BLG específicos por um método adaptado de Adel-Paciente et al. (2000, J. Immunol Methods). Em suma, as placas do microtiter MaxiSorp (Nunc) são revestidas por 18 horas em temperatura ambiente com 250 ng/poço de estreptavidina (Fluka), seguido por 300 μΐ de uma solução de polivinilpirrolidona K25 (Fluka) durante a noite. Um micrograma de biotinilado BLG incubado por 3 horas, e os soro diluídos (1:6666 e 1:2222 para IgGl, 1:666 e 1:222 para IgG2a, 1:66 e 1:22 para IgE) ou as fezes (1:3, 1:10, e 1:33) em PBS mais 10% de soro de cavalo são adicionados em duplicata na presença de 0,5 ug/mL anti- camundongo IgA de cabra, anti-camundongo IgGl de rato ou anti-camundongo IgG2a anticorpos rotulados com peroxidase (Southern Biotechnologies) por 2 horas. Para a medida de IgE, um anti-camundongo monoclonal IgE Ab do rato (clone R35-72, BD Pharmingen) seguido pelo anti-rato Ab acoplado peroxidase (Caltag) é adicionado. A densidade ótica é medida em 4 90 nm. Os resultados são expressos como unidades arbitrárias, com os soro agrupadas de BLG mais camundongos alum-imunizados usados como soro de referência.

Produção de anticorpo antígeno específico medida por meio de ELISPOT.

As placas de Peyer foram excisionados mecanicamente das tripas e incubadas por 3 0 minutos no meio HBSS suplementados com 5 mmol EDTA (Life Technologies) . Similarmente, as placas de Peyer e os gânglios linfãticos mesentéricos são delicadamente esmagados e filtrados através de um filtro de náilon de 70 μπκ As células do baço pré-incubadas por 5 minutos em NH4CI Tris-tamponado para remover as células sangüíneas vermelhas. Os linfoblastos são isolados em um gradiente Percoll 60%/66% (Amersham). Para a medida de anticorpos BLG específicos IgGl, de lgG2a e IgA, as placas ELISPOT (millipore) são revestidas com a estreptavidina durante a noite a 37°C, seguido por uma adição de 1 μg de biotinilado BLG por 3 horas. Os linfoblastos são isolados em um gradiente Percoll de 60%/66% resuspensos em duas concentrações diferentes, em 1 e 2xl06 no meio de Dulbecco modificado de Iscove suplementado com penicilina, estreptomicina, L-glutamina, gentamicina, polimixina B, e 5% de FCS por 24 horas a 37°C, seguido pela incubação durante a noite a 4 0C com os anticorpos anti-lgA, anti-IgGl e anti-lgG2a (Southern Biotechnology). 100 μL/poço de aminoetilcarbazole são adicionados por 10 minutos, e os pontos são automaticamente contados usando o software KS ELISPOT 4.2.1 (Zeiss) e expressos IO6 como unidades formadoras de colônias (CFU).

Exemplo El: LL-ILlO aumenta significativamente a capacidade de indução de tolerância de LL-BLG no modelo murina de alergia ao alimento.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A adição de LL-IL-10 aumenta significativamente a indução de tolerância para BLG enquanto a resposta proliferativa alergênico-específica dos esplenócitos é significativamente reduzida no grupo de LL- BLG+LL-mlL-10 em comparação ao controle e aos grupos LL- BLG.

Exemplo E2: LL-ILlO potencializa a tolerância oral em associação com resposta ao anticorpo BLG especifica reduzida e a baixa produção de citocina IL-4 em resposta ao dito alergênico.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A resposta do anticorpo BLG especifica e a produção de citocina em resposta ao dito fator são determinadas como descrita acima. Os níveis de anticorpos BLG específicos e IL-4 são abaixados significativamente no grupo LL-BLG+LL-mlL-10 em comparação com o controle e grupos LL-BLG.

