CN107913407A - 一种葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法。包括以下步骤：1、致敏：分别于第1天、第8天和第15天对BALB/c小鼠颈后皮下注射200μl葎草花粉致敏液。2、激发：给小鼠雾化吸入1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液，连续7天，每天30min。本模型用葎草花粉蛋白提取液对BALB/c小鼠进行皮下注射致敏和雾化激发，成功构建了葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型。模型小鼠可以很好的模拟葎草花粉致敏引起的人类哮喘的典型特征。该模型将为我们研究葎草花粉致敏引起的人类哮喘的发病机制及探索新的治疗方法提供良好平台。

Description

一种葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种新的过敏性哮喘小鼠模型的构建方法，即构建葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的方法。

背景技术

过敏性哮喘是由吸入过敏原引起的复杂的多因素作用疾病，全球发病率日益升高。在我国，一年生草本植物葎草(Humulus scandens)，因生长条件要求低，在全国范围内广泛分布，其花粉是引起夏秋季过敏性哮喘的重要原因。

要研究葎草花粉致敏引起的哮喘的发病机制，寻找更有效的治疗方法，动物模型是重要的工具。而小鼠由于肺部结构、组织学和功能特征与人类相似，饲养费用低，便于发展转基因模型等特点，成为最常用的模型研究对象。一个典型的过敏性哮喘小鼠模型应该能够模拟人类过敏性哮喘的主要免疫学特征：如可逆的气道阻塞，气道高反应性，以嗜酸性粒细胞浸润为主的呼吸道慢性炎症，血清过敏原特异性IgE显著增加，Th2类细胞因子(如IL-4，IL-13)的表达升高，Th1类细胞因子(如INF-γ)的表达降低等。

小鼠过敏性哮喘模型的构建通常包括致敏和激发两部分。常用的致敏的方式有皮下注射、腹腔注射、呼吸道直接接触等，激发的方式有滴鼻、雾化等。不同的致敏和激发方式会在一定程度上影响小鼠的免疫反应。目前文献报道的葎草花粉致敏小鼠哮喘模型，主要采用腹腔注射致敏和滴鼻激发的方式构建。但在我们的实验中发现：腹腔注射方式致敏引起的气道反应性较低，炎症反应较弱、血清学变化不明显，不能较好的模拟人类哮喘的典型特点，而滴鼻激发的方式又由于对气道直接的强烈刺激，容易引起小鼠的急性肺损伤，造成小鼠死亡。

发明内容

本发明的技术目的是构建一个可以更好的模拟葎草花粉致敏引起的人类过敏性哮喘典型特点的小鼠模型。

本发明采用的技术方案是：

一种葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，包括步骤：

(1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对BALB/c小鼠颈后皮下注射200μl葎草花粉致敏液；

(2)激发：给小鼠雾化吸入1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液，连续7天，每天30min。

上述方案是经过多次大胆假设、小心求证后得到的最佳技术方案，其中若采用滴鼻激发的方式，根据本发明的优选实施例2，模型组小鼠，用葎草花粉蛋白连续2次滴鼻激发后，总计66.7％(10/15)的小鼠死亡。肺功能显示，小鼠气道失去了对乙酰甲胆碱(Mch)刺激的反应能力。肺部病理切片也符合急性肺损伤的特点。因此，滴鼻激发的方式并不适合用来构建本模型。

同一种过敏原不同的致敏途径会引起程度甚至种类不同的免疫反应。根据本发明的优选实施例3，比较了腹腔注射致敏和皮下注射致敏建立哮喘模型的效果。结果显示：相比于腹腔致敏组，皮下致敏组小鼠血清中的葎草花粉特异性IgE的表达量更高，脾匀浆液、肺细胞灌洗液(BALF)中TH2类细胞因子(IL-4、IL-13)表达量更高；肺细胞灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量和比例更高，AB-PAS染色中，气道中有更多的粘液分泌，小鼠有更强的气道高反应。这些特点说明，通过皮下注射致敏构建的小鼠哮喘模型，更符合人类过敏性哮喘的典型特征。

综合上述，本发明采用皮下注射葎草花粉变应原致敏，雾化吸入葎草花粉变应原激发的方式构建的葎草花粉致敏小鼠哮喘模型，可以最大程度上模拟葎草花粉致敏引起的人类过敏性哮喘的典型特征，且可以避免腹腔注射和滴鼻激发方式带来的不良后果。

进一步的，根据本发明的优选实施例1，步骤(1)中，小鼠皮下注射前，对小鼠的麻醉最优选采用吸入异氟烷的方式。

步骤(1)中，葎草花粉致敏液的配制方法是：取500μg冻干的葎草花粉蛋白,1:1加入氢氧化铝佐剂及PBS，乳化至4ml。

步骤(2)中，雾化激发时用的1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液配置方法是：用PBS溶解冻干的葎草花粉蛋白，比例为：1000ml PBS溶解1g冻干的葎草花粉蛋白。

