DE102005049800B4

DE102005049800B4 - Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI 3) und deren Verwendungen bei der Behandlung von metastasierenden Tumoren und allergischem Asthma

Info

Publication number: DE102005049800B4
Application number: DE102005049800A
Authority: DE
Inventors: Susetta Finotto
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Finotto Susetta Prof Dr Dr De
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2009-09-17
Anticipated expiration: 2025-10-19
Also published as: DE102005049800A1; WO2007045389A2; US20090220498A1; WO2007045389A3; EP1942927A2

Abstract

Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI3), umfassend die Schritte von:
a) Zur Verfügung stellen eines Testsystems, umfassend EBI3 oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon,
b) In Kontakt bringen des Testsystems mit einer oder mehreren Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie EBI3 inhibieren, und
c) Nachweisen einer Inhibierung von EBI3 durch die eine oder mehreren Verbindungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI3), und Verwendungen von EBI3-defizienten dendritischen Zellen oder EBI3 knockout Zellen zur Behandlung einer metastasierenden Krebserkrankung oder von allergischem Asthma.
Eine Epstein-Barr-Virus (EBV)-Infektion führt zur Expression von verschiedenen Antigenen, wie zum Beispiel dem Epstein-Barr-Virus-induzierten Gen (EBI) 3 auf infizierten B Zellen. EBI3 kann mit p28 assoziieren, um IL-27 zu bilden oder als Mono-/Homodimer vorhanden zu sein. Das Gen kodiert für einen löslichen Typ 1 Cytokinrezeptor, homolog zu der p40 Untereinheit von Interleukin 12. Kürzlich wurde von EBI3 gefunden, dass es mit einer neuen IL-12 p35-verwandten Untereinheit, bezeichnet als p28, assoziiert, um ein nicht-kovalent verbrücktes heterodimeres Cytokin (EBI3/p28), genannt IL-27, zu bilden [1]. IL-27 (EBI3/p28) ist als ein frühes Produkt von aktivierten Antigen-präsentierenden Zellen bekannt, das nach TLR-Ligation produziert wird. Es steuert die schnelle klonale Expansion von naiven, jedoch nicht von Gedächtnis CD4⁺ T-Zellen, und ist mit IL-12 synergistisch, um die IFN-gamma Produktion über T-bet von naiven CD4⁺ T-Zellen auszulösen [1–3]. Die biologische(n) Funktion(en) von EBI3 als solches oder von EBI3/EBI3-Homodimeren bleiben jedoch immer noch unklar.
Experimentelles Lungenmelanom ist eine Erkrankung, die für überschiessende Th2-Antworten und verminderte Th1-Antworten bekannt ist. Eine mögliche Erklärung für die verminderten Th1-Antworten im Falle des Lungenmelanoms kann eine veränderte IL-12 Produktion und IL-12 Signaltransduktion sein [4]. Die Freisetzung von IL-12 (p40/p35) aus Antigen-präsentierenden Zellen steuert die Differenzierung von T-Zellen in Th1-Zellen mit Hoch-Regulation von IFN-gamma-Transkription und -Sekretion [6, 7]. Zusätzlich hat IL-12 eine protektive Rolle beim Lungenmelanom, da es die Fähigkeit hat, cytotoxische Lymphozyten zu aktivieren, natürliche Killerzellen zu stimulieren, die Produktion von IFN-gamma zu induzieren und synergistisch mit IL-2 zu sein.
EBI3 wird durch Monocyten und Makrophagen exprimiert, genau wie IL-12 [10]. Im Menschen wird das EBI3-Protein in vivo durch dendritische Zellen (DCs) von lymphoiden Geweben und in sehr hohem Maße durch plazentale Syncytiotrophoblasten exprimiert [10–12]. IL-27 fungiert in Synergie mit IL-12 und löst eine schnelle und klonale Expansion von Antigen-spezifischen menschlichen und murinen naiven, jedoch nicht Gedächtnis CD4⁺ T-Zellen aus. Seine prinzipielle Funktion ist, die Intensität und Dauer von ungeborener und adaptiver Immunantwort zu begrenzen [12]. Der IL-27-Rezeptor ist der Orphan-Rezeptor WSX-1/TCCR, assoziiert mit gp130 [13]. WSX-1/TCCR-Defizienz führt zu einer beeinträchtigten IFN-gamma-Produktion und Th1-Differenzierung und erhöhten Empfindlichkeit gegen Infektion mit intrazellulären Pathogenen [14,15]. WSX-1 ist ein neuer Klasse I Cytokinrezeptor mit Homologie zu dem IL-12-Rezeptor und ist in lymphoidem Gewebe stark exprimiert [16]. Es wurde vorgeschlagen, dass STAT-1 durch die Interaktion mit dem Tyrosinrest in der cytoplasmatischen Domäne von WSX-1 aktiviert wird. Weiterhin induziert IL-27 in Wildtyp naiven CD4⁺ T-Zellen die Expression von T-bet und IL-12Rbeta2 durch WSX-1, was anzeigt, dass die IL-27/WSX-1-Signaltransduktion für die anfängliche Festlegung auf Th1-Antworten wichtig ist [17].
Shrayer et al. [23] beschreiben, dass IL-12 sowohl cytotoxische Lymphocyten als auch natürliche Killerzellenaktivität und die Produktion von INF-Gamma stimulieren und somit die Entwicklung von verschiedenen experimentellen Tumoren inhibieren kann. Es wurde gefunden, dass die Behandlung von Melanomen in Mäusen mit IL-12 (300 ng/Tag) die Entwicklung von primären Melanomtumoren in 40% der Mäuse inhibierte.
Weiter beschreiben Shrayer et al. [24], dass IL-12 synergistisch mit IL-2 sein kann. Chiyo et al. [25] beschreiben, dass sich IL-27 aus p28 und EBI3 zusammengesetzt. Die Autoren untersuchten, ob murine Kolon 26-Kolonkarzinom-Zellen, die retroviral mit dem p28-verbundenen EBI3-Gen transduziert waren (Colon 26/IL-27), Antitumor-Effekte in inokulierten Mäusen hervorrufen konnten. Syngene BALB/c Mäuse stießen beimpfte Colon 26/IL-27-Tumore ab. Jedoch beschreiben die Autoren, dass syngene Mäuse, die entweder mit Colon 26/p28 oder Colon 26/EBI3 transduziert waren, Tumore entwickelten, und dass das Überleben der Mäuse mit denen der mit Ausgangs-Tumorzellen beimpften identisch war. Die Autoren schlagen konsequenterweise vor, dass lediglich exprimiertes IL-27 in Tumoren einen T-Zell-abhängigen bzw. -unabhängigen Anti-Tumor-Effekt hervorruft und eine mögliche therapeutische Strategie für Krebs ist.
Allergisches Asthma kann durch Umweltallergenexposition bei allergisch reagierenden Menschen ausgelöst werden. Die Folgen sind anfallsartige Phasen der Atemnot. Häufig geht allergischem Asthma ein quälender Dauerhusten oder allergischer Dauerschnupfen voraus. Auslöser für allergische Asthmaanfälle sind körperfremde Stoffe aus der Umwelt, wie Schimmelpilzsporen, Hausstaub, Tierhautschuppen, Tierhaare, Blütenpollen oder Mehlstaub. Eingeatmet reagiert das Immunsystem an den Bronchien auf die Allergene. Bei den allergischen Asthmapatienten finden sich häufig die vererbten Anlagen für überschießende IgE-allergen spezifische Antikörperproduktionen. Durch vermehrte Ausschüttung von Histamin schwellen die Schleimhäute an und sondern zähen Schleim ab. Anfallsauslösend können beim allergischen Asthma aber auch körperliche und geistige Belastungen sowie Viren sein. Allergisches Asthma ist eine unter Umständen lebensgefährliche Krankheit. Mit herkömmlichen Medikamenten (Glukocortikoide oft als Dosierspray) wird zur Behandlung das Immunsystem im Bereich der Atemwege gedampft oder die Atemwege werden erweitert.
In der WO 2004/060291 (Malefyt et al.) wird ein Verfahren zur Beeinflussung der Expression von Interferon γ zur Stimulierung der zellvermittelten Immunreaktion in Antwort auf Bakterien, Parasiten, Viren und Tumoren beschrieben. In Teilen basiert die dargelegte Erfindung auf der Beobachtung, dass Interleukin-27 die Produktion von Interferon γ erhöht. Im Besonderen werden daher Agonisten und Antagonisten von Interleukin-27 in genannten Verfahren verwendet.
Larousserie et al. stellen Daten zum in-vivo Expressionsprofil von EBI3 zur Verfügung. So wird gezeigt, dass EBI3 in Tumoren signifikant stärker exprimiert wird als p28. Interessanterweise konnte die Überexpression in HTLV-1 transformierten Zellen durch Zugabe eines NF-κB Inhibitors gesenkt werden. Dieser Effekt konnte in Jurkatzellen durch Expression einer NF-κB Mutante des Tax Onkoproteins bestätigt werden.