Exemplo E3: LL-ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se as células T CD4 mediam a indução da tolerância oral, a resposta proliferativa alergênico- específica da célula T CD4 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. Conseqüentemente, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental) e a proliferação de alergênicos específicos da célula T CD4+ é determinado como descrito em Culturas de célula, Proliferação e Ensaios de citocina. A resposta alergênico-específica da célula T CD4 no grupo LL-BLG+LL- mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao controle e aos grupos de LL-BLG.

Exemplo E4: IL-IO é menos eficaz do que LL-ILlO na potencialização da tolerância oral

Para avaliar se LL-ILlO é tão eficaz quanto IL-IO, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental). A resposta proliferativa alergênico- específica da célula T CD4 é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. A resposta alergênico-específica da célula T CD4 no grupo de LL-BLG + LL-mlL-10 é significativamente reduzida em comparação ao grupo LL-BLG + IL-10.

Exemplo E5: As células T reguladoras antígeno- induzidas seguindo a combinação da terapia LL-BLG - LL-IL10 pode transferir a proteção de respostas similares à alergia in vivo.

Para testar a supressão ativa de respostas similares â alergia nos camundongos tratados com o protocolo de tolerância oral, nós transferimos adotivamente esplenócitos dos diferentes grupos tratados como descritos acima {no ensaio de atividades reguladoras T in vivo). Comparado com os controles e os grupos de LL-BLG, respostas similares à alergias são significativamente reduzidos no grupo LL-BLV + LL-mlL-10, indicando a ativação das células reguladoras T CD4+ em nosso protocolo de tolerância oral da combinação.

Exemplo F: Indução de tolerância a insulina seguindo a administração oral de L. Iactis que secreta o dito alergênico em combinação com entrega IL-IO in si tu.

Introdução

A autoimunidade é caracterizada pelos danos inflamatórios espontâneos do tecido e pela função fisiológica danificada resultante da perda da tolerância ao próprio-antígeno. É associada com um sistema imune parcialmente hiperativo, que é caracterizado por um excesso de células T ajudante (th). Fatores predispostos, tais como genes de susceptibilidade e fatores ambientais são difíceis de influenciar, conseqüentemente os recentes esforços de desenvolver imunoterapia são focalizados em reestabelecer o equilíbrio funcional entre as células causadora da patogenese e células T immunoreguladoras pela depleção da anterior e/ou melhoria da última. A destruição autoimune das células beta da ilhota pancreatica é a causa principal da diabetes mellitus tipo 1 (TI D) . Esta destruição é associada com as respostas imune humoral e celular a diversos autoantígenos da célula beta, ambas podem preceder o início clínico da doença.

Aqui, nós demonstramos que a administração oral de um antígeno em combinação com IL-IO que produz L. Iactis suprime as respostas imunes especificas a diabetes através da indução das células T reguladoras CD4+ antígeno- específicas. Material e métodos para os exemplos

Bactérias e plasmídeos

As cepas L. Iactis MG1363 é usada durante todo este estudo. As bactérias são cultivadas no meio, i.e. M17 (Difco laboratories, Detroit, MI) suplementadas com 0,5% de glicose. As suspensões armazenadas de todas as cepas são armazenadas a -20 0C em 50% de glicerol em GM17. Para inoculações intragástricas, as suspensões armazenadas em estoque são diluídas em 200-dobras em GM17 fresco e incubadas a 30°C. Elas alcançaram uma densidade de saturação de 2 χ IO9 unidades formadoras de colônias (CFU) por ml dentro de 16 horas. As bactérias são colhidas por centrifugação e concentradas 10 vezes no meio BM9. Para tratamento, cada camundongo recebe 100 μΐ desta suspensão diariamente pelo catéter intragástrico.

A seqüência do DNA com o uso ótimo do codon L. Iactis codificando o peptídeo humano proinsulina II B24-C36 (hpllp), a insulina porcina e o peptídeo immunodominante InsBg-23 (B9-23 é essencialmente o mesmo das espécies humanos, ratos e camundongos) são sintetizado, amplificados e fundidos ao sinal de secreção Usp45 do vetor pTINX resistente do eritromicina, a jusante do promotor Pl lactococcal.