所述冻干的葎草花粉蛋白优选由下述方法制备：

(1)称取40g葎草花粉，加入800ml的丙酮于4℃搅拌24h；

(2)风干：弃丙酮，花粉置于通风橱内过夜，让残余丙酮挥发；

(3)提取：加入800ml去离子水，4℃搅拌24h；

(4)离心：10000转/分，4℃离心15min；

(5)过滤：0.2μm滤膜负压过滤；

(6)透析：滤液装入3.5kd透析袋，加入去离子水3L，4℃下搅拌24h，期间换水6次；

(7)分装：透析后的提取液分装于10ml西林瓶中，每瓶2ml，置于-80℃冰箱过夜；

(8)冻干：将西林瓶从-80℃冰箱取出迅速置于冻干机中冻干。

本模型在建立过程中，通过对小鼠皮下注射葎草花粉变应原致敏，雾化吸入葎草花粉变应原激发，成功构建了葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型。模型小鼠可以很好的模拟人类葎草花粉致敏引起的过敏性哮喘的典型特征。这个模型可以为我们研究人类葎草花粉过敏性哮喘的发生机制及探索新的治疗方法提供良好平台。

附图说明

图1：麻醉起效时间；

图2：麻醉维持时间；

图3a：对照组实验流程图；

图3b：模型组实验流程图；

图4：小鼠气道高反应性测定；

图5：小鼠BALF中的炎症细胞分类计数，*代表模型组VS.对照组，P＜0.05；**代表模型组VS.对照组，P＜0.01；

图6a：对照组100X镜下；

图6b：对照组200X镜下；

图6c：模型组100X镜下；

图6d：模型组200X镜下；

图7a：皮下致敏模型组实验进程示意图；

图7b：腹腔致敏模型组实验进程示意图；

图7c：皮下致敏对照组实验进程示意图；

图7d：腹腔致敏对照组实验进程示意图；

图8：小鼠气道高反应性检测，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01；##代表FQ-M组VS.FQ-D组，P＜0.01；#代表FQ-M组VS.FQ-D组，P＜0.05；

图9：各组小鼠葎草花粉特异性IgE比较，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01；##代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.01；

图10：BALF中细胞分类计数，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01；##代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.01；

图11：BALF中的嗜酸细胞比例，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01；

图12：BALF中的IL-4和IL-13表达，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01；#代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.05；

图13：脾匀浆液中IL-4和IL-13表达量，*代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.05；#代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.05；

图14：BALF中INF-γ的表达；

图15：脾匀浆液中中INF-γ的表达；

图16：BALF和脾匀浆液中IL-10的表达，*代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.05；

图17a：FQ-D 100倍镜下；

图17b：FQ-D 200倍镜下；

图18a：FQ-M 100倍镜下；

图18b：FQ-M 200倍镜下；

图19a：PX-D 100倍镜下；

图19b：PX-D 200倍镜下；

图20a：PX-M 100倍镜下；

图20b：PX-M 200倍镜下；

图21a：FQ-D 100倍镜下；

图21b：FQ-D 200倍镜下；

图22a：FQ-M 100倍镜下；

图22b：FQ-M 200倍镜下；

图23a：PX-D 100倍镜下；

图23b：PX-D 200倍镜下；

图24a：PX-M 100倍镜下；

图24b：PX-M 200倍镜下；

图25：小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和杯状细胞数评分，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：小鼠致敏时麻醉方法的选择

1.目的

本模型构建中，在致敏环节需要先对小鼠进行麻醉，然后进行致敏的操作。选择适宜、安全、有效的麻醉方法是实验安全性及数据可靠性的基础。本部分研究即比较采用三种不同的麻醉方法(注射戊巴比妥钠，吸入乙醚，吸入异氟烷)麻醉后，小鼠的存活率，麻醉起效时间及麻醉维持时间，以便选择致敏环节最适合的麻醉方法。

2.材料及方法

1)主要试剂

乙醚 洛阳吴华化学试剂有限公司 中国

异氟烷 河北一品制药有限公司 中国

戊巴比妥钠 Sigma公司 美国

2)主要仪器

通用型动物麻醉机 瑞沃德 中国

麻醉箱用透明有机玻璃自制长宽高为：30cm x 15cm x 15cm

3)主要试剂的配制

1％戊巴比妥那的配制：称取100mg戊巴比妥那，加入10ml无菌PBS完全溶解后备用。

4)动物准备及分组

6-8周龄雌性BALB/c小鼠45只(SPF级),体重18～20g，由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。所有小鼠随机分为戊巴比妥钠注射组(A组)、乙醚吸入组(B组)，异氟烷吸入组(C组)，每组15只。

5)麻醉方法及剂量

分别对每组小鼠做如下处理：

A组小鼠用1％戊巴比妥那100μl腹腔注射麻醉

B组小鼠用乙醚吸入麻醉，吸入方法为将浸透乙醚的棉球上放入小鼠所在的麻醉箱内。

C组小鼠通过麻醉机用2％异氟烷(2％异氟烷+98％氧气)吸入麻醉

6)观察指标

死亡率

各剂量组小鼠麻醉后死亡的百分比

起效时间

从注药完毕或药物进入麻醉箱到小鼠达到完全麻醉状态的时间。小鼠倒下，四肢无活动，对皮肤疼痛反应消失、肌肉松弛、呼吸平顺，即视为达到完全麻醉状态。维持时间：

从达到完全麻醉状态到小鼠开始有复苏反应的时间。小鼠的前肢开始抖动即判定为开始复苏。

7)统计学方法

数据用表示，采用SPSS 19统计软件进行独立样本t检验。认为P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

