CN108114272A - 一种构建哮喘免疫耐受模型的方法 - Google Patents

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CN108114272A CN201611064253.0A CN201611064253A CN108114272A CN 108114272 A CN108114272 A CN 108114272A CN 201611064253 A CN201611064253 A CN 201611064253A CN 108114272 A CN108114272 A CN 108114272A
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孙伟
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Abstract

本发明涉及动物模型构建领域，公开了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5‑1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5‑1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5‑1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。本发明通过给刚断奶的小鼠口服OVA直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。本发明解决了现有技术中母乳耐受构建模型的时间非常长，给母鼠雾化，后期给小鼠雾化等步骤非常繁琐，耗资大的技术问题。

Description

一种构建哮喘免疫耐受模型的方法
技术领域
本发明涉及动物模型构建领域，尤其涉及了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法。
背景技术
国际上通用的鸡卵清蛋白(OVA)构建哮喘免疫耐受模型的方法大多为母乳耐受，即给刚生完小鼠的母鼠OVA雾化，小鼠在通过母鼠乳汁间接地获得对OVA的免疫耐受,断奶之后获得OVA免疫耐受的小鼠再次接触OVA过敏源不会产生哮喘，而未获得OVA免疫耐受的小鼠再次接触OVA过敏源会产生哮喘表现。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点，提供了一种构建哮喘免疫耐受模型的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5-1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5-1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5-1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
本发明通过给刚断奶的小鼠口服鸡卵清蛋白(OVA)直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。
作为优选，步骤A中，幼鼠为3-4周龄的小鼠。
作为优选，步骤A中，幼鼠为3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠。
作为优选，步骤A中，小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水。
作为优选，步骤A中，第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1％OVA致敏小鼠。
作为优选，步骤A中，第22日开始予以含质量分数为1％的OVA雾化激发小鼠1个小时。
作为优选，步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。
作为优选，步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
作为优选，步骤B中，左肺组织进行苏木素-伊红、高碘酸-席夫氏病理染色。
本发明通过给刚断奶的小鼠口服OVA直接获得对OVA的免疫耐受，明显缩短了构建哮喘免疫耐受模型的时间，也减少了构建模型的步骤，大大提高了效率。本发明解决了现有技术中母乳耐受构建模型的时间非常长，前期需要交配，母鼠怀孕，母鼠生产，给母鼠雾化，后期给小鼠雾化，步骤非常繁琐，耗资大，实验效率低下的技术问题。在科研过程中前期构建哮喘免疫耐受模型周期缩短，不但为后期实验做了准备，而且缩短培养模型的时间后，更有利于后期研究；节约了科研成本，更有利于科研工作。同时，口服免疫耐受成功率高，可调控因素更强，更有利于应用于今后的临床研究，适用群体范围不局限于母乳喂养的婴幼儿，可适用于各年龄段群体。
附图说明
图1是实施例3中OVA特异性IgE含量的测定。
图2是实施例3中小鼠BALF中细胞总数及炎性细胞计数图。
图3是实施例3中小鼠肺Th2细胞因子mRNA表达图。
图4是实施例3中小鼠肺部炎症图。
图5是实施例3中口服OVA后气道高反应性图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
实施例2
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
实施例3