As cepas MG1363 transformadas com os plasmídios que carregam IL-10 murina, LL-hpllp, LL-insulina, LL- InsB^23. LL-pTINX, que é MG1363 contendo o vetor vazio pTINX, serve como controle. A expressão destas proteínas é determinada usando ELISA antígeno-específico e Western blot analysis.

Camundongos

Os camundongos machos e fêmeas não obesos (NOD) e os camundongos (Balb/c anteriores) (SCID) immunodeficientes combinados (NOD) são comprados são comprados do Jackson Laboratory. Os camundongos do tipo selvagem Balb/c (WT) são comprados do Charles River, Italy. Os camundongos são mantidos em uma área central especifica para animal livre de patôgenios. Os camundongos são tratados e usados de acordo com asa exigências institucionais.

Ajuste experimental

Em um grupo profilático, LL-hpllp, LL-insulina, LL- InsBg-23 são administrados oral aos camundongos NOD que iniciando do 21° dia de idade (weaning), sozinho ou junto com LL-ILlO ou camundongos recombinantes IL-IO (1-10 μg), e usando o regime ótimo de alimentação ou até 100 dias de idade (quando a maioria dos camundongos desenvolve diabetes). Adicionalmente, LL-pTINX é administrado oralmente como controle negativo. Para o grupo de controle positivo (tolerância), os camundongos NOD 3 semanas de idade são tratados oralmente com 0,8 mg de insulina humana por 3 vezes por semana por 2 ou 4 semanas. 0 desenvolvimento da diabetes é determinado pela monitoração contínua dos níveis do glicose da urina três vezes por semana e no caso de monitoração da glicosúria, níveis de glicose do sangue. Os Pancrêas são coletados em 12-23 semanas e no fim da experiência (35 semanas) , e das seções em série são corados com hematoxilina/eosina para marcar a infiltração mononuclear da célula ou por imunohistoquímica para analisar a infiltração da célula T. Em um ajuste terapêutico LL-hpllp, LL-insulina, LL-InsB9-23 são administrados oralmente, sozinhos ou juntos com LL-ILlO ou IL-IO do rato recombinantes, às fêmeas NOD diabéticas mostram glicosúria e hiperglicemia estáveis (12-23 semanas). Adicionalmente, LL-pTINX é administrado oralmente como um controle negativo. Para o grupo de controle positivo (tolerância), os camundongos diabéticos NOD são tratados como descritos em Bresson et al. 2006. A remissão completa ê definida como glicosúria não aparente e um retorno ao normal da glicemia.

Os mecanismos precisos de indução à tolerância são analisados in vifcro, in vitro após o redesafio os camundongos NOD com autoantígenos específicos e por transferência adotiva da célula T em camundongos NOD SCID.

Deteção da diabetes:

Monitoração da glicose:

A glicose da urina é medida usando Diastix (milhas) e confirmado pelas medidas de glicose do sangue com o sistema de monitoração da glicose do sangue OneTouch Ultra (LifeScan Inc.). A diabetes é definida por dois valores da glicose do sangue consecutivos superiores a 250 mg/dl.

Insulite:

Os camundongos são sacrificados por asfixia com CO2 e o pancrêas é conservado em 10% de formalina durante a noite, embebido em parafina, e as seções de 5 μm da série são coradas com hematoxilina e eosina. A contagem de insulite (meio ± SD) é determinada microscopicamente classificando o grau de infiltração celular em 10-15 ilhotas/camundongos como a seguir: 0. nenhum sinal visível da infiltração da ilhota; 1 infiltração da ilhota; 2. < 50% de infiltração; 3. > 50% de infiltração.

Imunohistoguímica

Para detectar a insulina, a expressão CD4 e CD8 em células β pancreáticas, preliminar Abs (insulina anti- suínos do porquinho da índia; de Dako [diluição 1:300], anti-CD4 RM4.5 e anti-CD8a IHC do BD Biosciences, [diluição 1:50] são aplicados às seções do tecido congelado como descrito em Christen et al., 2004.