3.实验结果

1)小鼠存活情况

3组小鼠的生存率分别为：A组86.7％，B组80％，C组100％(如表1)

表1

组别	存活小鼠数	存活率
			A组	13只	86.7％
B组	12只	80％
			C组	15只	100％

2)麻醉起效时间

3组小鼠的麻醉起效时间分别为：A组300.5±25.0s，B组21.6±2.8s，C组13.6±2.3s。C组与A，B组相比，都有显著性差异(P＜0.01)，如图1。

3)麻醉维持时间

3组小鼠的麻醉维持时间为：A组1215.3±67.2s，B组22.1±3.1s，C组16.1±2.3s。C组与A，B组相比，都有显著性差异(P＜0.01)，如图2。

4.实验结论

小鼠的麻醉是模型构建的重要环节，选择适宜、安全、有效的麻醉方法是实验安全性及数据可靠性的基础。良好的麻醉要求起效快，维持时间适中，对小鼠的刺激尽量小，麻醉后存活率高等。

在三组小鼠中，异氟烷吸入麻醉组(C组)的存活率最高(100％)，麻醉起效时间最短13.6±2.3s,麻醉维持时间最短16.1±2.3s。因为对小鼠皮下注射致敏的操作过程大约需要8-12s，因此，C组的麻醉维持时间虽然短，但已经可以满足试验的要求，而麻醉起效时间和维持时间较短，可以减少实验的整体时间，提高效率，同时维持时间较短，利于小鼠的恢复，可以减少麻醉对小鼠生命体征的影响及实验结果的干扰。因此异氟烷吸入麻醉是构建本模型最适合的麻醉方式。

实施例2：评估用腹腔注射致敏+滴鼻激发的方法构建小鼠哮喘模型的效果1.目的

腹腔注射致敏+滴鼻激发是常用的构建小鼠哮喘模型的方法，但该方法是否适用于构建葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型还有待实验验证。本部分研究即尝试用腹腔致敏+滴鼻激发的方法构建小鼠哮喘模型，评估建模效果。

2.实验对象及材料

研究对象

1)动物准备

6-8周龄雌性BALB/c小鼠30只(SPF级),体重18～20g，由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

2)分组建模

30只小鼠随机分为模型组、对照组，每组15只。

1)对照组(实验流程如图3a)

①致敏：分别于第1天、第7天和第14天对每只小鼠腹腔注射PBS与氢氧化铝佐剂的混合物300μl(混合比例为1:1)；

②激发：分别于第22天和第23天，对每只小鼠鼻腔滴入PBS 30μl。

2)模型组(实验流程如图3b)

①致敏：分别于第1天、第7天和第14天对每只小鼠腹腔注射葎草花粉蛋白浸液与氢氧化铝佐剂的混合物300μl(混合比例为1:1，其中含有葎草花粉蛋白300μg)②激发：分别于第22天和第23天，对每只小鼠鼻腔滴入葎草花粉蛋白浸液30μl(10μg/μl)。

第24天，对两组小鼠做肺功能检测，第25天，2％戊巴比妥钠麻醉后取材。实验材料

1)标本采集

血清

小鼠用2％戊巴比妥钠(无菌PBS稀释)150μl腹腔注射麻醉后，剪除口周胡须，倒控小鼠，摘除一侧眼球，用1.5ml的EP管收集血液。值得注意的是，模型组的小鼠在倒控取血时，口鼻会流出很多血水，对照组没有异常。4000rpm 4℃离心10Min后，取上层血清装入新的EP管，-80℃冻存备用。

BALF

切开颈部皮肤，分离皮下组织，暴露气管，支气管远心端剪“V”型切口，置气管插管。分别用0.5ml，0.8ml，0.8ml冰浴的PBS行支气管肺泡灌洗，灌洗液注入后停留30s，然后回抽，回收液体量＞80％为合格。收集的液体400g 4℃离心10Min，取上清装入新的EP管，-80℃冻存备用。管底的细胞沉淀用1ml PBS重悬,用做白细胞(WBC)总数及细胞分类计数。

肺脏

抽取BALF后，原位用10ml PBS通过右心室灌注冲洗肺脏血管，冲洗后将各个肺叶分离，置于福尔马林中固定，用于做病理切片。

脾匀浆液

切开小鼠左腹，摘取脾脏，放入研钵，加入5ml RIPA，研磨，待组织基本磨碎后，吸取研磨液，12000g离心10Min,吸取上清液，-80°冻存备用。

2)主要试剂和材料

葎草花粉购自于中国北京新华联协和药业有限公司，内毒素、农药残留、重金属残留厂家检验合格。

3)主要仪器

无创全身体积描记系统 WBP EMKA公司 法国

全自动血液分析仪 ADVIA2120 西门子公司 德国

4)主要试剂的配制

1％的伊红酒精溶液：伊红1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％酒精100毫升溶解。

苏木素染液配方：准备苏木精6g，无水乙醇100ml，硫酸铝钾150g，蒸馏水2000ml，碘酸钠1.2g，冰醋酸120ml，甘油900ml。将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

