CN102755633A - 人重组蛋白pdcd5在治疗自身免疫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人重组蛋白PDCD5在治疗自身免疫病中的应用。人重组蛋白PDCD5能够诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化、抑制Th17细胞的分化、抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生，具有免疫抑制作用。因此人重组蛋白PDCD5在诱导自身免疫抑制，应用于治疗自身免疫性疾病如多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病、迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’s病、重症肌无力等具有广阔的前景。

Description

人重组蛋白PDCD5在治疗自身免疫病中的应用

技术领域

本发明涉及生物制品以及免疫学领域，尤其涉及人重组蛋白PDCD5在诱导CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞分化、抑制Th17细胞的分化，抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生，预防和/或治疗自身免疫病中的应用。

背景技术

PDCD5(程序性细胞死亡分子5，programmed cell death 5)，以前被称为TFAR19(TF-1细胞凋亡相关基因19，TF-1cell apoptosis-related gene 19)，是一种新的程序性细胞死亡调控基因(中国专利98101869.6；BiochemBiophy Res Comm，1999，254：203-210)。该基因进化保守，表达广泛，其编码的PDCD5蛋白由125个氨基酸组成。前期的功能研究证明PDCD5在多种肿瘤组织中表达下调，人重组蛋白PDCD5可以利用窖蛋白(caveolae)/脂筏介导的胞吞作用进入细胞(J.Biol.Chem.2006，281：24803-24817)，加入外源性人重组PDCD5蛋白，细胞内吞后还可到达细胞核。进入细胞的重组人PDCD5能够增强多种肿瘤细胞对多种化疗药的敏感性，促进化疗药引起的肿瘤细胞的死亡(Chinese Science Bulletin，2009，54(21)：3981-3989；BiochemBiophys Res Commun，2010，96(2)：224-230；中国实验血液学杂志，2010；18(2)：277-281；Apoptosis，2010，15：805-813)，是一种潜在的新的抑癌基因，其效应机制是通过结合组蛋白乙酰转移酶Tip60(Tat Interactive Protein 60kD，Tip60)发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用(Neoplasia，2009，10(4)：345-354)。

Tip60是进化上保守的组蛋白乙酰化转移酶，其在转录调控、DNA损伤修复、细胞周期阻滞和凋亡等过程中发挥重要作用。最近的研究发现Tip60能够与FOXP3相互作用，促进FOXP3的乙酰化，从而介导FOXP3的转录抑制活性(Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(11)：4571-4576)。Foxp3分子是赋予调节T细胞细胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具特异性的标志分子。

FOXP3⁺调节性T细胞(FOXP3⁺Tregs)属于T淋巴细胞中表达CD4、CD25及转录因子FOXP3的一类T细胞亚型，其正常功能对于人体免疫稳态的动态调节必不可少。调节性T细胞的发育及功能失调，与多种重大免疫相关性疾病，包括自身免疫性疾病、炎症反应、急性及慢性传染性疾病、肿瘤免疫耐受、移植排斥以及过敏性疾病的生理病变进程密切相关(Cell，2008，133(5)：775-87，Cell，2010，140(6)：845-58)。FOXP3⁺Tregs主要可分为两类：自然性FOXP3⁺Treg(natural Treg，nTre g)和诱导性FOXP3⁺Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg免疫调节功能的发挥与Foxp3分子的持续表达密切相关。这些胸腺产生的nTreg细胞释放到外周后能够保持Foxp3分子的稳定表达，在特异性抗原的刺激下，此群细胞被激活，从而发挥免疫抑制作用。iTreg稳定发挥免疫抑制作用也需要维持Foxp3分子的稳定表达。Treg细胞抑制免疫反应的调节作用的机制包括分泌细胞因子(如IL-10，TGF-β，IL-35等)和细胞接触抑制。

