CN110326584B - 一种p物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法，1)将P物质用生理盐水配制成浓度为30μg/mL的P物质致敏溶液；2)在第1天给小鼠通过雾化吸入4mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；3)间隔一天重复上述步骤2)操作，即在第3、5、7天重复步骤2)操作；4)在第7天雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，经过数据分析符合哮喘动物模型指标，即说明模型成功构建。本发明构建方法操作简单，不需要麻醉。采用上述过敏性哮喘动物模型，动物反应性好，适合研究过敏性哮喘发生过程中体内炎症因子水平的变化及信号传递的通路，可用于筛选发现新的治疗哮喘的药物等研究。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种动物模型构建方法，尤其是一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法。
背景技术
过敏性哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症，在易感者中此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，多在夜间和(或)凌晨发生，气道对多种刺激因子反应性增高。但症状可自行或经治疗缓解。近十余年来，美国、英国、澳大利亚、新西兰等国家哮喘患病率和死亡率有上升趋势，全世界约有一亿哮喘患者，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。中国哮喘的患病率约为1％，儿童可达3％，据测算全国约有1千万以上哮喘患者。当前经典理论一般认为过敏性哮喘是致敏原吸入后和支气管粘膜肥大细胞表面受体上的特异性IgE结合，导致肥大细胞脱颗粒释放活性物质如组胺、白三烯等引起支气管平滑肌收缩所致。肥大细胞同时也释放具有趋化活性的物质，促使炎症细胞主要是嗜酸性白细胞聚集到肺部支气管参与过敏性炎症过程。
类过敏反应由于与Ⅰ型过敏反应症状相似，机制与肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒、激活补体系统，引起释放组胺或其他血管活性因子等生物活性介质有关，常被混称为Ⅰ型过敏反应，但两者却有不同的发生机制。通常类过敏反应起病比较急，短期暴露于致敏原下即迅速出现，不需要提前接触抗原的致敏过程，抗体或淋巴细胞不参与反应过程，无需IgE等免疫球蛋白介导，患者血清的IgE浓度也未见升高，具有病情危急的特点，首次给药即可发生严重ADR及休克。
P物质是一种广泛分布于细神经纤维内的神经肽。当神经末梢收到刺激时，便释放P物质于其特异性受体NK1结合。P物质不需要IgE的参与，可通过 MRGPRX2直接激活肥大细胞，引起胞内Ca2+动员和细胞脱颗粒，释放组胺。同时还具有对单核细胞，嗜酸性粒细胞的趋化作用，调节细胞因子的产生。故P物质是一种潜在的引起过敏性性哮喘的神经肽。
近年来，临床上遇到大量有哮喘症状，但血清IgE并未升高的患者。对其血清中P物质进行检测，发现有着明显升高。因此，建立一种不经过IgE途径，以 P物质为致敏物质的哮喘模型迫在眉睫。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法和筛选药物的方法，通过该方法可以成功构建过敏性哮喘动物模型，该动物模型无需二次接触致敏物质，不经过IgE介导，首次接触即可引发哮喘。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；
2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；
3)间隔一天重复上述步骤2)操作；
4)在最后一次的雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。
优选地，所述P物质的纯度≥97％。
优选地，所述小鼠为6～8周近交系C57BL/6。
优选地，构建的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的IgE未升高。
本发明还公开了利用上述的构建方法构建得到的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型筛选治疗哮喘药物的方法，包括以下步骤：
(1)设置待测药物组、正常对照组、生理盐水组；
(2)对待测药物组和生理盐水组采用P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发，正常对照组以生理盐水雾化激发；
