CN112336750A - 间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞技术领域，具体公开了一种间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。本发明提供的间充质干细胞源性小细胞外囊泡具有极低的免疫原性，副作用小，排斥免疫反应小，在生物体内较为稳定，具有天然的归巢和靶向性，滞留时间长，且将间充质干细胞源性小细胞外囊泡制成药物对类关节炎具有很好的治疗作用，可以有效地对抗关节炎症。

Description

间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病 药物中的应用

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种来源于间充质干细胞的小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病(ADs)是由于自身抗原免疫耐受缺失导致的一类慢性、异质性疾病，可累及特定的靶器官或多个系统，常见的自身免疫性疾病有自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)以对称性多发性小关节受累为主要临床表现的自身系统性、异质性疾病，受累关节的滑膜、软骨、肌腱等出现慢性进展性破坏。国内外不同人群地区RA的患病率为0.18％～1.07％，患病人数超500万，未经正规治疗的RA患者3年致残率可高达75％。由于缺乏治愈手段，病人几乎终身需要接受药物治疗并，价格昂贵，给国家和患者带来严重的社会和经济负担。因此，提高RA的诊疗水平，降低RA致残率是国家亟待解决的重大健康和经济问题，也是改善患者生命和生活质量、保护社会劳动力、促进社会和经济发展的重要事件。

目前临床上针对RA的药物和途径主要包括非甾体类消炎药(NSAID)、皮质激素(如Predesion)、慢性抗风湿类药DMARDs(如甲氨蝶呤、雷公藤)和生物抑制剂，甚至包括关节置换滑膜切除术。上述方法和药物都无法治愈RA，且可能带来的副作用，比如继发感染、继发肿瘤等，威胁病人的生命。尽管近年来兴起的生物制剂广泛应用于临床，如针对细胞因子靶向治疗的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂、拮抗B细胞的抗CD20抗体、拮抗细胞因子IL-6和IL-6受体的生物制剂、拮抗粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和破骨细胞分化因子配体(RANKL)产生的生物抑制剂、阻断JAK信号通路的抑制剂等。生物制剂类治疗策略由于药效无法长期维持，需要长期注射或者服用，治疗效果有限，给家庭带来严重的经济负担。因此，急需开发更加高效、精准且毒副作用少的新药物。

间充质干细胞(MSC)为自身免疫性疾病的治疗提供了新的思路，MSC来源于中胚层的成体干细胞，体外扩增的MSC具有较强的免疫抑制作用，并且可以同时在免疫反应中的多个环节发挥调节作用，但是在在临床环境中使用这些细胞存在一些不确定的问题，例如，患者的间充质干细胞通常功能失调，只能使用自体来源的细胞，并且目前还不清楚这些细胞移植到人体后的最终去向以及分化命运如何，其他长期的副作用包括感染和肿瘤发生也被认为是MSC细胞治疗局限性和缺点。此外，目前有研究发现来源于MSC源性小细胞外囊泡(EVs)可以介导MSC的旁分泌作用、促进组织修复、免疫抑制和体内平衡恢复。EVs是广义上EVs中直径在40-160nm范围内的盘状膜泡，与质膜融合后释放到细胞外基质中，EVs富含许多生物活性分子，包括复杂的mRNA、miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、转移RNA(tRNA)、脂质和蛋白质。EVs作为天然药物载体，是区别于普通脂质体的复杂而又特殊的蛋白和磷脂双分子层结构，有独特的优势主要体现在：(1)EVs是人体自身产生的，免疫原性低；(2)EVs在人体中不易被分解清除，在体内的半衰期长；(3)向细胞运输货物的靶向性好和效率高；(4)EVs直径很小，可以通过大多数生理障碍，可以利用增强渗透滞留效应使有效浓度达到目标组织，选择性渗入到炎症或者肿瘤部位。

因此，亟需开发一种间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其中间充质干细胞源性小细胞外囊泡具有极低的免疫原性，副作用小，在生物体内较为稳定，具有天然的归巢和靶向性，滞留时间长，不容易被巨噬细胞吞噬和其他免疫细胞的排斥，且间充质干细胞源性小细胞外囊泡呈纳米级别的大小，可以跨越生理屏障，从而提高组织的靶向性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明的第一目的是提供了一种间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

间充质干细胞源性小细胞外囊泡(EVs)具有极低的免疫原性，在生物体内滞留时间长，具有天然的归巢和靶向性；并且EVs还具有天然的特性和修饰的可塑性，具有更低的毒性，在整个免疫系统中耐受性更强，甚至可以穿过血脑屏障，避免被巨噬细胞吞噬或降解，此外，EVs可以很好的抵抗T细胞介导GVHD的免疫排斥反应。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞源性小细胞外囊泡为齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡。

本发明人意外的发现齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡(GMSC-sEV)可以特异性地靶向炎症关节部位，进一步地，本发明人发现GMSC-sEV可以应用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病。

通过透射电镜观察到GMSC-sEV粒径大小位于145nm左右，可以很容易地跨越生理屏障，从而提高组织靶向性；经过检测分离发现制备的GMSC-sEV表达CD63，CD81，CD9和TSG101等典型的表面标志物，并且GMSC-sEV可以通过miR-148a-3p靶向IKKB的表达。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述自身免疫性疾病包括自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。