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
步骤B中，如图1-5所示，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括：
(1)测定OVA特异性IgE含量。
小鼠血清IgE测定具体方法：
①包被将capture antibody稀释至Coating Buffer中,取100ul加至各孔中。ELISA板seal后直接置4℃冰箱过夜。
②洗涤弃掉包被液，用washing buffer(PBST)进行洗涤，方法为吸取PBST 250ul加入每孔，用手晃动几下，弃掉洗液，在吸水纸上拍打，然后重新加满，如此重复洗涤3-5次。
③封闭最后一次洗涤后反复在吸水纸上拍打，保证每个孔无洗涤液残留，每孔加封闭液250ul，室温放置2h。
④洗涤封闭结束后对ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。
⑤加入标准品及样品梯度稀释标准品，选择7个孔依次2倍稀释浓度，最后一孔作为空白对照，同时将提前准备的小鼠血清稀释50倍后，分别加入对应各孔100ul，室温放置2h。
⑥洗涤具体同步骤④。
⑦加二抗将detection antibody稀释在Assay Buffer中后，每孔加入100ul，seal后放置室温1小时。
⑧洗剂具体同步骤④。
⑨加酶标抗体将HRP-标记的抗体稀释后每孔加100ul，室温放置半小时。
⑩洗涤具体同步骤④。
显色加显色液至ELISA各孔中，每孔100ul。然后将ELISA板避光室温
放置约15min。
终止在ELISA板每孔中加终止液(2mol/L硫酸溶液)来终止反应。
测OD值：在酶标仪上读数，波长为450nm。然后用软件分析。
针对图1的分析：血清ELISA结果提示IgE在哮喘组明显上升，而Control组与Tolerance组之间无明显统计学差异。
注：n＝6，采用GraphPad Prism 5统计软件处理数据，数据表示为Mean±SEM，两组
间比较用独立样本t检验分析，多组计量资料间比较采用two-way ANOVA分析，
统计方法以P值<0.05定为具有统计学显著性差异。*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001vs Control组；△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001vs Tolerance组。
(2)a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
Ⅰ.肺泡灌洗液细胞计数及染色测试方法：
(1)取材：麻醉小鼠后，将小鼠固定在手术台上，小鼠仰卧行气管插管，用针灌洗肺泡1mlPBS，反复抽吸两次，注意不要将肺泡打破，动作轻柔缓慢，确保回吸率在80％以上。
(2)立即将肺泡灌洗液4℃500g 5min离心，去上清，1mlPBS重悬细胞，吸取10ul滴在细胞计数板上，镜下细胞计数。再次4℃500g 5min离心，弃上清，以200ulPBS重悬细胞后全部加入细胞涂片离心机细胞收集孔内，用笔画圈，做好标记，方便染色时找准位置，然后300r，5min离心，细胞随即转移至载玻片上。
(3)染色：小心滴加瑞氏-姬姆萨A溶液(约0.5-0.8ml)在涂片上，让染液覆盖住标本涂片画圈部位染色2分钟；再加瑞氏-姬姆萨B溶液于A溶液上面(量为A液2倍-3倍)；用嘴轻轻的吹，使两液充分混匀，染色约5～10分钟；把载玻片横着小心水洗，然后自然干燥后镜检，根据细胞形态分类计数。
图2分析：通过对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞进行瑞氏—姬姆萨染色,根据染色后细胞的形态、大小以及核的形态区分成嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞,通过计数统计后发现,OVA组BALF中总细胞及上述各种细胞类型的数目与Control、Tolerance组小鼠相比有显著的提高，后两者比较无明显差异。
Ⅱ.肺组织总RNA的提取
①取小鼠整个肺(约200-300mg)至1.5mlEP管中，加入800ul Trizol试剂，每个EP管中放入一大一小珠子，放入高通量组织研磨器，注意配平，70HZ的频率研磨120秒后取出。
②吸出上述EP管中200ul肺组织匀浆液至新的EP管中，然后加入40ul氯仿，20ulRNase free ddH2O，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下静置2～3分钟后，12000g，4℃，离心15分钟；
③吸取上层水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇彻底混匀，在室温下静置30分钟后，12000g，4℃，离心10分钟；
④弃上清，加入现配的800ul 75％乙醇进行洗涤，在手中上下甩几次，直到看到白色絮状物漂浮在酒精中，10000g，4℃，离心5分钟弃上清；重复洗一遍；
⑤尽量吸去残留的上清，然后放置沉淀的RNA在室温中自然干燥；
⑥用Rnase-free water溶解沉淀，80ul-100ul左右，放入-80℃冰箱保存。
Ⅲ.cDNA第一链合成：
①将上述RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
②配反应体系
表1.cDNA第一链合成反应体系
试剂 20ul反应体系 终浓度
dNTP Mix 4ul 500uM
Primer Mix 2ul