多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一种以血脑屏障遭破坏，伴有炎症、髓鞘损害为特征的中枢神经系统慢性自身免疫性疾病。好发于青壮年，发病年龄多在20～40岁，女性多见，具有高致残率、高复发性的特点，部分患者病情呈进行性加重，甚至死亡，对社会和家庭造成严重的影响。数据显示，在西方一些国家，该病患病率高达十万分之一百到三百；而在我国，据不完全统计，该病患病率也已达约十万分之五，并呈逐年上升趋势。MS的病理学改变由于自身反应性效应CD4⁺T细胞透过血-脑屏障，在中枢神经系统中浸润，诱发组织损伤。自身反应性效应T细胞(Th1和Th17)既存在于MS患者血液中，也存在于健康人群的血液中。调节T细胞(Regulatory T cell，Treg)在控制自身抗原反应性T细胞以及介导外周耐受过程中起着非常关键的作用。Treg与MS的免疫病理学改变相关，成为治疗MS潜在的靶标。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是发生在动物中枢神经系统内，由CD4⁺T淋巴细胞所介导的自身免疫性疾病，是目前被公认为人类多发性硬化症(MS)的理想动物模型，EAE与MS在临床、生化、免疫及病理等方面具有相同的特征，在研究MS的发病机制、治疗和预防复发中具有重要意义。

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性反复发作的系统性的自身免疫性疾病。该病在世界范围内普遍存在，其病理机制目前还不清楚，许多研究已经表明淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、滑膜细胞等多种炎症细胞介导的异常细胞免疫、体液免疫，导致关节局部和全身的免疫功能紊乱，在RA的病理中起着重要作用。为了进一步探讨RA的病因、病理、免疫学、临床等方面的机制，以便寻找更有效的治疗RA的方案，国内外学者进行了大量的动物实验，并建立了一些比较成熟的整体动物病理模型，目前应用较广泛的且较成熟的整体动物实验模型主要有II型胶原诱导的关节炎(Type II collagen induced arthritis，ClA)模型。这些动物模型在临床表现、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人RA有许多相似特征，目前国际上广泛用于RA发病机制的研究以及创新药物的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人重组PDCD5蛋白在促进CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞分化，免疫抑制中的应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有增强CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞抑制效应的作用，可在制备增强CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞抑制效应的药物中应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有促进抑制性细胞因子IL-10和TGF-β产生的作用，可在制备促进抑制性细胞因子IL-10和TGF-β产生的的药物中应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有抑制炎症性Th17细胞分化的作用，可在制备抑制炎症性Th17细胞分化的药物中应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-γ和TMF-α产生的作用，可在制备抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-γ和TMF-α产生的药物中应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有预防和治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物中的应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白具有预防和治疗类风湿关节炎的药物中的应用。

上述所说的人重组PDCD5蛋白在制备预防和治疗自身免疫病的药物中的应用。

人重组PDCD5蛋白可用于治疗Foxp³⁺调节性T细胞失调介导的自身免疫疾病EAE，人重组PDCD5蛋白在预防和治疗上都是有效的。因此人重组PDCD5蛋白可用于治疗的Foxp3⁺调节性T细胞介导的自身免疫病的实例包括多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病、迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’s病、重症肌无力等。

发明人经过研究表明，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG_35-55)成功诱导了小鼠EAE模型，腹腔注射人重组蛋白PDCD5能够延缓EAE模型小鼠的发病，减轻病情；组织病理学分析发现，人重组蛋白PDCD5处理能够减少炎性细胞在中枢神经系统的浸润，减少脊髓的脱髓鞘病变；进一步研究显示人重组蛋白PDCD5在小鼠体内能够上调抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的产生，增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的数量，减少Th17的数量，降低炎症细胞因子IL-17、IFN-γ和TNF-α的产生。体外实验的结果证明，人重组蛋白PDCD5处理的小鼠淋巴细胞和脾细胞对自身抗原MOG_35-55的增殖能力显著低于对照小鼠；人重组蛋白PDCD5体外处理naive小鼠的淋巴结细胞，能够促进CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的分化。研究还发现，在II型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型中，腹腔注射人重组蛋白PDCD5能够减轻CIA模型大鼠的病情；进一步研究显示人重组蛋白PDCD5在大鼠体内能够增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的数量，抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生。体外实验的结果证明，人重组蛋白PDCD5处理的大鼠淋巴细胞和脾细胞对II型胶原的增殖能力显著低于对照小鼠。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠临床评分。

图2显示人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠的发病率。

图3显示人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脊髓的H&E染色。

图4显示人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脊髓的luxol fast blue染色。

图5显示ELISA方法检测人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠血清的细胞因子水平。

图6显示流式细胞术分析人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结和脾细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的数目。