本发明的第二目的是提供了一种齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗胶原诱导的类风湿性关节炎药物中的应用。

在本发明的技术方案中，GMSC-sEV可以明显降低CIA小鼠的发病率(p<0.05)，还可以延缓关节炎发病的起始时间点，对CIA小鼠关节保护的作用更好。与GMSC相比，GMSC-sEV显著减轻关节炎的病理学严重程度，在对抗骨的破坏以及保护骨的完整性方面有更强的效果。

并且GMSC-sEV显著抑制促炎细胞因子TNF-α，IFN-γ，IL-17A，IL-6的产生，然而加强抗炎细胞因子IL-10的产生。与2×10⁶GMSC相比，100μg GMSC-sEV更好的保护CIA小鼠的疾病进程和更有效地对抗炎症反应能力。

本发明的第三目的是提供了一种齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制T细胞增殖的药物中的应用。

通过实施例3的实验可知，GMSC-sEV可以抑制CD3、CD4和CD8细胞的增殖能力，2×10⁶GMSC和100μg的GMSC-sEV在体外抑制T细胞增殖功能差异不大。

本发明的第四目的是提供了一种齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制Th1细胞分化的药物中的应用。

本发明的第五目的是提供了一种齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制Th17细胞分化的药物中的应用。

本发明的第六目的是提供了一种齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备促进Treg细胞分化的药物中的应用。

经过GMSC-sEV治疗后，生物体表现为更低的Th1和Th17细胞百分比，且还可以促进Treg细胞分化，对类关节炎有较佳的治疗效果。

本发明的第七目的是提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物，所述药物包括齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡。

此外，本发明的GMSC-sEV还可以成为药物递送的最佳载体，GMSC-sEV含有丰富的生物活性物质或在表面提供重要的治疗潜能，可以对GMSC-sEV进行膜修饰或者载药以提高靶向性和药物装载能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的齿龈间充质干细胞(GMSC)来源获取方便、增殖更快、在细胞培养过程中没有潜在的肿瘤发生风险，安全性高；

(2)本发明的GMSC-sEV具有极低的免疫原性，副作用小，在生物体内较为稳定，具有天然的归巢和靶向性，滞留时间长，可以很好的抵抗其他免疫细胞的排斥，并且机体移植后存活率高；

(3)本发明提供了间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，GMSC-sEV可治疗自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病，应用广泛；

(4)本发明还提供了齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗胶原诱导的类风湿性关节炎药物中的应用，意外的发现了GMSC-sEV可以特异性地靶向炎症关节部位，并且GMSC-sEV可以明显降低CIA小鼠的发病率(p<0.05)，还可以延缓关节炎发病的起始时间点，对CIA小鼠关节保护的作用更好。

附图说明

图1为齿龈间充质干细胞(GMSC)通过流式细胞术检测表面标志物的结果示意图；

图2A为齿龈间充质干细胞(GMSC)的光学显微镜示意图；

图2B为齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡(GMSC-sEV)的透射电镜示意图；

图2C为GMSC和GMSC-sEV粒径大小分布示意图；

图2D为GMSC和GMSC-sEV检测CD63，CD81，CD9和TSG101表达情况的结果示意图；

图3为GMSC和GMSC-sEV体外抑制T细胞增殖的检测结果示意图；

图4为GMSC和GMSC-sEV对胶原诱导的关节炎小鼠(CIA)动物模型的治疗实验的结果示意图；

图5为GMSC和GMSC-sEV对人源化GVHD模型的治疗实验的结果示意图；

图6为GMSC和GMSC-sEV靶向关节炎以及人源化GVHD小鼠的活体示踪实验的结果示意图；

图7为GMSC和GMSC-sEV改善炎症滑膜细胞介导的人源化动物模型的实验的结果示意图；

图8为GMSC-sEV的RNA或蛋白的消除实验的结果示意图；

图9为GMSC-sEV包含的miRNA表达特征以及生物信息学分析的结果示意图；

图10为GMSC-sEV通过包裹的miR-148a-3p靶向IKKB的结果示意图；

图11为GMSC-sEV依赖miR-148a-3p的表达抑制T细胞反应和改善CIA小鼠的验证实验的结果示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

对于常规的cDNA逆转录，根据“TaKaRa PrimeScript^TMRT Master Mix (PerfectReal Time)”的操作进行。

实施例1、齿龈间充质干细胞(GMSC)的分离和培养

1.采集样本：采集人牙龈样本，该人牙龈样本在中山大学第三医院口腔科接受常规牙科手术的病人丢弃的组织中获得的，经中山大学第三医院伦理委员会(IRB)医学伦理委员会批准(IRB 2018-02-195-01)。

2.分离和培养齿龈间充质干细胞(GMSC)：样采集的人牙龈样本用Disase II(2mg/mL)在4℃条件下消化过夜或37℃条件下消化2h；然后用浓度为4mg/mL的IV-型胶原酶在37℃条件下消化0.5h(每隔几分钟摇动组织一次以避免碎片)；再用70μm筛网过滤收集细胞悬液，300g，5min离心获得细胞沉淀，细胞沉淀用α-MEM完全培养基(包含10％FBS，100U/mLpenicillin，100μg/mL streptomycin，1×L-glutamic acid和1×MEM-NEAA)重悬于100mm培养皿并转移到37℃的CO₂培养箱，72h后，非贴壁的悬浮细胞丢弃，贴壁细胞即为GMSC。