Ensaios da proliferação in vitro As suspensões de células únicas do baço, LN mesentéricos (MLNs) e PLNs são preparados. Os ensaios de proliferação de populações totais do esplenócito, 2 χ IO5 células são cultivados em placas de 96 poços com fundo em U em um volume total de 200 μl completo do meio sozinho ou com (1-100 μ9/ιτι1) de insulina humana purificada ou peptídeos especifico para células T CD4 (InsB9.23, H-2d ou 9 restritos) ou para células T CD 8 (InsB15"23, Kd restrito) (Sigma), e com ou sem anti-IL-10 ou anti-TGF-β neutralizando anticorpos monoclonais. Os anticorpos neutralizantes são adicionados em 1, 0,1 e 0,01 μ9/m1. Para ensaios de proliferação de populações das células totais de células T CD3 +, células T CD8+, células T CD4+ e célula T CD4+ e populações de células T CD4+ CD25-, células T 0,2 χ 105 células são cultivadas em placas de 96 poços de fundo em U com 1 χ 105 esplenócitos irradiados dos camundongos WT Balb/c com insulina ou GAD65 ou peptídeos específicos para células T CD4+ ou de CD8+, em um volume total de 200 μl completo do meio com ou sem os anticorpos neutralizantes. Após 72 h a 37°C em um incubador humidificado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 μCi/poço [3H]-timidina. O limite de radioatividade DNA é colhido 16 a 18 h mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e a incorporação de timidina é medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer). As células T purificada de PLNs ou baços pela seleção negativa através da separação magnética do grânulo usando kit de isolamento CD3+, de CD4+ ou de CD8+ (MACS; Milteny Biotec, Auburn, Ca). As células T CD4+ são usadas como as células totais ou ainda separadas em CD25+ e CD25" por MACS usando o kit de isolamento de CD25+ (Milteny Biotec). A pureza (> 90%) das populações da célula é determinada pela análise citométrica de fluxo.

Para medidas de citocina, os sobrenadantes das culturas de célula usadas nos diferentes ensaios de proliferação são coletados após 24, 48 e 72 h de cultura e congelados a -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA).

Para medidas da citocina, os sobrenadantes das culturas de célula usadas nos diferentes ensaios de proliferação (estimulação do antígeno-específico), descritos acima, são coletados após 72 h de cultura e congelados a -80°C até que a análise da citocina seja realizada. A produção de citocina é quantificada usando o ensaio citométrico de grânulos para inflamação de camundongos (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA). As células purificadas T CD3+, CD4+, CD8+ são cultivadas e estimuladas in vifcro não especificamente com uma mistura de anti-CD3/anti-CD28 (1 ug/ml cada) por 24 horas ou elas permanesce não estimuladas como controle. Os sobrenadantes são colhidos e analisados para IL-IO, IL-4, IL-5 e para produção de IFN-γ usando o Kit flexível de disposição do grânulo citométrico BD™ em um bioanalizador BD FACSArray usando o software de disposição FCAP (BD biosciences). Experiências de captação ELISA são usadas para determinar TGF-β1 usando o Kit Quantikine (R&D System).

Ensaios de inibição da proliferação in vitro 2 χ 104 de células T CD4+CD25- do esplênico total purificado são isoladas das fêmeas NOD recentemente diabéticas (8 a 12 semanas) são co-cultivadas com um número variado de populações das células T CD8+, células T CD4+ e célula T CD4+CD25" isoladas do baço, MLN ou PLNs de diferentes grupos experimentais na presença de 2 χ IO4 células T de insulina com depleção irradiada ou esplenócitos peptídeos carregados de camundongos WT Balb/c. Após 72 horas a 37°C em um incubador humidificado com 5% de CO2, a proliferação é avaliada por adição de 1 μCi/poço [3H]-timidina. O limite de radioatividade DNA é colhido 16 a 18 hora mais tarde em esteiras de filtro de fibra de vidro (Perkin Elmer, Boston, EUA) e na incorporação da timidina medida em um contador de cintilação (Perkin Elmer).