(3)待测药物组和生理盐水组在每次用所述P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发前1小时，灌胃给药；正常对照组在每次用生理盐水雾化激发前1小时，灌胃等量生理盐水；每次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE 染色；
(4)分析步骤(3)得到的数据，对待测药物的治疗效果进行评价。
优选地，分析步骤(4)获得的数据：
若正常对照组记录的数据没有升高，而生理盐水组记录的数据有所升高，表明过敏性哮喘动物模型制备成功；
若待测药物组记录的数据较正常对照组记录的数据受到抑制，则表示待测药物具备治疗哮喘的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种过敏性哮喘动物模型的制备方法及一种筛选治疗P物质诱导的过敏性哮喘的药物的方法。本发明所述过敏性哮喘动物模型的制备方法操作简单，耗时短，无需经过IgE途径，通过直接刺激肥大细胞，即可引发哮喘。评价模型成功与否及药物效果的方法，从组织形态，生理功能，细胞类型等多方面，全面且精确的做出了评价。提供了一种全新的动物模型，也为哮喘发病机理研究、筛选治疗哮喘的药物提供一种新途径。
采用本发明所述制备方法得到的过敏性哮喘动物模型，动物反应性好，适合研究过敏性哮喘发生过程中体内炎症因子水平的变化及信号传递的通路，可用于筛选发现新的治疗哮喘的药物等研究。
附图说明
图1为实施例1中第3、7、11、15天喷雾结束后，flexiVent系统测定不同浓度模型鼠和正常鼠肺功能参数Rn(主气道阻力)的比较图；其中图1中A为第3 天测量结果；B为第7天测量结果；C为第11天测量结果；D为第15天测量结果横坐标为乙酰胆碱浓度，纵坐标为相应的压力；
图2为实施例1中第15天喷雾结束后，模型鼠和正常鼠肺组织切片HE染色比较，可见模型鼠肺组织有明显的炎性浸润及气道重塑；其中图2中A为空白对照组，B为P物质低浓度组，C为P物质中浓度组，D为P物质高浓度组，E 为MRGPRB2基因敲除组；
图3为实施例1中第15天喷雾结束后，采用ELISA法对各组小鼠血清中IgE 含量的测定；
图4为实施例3中每次喷雾结束后，flexiVent系统测定各组动物肺功能参数 Rn(主气道阻力)的比较图；其中，横坐标为乙酰胆碱浓度，纵坐标为相应的压力；
图5为实施例3中每次喷雾结束后对各组动物肺泡灌洗液中细胞因子的测定；图A-E分别为IL-4，MCP-1，IL-5，IL-13和TNF-α；
图6为实施例3中每次喷雾结束后对各组动物肺组织切片HE染色；其中图五A为空白对照组，B为模型对照组，C为待测药物组；。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，具体建立过程如下：
1)取P物质加生理盐水制成溶液，其中，将P物质的浓度设定为三个，分别是10μg/mL、30μg/mL、90μg/mL；
2)将实验用小鼠分为4组，分别为空百对照组，P物质低浓度组，P物质中浓度组，和P物质高浓度组。各组小鼠在第1、3、5、7、9、11、13、15天给予上述相应的致敏溶液，即空白对照组雾化吸入生理盐水，低浓度组吸入雾化吸入 10μg/mL P物质溶液，中浓度吸入30μg/mLP物质溶液，高浓度吸入90μg/mL P 物质溶液，20分钟(4mL)激发哮喘。激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色。
最终，通过实验验证，构建的过敏性哮喘动物模型为：
1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；
2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；
3)间隔一天重复上述步骤2)操作；
4)在最后一次雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。
优选地，P物质致敏溶液的浓度为30μg/mL。每次雾化吸入4mL。在第7天的时候，完成建模，得到P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。
本发明所述哮喘动物模型的制备方法无需二次接触致敏物质，不经过IgE介导，首次接触即可诱发哮喘。
目前用于制备过敏性哮喘动物模型的动物为小鼠。其中，在一些实施方案中，本发明所述小鼠为雌性6～8周近交系C57BL/6。
本发明所过敏性性哮喘是指不经过IgE介导的，直接刺激肥大细胞脱颗粒进而产生呼吸道高反应性的哮喘。
本发明所述的P物质(Substance P)是指由Von Euler和Gaddum于1931 发现的神经肽，序列为Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2，分子量为1340。
进一步的，在一些实施方案中，所述致敏液中的P物质的纯度≥97％。