3.分离和培养人皮肤成纤维细胞(Fibroblast)：本实施例将以原代培养的Fibroblast作为对照组，以判断GMSC是否分离(由于Fibroblast和GMSC形态相似)，从中山大学第三附属医院经IRB医学伦理委员会批准手术的6-8岁儿童包皮中分离出人皮肤组织，将组织切成小块，置于37℃的CO₂培养箱中培养30min，使用高糖1640完全培养基(包含10％FBS，100U/mL penicillin和100μg/mL streptomycin)，使人皮肤成纤维细胞(Fibroblast)从组织块中生长出来并附着到培养瓶壁上，直到细胞达到80-90％的融合，将第三至五代培养得到的Fibroblast备用。

将上述培养得到的GMSC通过流式细胞术检测CD44、CD73、CD90、HLA-ABC、CD105、HLA-DR、CD39和CD11B等表面标志物的表达情况，如图1所示，GMSC高表达MSC常见的表面标志物，如CD44、CD73、CD90、HLA-ABC和CD105，然而缺乏共刺激分子HLA-DR和CD11B的表达。结果表明我们分离的GMSC属于一个标准的MSC亚群。

实施例2、GMSC-sEV的分离和鉴定

取实施例1步骤2中制备的重悬液上清300g离心5min，去除细胞；3,000g离心15min去除死细胞；10,000g离心30min以去除细胞碎片；110,000g离心70min，去除上清，管底的沉淀是包含蛋白和EVs的混合物；接着用大体积的PBS重悬沉淀并继续使用110,000g离心70min，最终的沉淀就是small EVs(GMSC-sEV)；最终获得的sEV用PBS重悬，立即使用或者-20℃保存。

将获得的GMSC置于显微镜下观察，如图2-A，GMSC的直径大小分布在10-30μm，将获得的GMSC-sEV通过透射电镜(TEM)检测直径大小，如图2-B，GMSC-sEV的直径大小分布在120nm，进一步采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术进行分析，分离的GMSC-sEV粒径大小分布在峰值为145nm附近(图2-C)；采用Western blot检测分离的GMSC-sEV的特征性标志物CD63，CD81，CD9和TSG101的表达情况，如图2-D显示，GMSC-sEV表达CD63，CD81，CD9和TSG101等表面标志物，然而GMSC不表达CD63、CD81和TSG101。因此，GMSC-sEV和GMSC具有不同的表型以及粒径特征，分离的GMSC-sEV符合定义small EV的标准。

实施例3、GMSC-sEV体外抑制T细胞增殖的检测

取健康志愿者来源的全血用等体积的PBS稀释并混匀，在Ficoll淋巴细胞分离液(2-3:1to cells)上方约1cm处倾斜45°沿着管壁缓慢加入稀释的全血(注意不要破坏分离液层界面)，室温(18-28℃)，400g，离心20-30min(离心机设置为加速度3，减速度0)。待离心结束，小心吸取白膜层的细胞。全部收集的细胞再用5倍体积的PBS室温，300g离心10min，PBS重复洗1-2次，尽量去除血小板。最终得到的即为hPBMCs(人外周血单核细胞)，立即使用或者加冻存液置于-80℃保存备用。

新鲜获得的或者提前一晚上复苏的hPBMCs，置于1μM CFSE(carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester)下轻轻混匀，37℃孵育15min。加入5倍体积预冷的PBS，4℃400g离心弃上清，重复3次。计数CFSE标记的PBMCs，2million每孔的细胞浓度种板，并以anti-CD3(1μg/mL)和anti-CD28(1μg/mL)抗体刺激，加入GMSC的细胞数量为2×10⁶，加入GMSC-sEV的终浓度为100μg/mL，最终置于6孔板在37℃的CO₂培养箱中培养3天。轻轻收取细胞(尽量不要把贴壁的GMSC收集到)，用荧光标记的流式抗体CD3和CD8染色，通过流式细胞术获取CD4和CD8细胞增殖的图像和数据。

如图3-A所示，与Basline相比，GMSC明显抑制CD3、CD4和CD8细胞的增殖，而GMSC-sEV对CD3、CD4和CD8细胞的增殖能力弱于GMSC。

此外，本实施例还对PBMCs进行了qRT-PCR检测，分析参与促炎或抗炎表型维持和转化的细胞因子和转录因子的转录水平表达情况。如图3-B所示，发现GMSC显著抑制IL-1A，TNF-α，IFN-γ，Stat1，IL-17A，IL-6，Stat3，IL-21和IL-23的表达，但促进了Stat5、Foxp3、CTLA4的表达，说明GMSC可逆转PBMCs的促炎表型向抗炎表型转变。GMSC-sEV对这些细胞因子和转录因子的影响也显示GMSC相似但弱于GMSC的效应。综上所述，这些数据表明2×10⁶GMSC和100μg的GMSC-sEV在体外未表现出显著的抑制功能差异。