1％盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70％酒精中。

磷酸缓冲盐溶液(PBS)：NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na₂HP0₄.H₂0 1.56g，KH₂P0₄0.20g，用双蒸水溶解并定容至l 000ml，调pH至7.4，高压灭菌。

PBST溶液：1L PBS溶液加入0.5mlTWEEN20,搅拌均匀。

葎草花粉蛋白浸液的配置：用PBS溶解冻干的葎草花粉蛋白，根据试验需要配成不同浓度。

3.实验方法

1)观察小鼠的一般状态

小鼠一般状态包括小鼠存活情况，呼吸频率、毛发质量、精神状态、活跃程度以及是否伴发过敏性结膜炎等。

2)小鼠肺功能检测

小鼠的肺功能检测使用EMKA公司的无创全身体积描记系统(WBP)进行，主要评价指标是PenH值。

操作按照仪器使用说明进行：小鼠放入观察笼内，待其适应环境3分钟后，分别给予0,3.125mg/ml,6.25mg/ml,12.5mg/ml,25mg/ml,50mg/ml乙酰甲胆碱(Mch)雾化，雾化时间为2分30秒，在每一个浓度的雾化结束且观察笼澄清后，记录3分钟内的PenH值。

3)组织病理学染色观察小鼠肺部炎症浸润情况

HE染色观察小鼠肺部炎症细胞浸润情况。

实验步骤：

取材—固定—脱水—包埋—切片—脱蜡—水洗—HE染色—脱水—透明—封片—镜下观察。

4)统计学方法

数据用表示，采用SPSS 19统计软件进行独立样本t检验。认为P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

4.实验结果

1)小鼠一般状态评估

对照组小鼠致敏和滴鼻后活动、外观均无任何异常反应，正常存活。

模型组小鼠每次致敏后，毛发轻微直立，致敏3天后毛发直立情况消失。每次滴鼻后的30Min内，活动如常，没有典型哮喘症状出现。但第一次滴鼻后24H内，死亡3只，在第二次滴鼻后24H内，死亡7只，滴鼻激发2次，总计10只小鼠死亡。存活的5只小鼠：头部低垂，眼睑水肿，点头呼吸，聚集成簇，活动减少，毛发直立。

2)小鼠肺功能检测：

模型组小鼠一直非常的虚弱，不爱动，对不同浓度Mch的刺激没有明显反应，PenH值在PBS雾化时就高达5.0，随着Mch浓度的增加，PenH值没有明显波动，一直停留在较高的数值。对照组小鼠在检测笼里活动如常，只在雾化Mch50mg/ml的浓度时，出现轻微的躁动，其PenH值随着Mch雾化浓度的升高逐渐增加，最大值为2.0。结果如图4所示。

3)BALF中的WBC总数和细胞分类计数:

对照组的WBC总数是87.4±41.9×10³/ml,模型组的WBC总数是1448±338.6×10³/ml。相比于对照组，模型组的WBC总数显著升高(P＜0.01)。对照组的嗜酸性粒细胞(EOS)数是2±2.49×10³/ml，模型组的EOS数是10±7.1×10³/ml，模型组的EOS增加无显著差异。对照组的中性粒细胞(NEU)数是24±5.5×10³/ml,模型组的NEU数是213±101.2×10³/ml，模型组的NEU数显著增加(P＜0.05)。结果如图5所示。

4)肺组织组织病理学观察

HE染色观察小鼠肺部病理变化

对照组(图6a,6b)小鼠的支气管粘膜上皮及粘膜肌层均完好，支气管管腔规则，气管和血管周围无炎症细胞浸润，肺泡结构完整，肺泡腔正常。模型组小鼠(图6c,6d)肺泡结构不清，肺泡腔内大量广泛的炎症细胞浸润，同时伴有大量红细胞，间质血管严重充血。

5.结论

在本部分的研究中，模型组小鼠，用葎草花粉蛋白连续2次滴鼻激发后，总计约66.7％(10/15)的小鼠死亡。肺功能显示，小鼠气道失去了对Mch刺激的反应能力。和对照组相比，模型组小鼠BALF中白细胞和中性粒细胞数量显著增加，而反映过敏的嗜酸性粒细胞数量没有明显增加。模型组小鼠的肺部病理切片也符合急性肺损伤的特点。因此，滴鼻激发的方式并不适合用来构建本模型,以后的实验计划采用雾化吸入的方式激发。

实施例3比较皮下注射致敏和腹腔注射致敏构建模型的效果

1.目的

皮下注射致敏和腹腔注射致敏都是常用的致敏方式。腹腔注射致敏操作更加简便，但也有研究认为皮下注射致敏可以引起更强的免疫反应。本部分研究的目的，即是通过比较皮下注射致敏和腹腔注射致敏构建模型的效果，确定更适合构建葎草花粉致敏哮喘小鼠模型的致敏方法。

2.实验对象及材料

1)动物准备

6-8周龄雌性BALB/c小鼠40只(SPF级),体重18～20g，由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

2)分组建模

40只小鼠随机分为皮下致敏组(PX-M)，腹腔致敏组(FQ-M)，皮下致敏对照组(PX-D)，腹腔致敏对照组(FQ-D)，每组10只。试验流程如图7。皮下致敏组(PX-M)(如图7a)