Hausding et al. [26] beschreiben eine IL-27 unabhängige Rolle von EBI3 bei Asthma. EBI3-defiziente Mäuse wurden vor der Entwicklung von Atemwegs-Hyperantworten nach Acethylcholin- oder Methacholin-Inhalation und Eosinophilie nach Allergensensitivierung und -Aerosolisierung geschützt. Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die EBI3-Expression per se immunologische Antworten in der Lunge hervorrufen kann (wie die Experimente in EBI3-transgenen Mäusen zeigen), und daher erlaubt die Inhibierung von EBI3 auch eine entsprechende Therapie im Falle dieser Indikation.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Behandlung von metastatischen Krebserkrankungen und allergischem Asthma auf der Basis von Inhibitoren von EBI3 zur Verfügung zu stellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Inhibitoren von EBI3 zu identifizieren und einer solchen Therapie zugänglich zu machen.
Eine dieser Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird in einem ersten Aspekt dieser durch ein Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) gelöst. Dabei umfaßt das Verfahren die Schritte von a) Zur Verfügung stellen eines Testsystems, umfassend EBI3 oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon, b) In Kontakt bringen des Testsystems mit einer oder mehreren Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie EBI3 inhibieren, und c) Nachweisen einer Inhibierung von EBI3 durch die eine oder mehreren Verbindungen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren, das weiterhin die Schritte umfaßt von d) Identifizierung des Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon, und, gegebenenfalls, e) Chemische Derivatisierung des in Schritt d) ausgewählten Inhibitors.
In einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, umfassend a) Identifizieren eines Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon wie oben definiert, und b) Mischen des Inhibitors mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und/oder anderen geeigneten pharmazeutischen Hilfs- und Zusatzstoffen.
In einem dritten Aspekt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, hergestellt gemäß der vorliegenden Beschreibung und eines mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierten Inhibitors von EBI3 beschrieben.
Schließlich wird in einem vierten Aspekt ein Verfahren zur Behandlung einer metastasierenden Krebserkrankung oder allergischem Asthma, umfassend Verabreichen einer effektiven Menge eines Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon an einen Patienten, beschrieben.
Von IL-27 wurde gezeigt, dass es Th1-Signalwege positiv reguliert. Weiterhin haben die Erfinder früher gezeigt, dass eine EBI3-Defizienz mit verringerter Th2-Cytokinproduktion durch invariante CD1-restringierte T-Zellen und Schutz vor Colitis [18] und Asthma assoziiert ist. So wollten die Erfinder die Rolle von IL-27 und EBI3 in Lungemelanomen durch die Analyse von EBI3-defizienten Mäusen besser verstehen. Ähnlich zu vorhergehenden Studien mit einer Th2-assoziierten Colitis [18], beobachteten die Erfinder, dass die gerichtete Deletion von EBI3 vor allergischem Asthma schützt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass das Epstein-Barr-Virus (EBV) ein hoch antigenes Virus ist, was in der Expression von viralen Antigenen, wie zum Beispiel dem Epstein-Barr-Virus induzierten Gen 3 auf der Oberfläche von infizierten B Zellen, begründet liegt. Das EBI3-Gen kodiert für einen löslichen Typ 1 Cytokinrezeptor, homolog zu der p40-Untereinheit von Interleukin (IL)-12. Von EBI3 wurde auch als mit einer neuen IL-12 p35-verwandten Untereinheit, bezeichnet als p28, assoziiert gefunden, um IL-27 zu bilden, oder mit der p35-Untereinheit, um IL-12 zu bilden. Im Rahmen der Versuche für die vorliegende Erfindung fanden die Erfinder eine IL-27 unabhängige Rolle von EBI3 in metastatischen Krebserkrankungen und allergischem Asthma und insbesondere bei Lungenmelanomen. In der Tat sind EBI3-defiziente Mäuse vor der Entwicklung von Lungenmelanomen, induziert durch intravenöse Injektion von B16/F10-Zellen geschützt. Konsistenterweise haben CD4⁺ T-Zellen aus EBI3-defizienten Mäusen einen IL-4-abhängigen Defekt in der T-Helferzell-(Th) 2 Entwicklung, da sie CTLA-4 überexprimieren. Interessanterweise setzten nicht lokal aus der Lunge sondern Knochenmark-abgeleitete, EBI3-defiziente dendritische Zellen (BMDC)'s, eine erhöhte Menge an IL-12 nach CpG- und LPS-Stimulation frei. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Abzielen auf die EBI3-Expression und -Funktion im allgemeinen und spezifisch in BMDC's immunologische Antworten über IL-12 in der Lunge antreiben kann, und haben daher wichtige Konsequenzen für den Aufbau von neuen Krebstherapien im allgemeinen und speziell für Lungenkrebs und Lungenmetastasen.
Wichtigerweise haben die Erfinder gefunden, dass Knochenmark-abgeleitete dendritische Zellen (BMDC), denen EBI3 fehlt, erhöhte Mengen von IL-12 und IFN-gamma aufgrund synergistischer TLR-Ligation ausschütten können. Dieser Aktivierungssignalweg induziert auch den prozessierten Antigentransfer von BMDC's zu den Lungen-DCs'. Erhöhtes IFN-gamma, jedoch nicht IL-12 von Lungen-DCs, kombiniert mit einem Defekt in der IL-4-Produktion war für die finale Blockade der Entwicklung von Th2-Zellen in der Lunge verantwortlich. Diese Ergebnisse zeigen, daß, verglichen mit IL-27, die EBI3-Expression per se in BMDC's gegensätzliche immunologische Antworten in der Lunge bewirken kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Abzielen auf die EBI3-Expression und -Funktion in Tumor- und metastatischen Erkrankungen, wie etwa Lungenmelanomen, vorteilhaft für diese Erkrankungen im Menschen ist.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI3) wird ein Testsystem, umfassend EBI3 oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon, dazu verwendet, um nach in Kontakt bringen des Testsystems mit einer oder mehreren Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie EBI3 inhibieren, eine Inhibierung von EBI3 durch die eine oder mehreren Verbindungen nachzuweisen.
In einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Inhibierung der Expression und/oder eine Inhibierung der biologischen Aktivität von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon nachgewiesen.
Die Identifizierung der Rolle von EBI3 bei tumorösen Erkrankungen stellt in dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit der Verwendung von EBI3 als ein ”Target” für ein Verfahren zur Auffindung von Substanzen zur Verfügung, die an EBI3 binden und dieses inhibieren. Verfahren zur routinemäßigen Durchführung solcher „Screenings” sind dem Fachmann im Stand der Technik der Pharmazie gut bekannt. Mittels ”High-Throughput-Technologien” können geeignete Substanzbibliotheken durchsucht werden. Diese Bibliotheken und ihre Durchsuchung sind dem Fachmann bekannt und leicht an die Gegebenheiten der vorliegenden Erfindung anzupassen, ohne dabei erfinderisch tätig sein zu müssen. Zum Beispiel beschreibt US 6,821,737 Verfahren und Kits zum Screening auf Transkriptionsfaktor-Modulatoren. Der Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, das in der US 6,821,737 beschriebene Verfahren entsprechend auf die vorliegende Situation anzupassen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren, wobei das Testsystem ausgewählt ist aus gereinigtem EBI3, einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon; einer EBI3-, ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon exprimierenden Zelle; einem in vitro Testsystem; und/oder Mäuse, umfassend ein experimentelles Tumormodell. Dem Fachmann sind entsprechende Testsysteme bekannt; diese umfassen unter anderem die Analyse der Expression der zu analysierenden Genprodukte mittels DNA oder RNA-Analyse, Chip-basierte Analysen, RT-PCR, ELISA oder andere Antikörper-gestützte Nachweisverfahren.
Unter dem Begriff ”biologisch aktives Fragment oder Derivat davon” im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit dem EBI3 verwandt sind, d. h. Strukturmerkmale dieses Polypeptides aufweisen. Beispiele von „Derivaten” sind Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugsweise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von EBI3 aufweisen. Darunter zählen auch Additionen, Inversionen, Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder chemische/physikalische Modifikationen und/oder Austausche oder Teile des Polypeptids im Bereich von ca. 1–60, vorzugsweise von ca. 1–30, insbesondere von ca. 1–15, vor allem von ca. 1–5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne dass die biologische Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.
Unter dem Begriff ”Inhibitor” im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man zum einen Verbindungen und/oder Moleküle, die an EBI3 binden und die biologische Funktion des Polypeptids negativ beeinflussen, also ganz oder teilweise unterbinden. Der Inhibitor kann dabei direkt an das aktive Zentrum von EBI3 binden oder an eine Position, die dieses aktive Zentrum sterisch beeinflusst. Weiterhin kann der Inhibitor in Kombination mit einem Kofaktor binden, wie zum Beispiel einer zweiten chemischen Gruppe, einem Peptid, Protein, oder ähnlichem. Ein ”Inhibitor” im Sinne der vorliegenden Erfindung kann weiterhin die Expression des Gens für EBI3 unterbinden (z. B. als Deletionskonstrukt) oder die Translation des EBI3 in den Zellen verhindern. Bevorzugt ist der Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon ausgewählt aus chemischen Verbindungen niederen Molekulargewichts, Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, antisense-Oligonukleotiden und Antikörpern.
Weiter bevorzugt ist der Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon ausgewählt aus modifiziertem p28, modifiziertem p35, rekombinanten Antikörperfragmenten und respirablen antisense-Oligonukleotiden gegen die Expression des EBI3-Proteins. Entsprechende Ansätze, insbesondere inhalierbare Oligonukleotide, sind in der Literatur ebenfalls ausführlich beschrieben [27–33].