RNA x ul 5pg-5ug
5x RT Buffer 4ul 1x
DTT 2ul 10nM
HiFiScript 1ul
RNase-Free Water up to 20ul
③漩涡震荡，离心。
④程序设置：42℃30min 85℃5min反应结束，冰上冷却，备用。
Ⅳ.实时定量PCR(Real-time PCR)：
引物合成(上海生工)，各基因所用引物序列见下表2：
表2.各基因引物
反应体系的组成如下：
①反应体系
表3.Real-time PCR反应体系
试剂 10ul反应体系
2xUltra SYBRMixture(With High ROX) 5ul
Forward Primer 0.3ul
Reverse Primer 0.3ul
DNA 2ul
RNase-Free Water up to 10ul
②反应程序：
表4.Real-time PCR反应程序
反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，得出的每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(cycle threshold CT)值，以GAPDH为内参，校正单个样本目的基因的Ct值，即△Ct值(Ct目的基因-Ct管家基因)，每个样本重复3个复孔，对照组与实验组目的基因的相对表达值以2－△△Ct表示，△△Ct＝实验组(Ct目的基因-Ct管家基因)-对照组(Ct目的基因-Ct管家基因)。
图3分析：荧光定量PCR证明asthma组小鼠肺部与mock、tolerance组小鼠相比，哮喘相关基因(IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A)的表达显著上调，后两者无明显统计学差异。
(3)左肺组织进行苏木素-伊红、高碘酸-席夫氏病理染色。
Ⅰ.肺组织病理切片制备：
取材：根据实验分组，在OVA雾化后第7日，称重每只小鼠，2％的戊巴比妥钠麻醉用量80ul/20g，吸入到1毫升注射器，左手紧捏动物，将腹部朝上，为避免刺破内脏，可将动物头部放低，使内脏移向横隔处。右手将注射器的针头刺入皮肤，其部位是大腿根部与腹白线连线的中点处。针头到达皮下后再向前进针3-5mm，待完全麻醉后，颈椎脱臼处死小鼠，使用注射针头固定小鼠在泡沫架上，仰面朝上，剪开小鼠胸廓出毛发和皮肤，剪断锁骨和胸骨，充分暴露心脏和肺组织，取每只小鼠的左肺下叶，用4％多聚甲醛溶液浸泡固定24h。
脱水：70％乙醇20min→80％乙醇20min→95％乙醇Ⅰ10min→95％乙醇Ⅱ10min→100％乙醇Ⅰ10min→10％乙醇Ⅱ10min
透明：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min
浸蜡：苯蜡30min→石蜡30min
切片：将石蜡包埋块于-20℃冰箱放置冷冻5分钟，然后切片，切片厚度4μm，放于45～55℃温水中展平，再用载玻片捞起蜡片。
烤蜡：62℃1h以上，直到石蜡溶化。
脱蜡：趁热依次放入二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→100％乙醇Ⅰ10min→100％乙醇Ⅱ10min→95％乙醇Ⅰ10min→95％乙醇Ⅱ10min→80％乙醇10min→70％乙醇10min→自来水洗
HE染色：苏木素浸染5min→1％盐酸乙醇分化数秒5-10s→自来水洗反蓝→伊红浸染1分钟→自来水洗5-10s。
脱水：70％乙醇2min→80％乙醇2min→95％乙醇Ⅰ2min→95％乙醇Ⅱ2min→100％乙醇Ⅰ2min→100％乙醇Ⅱ2min
透明：二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min
封片：滴中性树胶→盖玻片
图4分析：小鼠肺病理切片及HE染色，病理分析表明,与Control、Tolerance组相比,OVA组小鼠均发生了肺部血管及支气管壁增厚,并伴随大范围的炎症细胞浸润，前两组无明显统计学差异。
Ⅱ.小鼠气道反应性测定方法：
①小鼠末次激发24h内Buxco小鼠肺功能仪有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性。2％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉小鼠后,行气管插管,连接小动物呼吸机,呼吸机频率设为120r/min,流量的调定以小鼠潮气量至0.13～0.15ml为准,通过测定小鼠气道气流和压力变化,得出小鼠气道阻力指数(resistance index,RI)的变化。
②记录小鼠气道阻力的基础值1min，作为基础值；随后测定10μl倍增浓度的乙酰甲胆碱(Mch)雾化激发小鼠气道后气道阻力的变化,每次雾化30s,记录3min。间歇4min，通过软件分析，统计结果以不同浓度Mch刺激下小鼠RI单位时间内改变(较基础值升高的平均值)表示为RI avg(％Change)。数值越大，道反应性越高,反之,数值越小气道反应性越低。
图5数据分析：末次激发24h内，小鼠连接Buxco有创呼吸功能检测系统，记录RI(肺阻力％)的变化。Control组、Tolerance组、OVA组的气道阻力(RI)都有随Mch浓度升高而增加的趋势。OVA组RI基础值(baseline)为(2.03±0.93)H2O.s/m，Mch激发后，上升至(8.15±3.80)cmH2O·s/ml；Control组RI基础值为(1.62±1.15)cmH2O.s/ml，Mch激发后上升至(4.36±2.00)cmH2O.s/ml，Tolerance组RI基础值(baseline)为(1.73±1.33)H2O.s/m，Mch激发后，上升至(5.15±2.80)cmH2O·s/ml，给以不同浓度Mch激发后，各组RI avg(％Change)变化如下。