Ensaio de citotoxidade in vitro

Alvos Iinfoblástico são os esplenócitos concavalina A ativados dos camundongo BALB/c. Um total de 106 células alvo são etiquetadas com 100 uCi de 51Cr (Amersham International, Buckinghamshire, Reino Unido) por 90 minutos a 37°C, lavadas três vezes e são então incubadas com 1 μg/ml de peptídeo (lnsB15-23 ou um peptídeo irrelevante) a 37°C por 1 h. As Células alvo são lavadas duas vezes e semeados em IO4 células por poço. As células T CD8+, isoladas do baço, MLNs e PLNs são adicionados a cada poço, triplicado, em vário efeitos: alvo razões (Ε: T). As placas são centrifugadas a 500 rpm por 2 minutos, e incubadas a 37 °C por 4 h. Após a incubação, os sobrenadantes são coletados para uma determinação da liberação de 51Cr [%Lisis = 100 X (teste cpm - espontâneo cpm) / (total cpm - espontâneo cpm)]. Para o ensaio indireto de mortalidade, células T CD8+ são incubadas com 5 μ9/πι1 de anticorpo anti- CD3 (clone 145-2C11, Pharmingen) antes da incubação com efeitos.

Transferência adotiva de diabetes

Camundongos NOD-SCID de 8 a 10 semanas são injetados i.v. com 2 x 10^7 ou i.p. com 5 x 10^6 esplenócitos isolados de camundongos fêmeas diabéticas (6 semanas, 12 semanas e 18 semanas) combinados com ou sem números de classificação de grânulo-purifiçados de células T CD3+, células T CD8+, células T CD4 +, células isoladas T CD4+CD25" ou CD4+CD25 + dos diferentes grupos experimentais tratados de L. Lactis. Os camundongos não tratados são usados como controle. O desenvolvimento da diabetes é determinado pela monitoração contínua dos níveis do glicose do sangue três vezes por semana.

Exemplo Fl: LL-ILlO aumenta significativamente a capacidade de indução de LL-hpllp, insulina LL, LL- lnsB9-23 no camundongos diabético não obeso.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A adição de LL-ILlO aumenta significativamente a indução da tolerância ao autoantígeno enquanto a resposta proliferativa do autoantígeno- específico dos esplenócitos é significativamente reduzida no grupo LL-hpllp/insulina/InsB9-23+LL-mlL-10 em comparação ao controle e ao grupo LL-hpllp/insulina/InsB9-23.

Exemplo F2: LL-ILlO potencializa a tolerância oral em associação com insulite reduzida, a taxa falecimento de célula beta destruída, e a produção de IL-10 aumentada por esplenócitos.

Para estudar a indução da tolerância oral, os camundongos são alimentados oralmente, como descritos acima (grupo experimental). A presença de insulite, da taxa de destruição da célula beta e da produção de citocina em resposta ao dito autoantígeno é determinada como descrita acima. A análise histological mostra um grau significativo mais baixo de insulite e célula beta de destruição e a produção IL-10 aumentada no grupo de LL-hpllp/insulina/ InsB9-23+LL-mlL-10 em comparação ao controle e aos grupos de LL-hpllp/insulina/InsB9-23.

Exemplo F3: LL-ILlO aumenta a tolerância oral através das células T CD4+.

Para avaliar se as células T CD4 mediam a indução da tolerância oral, a resposta proliferativa especifica da célula T CD4 do autoantígeno é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. Conseqüentemente, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental) e a proliferação da célula T CD4+ específica do autoantígeno é determinada como descrito (Ensaios de proliferação in vitro) . A resposta da célula T CD4 específica do autoantígeno no grupo de LL- hpllp/insulina/lnsB 9-23+LL-mlL-10 em comparação ao controle e aos grupos LL-hpllp/insulina/InsB9-23.