Ein weiter bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung von Substanzen, weiterhin umfassend eine computergestützte strukturelle Vorauswahl der einen oder mehreren Verbindungen, von der vermutet wird, dass sie ein Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon darstellt. Durch virtuelles Screenen können Substanzen selektioniert werden, die potentiell EBI3 inhibieren sollten. Diese Substanzen werden daraufhin getestet, ob sie den funktionierenden Test inhibieren können. Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin eine computergestützte strukturelle Vorauswahl der einen oder mehreren Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie EBI3 inhibieren. Entsprechende computergestützte Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren wie oben, das weiterhin die Schritte umfaßt von d) Identifizierung des Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon, und, gegebenenfalls, e) Chemische Derivatisierung des in Schritt d) ausgewählten Inhibitors. Kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Tests ein solcher Inhibitor gefunden werden, ist diese Verbindung erfindungsgemäß eine Leitsubstanz (”lead-compound”) für die weitere kommerzielle Arzneimittel-Entwicklung. Sie wird dann u. a. in folgenden, insbesondere lebenden Testsystemen angewendet und weiter entwickelt.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfaßt weiterhin den Schritt der chemischen Derivatisierung der wie oben ausgewählten Verbindungen. Wie hierin verwendet, soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem ”Derivat” eine von der erfindungsgemäß identifizierten Verbindung abgeleitete Verbindung verstanden werden, die z. B. durch verschiedene Restgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die z. B. auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen Daten oder Daten über den Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmt zu einem ”personalisierten” Medikament verarbeitet werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll unter einer ”chemischen Derivatisierung” das Verfahren zu einer entsprechenden chemischen Veränderung verstanden werden, also z. B. die Substitution verschiedener Restgruppen. Bevorzugterweise wird eine chemische Derivatisierung zum Zwecke des Erreichens einer besseren Bioverfügbarkeit oder der Verringerung von möglichen Nebenwirkungen durchgeführt. Unter einem ”Derivat” soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch ein ”Vorläufer” einer Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z. B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, dass sich als wirksame Substanz die erfindungsgemäße Verbindung oder deren Derivate bilden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Beschreibung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Identifizieren eines Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon mittels eines Verfahrens wie oben, und b) Mischen des Inhibitors mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und/oder anderen geeigneten pharmazeutischen Hilfs- und Zusatzstoffen, zum Beispiel einem geeigneten pharmazeutischen Träger.
Die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, z. B. in Form von Arzneimitteln mit einem Gehalt an erfindungsgemäßem Inhibitor bzw. dessen Einsatz bei der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt in üblicher Weise anhand geläufiger pharmazeutisch-technologischer Verfahren. Hierzu werden die Inhibitoren mit geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen zu den für die verschiedenen Indikationen und Applikationsorten geeigneten Arzneiformen verarbeitet.
Dabei können die Arzneimittel in der Weise hergestellt werden, dass die jeweils erwünschte Freisetzungsrate, z. B. eine rasche Anflutung und/oder ein Retard- bzw. Depoteffekt erzielt werden. Ein Medikament kann dabei eine Salbe, Gel, Pflaster, Emulsion, Lotion, Schaum, Creme oder mischphasige oder amphiphile Emulsionssysteme (Öl/Wasser-Wasser/Öl-Mischphase), Liposom, Transfersom, Paste oder Puder sein.
Der Begriff ”Hilfsstoff” bedeutet jedes, nicht-toxische, feste oder flüssige Füll-, Verdünnungs- oder Verpackungsmaterial, solange es nicht ungebührend nachteilhaft mit einem Inhibitor oder dem Patienten reagiert. Flüssige galenische Hilfsstoffe sind zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Zuckerlösungen, Ethanol und/oder Öle. Galenische Hilfsstoffe zur Herstellung von Tabletten und Kapseln können zum Beispiel Bindemittel und Füllmaterial enthalten.
Weiterhin kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor in Form von systemisch eingesetzten Arzneimitteln verwendet werden. Dazu gehören die Parenteralia, zu denen die Injektabilia und Infusionen gehören. Injektabilia werden entweder in Form von Ampullen oder auch als sog. gebrauchsfertige Injektabilia, z. B. als Fertigspritzen oder Einmalspritzen, daneben auch in Durchstechflaschen zur mehrmaligen Entnahme hergereichtet. Die Verabreichung der Injektabilia kann in Form der subkutanen (s. c.), intramuskulären (i. m.), intravenösen (i. v.) oder intrakutanen (i. c.) Applikation erfolgen. Insbesondere können die jeweils zweckmäßigen Injektionsformen als Kristallsuspensionen, Lösungen, nanopartikuläre oder kolloiddisperse Systeme, wie z. B. Hydrosole, hergestellt werden.
Die injizierbaren Zubereitungen können ferner als Konzentrate hergestellt werden, die mit wässrigen isotonischen Verdünnungsmitteln aufgelöst oder dispergiert werden. Die Infusionen lassen sich ebenfalls in Form von isotonischen Lösungen, Fettemulsionen, Liposomenzubereitungen, Mikroemulsionen zubereiten. Wie Injektabilia können auch Infusionszubereitungen in Form von Konzentraten zum Verdünnen zubereitet werden. Die injizierbaren Zubereitungen können auch in Form von Dauerinfusionen sowohl in der stationären als auch in der ambulanten Therapie, z. B. in Form von Minipumpen, appliziert werden.
Der erfindungsgemäße Inhibitor kann in den Parenteralia an Microcarrier oder Nanopartikel gebunden sein, beispielsweise an feinstverteilte Partikel auf Basis von Poly(meth)acrylaten, Polylactaten, Polyglycolaten, Polyaminsäuren oder Polyetherurethanen. Die parenteralen Zubereitungen können auch als Depotpräparate modifiziert sein, z. B. aufbauend auf dem ”Multiple Unit Prinzip”, wenn ein erfindungsgemäßer Inhibitor in feinstverteilter bzw. dispergierter, suspendierter Form oder als Kristallsuspension eingearbeitet ist, oder aufbauend auf dem ”Single Unit Prinzip”, wenn ein erfindungsgemäßer Inhibitor eingeschlossen ist in einer Arzneiform, z. B. einer Tablette oder einem Stäbchen, das anschließend implantiert wird.
Häufig bestehen diese Implantate oder Depotarzneimittel bei „Single Unit”- und „Multiple Unit”-Arzneiformen aus so genannten bioabbaubaren Polymeren, wie z. B. Polyester der Milch- und Glykolsäure, Polyetherurethanen, Polyaminosäuren, Poly(meth)acrylaten oder Polysacchariden.
Als Hilfs- und Trägerstoffe bei der Herstellung von Parenteralia kommen Aqua sterilisata, den pH-Wert beeinflussende Substanzen, wie z. B. organische und anorganische Säuren und Basen sowie deren Salze, Puffersubstanzen zur Einstellung des pH-Wertes, Isotonisierungsmittel, wie z. B. Natriumchlorid, Natriumhydrogencarbonat, Glucose und Fructose, Tenside bzw. oberflächenaktive Substanzen und Emulgatoren, wie z. B. Partialfettsäureester des Polyoxyethylensorbitans (Tween^®) oder z. B. Fettsäureester des Polyoxyethylens (Cremophor^®), fette Öle, wie z. B. Erdnußöl, Sojabohnenöl und Rizinusöl, synthetische Fettsäureester, wie z. B. Ethyloleat, Isopropylmyristat und Neutralöl (Miglyol^®), sowie polymere Hilfsstoffe, wie z. B. Gelatine, Dextran, Polyvinylpyrrolidon, die Löslichkeit erhöhende Zusätzen organischer Lösungsmittel, wie z. B. Propylenglycol, Ethanol, N,N-Dimethylacetamid, Propylenglycol, oder komplexbildender Stoffe, wie z. B. Citrate und Harnstoff, Konservierungsmittel, wie z. B. Benzoesäurehydroxypropyl- und -methylester, Benzylalkohol, Antioxidantien, wie z. B. Natriumsulfit und Stabilisatoren, wie z. B. EDTA, in Betracht.
Bei Suspensionen erfolgt ein Zusatz von Verdickungsmitteln zum Verhindern des Absetzens von erfindungsgemäßen Inhibitoren von Tensiden und Peptisatoren, um die Aufschüttelbarkeit des Sediments zu sichern, oder von Komplexbildnern, wie EDTA. Es lassen sich auch mit verschiedenen Polymeren Wirkstoffkomplexe erzielen, beispielsweise mit Polyethylenglykolen, Polystyrol, Carboxymethylzellulose, Pluronics^® oder Polyethylenglykolsorbitfettsäureestern. Zur Herstellung von Lyophilisaten werden Gerüstbildner, wie z. B. Mannit, Dextran, Saccharose, Humanalbumin, Lactose, PVP oder Gelatinesorten verwendet.
Die jeweils geeigneten Arzneiformen lassen sich in Einklang mit dem Fachmann bekannten Rezepturvorschriften und Verfahrensweisen auf der Basis pharmazeutisch-physikalischer Grundlagen herstellen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Beschreibung betrifft dann die entsprechend hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.
Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die weitere Chemotherapeutika enthält. Diese Chemotherapeutika können alle für den Fachmann üblichen Chemotherapeutika im Rahmen einer Krebstherapie umfassen (z. B. Taxol). Die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt ist eine Zusammensetzung zur Verabreichung eines respirablen antisense-Oligonukleotids gegen die Expression von EBI3-Protein. Entsprechende Ansätze, insbesondere inhalierbare Oligonukleotide, sind in der Literatur ebenfalls ausführlich beschrieben ([20], [31]–[33]) und können entsprechend angepasst werden.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann eine Verbindung, die mittels eines oben genannten erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert (ausgewählt) wurde. Diese Verbindung kann zum Beispiel aus einer (käuflich erhältlichen) natürlichen und oder künstlichen Substanzbibliothek entstammen, solche ”compound libraries” sind dem Fachmann bestens bekannt. Bevorzugt ist eine Bibliothek von kurzen Peptiden. Besonders bevorzugt ist diese Verbindung ausgewählt aus modifiziertem p28, modifiziertem p35, rekombinanten Antikörperfragmenten und respirablen antisense-Oligonukleotiden (siehe oben).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Oligonukleotid, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz von EBI3 hybridisiert. Oligonukleotide stellen wichtige Therapeutika in der z. B. Gentherapie dar. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können in Form von Nukleinsäuren umfassend DNA, dsDNA, RNA, mRNA, siRNA, PNA und/oder CNA vorliegen. Die Oligonukleotide liegen bevorzugt als ”antisense”-Oligonukleotide vor. Die Obergrenze für Oligonukleotide wird durch die jeweilige praktische Verwendung bestimmt, wobei üblicherweise eine maximale Länge von 50–200 Nukleotiden bevorzugt wird.
Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so dass über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird ([34], [35], WO 95/11910 , WO 98/37240 ; WO 97/29116 , Dudycz 1995, Macadam et al. 1998). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung einer oder mehrerer Internukleotid-Phosphatgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht-Phosphor-Internukleotide erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann, 1990 ([36]) zusammengefasst (siehe auch [34], [35], WO 95/11910 , WO 98/37240 ; WO 97/29116 , Dudycz 1995, Macadam et al. 1998). Modifizierte Internukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht-Phosphoresterbindungen in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phosphatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thiobrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, dass diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.
Mit ”antisense”-Oligonukleotiden kann die Expression des entsprechenden Gens von EBI3 in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Für die Verwendung als ”antisense”-Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.
Um die Einführung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Inhibitoren in die EBI3-exprimierende Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Retroviren, Baculoviren, Vakziniaviren, Adenviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder Polylysin konjugierte DNA.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Adenovirusvektoren oder retrovirale Vektoren ([37] und [38]).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Inhibitor in Form eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers oder ein EBI3-bindendes Fragment davon, bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff Antikörper versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenenfalls modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z. B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oligo-spezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)₂-Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684 , US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649 , WO 93/06213 , WO 98/24884 ).
Ein weiterer Aspekt betrifft die Verabreichung der erfindungsgemäßen Inhibitoren als Oligonukleotide bei der Gentherapie mittels herkömmlicher Transfektionssysteme, wie zum Beispiel Liposomen oder ”particle gun”-Techniken.
Ausgehend von aufgefundenen Strukturen lassen sich in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung strukturell ähnliche Substanzen (Derivate) herstellen, die im Rahmen eines ”molekularen Mimicry” spezifisch an das Target EBI3 des vorliegenden Pathomechanismus binden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung eines erfindungsgemäßen Inhibitors von EBI3 oder eines biologisch aktiven Fragments oder Derivats davon, wie oben definiert, zur Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen oder allergischem Asthma. Bevorzugt ist eine Verwendung gemäß der Erfindung, wobei der Inhibitor eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie oben, oder eine Verbindung, wie oben, ist. Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei die metastasierende Krebserkrankung ein primäres Melanom ist.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen und allergischem Asthma, umfassend eine Inhibierung der Expression von EBI3 durch Verabreichen einer effektiven Menge eines Inhibitors von EBI3 oder eines biologisch aktiven Fragments oder Derivats davon an einen Patienten. Die Erfindung betrifft die Korrelation der (u. a. transkriptionellen) Expressionshöhe von EBI3 mit der Metastasierung und allergischem Asthma sowie der Fernmetastasierungs-Wahrscheinlichkeit von u. a. Kolonkarzinomen. Damit ist die potentielle Nutzung dieses neuen Gens als Therapietarget als Interventionstarget auch für Tumortherapie zur Beeinflussung (Verhinderung) der Fernmetastasierung beim u. a. Lungenkarzinom gegeben. Eine Beeinflussung zur Behandlung von tumorösen Erkrankungen und allergischem Asthma kann die Verabreichung einer, wie oben angegebenen pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen. Ein weiterer besonderer Aspekt der vorliegenden Beschreibung ist somit ein Verfahren zur Behandlung von tumorösen Erkrankungen, wobei die tumoröse Erkrankung metastasierender Lungen- oder Kolonkrebs oder allergisches Asthma ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Immuntherapie mit dendritischen Zellen, die defizient für EBI3 oder Knockout-Zellen für EBI3 sind. Bevorzugterweise werden dabei EBI3-defiziente dendritische Zellen oder dendritische EBI3-knockout Zellen zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere metastasierenden Krebserkrankungen oder allergischem Asthma, verwendet. Bevorzugterweise werden dabei EBI3-defiziente dendritische Zellen oder dendritische EBI3-knockout Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere metastasierenden Krebserkrankungen oder allergischem Asthma, verwendet. Bevorzugt ist weiterhin eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei die metastasierende Krebserkrankung ein primäres Melanom ist. Es wird weiterhin bevorzugt, daß ein Verfahren zur Behandlung einer metastasierenden Krebserkrankung oder von allergischem Asthma das Verabreichen von EBI3-defizienten dendritischen Zellen oder dendritischen EBI3-knockout Zellen an einen Patienten umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Medikament, dass gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch verschiede Routen verabreicht, zum Beispiel oral, parenteral, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intracerebral. Die bevorzugte Route der Verabreichung wäre parenteral bei einer täglichen Dosis der Verbindung für einen Erwachsenen von ungefähr 0,01–5000 mg, bevorzugt 1–1500 mg pro Tag. Bevorzugterweise wird das Medikament in einer Dosierung von zwischen 30 mg/Tagund 2000 mg/Tag, bevorzugt zwischen 100 mg/Tag und 1600 mg/Tag, am meisten bevorzugt zwischen 300 to 800 mg/Tag. Die geeignete Dosis kann als eine einzelne Dosis oder als geteilte Dosen, in geeigneten Intervallen, zum Beispiel als zwei, drei, vier oder mehr Subdosen pro Tag, präsentiert werden.
Geeignete Dosen können leicht durch einen Fachmann durch Routineexperimente erhalten und auf Faktoren basiert werden, wie zum Beispiel die Konzentration des aktiven Inhaltsstoff, das Körpergewicht und Alter des Patienten und andere Patienten- oder aktive Inhaltsstoffzusammenhängende Faktoren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung oder Prophylaxe eines spezifischen Zustands oder Zustände effektiv ist. Die anfängliche Dosierung im Menschen wird durch klinische Überwachung von Symptomen begleitet, den Symptomen des ausgewählten Zustands. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen in einer Menge an aktivem Mittel von mindestens ungefähr 100 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden sie in einer oder mehreren Dosen in einer Menge nicht im Überschuss von ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Bevorzugt ist in den meisten Fällen die Dosis von ungefähr 100 μg/kg bis ungefähr 5 mg/kg Körpergewicht täglich.
Besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mit Hilfe der Abbildungen und der Beispiele verdeutlicht, ohne dadurch beschränkt zu werden.
1. Intravenöse Injektion von B16/F10-Zellen induziert Lungenmelanome in einem Mausmodell.

A. 2 × 10⁵ B16/F10-Zellen wurden in die laterale Schwanzvene jeder Maus injiziert.
B. Histologisch können B16/F10-Zellen erkannt werden, da sie mit Melanin, einem braunen Pigment, beladen sind. In B sind B16/F10-Zellen in histologischen Schnitten von der Lunge zu sehen, die die Blutgefäße verlassen haben und in die angrenzenden lymphatischen Gefäße eingetreten sind.
In C und D sind zwei verschiedene Vergrößerungen von Lungenschnitten zu sehen, die andere B16/F10-Zellen zeigen, die zur Pleura der Lunge gewandern sind, um dort makroskopisch sichtbare Kolonien zu bilden.

2. EBI3-defiziente Mäuse werden vor metastasierenden Melanomzellen in der Lunge geschützt. Intravenös injizierte B16/F10-Zellen induzieren metastatische Lungenmelanome in C57/BL6-Wildtyp-Mäusen. Dieser Tumor entwickelt sich und schreitet in der Größe von melanotischen Kolonien fort, beginnend an Tag 5 bis Tag 21 nach der intravenösen B16/F10- Zellinjektion (A–D). Verglichen mit den Wildtyp-Wurfgeschwistern sind EBI3 (–/–)-Mäuse in diesem Modell vor Lungenmelanomen geschützt (E–H).