图7显示流式细胞术分析人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结细胞中CD4⁺IL-17A⁺细胞的数目。

图8显示[³H]掺入法检测人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脾细胞和淋巴结细胞对MOG_35-55的反应性。

图9显示ELISA方法检测人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结细胞与MOG_35-55反应的培养上清中细胞因子的水平。

图10显示ELISA方法检测人重组蛋白PDCD5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脾细胞与MOG_35-55反应的培养上清中细胞因子的水平。

图11显示流式细胞术分析人重组蛋白PDCD5对小鼠淋巴结细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的诱导分化作用。

图12显示人重组蛋白PDCD5、卵白蛋白(OVA)处理的CIA大鼠以及生理盐水对照大鼠的发病情况。A：人重组蛋白PDCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的足跖肿胀程度；B：人重组蛋白PDCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的临床评分；C：人重组蛋白PDCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的足部图片。

图13显示[³H]掺入法检测人重组蛋白PDCD5和OVA处理的CIA大鼠脾细胞和淋巴结细胞对胶原的反应性。

图14显示ELISA方法检测人重组蛋白PDCD5、OVA处理的CIA大鼠以及生理盐水对照大鼠的炎性细胞因子的水平。A：人重组蛋白PDCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠血清和关节液中TNF-α的水平；B：人重组蛋白PDCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠血清和关节液中IL-17A的水平。

图15显示流式细胞术分析人重组蛋白PDCD5和OVA处理的CIA大鼠大鼠的淋巴结、外周血以及脾细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的数目。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1、人重组蛋白PDCD5(rhPDCD5)作为蛋白重组药物，可延缓EAE 模型小鼠的发病，减轻病情，减少发病率

方法：EAE模型的建立与临床评分

6-8周的雌性C57BL/6小鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，SPF级饲养，所用垫木、饮水、饲料及其与动物接触的物品均经高压灭菌处理。所有的动物实验操作和流程都符合北京大学实验动物管理制度。实验时，每只小鼠给予用完全弗氏佐剂乳化的MOG_35-55抗原200μl(1.5mg/ml)背部皮下三点免疫，同时尾静脉注射200μl(1μg/ml)百日咳毒素(PT)，第2天，再次尾静脉注射200μl PT。同时将小鼠随机分成2组，每组8-10只小鼠。

rhPDCD5处理组：第0、2、4、6、8、10天腹腔注射200μg的rhPDCD5；

阴性对照PBS组：第0、2、4、6、8、10天腹腔注射200μL的PBS。

第6天开始观察EAE临床体征的严重性，给出临床评分，观察发病率。

临床评分标准：0分：无症状；1分：尾部无力；2分：前肢或后肢中度瘫痪和运动失调；4分：前肢或后肢严重瘫痪或运动失调，人为翻转不能恢复；5分：濒死状态或者死亡。

结果如图1所示，阴性对照PBS组小鼠在第9天开始发病，症状呈进行性加重；而在rhPDCD5处理组，小鼠在第12天发病，发病时间明显延迟，症状减轻；同时如图2所示，rhPDCD5处理小鼠的发病率明显低于PBS阴性对照组，因此，给小鼠施用rhPDCD5能够延缓小鼠诱发的EAE。

实施例2、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少炎症细胞在中枢神经系 统的浸润，减少脊髓白质脱髓鞘病变

方法：

1：EAE模型的建立与临床评分同见实施例1。

2：组织化学染色

实验小鼠麻醉后打开胸腔，PBS心脏灌注，用4％多聚甲醛灌注内固定，再取出脊髓，放入装有4％多聚甲醛的玻璃瓶中固定，再将标本做脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、捞片、烘片。然后进行H&E染色和勒克索尔固蓝(Luxol Fast Blue)染色，封片进行观察。

H&E染色结果如图3所示，rhPDCD5处理的小鼠脊髓白质区炎性细胞浸润要比阴性对照PBS组轻；说明施用rhPDCD5减少炎症细胞在EAE小鼠中枢神经系统的浸润。

Luxol Fast Blue染色如图4所示，在rhPDCD5处理组脊髓的白质区致密，脱髓鞘现象很轻，而在PBS阴性对照组脊髓的白质区脱髓鞘现象明显。说明施用rhPDCD5减少EAE小鼠的脊髓脱髓鞘反应。