更进一步的是，本发明所指的P物质诱导的过敏性哮喘模型，是P物质作用于小鼠体内的MRGPRB2受体引起的。MRGPRB2属于MAS-相关G蛋白偶联受体超家族，该家族在人类中只有四个基因:MRGPRX1-X4，其中MRGPRX2与 MRGPRB2同源。2015年，美国约翰·霍普金斯大学利用人源肥大细胞LAD2与转基因小鼠研究证实，肥大细胞上MRGPRX2受体可被内源配体P物质直接激活引发类过敏反应。
我们采用以下步骤来验证P物质是否通过MRGPRB2引起哮喘：
实验所用的小鼠为雌性6-8周龄的野生型C57BL/6和雌性6-8周的 MRGPRB2敲除鼠。
选取野生型小鼠，分为空白对照组和模型对照组；选取MRGPRB2作为基因敲除组；模型对照组和基因敲除组在第1、3、5、7、9、11、13、15天给予30μg/mL P物质溶液4mL，雾化吸入；空白对照组小鼠雾化等体积的生理盐水。最后一次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色；
本发明还提供了一种筛选治疗过敏性哮喘的新药物的方法，包括以下步骤：
a.设置待测药物组、空白对照组、生理盐水组，其中待测药物组和生理盐水组用30μg/mL P物质致敏溶液雾化激发哮喘制备哮喘动物模型。空白对照组用生理盐水雾化吸入激发；
b.待测药物组和生理盐水组在第1、3、5、7、9、11、13、15天，每次雾化激发前一小时，灌胃给药；正常对照组在每次雾化激发前，灌胃等量生理盐水。每次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色；
c.分析步骤b所得数据，对待测药物的治疗效果做出评价。
其中，所述待测药物在P物质致敏制备哮喘动物模型前给予。
本发明所述方法中所述待测药物给予可以采用注射、口服或吸入的方式。
本发明所涉及的肺功能相关指标的测定，所用平台为SCIREQ公司研发的flexiVent系统。该平台创新性的采用了强迫震荡法测量呼吸力学参数。通过短暂中止机械换气进行一次测量操作，此期间一个预设的压力或容量波形(也可称为震荡)作用于目标动物的气道开口处，将呼吸系统的压力和体积数据都精确记录。
本发明所述筛选治疗过敏性哮喘的药物的方法通过比较肺功能参数、肺泡灌洗液细胞因子含量、肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞数目、肺组织切片HE染色评价待测药物组、生理盐水对照组及正常对照组，以评价药物对哮喘的治疗效果，筛选发现能够治疗哮喘的药物。
若正常对照组步骤b记录的数据没有升高，而生理盐水对照组步骤b记录的数据均有升高，即表示哮喘动物模型制备成功；
若待测药物组步骤b记录的数据较正常对照组步骤b记录的数据受到抑制，即表示待测药物有治疗哮喘的作用。
实施例1、过敏性哮喘动物模型的制备
实验材料：P物质(购于上海阿拉丁试剂公司)，生理盐水，雌性6～8周近交系C57BL/6小鼠(购于西安交通大学实验动物中心)
制备方法：
1.取15mg/mL的P物质母液24μL，用4mL生理盐水稀释，制成4mL浓度为90μg/mL的P物质生理盐水溶液；依次制成，10μg/mL、30μg/mL浓度的溶液。
2.取6～8周近交系C57BL/6小鼠或MRGPRB2-/-基因敲除小鼠，雾化吸入致敏液引起哮喘。
3.选取野生型小鼠，分为空白对照组和P物质低浓度组、P物质中浓度组、 P物质高浓度组；选取MRGPRB2作为基因敲除组；P物质的高中低浓度组分别在第1、3、5、7、9、11、13、15天雾化吸入浓度为10μg/mL、30μg/mL、90μg/mL 的P物质溶液；基因敲除组在第1、3、5、7、9、11、13、15天给予30μg/mL P 物质溶液4mL，雾化吸入；空白对照组小鼠雾化等体积的生理盐水。最后一次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色；
采用超声振动薄膜雾化P物质溶液，喷入装有小鼠的封闭盒中，使小鼠吸入雾化的P物质溶液。每次激发结束后，24小时内测定小鼠血浆中IgE含量，各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色。
采用flexiVent系统对哮喘动物模型和正常6～8周近交系C57BL/6小鼠的肺功能参数进行测定。石蜡包埋两者肺组织，HE染色。ELISA法测定血清中IgE 含量结果见图1、图2和图3。
由图1可见，雾化激发哮喘结束后对小鼠肺功能参数(Rn：主气道阻力；)的测定数据显示，随着P物质溶液浓度的升高，对应组小鼠的气道高反应性越敏感；随着激发次数的增多，不同浓度P物质组间差异越来越大。而基因敲除组小鼠在不同喷雾次数下，其Rn值均未表现出和空白对照组的差异。
由图2可见，第15天雾化结束后，比较各组肺组织切片HE染色可见：相较于空白对照组，随着P物质溶液浓度的升高，小鼠肺组织炎性浸润程度和气道重塑程度不断加重。而基因敲除组小鼠的气道炎性浸润较空白对照组而言基本正常。