Exemplo F4: IL-IO é menos eficaz do que LL-IL10 na potencialização da tolerância oral

Para avaliar se LL-IL10 é tão eficaz quanto IL-10, os camundongos são alimentados oralmente, como descrito acima (grupo experimental). A resposta da célula T CD4 específica do autoantígeno é estudada nos esplenócitos e nos gânglios linfáticos. A resposta da célula T CD4 específica do autoantígeno no grupo de LL-hpllp/insulina/ InsB9-23 +LL- mlL-10 em comparação ao LL-hpllp/insulina/InsB9-23 + grupo IL-10.

Exemplo F5: As respostas autoagressivas CD8+ são suprimidas nos camundongos NOD que seguem a combinação da terapia lnsB15-23 - LL-IL10.

Para examinar se nossa combinação aproxima a indução supressiva da célula T CD4+ que são capazes de modular a diabetes por mecanismos supressivos do tecido vizinho, nós analisamos o efeito autoagrassivo das células T CD8+. A porcentagem e/ou atividade de células autoagrassivas CD8+ antígeno-específicas são fortemente reduzidas após a combinação da terapia.

Exemplo F6: células T reguladoras antígeno-induzidas seguindo LL-InsB15-23 - LL-IL10 a combinação da terapia pode transferir a proteção de respostas alérgicas similares in vivo.

Com a finalidade de testar a supressão ativa das respostas diabéticas similares nos camundongos tratados com o protocolo de tolerância oral, nós adotamos transferir os esplenócitos dos diferentes grupos tratados como descritos acima (transferência adotiva da diabetes). Comparado com os controles e o grupo LL-InsB9-23, respostas similares a diabetes são reduzidas significativamente no grupo LL- LL- InsBg-23+LL-mlL-10, indicando a ativação das células TCD4 + reguladoras em nosso protocolo de tolerância oral da combinação.

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LISTAGEM SEQÜÊNCIA BIOLÓGICA

<110> VIB VZW

Universiteit Gent

<120> INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA DE MUCOSA AOS ANTÍGENOS

<130> PRO/DC/V225

<150> EP 05111467.6 <151> 2005-11-29

<160> 16

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Forward primer 1 <400> 1

ggctccatcg gtgcagcaag catggaatt

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Reverse primer 1

<400> 2

actagttaag gggaaacaca tctgccaaag aagagaa

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sense primer beta-actin

<400> 3

acgacatgga gaagatctgg

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antisense primer beta-actin

<400> 4

tcgtagatgg gcacagtgtg

<210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial

Página 1 AGXOllPCT ST25.txt

<220>

<223> sense primer IL-13 <400> 5

tcttgcttgc cttggtggtc tcgc

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antisense primer IL-13

<400> 6

gatggcattg caattggaga tgttg

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sense primer eotaxin

<400> 7

gggcagtaac ttccatctgt ctcc

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antisense primer eotaxin

<400> 8

cacttcttct tggggtcagc

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sense primer IL-IO

<400> 9

tacctggtag gagtgatgcc

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antisense primer IL-IO <400> 10

gcatagaagc atacatgatg

Página 2 AGXOllPCT ST25.txt

<210> 11 <211> 20 <212> DNA <21Β> Artificial

<220>

<223> Sense primer iFN-gamma <400> 11

catagatgtg gaagaaaaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22Β> Antisense primer iFN-gamma <400> 12

ttgctgaaga aggtagtaat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sense primer TGF-beta <400> 13

ctttaggaag gacctgggtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antisense primer TGF-beta <400> 14

caggagcgca caatcatgtt 20

<210> 15

<211> 18

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 15

Gln Tyr Pro Ser Gly Gln Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Gln Asn Pro 1 5 10 15

Gln Ala

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

Página 3 <400> 16

Gln Tyr Pro Ser Gly Glu Gly 1 5

Gln Ala

AGXOllPCT ST25.txt

Ser Phe Gln Pro Ser Gln Glu Asn 10 15

Página 4

Claims (72)

1. Uso de um microorganismo que produz um composto imunomodulador em combinação com um antígeno para preparação de um medicamento, alimento funcional ou nutracêutico CARACTERIZADO por induzir a tolerância imunológica ou tratar uma doença relacionada às respostas imunitárias de um mamífero.