实施例3、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少EAE小鼠Th17细胞的 数目，减少血清中炎症细胞的水平；同时促进调节性T细胞 (CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3)的分化，增加抑制性细胞因子的水平

方法：

1：EAE模型的建立与临床评分同实施例1。

2：ELISA方法检测血清中的细胞因子：rhPDCD5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，收集血清，按照Biolegend公司的说明书操作。

3：流式细胞术分析T细胞亚群：rhPDCD5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液，加入合适浓度抗鼠CD16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fc受体，4℃10min。1200rpm，离心洗一遍。细胞重悬100μl PBS，分别加入合适浓度的抗CD4和抗CD25表面荧光抗体，4℃，避光孵育20min。PBS洗两遍，加1ml Fix/Perm buffer重悬细胞，混匀，避光20min，离心，弃上清。用1ml perm buffer洗一遍。重悬1ml perm buffer，避光15min。离心，加100μl perm buffer，加入合适浓度抗IL-17A抗体或抗FOXP3抗体，避光30min。PBS洗两遍。重悬于400μlPBS中，流式细胞计进行分析。

ELISA分析的结果如图5所示，rhPDCD5处理的EAE小鼠血清中炎性细胞因子如IL-17A和IFN-γ含量明显低于PBS阴性处理组；同时，rhPDCD5处理的EAE小鼠血清中抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β含量明显高于PBS阴性处理组。说明施用rhPDCD5减少EAE小鼠炎症细胞因子水平。

流式细胞计的分析结果如图6所示，rhPDCD5处理的EAE小鼠淋巴结中CD4⁺CD25⁺Poxp3⁺的细胞为26.9％，PBS阴性处理组则为7.4％，在小鼠脾细胞中，rhPDCD5处理组CD4⁺CD25⁺Poxp3⁺的细胞为14.9％，PBS阴性处理组则为9.1％。因此，rhPDCD5处理小鼠外周免疫器官CD4⁺CD25⁺Poxp3⁺细胞数目显著高于PBS阴性处理组；说明施用rhPDCD5能够增加外周免疫器官CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的数目。另外如图7所示，rhPDCD5处理的EAE小鼠淋巴结中CD4+IL-17A+的细胞为8.5％，PBS阴性处理组则为14.62％，rhPDCD5处理小鼠Th17细胞数目显著低于PBS阴性处理组。说明施用rhPDCD5能够减少外周免疫器官CD4⁺IL-17A⁺细胞的数目。

实施例4、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够抑制MOG _35-55 特异性脾细胞 和淋巴细胞增殖

方法：

1：EAE模型的建立与临床评分同实施例1。

2：[³H-TdR]掺入法检测细胞的增殖

RhPDCD5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液。将小鼠脾细胞或者淋巴结细胞重悬于10％FBS-RPMI 1640中，加200μl细胞悬液于96孔板中(每孔4×10⁵的细胞)，每个标本三个复孔，细胞培养液中加入20μg/ml的MOG_35-55。在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养40小时，在培养时间到达40小时每孔加入1μCi ³H-甲基胸腺嘧啶([³H]-TdR)。培养时间到达48h时，将细胞摄取的同位素转移到玻璃纤维素膜。膜烘干后加入闪烁液，计数仪上读取cpm值，检测³H的掺入量。

结果如图8所示，rhPDCD5处理的EAE小鼠淋巴结细胞对MOG_35-55的反应性明显低于PBS阴性处理组，显示[³H]-TdR掺入量的明显降低，两者有显著性差异；同时，rhPDCD5处理的EAE小鼠脾细胞对MOG_35-55的反应性明显低于PBS阴性处理组，两者有显著性差异。说明施用rhPDCD5能够抑制MOG_35-55特异的淋巴细胞增殖反应。

实施例5、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够促进MOG _35-55 特异性脾细胞 和淋巴结细胞产生抑制性细胞因子，抑制MOG _35-55 特异性脾细胞和淋巴结 细胞产生炎症性细胞因子