2I. zeigt eine Quantifikationsanalyse der Lungenkolonien 10, 14 und 21 Tage nach intravenöser Injektion in Wildtyp- bzw. EBI3-defizienten Mäusen. EBI3-defiziente Mäuse tragen eine signifikant reduzierte Zahl von Kolonien/Oberfläche, verglichen mit den Wildtyp-Wurfgeschwistern unter denselben experimentellen Bedingungen.
3. Erhöhte Zahl von aktivierten Gedächtnis CD4⁺ T-Zellen und NKDX5⁺-Zellen in der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen 5 Tage nach Injektion von B16/F10-Zellen.
Nachweis von immunologisch kompetenten Zellen in Lungen von Wildtyp- und EBI3-defizienten Mäusen, die zu den angegebenen Tagen nach intravenöser Injektion von B16/F10-Zellen infiltriert waren. An Tag 5 wurde eine signifikante Zunahme in CD4⁺CD44⁺CD69⁺-Zellen in der Lunge von Tumor-tragenden EBI3-defizienten Mäusen beobachtet, verglichen mit den Wildtyp-Wurfgeschwistern (A–B). Zusätzlich erhöhte sich die Zahl von CD4⁺NK⁺DX5⁺ in den Lungen von EBI3-defizienten Mäusen, im Vergleich zu den Wildtyp-Wurfgeschwistern (C–D).
4. Erhöhte IFN-gamma Freisetzung in den Luftwegen von Melanom-tragenden Lungen von EBI3-defizienten Mäusen. Bronchoalveolare Lavageflüssigkeit wurde aus der Lunge von Wildtyp- und EBI3-defizienten Tumor-tragenden Mäusen erhalten. Die Interferon-gamma-Analyse wurde mittels ELISA, wie in den Materialien und Methoden beschrieben, durchgeführt. Verglichen mit den Wildtyp-Wurfgeschwistern zeigt die Abbildung, dass, zehn Tage nach der Injektion von B16/F10-Zellen in EBI3-defizienten Mäusen, die Tumor 6 tragen, Interferon-gamma hochreguliert wird.
5. Ko-stimulatorische Konfrontation mit anti-CD28 Antikörpern und IL-4 oder IL-2 induziert IFN-gamma-Produktion durch CD4⁺ T-Zellen in EBI3-defizienten Mäusen.
CD4⁺ Milz-T-Zellen, isoliert aus EBI3-defizienten Mäusen, setzten zeitabhängig eine erhöhte Menge von IFN-gamma nach ko-stimulatorischer Konfrontation mit anti-CD28-Antikörpern, 2 (A) und 6 (B) Tage nach Beginn der Zellkultur frei. Ectopisch hinzugeführtes IL-4 und IL-2 trug an Tag 2 jedoch nicht an Tag 6 zu der verstärkten IFN-gamma-Produktion durch CD4⁺ T-Zellen bei, denen EBI3 fehlt.
C zeigt RT-PCR-Analysen von T-bet-Transkripten aus CD4⁺ Milz-T-Zellen nach angezeigter Konfrontation und Allergen-Konfrontation mit OVA sowohl in Wildtyp- als auch in EBI3- defizienten Mäusen. Die höchste Expression von T-bet wurde in CD4⁺ T-Zellen aus EBI3-defizienten Mäusen nach ko-stimulatorischer Konfrontation mit anti-CD28-Antikörpern gefunden, was eine T-bet getriebene INF-gamma-Produktion in CD4⁺ T-Zellen anzeigt, denen EBI3 nach der Antigen-Aussetzung fehlt.
6. Erhöhte IL-2-Produktion und CTLA-4-Expression durch CD4⁺ Lungen-T-Zellen aus EBI3-defizienten Mäusen.
Die gezielte Deletion von CTLA-4 in Mäusen führt zu einer verringerten Produktion von IL-2 aus Lymphknoten. Im Gegensatz dazu setzten aus der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen isolierte CD4⁺ T-Zellen erhöht IL-2 frei, verglichen mit den Wildtyp-Wurfgeschwistern, wie CBA-Dotblot und Histogramm-Analyse zeigen (A).
Darüber hinaus wurden hohe CD4⁺ CTLA-4-Zellen in der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen gefunden, was eine negative Regulation der Th2-Immunantworten in diesen Mäusen anzeigt (B).
7. CpG verstärkt synergistisch mit LPS die IL-12-Produktion in EBI3-defizienten Knochenmark-abgeleiteten DCs und bewirkt die Antigenpräsentation für residente Lungendendritische Zellen.
BMDC's, denen EBI3 fehlt und die in der Anwesenheit von TNF-alpha und Stimulation mit TLR-9 und TLR-2/4 differenziert wurden, setzten erhöhte Mengen an IL-12 frei, verglichen zu DC's, die aus Wildtyp-Wurfgeschwistern isoliert wurden (A).
Im Gegensatz dazu, setzten Lungen DCs' aus EBI3-defizienten Mäusen niedrigere Mengen an IL-12 frei, sogar unter ko-stimulatorischer Konfrontation (B).
Die Erfinder schließen daraus, dass BMDC's eine erhöhte Menge an IL-12 in Abwesenheit von EBI3 freisetzen, dass diese Zellen das Antigen in der Peripherie aufnehmen und das prozessierte Peptid zu residenten DC's in der Lunge transferieren, die im Gegenzug die CD4⁺ T-Zell-Antworten steuern. Um dies zu verdeutlichen, beluden die Erfinder BMDC's sowohl aus Wildtyp- und EBI3-defizienten Mäusen mit Texasrot-markiertem-Ovalbumin und ko-kultivierten diese in Anwesenheit von CFSE-markierten Lungen-DC's, um zu sehen, ob das Peptid (rot) zu den CFSE-markierten Lungen-DC's transferiert würde. In diesem Fall würden die grünen Zellen gelbe intra-cytoplasmatische Flecken aufweisen (grün plus rot), was anzeigt, dass OVA zwischen den zwei DC-Populationen weitergegeben wird. Wie die 7C–H zeigen, tritt eine induzierte Antigenpräsentation spontan unter Beteiligung von CpG und LPS oder beidem auf und induziert die IL-12 Produktion.
Beispiele
Materialien und Methoden
Mäuse, Cytokine und Antikörper
C57/BL6-Mäuse wurden von Charles River Laboratories erhalten. EBI3(–/–)-Mäuse wurden, wie vorher beschrieben, gehalten [29, 36, 48]. Gereinigtes rekombinantes Maus-spezifisches IL-4 (10 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ), anti-CD3 (5 mg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland), anti-CD28 (2 mg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland), IL-27 (Rand D, Wiesbaden, Deutschland, LPS (Invivogen, San Diego, CA), und CpG (MWG Biotech, Heidelberg, Deutschland) mit der Sequenz
(5'-t(phosphothioniert;PTO)CCATGACGTTCCTGACGt(PTO)t(PTO)-3'),
wurden für die in vitro Studien verwendet.
Quantifizierung der Lungenmetastasen
Metastatische Lungen wurden unter dem Stereomikroskop Stemi 200-C mit AxioCam MRc photographiert. Die Metastasen wurden auf der Vorderseite und der Rückseite der Lunge durch Axiovision 4.2. von Carl Zeiss Vision GmbH markiert. Die markierten Bereiche wurden aufsummiert und mit der Größe der gesamten Lunge verglichen. Die Ergebnisse sind in Prozent gezeigt.
Sammlung und Analyse der BAL
Bronchoalveolare Lavageflüssigkeit (RALF) aus der rechten Lunge wurde durch intratracheales Injizieren von 0,75 ml Kochsalzlösung (4 ×) erhalten. RALF wurde gesammelt und ein Aliquot von Zellen wurde mit Trypanblau-Lösung für die Testung auf Lebensfähigkeit unter der Verwendung einer Neubauer-Kammer gefärbt. Die Proben wurden bei 1500 U/min für 5 Min zentrifugiert und Zellpellets wurden in 1 ml PBS resuspendiert. Cytospins wurden durch Zentrifugation bei 500 U/min für 5 Min durchgeführt. Eosinophile wurden durch Färben gemäß Diff Quick (Dade Behring, Marburg, Deutschland) bestimmt. Die Cytospins wurden mit einem Zeissmikroskop unter der Verwendung eines 40x Objektivs analysiert. Die Überstände wurden eingefroren und anschließend durch ELISA analysiert.
Isolierung und Reinigung von Milz- und Lungen-CD4+ Zellen
Milz- und Lungen-mononukleäre Zellen wurden aus frisch erhaltenen Proben von gesunden C57/BL6-Mäusen (6–8 Wochen alt) isoliert. Die Lungen wurden entfernt, auf Eis in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium (Biochrom, Berlin, Germany) transportiert. Gewebestücke wurden in Dulbecco's PBS, enthaltend 300 U/ml Collagenase Type II (Worthington, Lakewood, NJ) und 0,001% DNase (Roche, Basel, Schweiz), suspendiert. Die Lungen- und Milzzellen wurden, wie vorher beschrieben [20], isoliert. Kurz beschrieben wurde der Lungenverdau filtriert, zentrifugiert und vor der Zellsuspension die Erythrocyten durch hypotonische Lyse in Ammoniumchlorid- und Kaliumchlorid(ACK)-Puffer entfernt. Lungen- und Milz-CD4⁺ T-Zellen wurden durch die Verwendung von anti-CD4-Perlen von Miltenyi (L3T4 Perlen; Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Deutschland) gereinigt. Lungen-CD4⁺ T-Zellen wurden in RPMI-Medium in mit anti-CD3-Antikörpern (5 mg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) beschichteten Wells in der Anwesenheit von anti-CD28-Antikörpern (2 mg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) mit und ohne IL-4 (10 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ) für zwei Tage bei einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Überstände eingefroren und die Zellen wurden für vier weitere Tage, wie oben angegeben, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von IL-4 (Tag 6) inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Überstände eingefroren und später durch ELISA auf die Cytokinproduktion hin analysiert.