①致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，颈后皮下注射葎草花粉蛋白浸液与氢氧化铝佐剂的混合物200μl(混合比例为1:1，其中含有葎草花粉蛋白25μg)。

②激发：第21-27天，雾化吸入1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液，连续7天，每天30Min。

腹腔致敏组(FQ-M)(如图7b)

①致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，腹腔注射葎草花粉蛋白浸液与氢氧化铝佐剂的混合物300μl(混合比例为1:1，其中含有葎草花粉蛋白300μg)。

②激发：第21-27天，雾化吸入1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液，连续7天，每天30Min。

皮下致敏对照组(PX-D)(如图7c)

①致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，颈后皮下注射PBS与氢氧化铝佐剂的混合物200μl(混合比例为1:1)

②激发：第21-27天，雾化吸入PBS，连续7天，每天30Min。

腹腔致敏对照组(FQ-D)(如图7d)

①致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，腹腔注射PBS与氢氧化铝佐剂的混合物300μl(混合比例为1:1)。

激发：第21-27天，雾化吸入PBS，连续7天，每天30Min。

D28天，对所有小鼠做肺功能检测，D29天，2％戊巴比妥钠麻醉后取材。3)主要实验材料和试剂

葎草花粉购自于中国北京新华联协和药业有限公司，内毒素，农药残留，重金属残留厂家检验合格。

3)主要仪器

4)主要试剂的配制

1％的伊红酒精溶液：伊红1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％酒精100毫升溶解。

苏木素染液配方：准备苏木精6g，无水乙醇100ml，硫酸铝钾150g，蒸馏水2000ml，碘酸钠1.2g，冰醋酸120ml，甘油900ml。将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

1％盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70％酒精中。

磷酸缓冲盐溶液(PBS)：NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HP04.H20 1.56g，KH2P040.20g，用双蒸水溶解并定容至l 000ml，调pH至7.4，高压灭菌。

PBST溶液：1L PBS溶液加入0.5mlTWEEN20,搅拌均匀。

碳酸盐缓冲液(PH9.6，ELISA试验包被液)：碳酸钠0.16g，碳酸氢钠0.29g用双蒸水溶解至100mL，用Hcl调至PH9.6。

ELISA用封闭液：5g脱脂奶粉，溶于100ml PBS。

葎草花粉蛋白浸液的配置：用PBS溶解冻干的葎草花粉蛋白，根据试验需要配成不同浓度。

标本固定液(福尔马林)：10ml甲醛，90ml PBS搅拌均匀后室温保存，用于动物组织的固定雪夫氏液：0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤,加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存。

5)标本采集

血清

小鼠用2％戊巴比妥钠(无菌PBS稀释)150μl腹腔注射麻醉后，剪除口周胡须，倒控小鼠，摘除一侧眼球，用1.5ml EP管收集血液。4000rpm，4℃离心10Min，取上层血清装入另外的EP管，-80℃冻存备用。

BALF

切开小鼠颈部皮肤，分离皮下组织，暴露气管，支气管远心端剪“V”型切口，置气管插管。分别用0.5ml，0.8ml，0.8ml冰浴的PBS行支气管肺泡灌洗，灌洗液注入后停留30s，然后回抽，回收液体量＞80％为合格。收集的BALF 400g 4℃离心10Min，取上清装入另外的EP管，-80℃冻存备用。管底的细胞沉淀用1ml PBS重悬,做白细胞总数及细胞分类计数。

肺脏取材

抽取BALF后，原位用10ml PBS通过右心室灌注冲洗肺脏血管，冲洗后将各个肺叶分离，置于标本固定液中固定，用于做病理切片。

脾脏匀浆

切开小鼠左腹，摘取脾脏，放入研钵，加入5ml RIPA，研磨，待组织基本磨碎后，吸取研磨液，12000g离心10Min,吸取上清，-80°冻存。

3.研究方法

1)观察小鼠的一般状态

小鼠一般状态包括小鼠存活情况，呼吸频率、毛发质量、精神状态、活跃程度等。

2)检测小鼠的肺功能，方法同实施例2。

3)用定量ELISA的方法检测小鼠血清中的葎草特异性IgE(sIgE)浓度

实验步骤：

包被：用包被液稀释样品,4℃过夜包被。

对参照孔：100ul/孔，包被纯化的anti-mouse IgE(1μg/ml)

对样品孔：100ul/孔，包被葎草花粉蛋白(500μg/ml)

封闭：PBST洗三次后，每孔加入200ul封闭液，室温孵育2H。

孵育一抗：样品孔每孔加入50ul用封闭液1:5稀释的小鼠血清；参照孔加入50ul从浓度1μg/ml开始，2倍等比稀释的purified mouse IgE，连续稀释7个浓度。4℃过夜孵育。

孵育二抗：PBST洗三次后，每孔添加100ul生物素化的大鼠抗小鼠IgE抗体(1μg/ml)，室温孵育1H。PBST洗三次后，每孔添加100ul，1:1000稀释的SAV-HRP(链霉亲和素)，室温孵育45Min。

显色：PBST洗6次后每孔添加100ul TMB显色液，放置20Min。450nm读板。定量计算：以参照孔的吸光度值做标准曲线，在该标准曲线上，根据样品孔的吸光度值计算其IgE抗体浓度。