方法

1：EAE模型的建立与临床评分同实施例1。

2：ELISA方法检测细胞培养上清中的细胞因子：RhPDCD5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液。将小鼠脾细胞或淋巴结细胞重悬于10％FBS-RPMI 1640中，加200μl细胞悬液于96孔板中(每孔4×10⁵的细胞)，每个标本三个复孔，细胞培养液中加入20μg/ml的MOG_35-55。在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养48小时，收集细胞上清，Flow Cytomix(按照e Bioscience公司的说明书操作)方法或ELISA(按照Biolegend公司的说明书操作)方法检测培养上清中的细胞因子。

结果如图9所示，MOG_35-55与淋巴结细胞一起培养的上清中，与PBS处理组相比较，RhPDCD5处理组的细胞因子如IL-2、IL-17A以及IFN-γ的水平明显下调，甚至检测不到，而抑制性细胞因子IL-10明显上调。说明施用rhPDCD5能够抑制MOG_35-55特异的淋巴结细胞分泌炎症因子。在MOG_35-55与脾细胞一起培养的上清中，与PBS处理组相比较，RhPDCD5处理组的细胞因子如TNF-α、IL-17A以及IFN-γ的水平明显下调(图10)，说明施用rhPDCD5能够抑制MOG_35-55特异的脾细胞分泌炎症因子。

实施例6、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够促进小鼠CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ 细胞的分化

方法：

1：细胞培养：用160μl的抗-CD3抗体(10μg/ml)包被48孔板，4℃过夜，用PBS洗两遍；麻醉处死的6-8周雌性C57BL/6小鼠，摘取体内淋巴结，制成细胞悬液(含10％FBS-RPMI 1640)，加500μl培养液于预先包被抗-CD3抗体的48孔板，每孔为1×10⁶的细胞，同时加入抗CD28抗体(5μg/ml)、TGF-β(5ng/ml)、IL-2(2ng/ml)以及加入不同浓度的rhPDCD5蛋白，在含有5％CO₂的37℃培养箱中培养72小时，收集细胞。

2：流式细胞分析：收集不同处理的培养细胞，加入合适浓度的抗鼠CD16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fc受体，4℃10min。1200rpm，离心洗一遍。细胞重悬100μl PBS，分别加入合适浓度的抗CD4和抗CD25表面荧光抗体，4℃，避光孵育20min。PBS洗两遍，加1ml Fix/Perm buffer重悬细胞，混匀，避光20min，弃上清。用1ml perm buffer洗一遍。重悬1ml permbuffer，避光15min，弃上清。加入合适浓度抗FOXP3抗体，避光30min。PBS洗两遍。重悬于400μl PBS中，流式细胞计进行分析。

结果如图11所示，rhPDCD5后以浓度依赖的方式增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞数目。说明施用rhPDCD5能够体外增加

淋巴结细胞分化为CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的数目。

实施例7、rhPDCD5作为蛋白重组药物，可延缓CIA模型大鼠的发病，减轻 病情。

方法：CIA大鼠模型的建立与临床评分

6-8周的雌性SD大鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，SPF级饲养，所用垫木、饮水、饲料及其与动物接触的物品均经高压灭菌处理。所有的动物实验操作和流程都符合北京大学实验动物管理制度。实验时，将胶原醋酸溶液与不完全佐剂4℃过夜充分溶解后1∶1均质混合，于大鼠尾根部皮下注射0.2ml/只，7天后避开上次注射部位强化免疫一次。同时将大鼠随机分成3组，每组8只大鼠。

CIA大鼠rhPDCD5处理组：从模型制备当天起，腹腔注射rhPDCD5(14mg/kg)，隔日一次，第30天结束。

CIA大鼠OVA无关蛋白对照组：从模型制备当天起，腹腔注射卵白蛋白(OVA)(14mg/kg)，隔日一次，第30天结束。

阴性对照生理盐水组：从模型制备当天起，腹腔注射生理盐水，隔日一次，第30天结束。

足跖肿胀度测量：采用容积法测定大鼠膝关节容积。测量前于每只大鼠膝关节上0.5cm作一标记线，每次测定以标记线为标准，每只大鼠每次测量3次取其平均值为当前容积。在造模前1天测定双侧后足爪容积，以后每周对大鼠双侧足爪容积进行测量，记录容积值。肿胀程度用当前容积减去造模前容积的差值表示。