Milz- und Lungen-mononukleare Zellen wurden aus frisch erhaltenen Proben von gesunden C57/BL6 Mäusen (6–8 Wochen alt), wie vorher beschrieben (21), isoliert.
Differentiation von Knochenmark-abgeleiteten DCs und RNA-Extraktion
Murine Knochenmark-abgeleitete DCs (BMDC) wurden, wie vorher beschrieben, erzeugt [22]. Knochenmarkzellen wurden aus Femuren von 6- bis 10-Wochen alten Mäusen isoliert und in serumfreiem X-Vivo-15 Medium (Cambrex, East Rutherford, NJ), ergänzt mit 10 ng/ml murinem GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ), kultiviert. Gesamt-RNA wurde unter der Verwendung des Trifast-Reagenz (Peqlab, Erlangen, Deutschland) isoliert, gefolgt von weiterer Reinigung mit dem RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) einschließlich DNase I.-Verdau. 1 bis 5 μg RNA wurden für die cDNA Synthese mit Superscript II (Invitrogen, Heidelberg, Deutschland) verwendet. Der spezifische mRNA-Nachweis wurde durch PCR-Analyse mit den vorher beschriebenen Primern TI#TI durchgeführt [29]. Differenzierte BMDCs wurden dann für die TLR-Ligation und IL-27-Stimulierung, wie unten beschrieben, verwendet und die Überstände nach 48 Stunden eingefroren. Lungen-dendritische Zellen wurden nach Lungendissoziation unter der Verwendung von anti-CD11c-Perlen von Miltenyi (L3T4 Perlen; Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Deutschland), wie vom Hersteller beschrieben, isoliert.
Isolierung von RNA aus Lungen CD4⁺ T-Zellen und BMDC's und RT-PCR.
Sortierte und kultivierte Lungen-CD4⁺ T-Zellen und BMDC-Zellen wurden bis zur RNA-Isolierung sofort nach der Zellkultur eingefroren, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden (RNeasy Micro Kit; Qiagen, Hilden, Deutschland), und wie vorher beschrieben (21).
6 μl Gesamt-RNA aus CD4⁺ T-Zellen wurden unter der Verwendung des RevertAid^TM 1^st Strang cDNA Synthesekits für RT-PCR (M-MuLV reverse Transkriptase; MBI-Fermentas GMBH, St.Leon-Rot, Deutschland) revers transkribiert. Die sich ergebende cDNA wurde als Templat für die PCR verwendet. Für die T-bet-Analyse verwendeten die Erfinder die folgenden Primer:
antisense 5' TGC CCC GCT TCC TCT CCA ACC AA 3',
sense 5' TGC CTG CAG TGC TTC TAA CA 3'.
Die Primer für Aktin waren:
5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3' und
5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'.
Das PCR-Programm war wie folgt: 93°C 3 min: 32 Zyklen von je 93°C 30 sec: 60°C 30 sec, 72°C 1 min und finale Verlängerung 10 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5%igen Agarosegelen analysiert.
FACS Analyse und cytometrischer Perlen-Array (CBA)
Um die Reinheit der isolierten CD4⁺ T-Zellen sicherzustellen wurden routinemäßig 5 × 10⁵ Zellen mit 1 ml PBS gewaschen und dann für 30 min in 100 μl PBS, enthaltend 5 μg/ml an anti-CD4-AK-FITC (BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland), inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 ml PBS gewaschen und anschließend in 1 ml 2%iger PFA/PBS (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)-Lösung fixiert und analysiert. Die sich ergebenden Zellsuspensionen wurden durch FACS-Calibur gemessen und unter der Verwendung von Cell-Quest Pro Version 4.02 (BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) analysiert.
CD4⁺ T-Zellen aus der Lunge von OVA-sensibilisierten und -konfrontierten Mäuse wurden über Nacht in Anwesenheit von Platten-gebundenen anti-CD3-Antikörpern und löslichen anti-CD28-Antikörpern inkubiert. Die Überstände wurden Fluoreszenz-cytometrisch unter Verwendung eines cytometrischen Perlen-Array (CBA; Maus Th1/Th2 Kit erhalten von BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA) analysiert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden, und wie vorher beschrieben (21). Im Anschluss an die flußcytometrische Akquisition wurden die Probenergebnisse in graphischen und Tabellenformaten, unter Verwendung der BD CBA Analyse-Software (BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) erzeugt.
ELISA.
Murines IL-5 wurde unter Verwendung eines spezifischen Sandwich ELISAs (OptEIA^TM; Standardbereich von 15,6 bis 1000 pg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) nachgewiesen, murines IL-4 unter Verwendung eines spezifischen Sandwich ELISAs (OptEIA^TM; Standardbereich von 7,8 bis 500 pg/ml; BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland). IL-13 wurde unter Verwendung eines Maus-spezifischen ELISA Kits (Duo set-IL-13; Standardbereich von 40 bis 2500 pg/ml, R&D Systems, Wiesbaden, Germany) in der bronchoalveolaren Lavageflüssigkeit nachgewiesen. IFN-gamma-ELISAs wurde von BAL und Zellüberständen unter Verwendung eines Sandwich ELISAs (OptEIA^TM, Standardbereich von 31.3 bis 2000 pg/ml, BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. IL-12p70 wurde unter Verwendung eines Maus-spezifischen ELISA Kits (OptEIA^TM, Standardbereich von 62.5 bis 4000 pg/ml, BD PharMingen, Heidelberg, Deutschland) in den dendritischen Zellüberständen nachgewiesen.
Histologische Analyse.
Für die histologische Analyse wurde ein signifikantes Stück der Lunge präpariert und in 10% gepuffertes Formalin eingetaucht, bis es in Übereinstimmung mit Standardprotokollen in der pathologischen Abteilung der Universität in Paraffin eingebettet wurde. Histologische Lungenbilder wurden (40x; Bildbreite: jeweils 320 μm) in Photoshop (Adobe Systems Inc. Version 7.0, San Jose, CA) importiert, wie vorher beschrieben (48).
Statistische Analyse.
Die Unterschiede wurden durch den zweiseitigen Studenten-t-Test auf Signifikanz (P < 0.05) von unabhängigen Ereignissen (Excel, PC) evaluiert. Der Korrelationskoeffizient wurde unter der Verwendung der statistischen Analyse des Excel-Programms berechnet. Daten sind als Mittelwerte ± SD angegeben.
Ergebnisse
EBI3-defiziente Mäuse sind vor Lungenmelanomen geschützt.
Die Erfinder und andere (18) berichteten über gestörte Th2-Immunantworten in EBI3-defizienten Mäusen. In dieser Erfindung analysierten die Erfinder in einem experimentellen Modell, ob eine EBI3-Defizienz vor Lungenmelanomen schützen würde. Wie in 2A–D gezeigt, führte die intravenöse Injektion von Zellen der B16/F10-Zelllinie in Wildtyp-Wurfgeschwistern zur Entwicklung von Lungenmetastasen auf zeitabhängige Art und Weise. In der Tat wiesen Lungen von Wildtyp-Mäusen, die Tumore trugen, an Tag 5 bis Tag 21 nach der Zellinjektion Lungenmetastasen auf. Am spätesten Zeitpunkt, Tag 21, starben ungefähr 10–20% der Mäuse.
Im Gegensatz dazu schützte die intravenöse Injektion der B16/F10-Zellen in EBI3-defiziente Mäuse diese Mäuse vor Lungemetastasen, wie in 2E–H gezeigt. Die quantitative Analyse zeigte, dass 10, 14 und 21 Tage nach intravenöser Injektion von B16/F10-Zellen, EBI3-defiziente Mäuse vor Lungemetastasen geschützt sind, was durch den durch metastatische schwarze Kolonien besetzten Bereich gezeigt ist (2I).
Erhöhte Zahl von aktivierten Gedächtnis-CD4⁺ T-Zellen und NKDX5⁺-Zellen in der Lunge von EBI3-defizienten Mäuse fünf Tage nach der Injektion von B16/F10-Lungenmelanom-Zellen.
Um die immunologischen Mechanismen zu verstehen, die dem Tumor-Entkommen in EBI3-defizienten Mäusen zugrunde liegen, dissoziierten die Erfinder Lungen, die Tumore trugen, von Wildtyp- und EBI3-defizienten Mäusen und führten eine FACS-Analyse durch. Wie in 3A–B gezeigt, wanderten fünf Tage nach der intravenösen Injektion von 2 × 10⁵ B16/F10-Zellen in EBI3-defiziente Mäuse eine erhöhte Zahl von CD4⁺CD44⁺CD69⁺-Zellen in die Lunge ein, verglichen mit Wildtyp-Wurfgeschwistern. Zu diesem Zeitpunkt wurde auch eine erhöhte Zahl von CD4⁺NK⁺DX5⁺-Zellen aus der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen festgestellt, verglichen mit Wildtyp-Wurfgeschwistern (3C–D), was eine erhöhte Immunantwort in der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen anzeigt, verglichen mit Wildtyp-Wurfgeschwistern nach Injektion von B16/F10-Zellen.
