CN102895657A - 一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，包括：步骤一、在第1天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；步骤二、从第13天到第15天连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。上述方法成功构建了气道以中性粒细胞增高的非人哺乳动物的哮喘模型，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，缩短了建模时间。
Description
技术领域
本发明涉及哮喘动物模型构建领域，特别涉及一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法。
背景技术
支气管哮喘是一种气道慢性非特异性炎症，全球患病人数多，控制哮喘发作需花费大量人力物力。为尽最大可能解除患者痛苦，构建疾病动物模型，研究哮喘的发病机制十分必要。以往认为过敏原诱导Th1/Th2应答失衡致气道嗜酸性粒细胞浸润是哮喘的重要病理特点，此类患者对激素治疗效果敏感。现有技术构建的模型也多以致嗜酸性粒细胞升高为主。此类模型常用构建方法为：分别在第1大和第14天腹腔注射鸡卵蛋白致敏，在第28、29、30连续3天，每天30分钟-1小时1％卵蛋白液雾化激发，第32天处死，收集相关标本。
然而，人们发现一类患者使用激素治疗效果不佳，症状得不到有效控制。研究发现，此类患者气道炎症以中性粒细胞为主，嗜酸性粒细胞轻度增高甚至不增高；外周血除了Th2细胞的增高，还有Th17细胞的增高，且增加的幅度更大；相应细胞因子IL-4/IL-17的ELISA结果也有类似发现。据此提出：静息型T细胞在接收树突状细胞处理、提呈的相关抗原刺激后向Th17细胞方向偏振，诱导哮喘患者气道内中性粒细胞募集。现有技术虽能成功构建相关哮喘模型，但共有三次致敏，分别在第0、7、14天，在第21天激发，连续两周，建模时间较长，且鼻内滴入脂多糖量过大，不能排除气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，不符合哮喘是以过敏原诱导体内免疫应答失衡的发病机制。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，从哮喘的疾病特点对模型进行全面的评价，缩短激发和致敏时间。
为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，包括：
步骤一、在第1天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；
步骤二、从第13天到第15大连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，所述的非人哺乳动物是小鼠。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，从小鼠咽喉壁滴加含100μg鸡卵蛋白和0.1μg含脂多糖的PBS溶液，共50μL，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10μL；向腹腔注射含100μg鸡卵蛋白和100μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200μL。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为1％。
优选的是，所述构建非人哺乳动物哮喘模型的方法中，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4％水合氯醛，剂量为0.08～0.1ml/10g。
本发明实施例所提供的技术方案，加入了以前从未使用过的气道致敏方法，即从小鼠咽喉壁将含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液缓慢滴入气道，且有效地控制了用量，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，符合哮喘是以过敏原诱导体内免疫应答失衡的发病机制。本发明在最后一次抗原激发24小时后，处死小鼠，并从血清IgE水平、气道高反应性、浸润到气道中炎症细胞的类型及数量和肺组织效应T细胞偏振情况等方面将此模型与嗜酸性粒细胞哮喘模型组和正常对照组模型进行了对比评价，因Th17细胞应答增强致使气道中性粒细胞增高的非人哺乳动物哮喘模型构建成功。
附图说明
图1为本发明所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法的流程示意图；
图2为各组小鼠肺组织气道炎症情况(HE，×200)，A图为正常对照组，B图为嗜酸性粒细胞哮喘模型组，C图为中性粒细胞哮喘模型组；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要的附图作简单的介绍。
本发明提供了一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，排除了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，缩短了激发和致敏时间。
本发明实施例提供的一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，包括：
步骤一、在第1天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；
步骤二、从第13天到第15大连续三大雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。
本方法的具体实施步骤为：将实验所需BALB/c小鼠称重，并用麻醉剂麻醉小鼠；将小鼠四肢用活结固定于简易操作台上，并套牙固定小鼠颈部；将操作台竖立，用消毒后的无菌平镊夹出小鼠舌头，使其歪向一侧，充分暴露口腔；在第1天和第7天从小鼠咽喉壁缓慢滴加含100μg鸡卵蛋白和0.1μ脂多糖的PBS溶液，共50μL，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部；将小鼠腹外侧部消毒后，在第1天和第7天向腹腔注射含100μg鸡卵蛋白和100μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200μL；将小鼠放回鼠笼中，侧卧，同时刨除小鼠口鼻周围垫料，防止堵塞呼吸道窒息；将小鼠放入密闭容器中，从第13天到第15天连续三天用雾化仪雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液。
所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。