实施例4、GMSC-sEV对胶原诱导的关节炎小鼠(CIA)动物模型的治疗实验

建立关节炎小鼠(CIA)动物模型：牛II型胶原(C-II)溶解于10mM冰醋酸中，使C-II终浓度为4mg/mL，溶解过程中放置在4℃环境中缓慢溶解过夜，不能剧烈振荡以免局部温度过高导致胶原失活，C-II溶解后溶液无色澄清，若产生沉淀则可能是溶解不完全或胶原失活，因此，每次溶解后按实验需要分装冻存至-80℃冰箱中。将不完全弗氏完全佐剂(IFA)与热灭活结核分支杆菌混匀(此时菌的终浓度为6mg/mL)配成CFA。将溶解的C-II和CFA以1：1等体积添加到10mL BD螺口注射器内，然后用一个三通阀与另外一个10mL BD螺口注射器连接。手动调整推拉速度，冰上混匀20分钟左右直至乳化充分(低温的目的是防止胶原变性，乳化完全的标准是滴在水上不扩散)。后续的操作过程中都尽量保持低温，包括注射器和针头最好都先预冷。选择离鼠尾根部约1.5cm处，顺着身体方向用1mL的注射器穿刺皮内用力缓慢推入50μL的配制好的乳液。

CIA与RA有着一些相同的病理学特征：关节滑膜纤维细胞增生、单核细胞侵润、软骨降解、关节腔内有炎性细胞浸润，体内可以检测到高滴度的C-II抗体。炎症后期出现骨破坏，并导致不可逆的关节畸变等。CD4+T细胞是CIA的主要致病因素，此外还有CD8+T细胞、C-II自身抗体、炎症因子大量产生等因素也在其病理过程中起到重要作用。目前常用的根据病变程度来评判的评分系统、组织病理学检测方法和影像学检测方法。评分的时候4肢评分的总和即为评分分数。每2-3天评分一次。

病变程度评价方法：

实验方法：将每只动物模型小鼠在免疫后的0，15，30天分别注射2×10⁶数量的GMSC和100μg的GMSC-sEV(如图4-A)。在实验终点(免疫后的第60天)，采用CO₂或者颈椎脱位处死CIA小鼠。收集小鼠后肢并用10％福尔马林固定，用切片机切成4-7μm，放置在一个65℃恒温烤箱烘焙30min，之后浸泡在I-二甲苯中15min，II-二甲苯中15min。再依次用100％、95％、85％和75％的酒精浸泡5min，最后切片分别用苏木精水溶液染色5min，伊红染色1-2min。通过普通光学显微镜拍摄苏木精和伊红的染色(H&E)结果，获得的图像被运用与评价CIA小鼠的组织病理学分析。评分标准为：以0级无炎症征象，1级为轻度炎症伴滑膜内膜增生，未见软骨破坏，2-4级为炎性细胞浸润程度增加，软骨/骨破坏。炎症细胞的侵润以及细胞因子的累积会破坏软骨组织，成骨能力减弱，最终造成骨的损伤。浸润性CD4+T细胞和促炎细胞因子的产生最终以骨骼和关节为目标，启动破坏性关节炎症。

对CIA小鼠的后爪进行高分辨率微计算机断层成像(micro-CT)分析。采用3.6mm长度对包括整个爪子进行扫描，设置为以下参数：17.5μm体素，55kV,145μA，200ms集成时间，211图像片段。图像被转换成8位，采用进口模拟软件(Materialise，Belgium))和使用离散高斯滤波过滤(方差＝1，马克斯内核宽度＝1)。最终通过micro-CT系统(Viva CT 40,Scanco,Switzerland)获得了后爪的三维骨成像，骨体积被用来定量骨的侵蚀，基于第二至第四跖骨和指骨的第三跖骨的3D纵轴进行骨体积的定量。Micro-CT对整个爪子的扫描能够更加直观地呈现关节炎骨的破坏程度。

如图4-B，与GMSC相比，在关节炎初始阶段，GMSC和GMSC-sEV的发病率无明显差异，但30天后的发病率呈现显著性差异，GMSC-sEV明显降低CIA小鼠的发病率(p<0.05)，GMSC-sEV显著延缓关节炎发病的起始时间点。

如图4-C，在实验结束前每2-3天记录一次CIA小鼠的临床评分，经关节炎评分的结果表明，GMSC-sEV展现更好的对CIA小鼠关节的保护作用。

如图4-D，与GMSC相比，GMSC-sEV显著减轻CIA小鼠关节炎的病理学严重程度。

如图4-E所示，与GMSC相比，GMSC-sEV在对抗骨的破坏以及保护骨的完整性方面有更强的效果。

如图4-F和图4-G所示，与GMSC相比，GMSC-sEV治疗后表现更低的Th1和Th17细胞百分比。

如图4-H所示，与GMSC相比，GMSC-sEV还进一步加强Treg的分化。

本实施例采用ELISA试剂盒检测CIA小鼠血清细胞因子表达情况，如图4-I所示，GMSC-sEV显著抑制促炎细胞因子TNF-α，IFN-γ，IL-17A，IL-6的产生，然而加强抗炎细胞因子IL-10的产生。与2×10⁶GMSC相比，100μg GMSC-sEV更好的保护CIA小鼠的疾病进程和更有效地对抗炎症反应能力。