4)BALF中的细胞分类计数

用全自动血液分析仪做白细胞分类计数，系统自动读出检测样品中WBC、EOS、NEU、Lymph、Mono、Baso细胞数量和每种细胞所占比例。

5)BALF和脾细胞匀浆液中细胞因子IL-4、IL-13、IL-10、INF-γ的检测

细胞因子的检测使用eBiosciense的ELISA试剂盒，实验参照说明书进行。具体步骤如下：

IL-4检测：

准备工作：

1.浓缩洗涤液(25X)用双蒸水稀释成1X(至750ml)。

2.标准品用2.5ul标准品加5ml标准品稀释液稀释，盖好后静置10分钟以上，反复颠倒以助溶解。得到500pg/ml的高浓度标准品，将其进行倍比稀释，如：250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,0pg/ml。

3.配制1x HRP：取一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

4.配制1x Biotin：取Anti Mouse IL-4Biotin一支加入6ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin在临用前15分钟配制。

试剂盒平衡至室温(20-25℃)，取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1.加入100ul标准品(Standards)、100ul样本于相应反应板孔中。

2.轻轻混匀30秒，封住板孔，25℃温育120分钟。

3.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

4.每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，25℃温育60分钟。

5.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

6.每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，25℃温育30分钟。

7.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

8.每孔加入100ul TMB显色液，轻轻混匀10秒，25℃暗处温育15±10分钟。

9.每孔加入50ul终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。

以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上计算出样品浓度。

IL-13检测：

1.浓缩洗涤液(25X)用双蒸水稀释成1X(至750ml)。

2.标准品用2.5ul标准品加2.5ml标准品稀释液稀释，盖好后静置10分钟以上，反复颠倒以助溶解。得到1000pg/ml的高浓度标准品，将其进行倍比稀释，如：500,250,125,62.5,31.25,15.63,0pg/ml。

3.配制1x HRP：取一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

4.配制1x Biotin：取Anti Mouse IL-13Biotin一支加入6ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin在临用前15分钟配制。

试剂盒应平衡至室温(20-25°)再试验。取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1.加入100ul标准品(Standards)、100ul样本于相应反应板孔中。

2.轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育120分钟。

3.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

4.每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育60分钟。

5.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

6.每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育30分钟。

7.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

8.每孔加入100ul TMB显色液，轻轻混匀10秒，25°暗处温育15-10分钟。

9.每孔加入50ul终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

IL-10检测：

1.浓缩洗涤液(25X)用双蒸水稀释成1X(至750ml)。

2.标准品用2.5ul标准品加2.5ml标准品稀释液稀释，盖好后静置10分钟以上，反复颠倒以助溶解。得到1000pg/ml的高浓度标准品，将其进行倍比稀释，如：500,250,125,62.5,31.25,15.63,0pg/ml。

3.配制1x HRP：取一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

4.配制1x Biotin：取Anti Mouse IL-13Biotin一支加入6ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin在临用前15分钟配制。

试剂盒应平衡至室温(20-25°)再试验。取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1.加入100ul标准品(Standards)、100ul样本于相应反应板孔中。

2.轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育120分钟。

3.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

4.每孔加入100ul 1x Biotin。轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育60分钟。

5.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

6.每孔加入100ul 1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，25°温育30分钟。

7.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

8.每孔加入100ul TMB显色液，轻轻混匀10秒，25°暗处温育15-10分钟。

9.每孔加入50ul终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

IFN-γ检测：

浓缩洗涤液(25X)用双蒸水稀释成1X(至750ml)。

2.取5ul标准品用2.5ml标准品稀释液进行稀释，得到2000pg/ml的高浓度标准品，充分溶解后混匀。将其进行倍比稀释，如，1000，500，250，125，62.5，31.25，0pg/ml。

3.配制1x HRP：取一支HRP加入6ml酶联物稀释液，混匀。1x HRP最好在临用前15分钟配制。

4.配制1x Biotin：取Anti Mouse IFN-γBiotin一支加入6ml Biotin稀释液，混匀。1x Biotin最好在临用前15分钟配制。

操作步骤：

试剂盒应平衡至室温(20-25℃)，取出所需反应板。

临用前15分钟配制工作液

1.加入100ul标准品(Standards)、100ul样本于相应反应板孔中。

2.轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育120分钟。

3.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

4.每孔加入100ul配制好的Anti-mouse IFN-γBiotin，轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育60分钟。

5.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

6.每孔加入100ul配置好的1x HRP。轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育30分钟。

7.洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入300ul洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤3次。