2. Uso de uma composição para a preparação de um medicamento, alimento funcional ou nutracêutico para tratar, evitar e/ou aliviar uma doença ou uma desordem que envolve uma doença relacionada às respostas imunitárias ou para induzir a tolerância imunológica em um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto compreende pelo menos um composto imunomodulador que produz microorganismo e um antígeno.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito mamífero do grupo que consiste de camundongo, rato, cão, gato, gado, cavalo, porco e ser humano.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita indução da tolerância imunológica é pelo menos 1,5, 2, 3 vezes ou mais em relação a antes da dita indução.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita indução da tolerância imunológica é medida pela modulação do nível de citocina no dito mamífero.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita modulação é um aumento do nível de citocina, onde a dita citocina é escolhida do grupo IL-1O, TGF-β, IL-4 e IFNα.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito aumento do nível de citocina é pelo menos 1,5, 2, 3 vezes ou mais em relação a antes da dita indução.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita modulação é uma diminuição do nível de citocina, onde a dita citocina é escolhida do grupo IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13 e TNF-α, MCP-1.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a diminuição dita do nível de citocina é pelo menos 1,5, 2, 3 vezes ou mais em relação a antes da dita indução.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno provoca uma resposta imunitária mediada da célula T e/ou célula B.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que dita resposta imunitária mediada a célula T é uma resposta Thl imune.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita célula T resposta imunitária mediada é uma resposta imunitária Th2.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é um alergênico, aloantígeno, próprio-antígenos ou um auto- antígeno.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é envolvido na indução da asma alérgica, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, uveitis auto-imune, tireoidite auto- imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, alergia ao alimento ou doença celíaca.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações la 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é um antígeno terapêutico, preferivelmente Anti-CD3.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é entregue por um antígeno que expressa o microorganismo.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é mostrado na superfície do dito antígeno que expressa o microorganismo.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é secretado.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método é terapêutico.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método é profilático.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita administração pela mucosa é escolhida do grupo que consiste na administração retal, bucal, pulmonar, ocular, nasal, vaginal e oral.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e/ou dito composto imunomodulador que expressa o microorganismo são entregues por spray, cápsula, aerossol, pastilhas, pílulas, tabletes, saches, líquido, suspensão, emulsão, ou comprimido.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e o dito composto imunomodulador que expressa o microorganismo são entregues na forma de uma dose única, por exemplo, tablete, cápsula ou dose medida de aerossol.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno é entregue simultaneamente ou seqüencialmente ao dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24', CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto imunomodulador é um composto imunossupressor.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto imunossupressor é uma citocina que melhora a tolerância ou um anticorpo que melhora a tolerância.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto imunossupressor é uma citocina ou um anticorpo imunossuprimido.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita citocina imunossupressora é escolhido do grupo que consiste de IL-4, IL10, IFN-α, Flt3L, TGFβ e RANK-L.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo imunossuprimido é escolhido do grupo que consiste de anti- IL-2, anti-IL12 e anti-IFN-γ.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito microorganismo é uma bactéria ou um fermento.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita bactéria é uma bactéria do ácido lático.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita bactéria do ácido lático é escolhida do grupo que consiste de Lactobacilos, Leueonostoe, Pediococcus, Lactococeus, Streptococcus, Aerocoeeus, Carnobaeterium, Enteroeoceus, Oenoeoceus, Teragenoeoceus, Vagoeoeeus, e Weisella.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito lactococcus é Lactococcus lactis.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito fermento é Saccharomyces cerevisiae.

35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito microorganismo é um microorganismo probiótico.

36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto imunomodulador é secretado.

37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto imunomodulador é mostrado na superfície do microorganismo.

38. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e o dito composto imunomodulador são expressos pelo mesmo microorganismo.

39. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo adicionalmente compreende um adjuvante, um portador farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.

40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo adicionalmente compreende um composto que estimula a produção de citocina imunossupressoras.