实施例5、GMSC-sEV对人源化GVHD模型的治疗实验

Xeno-GVHD人源化动物模型的建立：NOD/SCID小鼠先经受2.5cGy全身性辐照(TBI)，2-4h内每只小鼠静脉接受20×10⁶CD25-depleted hPBMCs。分别在0，15，30天尾静脉注射2×10⁶数量的GMSC和100μg的GMSC-sEV(如图5-A)。每2-3d称重，并评价GVHD评分，每天记录存活率。每周用流式细胞术检测外周血样品CD3+T细胞比例。在实验终点，分离肺，肝，肠组织进行H&E染色的病理学检测，血清样品采用ELISA试剂盒检测IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-10、IL-2和TNF-α的表达水平。

如图5-B，与GMSC相比，GMSC-sEV显著延长xeno-GVHD小鼠的存活时间和生存率。如图5-C，与GMSC相比，GMSC-sEV也逆转小鼠体重的丧失。

如图5-D所示，与GMSC相比，GMSC-sEV显著抑制CD3+T细胞的扩增(p<0.05)。在实验终点，取引流淋巴结检测CD3+T细胞检测，得到与外周血CD3+T细胞相似的结果(如图5-E所示)。

如图5-F和图5-G所示，与GMSC相比，GMSC-sEV治疗小鼠的肺、肝、肠器官观察到更少的T细胞侵润。供体来源的T细胞识别抗原或者MHC复合物引起激活和扩增后，也会出发细胞因子的释放。

如图5-H所示，与GMSC相比，GMSC-sEV显著抑制TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-17A、IL-4表达，但是上调IL-10的表达。综上所述，GMSC-sEV更好地抵抗T细胞介导GVHD的免疫排斥反应。

实施例6、GMSC-sEV靶向关节炎以及人源化GVHD小鼠的活体示踪实验

DiR染料(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-TetramethylindotricarbocyanineIodide)是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。DiR可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析，DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

实验方法：取适当浓度的新鲜制备或者冻存的EVs/PBS悬液，加入5μM终浓度的DiR混匀，室温避光孵育15min。随后加入10mL的PBS，110,000g离心1h，PBS重复洗涤一次。DiR标记的EVs立即静脉输注到小鼠。相似的，GMSC以1×10⁶/mL浓度重悬于PBS，加入5μM终浓度的DiR混匀，室温避光孵育15min，最后用PBS离心洗涤3次。DiR标记的GMSC立即静脉输注到小鼠。DiR标记的GMSC和EVs通过尾静脉注入小鼠24h后，用乙醚麻醉小鼠置于小动物活体成像仪下。分别使用700-780nm波长激发光滤片和530-620nm波长激发光的滤片来检测DiR。通过设置背景测量参数去除背景荧光。荧光的发射被归一化为每秒每平方厘米每立体弧度的光子数(p/sec/cm2/sr)。彩色图像表示同时收集的小鼠黑白照片上覆盖的动物体内荧光的空间分布。图像采集和分析使用Live Image 4.0软件(PerkinElmer)。数据以平均辐射亮度±SD表示。实验结束后，处死小鼠，立即对其淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏、肺、肠和关节等组织按照上述描述的方法再进行图像采集和荧光强度计算。

如图6-A和图6-B所示，GMSC和GMSC-sEV大部分的荧光都分布在肝脏，在关节部位，GMSC输注的小鼠几乎观察不到荧光信号的存在，然而GMSC-sEV输注的小鼠可看到明显的荧光分布。

如图6-C和图6-D，将小鼠的主要器官分离并同样地置于小动物成像系统下采集图像，得到与相似的关节荧光分布结果。

在24h后，处死并立即解剖得到的脾脏、淋巴结、肠、肾、肝和肺被置于活体小动物成像系统检测荧光信号的分布。如图6-E和图6-F所示，GMSC和GMSC-sEV的荧光信号都是聚集在肝和肺部位。尽管肝和肺各自的荧光分布比例不太相同，但脾脏、淋巴结、肠和肾这些器官的荧光分布比例基本相同。

在xeno-GVHD小鼠，GMSC和GMSC-sEV的靶向炎症性的主要器官能力相似。一些特殊部位比如关节，GMSC-sEV展现了优越的靶向能力。

实施例7、GMSC-sEV改善炎症滑膜细胞介导的人源化动物模型的实验

用异氟醚麻醉小鼠，在小鼠背侧处皮肤用无菌手术剪刀剪开，在切口局部用布比卡因镇痛。将一块包含正常人软骨组织的海绵状复合体植入NOC/SCID小鼠。对老鼠进行了观察，看它们是否有不适的迹象。

选自中山大学附属第三医院的1例RA患者(女性，65岁，患有风湿性关节炎12年)和1例关节置换手术患者(无关节炎病情，男性55岁)，获得医院批准并获得病人书面的知情同意书。