Erhöhte IFN-gamma-Produktion in der Lunge von EBI3-defizienten Mäusen sechs und zehn Tage nach intravenöser Injektion von B16/F10-Zellen.
Von IFN-gamma ist bekannt, dass es Antitumor Eigenschaften besitzt und CTL-Antworten induziert. Die Erfinder analysierten daher die IFN-gamma-Freisetzung in der Lunge von Mäusen, die Melanome trugen, und fanden, dass sechs und zehn Tage nach intravenöser B16/F10-Zelleninjektion EBI3-defiziente Mäuse eine erhöhte Menge an IFN-gamma in die Atemwege (bronchoalveolare Lavageflüssigkeit) freisetzten, verglichen zu Wildtyp-Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten.
Milz-CD4⁺ T-Zellen, denen EBI3 fehlt, setzen erhöhtes IFN-gamma nach T-bet-Hoch-Regulation und Kostimulation frei.
EBI3 wird durch dendritische Zellen nach TLR-Ligation produziert, für eine EBI3-Freisetzung durch CD4⁺ T-Zellen gab es bisher keine Hinweise. Die Erfinder analysierten daher, ob die EBI3-Defizienz in DCs die Cytokinproduktion in CD4⁺ T-Zellen, die aus EBI3-defizienten Mäusen isoliert wurden, beeinflussen würden. Wie in 5 gezeigt, setzten CD4⁺ T-Zellen aus EBI3-defizienten Mäusen eine erhöhte Menge an IFN-gamma 2 und 6 Tage nach Kostimulation mit anti-CD28-Antikörpern und in der Anwesenheit von entweder IL-2 oder IL-4 oder beiden frei (5A und 5B, jeweils an Tag 2 und Tag 6). Die IFN-gamma-Produktion wurde durch die erhöhte Expression des Signatur-TH1-Transkriptionsfaktors T-bet (5C) begleitet.
CD4⁺ T-Zellen aus Lungen von EBI3-defizienten Mäusen setzen eine erhöhte Menge an IL-2 frei und exprimieren erhöhte Mengen des inhibierenden kostimulatorischen Moleküls CTLA-4.
CTLA-4 ist ein mit dem T-Zellrezeptor assoziertes, kostimulatorisches Molekül, das negativ die Th2- jedoch nicht die Th1-Differenzierung reguliert. Die Erfinder analysierten daher die CTLA-4 Expression in Lungen-CD4⁺ T-Zellen, isoliert aus EBI3-defizienten und Wildtyp-Wurfgeschwistern. Wie in 6A gezeigt, wurde von CTLA-4 gefunden, das es in Lungen CD4⁺ T-Zellen, isoliert aus EBI3-defizienten Mäusen, hoch-reguliert ist. Zusammen mit diesem Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass CD4+ T-Zellen, isoliert aus EBI3-defizienten Mäusen erhöhte Mengen von IL-2 freisetzten, wie durch CBA-Analyse in 6A gezeigt.
CpG verstärkt synergistisch mit LPS die IL-12-Produktion durch Knochenmarkabgeleitete DC's (BMDCs'), denen EBI-3 fehlt, und gibt das Antigen an residente Lungen-dendritische Zellen weiter.
Die Erfinder fragten als nächstes, ob DCs, isoliert aus verschiedenen immunologisch relevanten Stellen, verschieden auf die TLR-Ligation antworten würden. In diesem Zusammenhang wurde erst kürzlich beschrieben, dass BMDC's durch LPS oder CpG oder synergistisch durch beide induziert werden können, vermehrt IL-12 zu produzieren [19]. Die Erfinder untersuchten daher, ob EBI3-defiziente BMDC's den Defekt in der IL-27 Produktion durch Überproduktion von IL-12 in der Abwesenheit von EBI3 kompensieren können. In Übereinstimmung mit vorherigen Berichten haben die Erfinder gefunden, dass BMDC's synergistisch nach LPS- und CpG-Stimuli erhöhte Mengen an IL-12 (7A) freisetzen. Interessanterweise setzten BMDC's abgeleitet aus EBI3-defizienten Mäusen signifikant mehr IL-12 frei, verglichen mit denen, isoliert aus Wildtyp Mäusen, wenn beide TLR-Signalwege (TLR2/4 und 9) aktiviert wurden (7A). Außerdem setzen Lungen-DCs, isoliert aus EBI3-defizienten Mäusen, nicht so viel IL-12 frei, sogar in der Anwesenheit von Tollähnlicher Rezeptorstimulation (7B). Die Erfinder schließen daraus, dass BMDC's erhöhte Mengen von IL-12 in Abwesenheit von EBI3 freisetzen, dass diese Zellen das Antigen in der Peripherie aufnehmen, prozessieren und es zu residenten DC's in der Lunge transferieren, die im Gegenzug die CD4⁺ T-Zell-Antworten steuern. Um diesen Punkt zu belegen, beluden die Erfinder BMDC's von sowohl Wildtyp- als auch EBI3-defizienten Mäusen mit Texasrot-markiertem OVA und ko-kultivierten diese in Anwesenheit von CFSE-markierten Lungen-DC's, um zu sehen, ob die Peptide (rot) zu den CFSE-markierten Lungen DC's passiert wurden. In diesem Fall würden die grünen Zellen gelbe intracytoplasmatische Flecken (grün plus rot) aufweisen, was eine OVA-Weitergabe zwischen den zwei DC-Populationen anzeigen würde. Wie in den 7C–H gesehen werden kann, tritt die weitergegebene-Antigenpräsentation spontan auf und wird durch Stimuli induziert, die IL-12 Produktion induzieren, nämlich durch CpG und LPS oder beide.
Es sollte verstanden werden, dass die Merkmale der Erfindung, wie hier beschrieben und offenbart, nicht nur in der jeweiligen angegebenen Kombination, sondern auch auf eine einzelne Weise verwirklicht werden können, ohne sich vom vorgesehenen Bereich der vorliegenden Erfindung zu entfernen.
Zitierte Literatur

1. Pflanz, S., Timans, J. C., Cheng, J., Rosales, R., Kanzler, H., Gilbert, J., Hibbert, L., Churakova, T., Travis, M., Vaisberg, E., Blumenschein, W. M., Mattson, J. D., Wagner, J. L., To, W., Zurawski, S., McClanahan, T. K., Gorman, D. M., Bazan, J. F., de Waal Malefyt, R., Rennick, D., and Kastelein, R. A. (2002). IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 und p28 protein, induces proliferation of naive CD4+ T cells. Immunity 16, 779–790.
2. Devergne, O., Hummel, M., Koeppen, H., Le Beau, M. M., Nathanson, E. C., Kieff, E., and Birkenbach, M. (1996). A novel interleukin-12 p40-related protein induced by latent Epstein-Barr virus infection in B lymphocytes. J. Virol. 70, 1143–1153.
3. Devergne, O., Birkenbach, M., and Kieff, E. (1997) Epstein-Barr virus-induziert gene 3 und the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94, 12041–12046.
4. Wright, E. D., Christodoulopoulos, P., Frenkiel, S., and Hamid, Q. (1999) Expression of interleukin (IL)-12 (p40) and IL-12 (beta 2) receptors in allergic rhinitis und chronic sinusitis. Clin. Exp. Allergy 29, 1320–1325.
5. Bryan S. A., O'Connor B. J., Matti S., Leckie M. J., Kanabar V., Khan J., Warrington S. J., Renzetti L., Rames A., Bock J. A., Boyce M. J., Hansel T. T., Holgate S. T. Barnes P. J. (2000). Effects of recombinant human interleukin-12 on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic process. Lancet 356, 2149–2153.
6. Rogge, L., Barberis-Maino, L., Biffi, M., Passini, N., Presky, D. H., Gubler, U., and Sinigaglia, F. (1997) Selective expression of an interleukin-12 receptor component by human T helper 1 cells. J. Exp. Med. 185, 825–831.
7. Shevach, E. M., Chang, J. T., and Segal, B. M. (1999) The critical role of IL-12 and the IL-12R beta 2 subunit in the generation of pathogenic autoreactive Th1 cells. Springer Semin. Immunopathol. 21, 249–262. Review.
8. Prescott, S. L., Taylor, A., King, B., Dunstan, J., Upham, J. W., Thornton, C. A., and Holt, P. G. (2003) Neonatal interleukin-12 capacity is associated with variations in allergen-specific immune responses in the neonatal und postnatal periods. Clin. Exp. Allergy 3, 566–572.
9. Busse, W. W., and Lemanske, R. F. Jr. (2001). Asthma. N Engl J Med. 24, 1643–1644.
10. Devergne, O., Coulomb-L'Hermine, A., Capel, F., Moussa, M., and Capron, F. (2001). Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3, an interleukin-12 p40-related molecule, throughout human pregnancy: involvement of syncytiotrophoblasts and extravillous trophoblasts. Am. J. Pathol. 159, 1763–1776.