临床评分：按照关节炎指数评分办法进行评估病变程度多发性关节炎评分如下：0分，无肿胀；1分，1个趾关节受累；2分，多趾关节受累；3分，踝关节以下受累；4分：全爪受累。造模1天后，隔日评分。

结果如图12A所示，阴性对照生理盐水组大鼠不出现足跖肿胀，OVA无关蛋白对照组大鼠的足跖肿胀明显，而在rhPDCD5处理组，大鼠的足跖肿胀度明显减轻，在第三和第四周，比较OVA无关蛋白对照组和rhPDCD5处理组大鼠的足跖肿胀度，两者有明显的差异，*P＜0.05。同时如图12B所示，与OVA无关蛋白对照组相比，rhPDCD5处理组大鼠的临床症状明显减轻，有统计学意义。*P＜0.05，**P＜0.01。图12C是分别代表生理盐水组、OVA无关蛋白对照组和rhPDCD5处理组大鼠的足部照片。

实施例8、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够抑制胶原(collagen)特异性 脾细胞和淋巴细胞增殖

方法：

1：CIA大鼠模型的建立与临床评分同实施例7。

2：[³H-TdR]掺入法检测细胞的增殖同实施例4。

结果如图13所示，在体外的培养体系中，rhPDCD5处理的CIA大鼠淋巴结细胞对胶原的反应性明显低于OVA处理组，显示[³H]-TdR掺入量的明显降低，两者有显著性差异，*P＜0.05；同时，rhPDCD5处理的CIA大鼠脾细胞对胶原的反应性明显低于OVA处理组。说明施用rhPDCD5能够抑制胶原特异的淋巴细胞增殖反应。

实施例9、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少血清和关节滑液中 炎症细胞的水平；同时增加调节性T细胞(CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ )的数量

方法：

1：CIA大鼠模型的建立与临床评分同实施例7。

2：ELISA方法检测血清和关节液中的细胞因子：rhPDCD5和OVA处理的CIA大鼠，以及生理盐水(空白)对照组大鼠，行麻醉处死，收集血清和关节液，按照Biolegend公司的说明书操作。

3：流式细胞术分析T细胞亚群：rhPDCD5和OVA处理的CIA大鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液，同时制备外周血淋巴细胞，加入合适浓度抗鼠CD16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fc受体，4℃10min。1200rpm，离心洗一遍。细胞重悬100μl PBS，分别加入合适浓度的抗CD4和抗CD25表面荧光抗体，4℃，避光孵育20min。PBS洗两遍，加1ml Fix/Perm buffer重悬细胞，混匀，避光20min，离心，弃上清。用1ml perm buffer洗一遍。重悬1ml perm buffer，避光15min。离心，加100μlperm buffer，加入合适浓度抗FOXP3抗体，避光30min。PBS洗两遍。重悬于400μl PBS中，流式细胞计进行分析。

ELISA分析的结果如图14A所示，rhPDCD5处理的CIA大鼠血清以及关节滑液中TNF-α含量明显低于OVA处理组，**P＜0.01，***P＜0.001；同时如图14B所示，rhPDCD5处理的CIA大鼠血清以及关节滑液中IL-17A含量明显低于OVA处理组，*P＜0.05，**P＜0.01。说明施用rhPDCD5减少CIA大鼠炎症细胞因子水平。

流式细胞计的分析结果如图15所示，rhPDCD5处理的CIA大鼠淋巴结、外周血以及脾脏中CD4⁺CD25⁺Poxp3⁺的细胞均高于OVA处理组，说明施用rhPDCD5能够增加外周免疫器官以及外周血中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞的数目。

Claims (8)

1.人重组PDCD5蛋白在制备增强CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节T细胞免疫抑制效应的药物中的应用。

2.人重组PDCD5蛋白在制备促进抑制性细胞因子IL-10和TGF-β产生的药物中的应用。

3.人重组PDCD5蛋白在制备抑制炎症性Th17细胞分化的药物中的应用。

4.人重组PDCD5蛋白在制备抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-γ和TNF-α产生的药物中的作用。

5.人重组PDCD5蛋白在制备预防和治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物中的应用。

6.人重组PDCD5蛋白在制备预防和治疗类风湿关节炎的药物中的应用。

7.人重组蛋白PDCD5在制备预防和治疗自身免疫病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述自身免疫病为迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’s病或重症肌无力。

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