实验方法：RASF用PBS洗1次，然后加1μM终浓度的CM-DiI(红色)室温避光孵育15min，用PBS以500g，5min离心洗3次制得带有CM-DiI标记的RASF。15天后在对侧植入一块CM-DiI标记的包含RA滑膜成纤维细胞(RASF，5×10⁵个)和正常人软骨组织的海绵状复合体并包含2×10⁶GMSC和100μg的GMSC-sEV。我们在60天后取出同侧和对侧的植入物(软骨组织)进行相应的组织病理学检测(如图7-A所示)。

如图7-B和图7-C所示，荧光显微镜结果显示，GMSC-sEV的荧光信号显著低于GMSC。在第60天取出的软骨组织被H&E染色以评价RASF侵袭并造成的炎症浸润对软骨的破坏程度。如图7-D和图7-E所示，与GMSC相比，GMSC-sEV显著减少炎症细胞的浸润程度，更强的保护软骨能力。

实施例8、GMSC-sEV的RNA或蛋白的消除实验

实验方法：将实施例1制备的GMSC-sEV经历3个循环的反复冻融(-80℃～37℃)使EVs膜破裂，每个循环10min。接着用蛋白酶(Sigma，0.5mg/mL，37℃)分别处理10、30和60min。处理结束后为灭活蛋白酶，EVs经过10个循环的反复冻融(-80℃～100℃)，最终得到含有RNA但无蛋白的EVs。为去除EVs的RNA，同样的，EVs先进行3个循环的反复冻融(-80℃～37℃)使EVs膜破裂，每个循环10min。接着用RNase A(Takara，10μg/mL，37℃)分别处理10，30和60min。处理结束后，用RNA抑制剂(Takara，2,000units/mL，37℃)与EVs孵育1h(如图8-A所示)，这样就获得了含有蛋白但无RNA的EVs。部分EVs用RNase A加蛋白酶分别处理10min、30min和60min，得到无RNA和无蛋白的EVs。

对GMSC-sEV进行不同的处理，然后在样品中加入5×SDS加载缓冲液，95℃恒温5min变性。样品用SDS-PAGE分离，然后用银染评估GMSC-sEV的蛋白消除情况。凝胶在30％甲醇加10％乙酸中固定15min，敏化1min。之后，凝胶在银染反应缓冲液中浸泡5min，显影2-3min，用停止缓冲液冲洗1-2min，最后成像。对于GMSC-sEV的RNA消除实验的验证，采用琼脂糖凝胶分离并成像并评估。

如图8-B所示，为了去除蛋白质，GMSC-sEV先经蛋白酶(Protease)处理，随后与5×SDS上样缓冲液混合，在SDS-PAGE胶上被分离，获得的SDS-PAGE凝胶经过银染并在成像仪下取得图像，结果显示成功地获得了不含蛋白但包含RNA的GMSC-sEV。

如图8-C所示，为了去除RNA，GMSC-sEV经RNase处理后，用琼脂糖凝胶分离并成像，结果显示成功地获得了不含RNA但是包含蛋白的GMSC-sEV。

如图8-D和图8-E所示，不含RNA但是包含蛋白的GMSC-sEV的抑制能力几乎丧失，而不含蛋白但包含RNA的GMSC-sEV的抑制能力只有45％。本实验成功证实了RNA在介导GMSC-sEV免疫调控活性中的关键作用。

实施例9、GMSC-sEV包含的miRNA表达特征以及生物信息学分析

根据说明书，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒从EVs中分离总RNA。采用Agilent2100生物分析仪测定总RNA的含量和完整性。oligo-dT免疫磁珠去除多聚腺苷酸化的mRNA后，用乙醇在-20℃过夜沉淀RNA，利用Illumina公司的NEB Next Multiplex Small RNALibrary Prep Set准备小RNA文库的制备，使用基于qPCR的KAPA Biosystems LibraryQuantification kit精确的定量以用于测序。每个文库被稀释到最终浓度为2nM，并在聚类前聚集换算成等摩尔质量的RAN。采用pairend模式，在Illumina Hiseq 2500基因组分析仪平台上进行150bp对端(PE150)测序。以p<0.05和Fold change>1.5为显著性阈值，定义miRNA的上调或下调。RNA-seq数据已被存入NCBI基因表达综合数据库(GEO)。

使用Cluster 3.0软件生成表达差异调控基因的热图。使用三个在线平台预测miRNA的靶基因：DIANA-microT-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr)，TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(www.microrna.org)。上述基因富集的信号通路是通过基于KEGG(Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库的分析得到。

如图9-A和图9-B所示，与Fibroblast-sEV相比，GMSC-sEV有41个上调的和10个下调的miRNAs(p<0.05,fold change≥1.5)。GMSC-sEV显著高表达的miRNAs包括miR-1247、miR-204-3p、miR-1-3p、miR-146a-5p、miR-483-3p、miR-148a-3p、miR-1246、miR-32-5p、miR-377-3p和miR-455-5p。

富集的信号通路如图9-C所示，其中包括NF-κB信号通路。如图9-D所示，在这些miRNAs当中，发现GMSC显著高表达miR-148a-3p。

实施例10、GMSC-sEV通过包裹的miR-148a-3p靶向IKKB的分析

实验方法：提前一天种板在100mm培养皿，使第二天GMSC汇合度在50％左右。转染前用新鲜完全培养基换液，具体的转染步骤如下，转染miRNA-148a-3p mimic/NC时每皿的试剂用量：A：Opti-MEM 500μL+Lipo3000 24μL；B：Opti-MEM 500μL+40nM miRNA mimic/NC。将上述A+B溶液混匀，室温避光放置5min，加入到培养皿内。转染48h后收获上清，按照sEV分离步骤进行操作得到miR-148a-3p阻断的GMSC-sEV。