11. Hashimoto, S. I., Suzuki, T., Nagai, S., Yamashita, T., Toyoda, N., and Matsushima, K. (2000) Identification of genes specifically expressed in human activated and mature dendritic cells through serial analysis of gene expression. Blood 96, 2206–2214.
12. Hunter C. A. New IL-12-family members: IL-23 and IL-27, cytokines with divergent functions. Nature Reviews-Immunology 5, 521–531.
13. Pflanz, S., Hibbert, L., Mattson, J., Rosales, R., Vaisberg, E., Bazan, J. F., Phillips, J. H., McClanahan, T. K., de Waal Malefyt, R., and Kastelein, R. A. (2004) WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27. J. Immunol. 172, 2225–2231
14. Villarino, A., Hibbert, L., Lieberman, L., Wilson, E., Mak, T., Yoshida, H., Kastelein, R. A., Saris, C., and Hunter, C. A. (2003) The IL-27R (WSX-1) is required to suppress T cell hyperactivity during infection. Immunity 19, 645–655.
15. Yoshida, H., Hamano, S., Senaldi, G., Covey, T., Faggioni, R., Mu, S., Xia, M., Wakeham, A. C., Nishina, H., Potter, J., Saris, C. J., and Mak, T. W. (2001) WSX-1 is required for the initiation of Th1 responses and resistance to L. major infection. Immunity 15, 569–578.
16. Brombacher, F., Kastelein, R. A., and Alber, G. (2003) Novel IL-12 family members shed light on the orchestration of Th1 responses. Trends Immunol. 24, 207–212. Review.
17. Takeda, A., Hamano, S., Yamanaka, A., Hanada, T., Ishibashi, T., Mak, T. W., Yoshimura, A., and Yoshida, H. (2003) Cutting edge: role of IL-27/WSX-1 signalling for induction of T-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment. J. Immunol. 170, 4886–4890.
18. Nieuwenhuis, E. E., Neurath, M. F., Corazza, N., Iijima, H., Trgovcic, J., Wirtz, S., Glickman, J., Bailey, D., Yoshida, M., Galle, P. R., Kronenberg, M., Birkenbach, M., Blumberg, R. S. (2002) Disruption of T helper2-immune responses in Epstein-Barr virus induced gene 3-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16951–16956.
19. Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Sallusto, F., and Lanzavecchia, A. (2005) Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 6, 769–776.
20. Finotto, S., Hausding, M., Doganci, A., Maxeiner, J. H., Lehr, H. A., Luft, C., Galle, P. R., Glimcher, L. H. (2005) Asthmatic changes in mice lacking T-bet are mediated by IL-13. Int. Immunol. 17, 993–1007.
21. Doganci, A., Eigenbrod, T., Krug, N., De Sanctis, G. T., Hausding, M., Erpenbeck, V. J., Haddad, E-B., Lehr, H. A., Schmitt, E., Bopp, T., Kallen, K. J., Herz, U., Schmitt, S., Luft, C., Hecht, O., Hohlfeld, J. M., Ito, H., Nishimoto, N., Yoshizaki, K., Kishimoto, T., Rose-John, S., Renz, H., Neurath, M. F., Galle, P. R., and Finotto, S. (2005) The IL-6R alpha chain controls lung CD4+CD25+ Treg development and function during allergic airway inflammation in vivo. J. Clin. Invest. 115, 313–325.
22. Wirtz, S., Becker, C., Fantini, M. C., Nieuwenhuis, E. E., Tubbe, I., Galle, P. R., Schild, H. J., Birkenbach, M., Blumberg, R. S., and Neurath, M. F. (2005) EBV-induced gene 3 transcription is induced by TLR signaling in primary dendritic cells via NF-kappa B activation. J. Immunol. 174, 2814–2824.
23. Shrayer DP, Cole B, Hearing VJ, Wolf SF, Wanebo HJ. (1999) Immunotherapy of Mice with an irradiated melanoma vaccine coupled with interleukin-12. Clin Exp Metastasis. 17(1): 63–70.
24. Shrayer DP, Bogaars H, Cole B, Wolf SF, Wanebo HJ. (2002) Capacity of murine IL-12 to inhibit the development of primary melanoma tumors and to prevent lung metastases in the melanoma-challenged mice. J Exp Ther Oncol 2(2): 93–9.
25. Chiyo M, Shimozato O, Yu L, Kawamura K, Iizasa T, Fujisawa T, Tagawa M. (2005) Expression of IL-27 in murine carcinoma cells produces antitumor effects and induces protective immunity in inoculated host animals. Int J Cancer. 115(3): 437–42.)
26. Hausding M, Wirtz S, Karwot R, Maxeiner J, Lehr HA, Wegmann M, Doganci A, Sternemann K, Renz H, Galle PR, Birkenbach M, Neurath MF, Blumberg RS, Finotto S Antigen presentation by Bone Marrow Dendritic Cells (BMDC's) protects EBI3 (–/–) mice from allergic asthma via activation of T-bet, zur Publikation eingereicht.
27. Finotto S, De Sanctis GT, Lehr HA, Herz U, Buerke M, Schipp M, Bartsch B, Atreya R, Schmitt E, Galle PR, Renz H, Neurath MF. Treatment of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness by antisense-induced local blockade of GATA-3 expression Exp Med. 2001 Jun 4; 193(11): 1247–60.
28. Finotto S, Buerke M, Lingnau K, Schmitt E, Galle PR, Neurath MF. Local administration of antisense phosphorothioate oligonucleotides to the c-kit ligand, stem cell factor, suppresses airway inflammation and IL-4 production in a murine model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 2001 Feb; 107(2): 279–86.
29. Nesterova M, Cho-Chung YS. Killing the messenger: antisense DNA und siRNA. Curr Drug Targets. 2004 Nov; 5(8): 683–9.
30. Pierce TL, White AR, Tregear GW, Sexton PM. Peptide-oligonucleotide hybrids in antisense therapy. Mini Rev Med Chem. 2005 Jan; 5(1): 41–55.
31. Sandrasagra A, Leonard SA, Tang L, Teng K, Li Y, Ball HA, Mannion JC, Nyce JW. Discovery und Entwicklung of respirable antisense therapeutics for asthma. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002 Jun; 12(3): 177–81.
32. Sandrasagra A, Tang L, Leonard SA, Teng K, Li Y, Mannion JC, Nyce JW. RASONs: a novel antisense oligonucleotide therapeutic approach for asthma. Expert Opin Biol Ther. 2001 Nov; 1(6): 979–83.
33. Ball HA, Van Scott MR, Robinson CB. Clin Rev Allergy Immunol. 2004 Dec; 27(3): 207–17Sense und antisense: therapeutic potential of oligonucleotides und interference RNA in asthma und allergic disorders.
34. Beigelman L, Matulic-Adamic J, Haeberli P, Usman N, Dong B, Silverman RH, Khamnei S, Torrence PF. Nucleic Acids Res. 1995 Oct 11; 23(19): 3989–94: Synthesis and biological activities of a phosphorodithioate analog of 2',5'-oligoadenylate.
35. Reese CB, Song Q. Nucleic Acids Symp Ser. 1997; (37): 1–2: A new approach to oligonucleotide synthesis in solution.
36. Uhlmann E. and Peymann, A. (1990) Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle. Chem. Rev., 90, 544–584.
37. Lindemann D, Patriquin E, Feng S, Mulligan RC. Versatile retrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and in vivo. Mol Med. 1997 Jul; 3(7): 466–76.
38. Springer ML, Chef AS, Kraft PE, Bednarski M, Blau HM. VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults. Mol Cell. 1998 Nov; 2(5): 549–58.

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren des Epstein-Barr-Virus-induzierten Gens 3 (EBI3), umfassend die Schritte von: a) Zur Verfügung stellen eines Testsystems, umfassend EBI3 oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon, b) In Kontakt bringen des Testsystems mit einer oder mehreren Verbindungen, von denen vermutet wird, dass sie EBI3 inhibieren, und c) Nachweisen einer Inhibierung von EBI3 durch die eine oder mehreren Verbindungen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Testsystem ausgewählt ist aus gereinigtem EBI3, einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon; einer EBI3, ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon exprimierenden Zelle; einem in vitro Testsystem; und/oder Mäusen, umfassend ein experimentelles Tumormodell.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Inhibierung der Expression und/oder die Inhibierung der biologischen Aktivität von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon ausgewählt ist aus chemischen Verbindungen niederen Molekulargewichts, Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, antisense-Oligonukleotiden und Antikörpern.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon ausgewählt ist aus modifiziertem p28, modifiziertem p35, rekombinanten Antikörperfragmenten und respirablen antisense-Oligonukleotiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend eine computergestützte strukturelle Vorauswahl der einen oder mehreren Verbindungen, von der vermutet wird, dass sie ein Inhibitor von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin umfassend die Schritte von d) Identifizierung des Inhibitors von EBI3 oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat davon, und, gegebenenfalls, e) Chemische Derivatisierung des in Schritt d) ausgewählten Inhibitors.
Verwendung von EBI3-defizienten dendritischen Zellen oder dendritischen EBI3-knockout Zellen zur Behandlung von metastasierenden Krebserkrankungen oder allergischem Asthma.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die metastasierende Krebserkrankung ein primäres Melanom ist.