41. Uso, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito composto que estimula a produção de citocina imunossupressoras é subunidade da toxina B da cólera.

42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo são entregues por pelo menos 1 dia, preferivelmente por pelo menos 1 semana, mais preferivelmente por pelo menos 1 mês ou 1 ano.

43. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e o dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo são entregues pelo menos uma vez por dia, pref erivelmente duas vezes por dia.

44. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que secreta o microorganismo são entregues em uma dose de pelo menos 10 femtograma a 100 mg por dia.

45. Composição, CARACTERIZADA por compreender um microorganismo que produz um composto imunomodulador em combinação com um antígeno.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita composição é uma composição farmacêutica.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 45 ou -46, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é um alergênico, aloantígenos, próprio-antígenos ou auto- antígeno.

48. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é envolvido na indução da asma alérgica, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, uveitis auto-imune, tireoidite auto-imune, miastenia gravis auto-imune, artrite reumática, alergia ao alimento ou doença celíaca.

49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 47, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é um antígeno terapêutico, preferivelmente Anti-CD3.

50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 49, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é entregue por um antígeno que expressa o microorganismo.

51. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 50, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é mostrado na superfície do dito antígeno que expressa o microorganismo.

52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 50, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno é secretado.

53. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 52, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que expressa o microorganismo estão presentes em um pulverizador, cápsula, aerossol, pastilhas, pílulas, tabletes, saches, líquido, suspensão, emulsão ou comprimidos.

54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 53, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno e o dito composto imunomodulador que expressa o microorganismo estão presentes em forma de dosagem única, por exemplo um tablete, uma cápsula ou dose medida de aerossol.

55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 54, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto imunomodulador é um anticorpo ou composto imunossupressor.

56. Composição, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto imunossupressor é uma citocina que melhora a tolerância ou um anticorpo que melhora a tolerância.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto imunossupressor é uma citocina escolhida do grupo que consiste de IL-4, IL10, IFNa, Flt3L, TGFP e RANK-L.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito anticorpo imunossuprimido é escolhido do grupo que consiste de anti- IL-2, anti-IL12 e anti-IFNa.

59. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 58, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito microorganismo é um microorganismo probióticos.

60. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 59, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito microorganismo é uma bactéria ou um fermento.

61. Composição, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita bactéria é uma bactéria do ácido lático.

62. Composição, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita bactéria do ácido lático é escolhida do grupo que consiste de Lactobacilos, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, e Weisella.

63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito lactococcus é Lactococcus lactis.

64. Composição, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito fermento é Saccharomyces cerevisiae.

65. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 64, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno e o dito composto imunomodulador são expressos pelo mesmo microorganismo.

66. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 65, CARACTERIZADA por adicionalmente compreender um adjuvante, portador farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente.

67. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 66, CARACTERIZADA por adicionalmente compreender um composto que estimula a produção de citocina imunossupressoras.

68. Composição, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito composto que estimula a produção de citocinas imunossupressoras é uma subunidade da toxina B da cólera.

69. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 45 a 68, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito antígeno e/ou o dito composto imunomodulador que produz microorganismo estão presentes em uma dose de pelo menos 10 femtograma a 10 0 mg.

70. Método para induzir a tolerância imunolõgica a um antígeno em um animal, CARACTERIZADO por compreender a administração pela mucosa do dito antígeno, em combinação com a administração pela mucosa de uma molécula imunomoduladora que expressa o microorganismo.

71. Método para tratar uma doenças relacionadas as respostas imunitárias em um mamífero na necessidade destas, CARACTERIZADO por compreender a administração pela mucosa de um antígeno em combinação com a administração pela mucosa de um microorganismo que produz um composto imunomodulador.

72. Medicamento, nutracêutico ou alimento funcional tratar, previnir e/ou aliviar uma doença ou uma desordem que envolve doenças relacionadas às respostas imunitárias ou indução a tolerância imunológica CARACTERIZADOS por compreender pelo menos um antígeno em combinação com um composto imunomodulador que produz microorganismo e um antígeno.