NF-κB的磷酸化激活是淋巴细胞生存，激活以及正常免疫反应至关重要的。结构性的激活NF-κB途径往往与炎症疾病相关，比如风湿性关节炎、多发性硬化症和移植物抗宿主病。IKKB作为NF-κB激活的关键调节因子，IKKB是潜在miR-148a-3p的靶基因。

如图10-A所示，构建包含miR-148a-3p潜在结合位点的IKKB 3’UTR片段的双荧光素酶报告基因质粒。结果发现，miR-148a-3p mimic转染组显著降低荧光素酶活性。如图10-B所示，miR-148a-3p潜在结合位点突变的IKKB 3’UTR片段的荧光素酶活性不被降低。结果表明了IKKB是miR-148a-3p的直接靶向分子。

本实验还采用miR-148a-3p mimic转染HEK-293T细胞，48h后收集细胞进行RT-qPCR和Western blot检测IKKB的表达情况。结果发现IKKB的mRNA显著被miR-148a-3pmimic抑制(图10-C)。相似地，p-IKKB和IKKB蛋白水平也被miR-148a-3p mimic降低(图10-D)。

此外本实验还利用基因转染技术阻断GMSC-sEV中miR-148a-3p的表达，产生极低表达或者不包含miR-148a-3p的GMSC-sEV(miR-148a-3p-i-exo)，然后与hPBMC共培养。结果表明miR-NC-exo处理的hPBMCs中IKKB的mRNA是显著降低的，p-IKKB和IKKB蛋白水平的表达也减少。然而，miR-148a-3p-i-exo丧失对IKKB或者p-IKKB的抑制(如图10-E和图10-F所示)。结果表明，GMSC-sEV可以通过miR-148a-3p靶向IKKB的表达。

实施例11、GMSC-sEV依赖miR-148a-3p的表达抑制T细胞反应和改善CIA小鼠的验证实验

1.体外人T细胞分化实验：新鲜获得的或者提前一晚上复苏的hPBMCs，计数后以0.3million每孔的细胞浓度，分别在Th1((IL-12 50ng/mL,anti-IL-410μg/mL))和Th17(IL-6 100ng/mL,TGF-β20ng/mL,anti-IFN-γ10μg/mL,anti-IL-410μg/mL)分化条件下，加入human T-Activator CD3/CD28 D ynabeads(1:10细胞)和20μg/mL终浓度的EVs，置于96孔板在37℃的CO2培养箱中培养5天。获取细胞前，用PMA(PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE,50ng/mL)，Ionomycin(500ng/mL)和BFA(Brefeldin A,1×)刺激5h。通过固定破膜的方法，最终用流式细胞仪检测Th1(CD4+IFN-γ)和Th17(CD4+IL-17A)的百分比获取细胞分化的图像和数据。

2.体外人PBMC释放炎症因子的抑制实验

新鲜获得的或者提前一晚上复苏的PBMCs，计数后以0.3million每孔的细胞浓度，直接用anti-CD3(1μg/mL)和anti-CD28(1μg/mL)抗体刺激，置于96孔板在37℃的CO2培养箱中培养5天。获取细胞前，用PMA(50ng/mL)，Ionomycin(500ng/mL)和BFA(1×)在37℃的CO₂培养箱中刺激5h。通过固定破膜的方法，最终用流式细胞仪检测CD4+TNF-α+和CD4+Foxp3+百分比的情况。

3.双荧光素酶报告基因实验：将HEK-293T细胞按50％的密度接种到细胞培养48孔板内。细胞汇合度约70％时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。在48孔板转染体系中使用Lipo3000转染miRNA mimic和双荧光素酶质粒。转染前用250μL新鲜培养基换液。具体的转染步骤如下，转染miRNA mimic/NC时每孔的试剂用量：A：Opti-MEM 10μL+Lipo3000 1.5μL；B：Opti-MEM 10μL+30nM miRNA mimic/NC。将上述A+B溶液混匀，室温放置5min，加入到培养皿内。转染双荧光素酶质粒的试剂用量：A：Opti-MEM 10μL+Lipo3000 0.3μL；B：Opti-MEM 10μL+0.2μg质粒+0.5μL p3000。将上述A+B溶液混匀，室温放置5min，加入到培养皿内。不需换液，转染48h后的细胞用于荧光素酶的检测。根据说明的操作，具体的：(1)弃去培养基，用100μL1×PBS洗细胞一次。(2)倾斜48孔板，吸干剩余的PBS。(3)去离子水将5×PLB(裂解液)稀释成1×PLB(现配现用)，使用前放到常温。(4)每孔加50μL稀释好的1×PLB，置摇床振摇20-30min以保证完全裂解。(5)选用白色不透光的96孔酶标板，每孔加入步骤4的上清液10μL，加入100μL预先混好的Luciferase Assay Reagent II，2s后读数，检测荧光素酶活性。注意此步需在避光条件下进行。(6)测定结束后，每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后读数，检测内参海肾荧光素酶反应活性。(7)记录读数：每个样品会有3个数值：RLU1-萤火虫荧光素酶反应强度，RLU2-内参海肾荧光素酶反应强度，计算两组数据比值，即RLU1/RLU2。(8)分析数据：可以发现由于对照组未转染质粒，因此检测不到荧光素酶反应强度。比较3、4组，由于转染miRNA mimic，萤光素酶的活性降低，提示miRNA可能参与抑制靶基因的表达，需要结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