8.每孔加入100ul TMB显色液，轻轻混匀10秒，室温暗处温育15±10分钟。

9.每孔加入50ul终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。

以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

6)组织病理学染色观察小鼠肺部炎症浸润和粘液分泌情况

HE染色观察小鼠肺部炎症细胞浸润

实验步骤：

取材—固定—脱水—包埋—切片—脱蜡—水洗—HE染色—脱水—透明—封片—镜下观察。

HE染色步骤：

烤片80°半小时

1)二甲苯(Ⅰ)5Min

2)二甲苯(Ⅱ)5Min

3)二甲苯(III)5Min

4)100％乙醇(Ⅰ)2Min

5)90％乙醇(Ⅱ)2Min

6)80％乙醇(III)2Min

7)70％乙醇(IV)2Min

8)流水冲洗5Min

9)苏木精液染色5Min

10)流水稍洗去苏木精液1-3s

11)1％盐酸乙醇1-3s

12)流水过洗至返蓝

13)0.5％伊红液染色1-3Min

14)蒸馏水稍洗1-2s

15)80％乙醇稍洗1-2s

16)95％乙醇(Ⅰ)2-3s

17)100％乙醇(Ⅱ)3-5s

18)二甲苯(Ⅰ)2Min

19)二甲苯(Ⅱ)2Min

20)二甲苯(Ⅲ)2Min

21)中性树胶封固，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡。

AB-PAS染色观察小鼠肺部粘液分泌情况

实验步骤：

取材—固定—脱水—包埋—切片—脱蜡—水洗—阿里新蓝溶液染色—水洗—过碘酸氧化—希夫试剂染色—水洗—苏木素核染—分化—水洗—反蓝—水洗—脱水—透明—封片—镜下观察。

AB-PAS染色步骤(Alcian blue-periodic acid sthiff)

1)切片脱蜡至水，

2)在AB染液中染10-50分钟，

3)蒸馏水洗，

4)1％高碘酸水溶液氧化10Min，

5)自来水洗，蒸馏水洗，擦干切片，

6)于schiff氏液中浸染(避光)20Min，

7)用亚硫酸水洗2-3次，

8)流水冲洗5Min，

9)天青石蓝液染3Min，

10)Mayer氏苏木素染3Min。

11)流水冲洗5Min。

12)0.5％桔黄G水溶液等30s。

13)系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

病理切片的判读方法：

对每一张切片切片至少观察3个不同视野。

对气道和血管周围炎症细胞浸润情况的评估，采用5分制评分法进行：0，没有炎症细胞；1，少量细胞；2，单层的细胞环；3，2-4层的细胞环；4，多于4层的细胞环。

对气道黏液分泌情况的评估，采用半定量的方法计数气道上皮中增生的杯状细胞占上皮细胞总数的比例。按5分制评分法进行评分：0，没有杯状细胞；1，＜25％；2，5-50％；3，50-75％；4，＞75％。

7)统计学方法

数据用表示，样本之间均数差异显著性检验采用ANOVA分析，如果有显著性差异，采用LSD(方差齐)和Benferroni(方差不齐)方法进行两两比较。当方差不齐时采用秩和检验，使用SPSS 19统计软件进行数据分析。认为P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

4.研究结果

1)小鼠一般状态评估

腹腔注射致敏组小鼠在每次雾化10Min后，小鼠开始频繁揉搓鼻子，搔抓身体，呼吸急促。雾化结束大约20Min后，小鼠恢复正常。

皮下注射致敏组小鼠雾化激发时的反应与腹腔注射致敏组基本一致。

腹腔注射对照组、皮下注射对照组雾化后无任何异常反应。

2)小鼠肺功能检测：

FQ-D和PX-D小鼠，在检测笼里活动自如，当雾化Mch 25和50mg/ml的浓度时，出现轻微的躁动。FQ-M和PX-M组小鼠在雾化吸入Mch 6.25mg/ml时开始出现呼吸频率增加，躁动不安，抓挠笼壁，随着Mch浓度的进一步升高，小鼠逐渐萎靡，活动减少，流涎、口唇发绀，点头呼吸，腹式呼吸明显。

从PenH的结果看，雾化Mch浓度在6.25mg/ml，12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml时，FQ-M和PX-M组的PenH值都显著高于各自的对照组，PX-M组的PenH值还稍高于FQ-M组，但没有显著差异。如图8

3)葎草花粉特异性IgE(specific IgE)定量检测

FQ-M组小鼠的sIgE的表达量(26±3)ng/ml相比FQ-D组(16±2)ng/ml有轻微升高，但无显著差异(P＞0.05)；PX-M组小鼠血清中LC-sIgE的滴度是(216±39)ng/ml，显著高于PX-D组(18±2)ng/ml(P＜0.01)，同时也显著高于FQ-M组(P＜0.01)。这些说明相较于腹腔致敏，皮下致敏可以诱导小鼠产生更多的的葎草花粉特异性IgE抗体。如图9。

4)BALF中的白细胞总数及分类计数

BALF中白细胞总数及分类计数的结果(如图10)显示：FQ-M和PX-M组小鼠BALF中出现了大量的炎症细胞浸润，WBC、EOS、NEU数量均显著高于各自的对照组(P＜0.01)，说明葎草花粉的致敏和激发诱导出了气道的炎症反应。FQ-M组炎症细胞的总数高于PX-M组，但没有显著差异(P＞0.05),浸润的细胞以NEU为主。PX-M组虽然炎症细胞总数相对FQ-M组稍少，但EOS数量和比例(如图10、图11)都显著高于FQ-M组(P＜0.01)，而气道中大量EOS的浸润正是人类过敏性哮喘的典型特征之一。