根据图1、图2，可以得出如下结论：P物质溶液可以剂量依赖地通过 MRGPRB2受体，引起小鼠发生哮喘。
实施例2、过敏性哮喘动物模型鉴定
选取6～8周近交系C57BL/6，将小鼠分为空白对照组和模型对照组。在第1、3、5、7、9、11、13、15天给予模型对照组30μg/mL P物质溶液4mL，雾化吸入；空白对照组小鼠雾化等体积的生理盐水。动物在每次喷雾结束后，取血样采用ELISA法，测量血清中是否产生IgE。
由图3可见，不同浓度的P物质喷雾刺激均不能造成小鼠血清IgE的上升。
实施例3、筛选治疗过敏性哮喘的药物的方法
实验材料：6～8周近交系C57BL/6小鼠(购自：西安交通大学实验动物中心)，地塞米松(购自：美国SIGMA公司)。
取6～8周近交系C57BL/6小鼠分为三组：生理盐水组、正常对照组、待测药物组。其中待测药物组在每次激发前半个小时，灌胃给予6mg/kg的地塞米松溶液。之后，按照实施例1的方法，第1、3、5、7、9、11、13、15天生理盐水对照组和待测药物对照组以P物质溶液雾化吸入激发哮喘，正常对照组雾化吸入生理盐水激发。
最后一次次雾化结束后，测量其肺功能参数，结果见图4，小鼠的气道反应性(Rn：主气道阻力)随着乙酰胆碱的浓度增大而升高。当乙酰胆碱浓度达到 50mg/mL时，待测药物组与生理盐水组间均有显著性差异；
最后一次次雾化结束后，取肺泡灌洗液测量细胞因子，结果见图5，图A-E 分别为IL-4，MCP-1，IL-5，IL-13和TNF-α。由图可见，待测药物组的细胞因子和趋化因子的表达较生理盐水组相比均有明显降低。
取肺组织切片HE染色，结果见图6。待测药物组的肺部炎性浸润和生理盐水组相比，有着显著的改善。
由上述分析可知，本发明所提供的方法能够成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型，且能够用构建的模型成功筛选治疗过敏性哮喘的药物，灌胃给予地塞米松后，过敏性哮喘的症状受到明显抑制。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将P物质用生理盐水配制成浓度为10～90μg/mL的P物质致敏溶液；
2)在第1天给小鼠通过雾化吸入1～6mL的P物质致敏溶液激发哮喘，吸入时间为20min；
3)间隔一天重复上述步骤2)操作；
4)在最后一次的雾化吸入激发哮喘结束后，在24小时内测定小鼠肺功能相关指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色，分析数据观察可见：小鼠气道高反应性，肺泡灌洗液中细胞因子含量升高，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，HE染色可见明显的炎性浸润，即成功构建P物质诱导的过敏性哮喘动物模型。
2.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述P物质的纯度≥97％。
3.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为6～8周近交系C57BL/6。
4.根据权利要求1所述的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，构建的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型的IgE未升高。
5.利用权利要求1～4中任意一项所述的构建方法构建得到的P物质诱导的过敏性哮喘动物模型筛选治疗哮喘药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设置待测药物组、正常对照组、生理盐水组；
(2)对待测药物组和生理盐水组采用P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发，正常对照组以生理盐水雾化激发；
(3)待测药物组和生理盐水组在每次用所述P物质诱导的过敏性哮喘动物模型激发前1小时，灌胃给药；正常对照组在每次用生理盐水雾化激发前1小时，灌胃等量生理盐水；每次激发结束后，24小时内测定小鼠各项肺功能指标，肺泡灌洗液中细胞因子含量，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量，并取肺组织切片，HE染色；
(4)分析步骤(3)得到的数据，对待测药物的治疗效果进行评价。
6.根据权利要求5所述的利用P物质诱导的过敏性哮喘动物模型筛选治疗哮喘药物的方法，其特征在于，分析步骤(4)获得的数据：
若正常对照组记录的数据没有升高，而生理盐水组记录的数据有所升高，表明过敏性哮喘动物模型制备成功；
若待测药物组记录的数据较正常对照组记录的数据受到抑制，则表示待测药物具备治疗哮喘的作用。
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