4.流式细胞术

收获的细胞用PBS以300g，5min离心洗一次。加入相应CD3、CD4、CD8流式抗体并混匀，室温孵育15min，随后加入2-5mL的PBS以300g，5min离心洗一次。最终用适当体积的PBS重悬细胞，立即采用流式细胞术检测。对于Foxp3的检测，根据“Foxp3/TranscriptionFactor Staining buffer Set”的说明，首先对收获的细胞用PBS以300g，5min离心洗一次；加CD4，CD25抗体各0.2-0.5μL，4℃避光孵育15min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；加入1mL 1×Biolegend Foxp3 Fix/Perm溶液(取4×溶液，用稀释液稀释)，涡旋震荡重悬细胞，室温避光孵育20min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；加入1mL 1×Foxp3 Perm buffer(10×，用ddH20稀释)，涡旋震荡重悬细胞，室温避光放置15min；直接300g，4℃离心5min，弃上清；在残余的液体中加入0.5-1μL细胞因子抗体并涡旋震荡重悬细胞，室温避光孵育30-60min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；用适当体积的PBS重悬细胞立即进行上机分析。

对于胞内细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17A的检测。根据“BiolegendIntracelluLar Staining Protocol”的说明，获取细胞前，用PMA(50ng/mL)，Ionomycin(500ng/mL)和BFA(1×)在37℃的CO2培养箱中刺激5h。收获的细胞用PBS以300g，5min离心洗一次；加表面抗体0.2-0.5μL，4℃避光孵育15min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；加入1mL Fixation Buffer，涡旋震荡重悬细胞，室温避光孵育20min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；加入1mL 1×IntracelluLar stainingPerm Wash Buffer(本身为10×溶液，用DI water稀释)，涡旋震荡重悬细胞，室温避光孵育15min；直接300g，4℃离心5min，弃上清；在残余的液体中加入0.5-1μL细胞因子抗体并涡旋震荡重悬细胞，室温避光孵育30-60min；加入2-5mL PBS，300g，4℃离心5min洗涤1次，弃上清；用适当体积的PBS重悬细胞立即进行上机分析。流式细胞数据的分析采用FlowJo 10。

如图11-A所示，miR-148a-3p-i-exo丧失对CD8+T细胞增殖的抑制。如图11-B和图11-C所示，miR-148a-3p-i-exo丧失对Th1，Th17细胞分化的抑制。此外，是否GMSC传递miR-148a-3p介导了Treg的上调以及细胞因子TNF-α的抑制，本实验使用正常志愿者来源的PBMC在CD3和CD28刺激的情况下检测CD4+Foxp3以及CD4+TNF-α+的表达情况。从图11-D和图11-E所示，结果发现，miR-148a-3p-i-exo丧失对CD4+TNF-α+的抑制和丧失对Treg的上调。NF-κB信号在炎症级联中起重要作用。NF-κB是促炎症基因表达其中一个关键的调节因子，NF-κB诱导促炎细胞因子的转录。

本实施例采用Western blot检测p-NF-κB的表达情况。如图11-F所示，miR-148a-3p-i-exo对p-NF-κB的抑制能力丢失。NF-κB在多种疾病的炎症部位高度激活，如RA。为进一步运用CIA模型证实是否GMSC-sEV通过转移miR-148a-3p改善体内炎症回应。如图11-G所示，结果发现，miR-148a-3p-i-exo显著逆转miR-NC-exo对滑膜增生、白细胞浸润和骨侵蚀严重程度的抑制。Micro-CT分析CIA小鼠爪子的骨完整性结果表明，miR-148a-3p-i-exo丧失对小鼠骨完整性的保护(如图11-H)。此外，运用流式细胞术检测Th17和Treg细胞的比例。结果显示miR-148a-3p-i-exo部分地回升Th17/Treg的比率(如图11-I所示)。最后，ELISA试剂盒检测CIA小鼠血清细胞因子的表达水平。如图11-J所示，miR-148a-3p-i-exo对TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-6和IL-10的调控能力丧失。综上所示，本实验表明GMSC-sEV依赖miR-148a-3p的表达和通过靶向IKKB-NF-κB信号改善CIA小鼠。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞源性小细胞外囊泡为齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。

5.齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备治疗胶原诱导的类风湿性关节炎药物中的应用。

6.齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制T细胞增殖的药物中的应用。

7.齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制Th1细胞分化的药物中的应用。

8.齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备抑制Th17细胞分化的药物中的应用。

9.齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡在制备促进Treg细胞分化的药物中的应用。

10.一种治疗类风湿性关节炎的药物，其特征在于，所述药物包括齿龈间充质干细胞源性小细胞外囊泡。

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