5)BALF和脾匀浆液中细胞因子IL-4、IL-13、INF-γ、IL-10的检测

与FQ-D组相比，FQ-M组小鼠的BALF及脾匀浆液中的IL-4表达都有增加，但没有显著差异。BALF中IL-13显著增加(P＜0.01)，但脾匀浆液中IL-13表达仅有少量增加(如图12、13)。可能是这些原因导致了FQ-M组血清中仅出现很少量的sIgE。而PX-M组小鼠BALF及脾匀浆液中的IL-4和IL-13表达量相对于PX-D组都显著增加(P＜0.01)，特别是IL-4的表达相对于FQ-M组也显著增加(P＜0.05，如图12、13)这可能解释为何PX-M组的sIgE量显著高于FQ-M组。而BALF和脾匀浆液中的INF-γ表达量(如图14、图15)，与各自的对照组相比，无论是PX-M组还是FQ-M组都没有显著的变化。IL-10被认为是一种过敏性哮喘发病过程中的保护性细胞因子。在本实验中，FQ-M组和PX-M组小鼠BALF中IL-10的含量相对于各自的对照组都有显著的提高(P＜0.05)。FQ-M组和PX-M组之间表达没有差异。在脾匀浆液中，FQ-M组和PX-M组小鼠的IL-10的含量相对于各自的对照组也有提高，但差异不显著(P＞0.05)，如图16。

6)组织病理学改变

HE染色观察小鼠肺部炎症细胞浸润

HE染色后镜下可见FQ-D和PX-D组小鼠肺部均无明显炎症反应(如图17a、17b,图19a、19b)。FQ-M和PX-M组小鼠肺部气管和血管周都有大量炎症细胞浸润(如图18a、18b、图20a、20b)，FQ-M组相比于PX-M组，浸润的炎症细胞数量更多。但PX-M组有更严重的气道壁水肿、增厚和气道破坏。

AB-PAS染色观察小鼠气道粘液分泌情况

AB-PAS染色后，FQ-D和PX-D组小鼠肺泡和支气管管腔内未见明显粘液分泌(如图21a、21b,图23a、23b)。FQ-M组气道壁有部分细胞染成蓝紫色(如图22a、22b)，说明气道内粘液分泌增加。PX-M组气道壁大量细胞呈蓝紫色，(如图24a、24b)，说明气道中有大量杯状细胞，粘液分泌过度。

小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和黏液分泌评分

结果所示：PX-M和FQ-M组的炎症细胞浸润及杯状细胞增生数均显著高于各自的对照组(P＜0.01)，PX-M组的炎症细胞浸润数少于FQ-M组，而杯状细胞数多于FQ-M组，但都没有显著差异，如图25。

5.实验结论

过敏性哮喘小鼠模型的构建主要包括两个部分：致敏和激发。通过实施例2部分的研究，已经确定了雾化激发更适合做为本模型的激发方式。而常用的致敏方式有：皮下注射、腹腔注射、气道直接接触等。同一种过敏原不同的致敏途径会引起程度甚至种类不同的免疫反应。在本部分研究中，比较了腹腔注射致敏和皮下注射致敏建立模型的效果。结果显示：相比于腹腔致敏，皮下致敏组小鼠血清中的葎草特异性IgE的表达量更高，脾匀浆液、BALF中TH2类细胞因子(IL-4、IL-13)表达量更高；BALF中嗜酸性粒细胞的数量和比例更高，AB-PAS染色中，气道中有更多的粘液分泌，小鼠肺功能显示有更高的气道高反应性。这些特点符合人类过敏性哮喘的典型特征。因此，皮下注射致敏的方式更适合用来构建葎草花粉致敏小鼠哮喘模型。

Claims (5)

1.一种葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，其特征在于，包括步骤：

(1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对BALB/c小鼠颈后皮下注射200μl葎草花粉致敏液；

(2)激发：给小鼠雾化吸入1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液，连续7天，每天30min。

2.根据权利要求1所述的葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，小鼠皮下注射前，对小鼠的麻醉采用吸入异氟烷的方式。

3.根据权利要求1所述的葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，葎草花粉致敏液的配制方法是：取500μg冻干的葎草花粉蛋白,1:1加入氢氧化铝佐剂及PBS，乳化至4ml。

4.根据权利要求1所述的葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，雾化激发时所用的1μg/μl的葎草花粉蛋白浸液配置方法是：用PBS溶解冻干的葎草花粉蛋白，比例为：1000ml PBS溶解1g冻干的葎草花粉蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的葎草花粉致敏的小鼠哮喘模型的构建方法，其特征在于，所述冻干的葎草花粉蛋白由下述方法制备：

(1)称取40g葎草花粉，加入800ml的丙酮于4℃搅拌24h；

(2)风干：弃丙酮，花粉置于通风橱内过夜，让残余丙酮挥发；

(3)提取：加入800ml去离子水，4℃搅拌24h；

(4)离心：10000转/分，4℃离心15min；

(5)过滤：0.2μm滤膜负压过滤；

(6)透析：滤液装入3.5kd透析袋，加入去离子水3L，4℃下搅拌24h，期间换水6次；

(7)分装：透析后的提取液分装于10ml西林瓶中，每瓶2ml，置于-80℃冰箱过夜；

(8)冻干：将西林瓶从-80℃冰箱取出迅速置于冻干机中冻干。