所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，所述的非人哺乳动物是小鼠。
所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，从小鼠咽喉壁滴加含100μg鸡卵蛋白和0.1μg脂多糖的PBS溶液，共50μL，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10μL；向腹腔注射含100μg鸡卵蛋白和100μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200μL。
所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为1％。
所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4％水合氯醛，剂量为0.08～0.1ml/10g。
在最后一次抗原攻击24小时后，处死小鼠，检测其血清IgE水平、气道高反应性、浸润到气道中炎症细胞的类型及数量和肺组织效应T细胞偏振情况等方面情况。
表1为各组模型的血清ELISA结果、灌洗液相关细胞因子浓度比较，其中，Th1细胞分泌的特异细胞因子为IFN-γ，Th2细胞分泌的特异细胞因子为IL-5，Th17细胞分泌的特异细胞因子为IL-17。反应中性粒细胞炎症程度的炎症因子为：TNF-α和IL-8。本方法构建的非人哺乳动物哮喘模型的炎症细胞中性粒细胞显著增高，且具有较高的鸡卵蛋白相关性血清IgE水平。
表1血清ELISA结果、灌洗液相关细胞因子浓度比较
表2为各组肺功能Penh值增长倍数比较，分5个乙酰胆碱浓度测定Penh值，并与正常对照组比较计算增长倍数：[R(测)-R(基)]/R(基)。与嗜酸性粒细胞哮喘模型组比较，中性粒细胞哮喘模型组在浓度12mg/mL已有显著的气道高反应性，在浓度25mg/mL时气道高反应性更显著，差异有统计学意义。
表2各组肺功能Penh值增长倍数比较(n＝12，
)
表3为各组灌洗液细胞分类计数比较，每组随机选取6只鼠，以4％水合氯醛麻醉，挖眼球放血法处死小鼠。打开胸腔，用腰麻导管做气管置管，行支气管肺泡灌洗，共3次，每次入量为1mL，将灌洗液离心后的细胞沉淀涂片，瑞氏-吉姆萨染液染色细胞，油镜下至少计数200个细胞做分类计数：嗜酸性粒细胞(EOS)，中性粒细胞(NEU)，淋巴细胞(LYM)，单核-巨噬细胞(MON)。与正常对照组比较，两组哮喘模型灌洗液嗜酸性粒细胞和中性粒细胞均升高，差异有统计学意义。与嗜酸性粒细胞哮喘模型相比，中性粒细胞哮喘模型组中性粒细胞比例升高，嗜酸性粒细胞降低，差异有统计学意义。
表3各组灌洗液细胞分类计数比较(n＝6，
)
如图2所示，与正常对照组A比较，嗜酸性粒细胞哮喘模型组B和中性粒细胞哮喘模型组C均见气道、小血管周围及肺泡间质嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎症细胞明显浸润。
表4为Q-PCR检测肺组织3种效应T细胞核转录因子表达倍数比较，每组随机选取6只鼠，取右下肺做匀浆，提取总RNA，行定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测Th1、Th2、Th17细胞核转录因子T-bet、GATA-3、RORC，反应Th1、Th2、Th17细胞分化偏振情况。以正常对照组CT值为比较基准，计算Th1、Th2、Th17各自的细胞核转录因子T-bet、GATA-3、RORγt基因表达倍数。与正常对照组比较，嗜酸性粒模型组小鼠摄取抗原后，肺部
T细胞主要向Th2细胞分化，并诱导嗜酸性粒细胞活化。中性粒模型组小鼠气道滴加鸡卵蛋白和脂多糖可以影响T细胞分化：
T细胞向Th2细胞分化减少，向Th17细胞方向偏振增加，并活化中性粒细胞为主要效应细胞。
表4Q-PCR检测肺组织3种效应T细胞核转录因子表达倍数(n＝6，
)
综上可见，在传统哮喘模型构建基础上向小鼠气道滴加含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液能改变气道炎症类型，中性粒细胞增多显著，成功构建了Th17应答增强致气道炎症以中性粒细胞浸润为主的小鼠哮喘模型。本发明基于T细胞的活化和偏振方向主要由树突状细胞决定，且树突状细胞在体内的循环周期为7天，因此修改致敏时间间隔为6天，致敏两次，连续激发三天，缩短了建模周期。从小鼠咽喉壁滴入含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液，依靠小鼠的呼吸将其吸入肺部，并控制含脂多糖的PBS溶液的滴入量，排出了气道损伤引起中性粒细胞增多的可能，符合哮喘是以过敏原诱导体内免疫应答失衡的发病机制。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (6)
1.一种构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，包括：
步骤一、在第1天和第7天向非人哺乳动物腹腔注射有效量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液，同时从非人哺乳动物咽喉壁缓慢滴加有效量的含鸡卵蛋白和脂多糖的PBS溶液；
步骤二、从第13天到第15天连续三天雾化含鸡卵蛋白的PBS溶液，对非人哺乳动物进行抗原的呼吸道致敏。
2.如权利要求1所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，同时构建的模型还包括只在腹腔注射等量的含鸡卵蛋白和氢氧化铝凝胶的PBS溶液的嗜酸性粒细胞哮喘模型组以及在腹腔注射等量的含氢氧化铝凝胶的PBS溶液的正常对照组，前者为含鸡卵蛋白的PBS溶液激发，后者为PBS溶液激发。
3.如权利要求1所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。
4.如权利要求1所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，从小鼠咽喉壁滴加含100μg鸡卵蛋白和0.1μg脂多糖的PBS溶液，共50μL，使小鼠慢慢将PBS溶液吸入肺部，滴加时用移液枪分次吸取滴加，每次10μL；向腹腔注射含100μg鸡卵蛋白和100μL氢氧化铝凝胶的PBS溶液，共200μL。
5.如权利要求1所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，所述步骤2)中的雾化用的含鸡卵蛋白的PBS溶液浓度为1％。
6.如权利要求1所述的构建非人哺乳动物哮喘模型的方法，其特征在于，麻醉小鼠的麻醉剂为浓度4％水合氯醛，剂量为0.08～0.1ml/10g。
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