表5.各组小鼠RI较基础值升高百分比
Mch(mg/ml) 0 3.125 6.25 12.5
Tolerance(％) 0 12.38±9.72** 58.21±22.20** 99.76±15.90**
OVA(％) 0 54.00±12.96 135.60±22.80 213.22±44.67
Control(％) 0 17.63±8.06△△ 64.12±6.29△△ 80.56±4.83△△△
实施例4
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让3周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为0.6％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.6％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.6％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
实施例5
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为1.4％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1.4％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1.4％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
实施例6
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠每日饮用含质量分数为0.8％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.8％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.9％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
步骤B中，左肺组织进行苏木素-伊红、高碘酸-席夫氏病理染色。
实施例7
一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让3-4周龄的小鼠每日饮用含质量分数为1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1.2％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为1.1％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于，包括以下步骤，
A.建立免疫耐受小鼠模型：让幼鼠每日饮用含质量分数为0.5-1.5％OVA的无菌水，连续7日，每24h更换饮用水，第八日开始饮用无菌水；第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为0.5-1.5％OVA致敏小鼠，第22日开始予以含质量分数为0.5-1.5％的OVA雾化激发小鼠1个小时，连续7日；
B.免疫耐受小鼠模型的鉴定。
2.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，幼鼠为3-4周龄的小鼠。
3.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，幼鼠为3-4周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠。
4.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，小鼠每日饮用含质量分数为1％OVA的无菌水。
5.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，第15日予以腹腔注射125ul含质量分数为1％OVA致敏小鼠。
6.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤A中，第22日开始予以含质量分数为1％的OVA雾化激发小鼠1个小时。
7.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括测定OVA特异性IgE含量。
8.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤B中，免疫耐受小鼠模型的鉴定包括，
a.进行支气管肺泡灌洗、进行细胞计数和分类、测定气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ细胞因子的含量；
b.右肺组织匀浆抽提RNA，用时实定量PCR测定步骤a中细胞因子的mRNA的表达。
9.根据权利要求1所述的构建哮喘免疫耐受模型的方法，其特征在于：步骤B中，左肺组织进行苏木素-伊红、高碘酸-席夫氏病理染色。
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