CN109966282B - 去乙酰佛司可林在制备预防和治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用 - Google Patents

去乙酰佛司可林在制备预防和治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种化学物质‑‑去乙酰佛司可林(DFSK)作为AC8亚型酶的激动剂，在预防和治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的药物或保健品中的用途。DFSK是从药用植物毛喉鞘蕊花中分离到的二萜类化合物，具有较好的成药性质以及较强的激动AC8亚型酶活性。DFSK灌胃给药后可明显改善弹性蛋白酶、香烟烟雾联合脂多糖等诱导大鼠COPD模型的肺功能指标(FEV0.3/FVC等)，显著改善大鼠COPD模型肺组织病理损伤，抑制COPD大鼠血清中多种炎症因子水平。实验结果证明DFSK具有作为预防和治疗COPD的药物新用途。

Description

去乙酰佛司可林在制备预防和治疗慢性阻塞性肺病药物中的 应用
技术领域
本发明属于肺部疾病的治疗药物领域，尤其涉及一种二萜类化合物--去乙酰佛司可林在制备预防和治疗慢性阻塞性肺病药物或保健品中的应用。
背景技术
慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是呼吸系统最常见的疾病之一，其临床表现为持续性呼吸系统症状(呼吸困难、咳嗽、咳痰等)及气流受限(肺功能指标FEV1/FVC<0.7)。COPD主要的致病因素包括长期暴露于香烟烟雾、空气污染等有害气体或颗粒、宿主遗传异常等，其病理特征为全身系统性及肺部局部性的慢性炎症反应，炎症反应破坏肺泡，导致气道和血管重塑等。目前COPD被列为全球第四大死亡原因(每年的死亡人数超过300 万)，其发病率和死亡率逐年攀升，因此研发预防和治疗此类疾病的新药具有重要意义。
去乙酰佛司可林(deacetylforskolin，DFSK)是从药用植物毛喉鞘蕊花 (Coleusforskolin)中提取分离得到的二萜类化合物，其结构式如下式所示：
Figure BDA0002001706550000011
DFSK为佛司可林(FSK)的衍生物，体外实验研究证明其具有激动腺苷酸环化酶(AC)的作用(Yang WM,et al.Chin Ophthal Res.2001,19(1):1-4.)。异佛司可林(ISOF)也是FSK的衍生物，尽管已有研究报道ISOF具有预防和治疗 COPD的药理作用(专利公开号CN103860543B)，但DFSK与ISOF的化学结构不同，理化性质有明显差异。目前，尚未见文献报道DFSK具有预防和治疗COPD 的功效及其在治疗COPD药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二萜类化合物去乙酰佛司可林(DFSK)在制备 AC8亚型酶的激动剂，特别是预防和治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的药物或保健品中的应用。所述药物包括去乙酰佛司可林以及药学上可接受的载体。可以为口服剂、注射剂或吸入剂。
本发明测定了DFSK的理化性质、比较了DFSK和ISOF激动AC8的活性，并在弹性蛋白酶(PPE)、香烟烟雾吸入联合脂多糖(CS-LPS)诱导大鼠COPD 两种动物模型上，通过口服灌胃给药DFSK进行实验研究，证明DFSK对PPE 及CS-LPS诱导的COPD具有明显的预防和治疗作用。
在不同pH的溶液中，DFSK具有良好的平衡溶解度，且DFSK的脂水分配系数较为理想，表明DFSK具有较好的成药性质。此外，在特异表达AC8亚型酶的细胞株上，DFSK激动AC8的活性是ISOF的2倍。
在PPE(25U/100g，气管滴入)诱导的大鼠COPD模型上，与模型组比较，DFSK(4、8mg/kg)组FEV0.3/FVC显著升高(P<0.001)，提示DFSK能在一定程度升高肺损伤大鼠通气指标，改善大鼠的肺功能。
在CS-LPS诱导的大鼠COPD模型上，与模型组比较，DFSK(2、4mg/kg) 组肺组织损伤病变程度明显减轻，肺泡壁破裂减少，肺气肿程度减轻，平均肺泡面积(MAA)减少、平均肺泡数(MAN)增多；清醒动物肺功能检测结果显示， DFSK(2、4mg/kg)组大鼠的PIF、PEF、MV、EF50显著升高(P<0.05)；麻醉动物肺功能检测结果显示，DFSK(2、4mg/kg)组大鼠的Ers、H、FEV0.3、 FEV0.3/FVC均显著升高(P<0.05)；血清炎症因子水平检测结果显示，DFSK(2 mg/kg)组大鼠血清IL-17、M-CSF、MIP-3α水平显著降低(P<0.05)。结果表明 DFSK可明显改善CS-LPS诱导的COPD大鼠模型的肺组织病理损伤及肺功能，抑制COPD大鼠血清中多种炎症因子水平。
本发明通过比较DFSK和ISOF理化性质的差异，发现DFSK具有较好的成药性质，且其对AC8亚型酶的激活活性是ISOF的2倍；体内实验证明DFSK 对弹性蛋白酶、香烟烟雾联合脂多糖诱导的大鼠COPD模型具有很好的干预作用，可用于制备预防和治疗COPD的药物及保健品。
附图说明
图1：本发明实施例4中DFSK对PPE诱导大鼠COPD模型FEV0.3/FVC的影响。组间比较采用单因素方差分析(One Way Analysis of Variance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。
图2：本发明实施例5中DFSK对CS-LPS诱导的大鼠COPD模型肺组织形态结构的影响。A：正常组(control)、B：模型组(model)、C：ROFL 1mg/kg组、 D：ROFL 2mg/kg组、E：DFSK2mg/kg组、F：DFSK 4mg/kg组。肺组织在 40倍镜下观察得到。
图3：本发明实施例5中DFSK对CS-LPS诱导的大鼠COPD模型清醒动物肺功能指标(PIF、PEF、MV、EF50)的影响。组间比较采用单因素方差分析(One Way Analysis ofVariance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05。
图4：本发明实施例5中DFSK对CS-LPS诱导的大鼠COPD模型麻醉动物肺功能指标(Ers、H、FEV0.3、FEV0.3/FVC)的影响。组间比较采用单因素方差分析 (One Way Analysis ofVariance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。
图5：本发明实施例5中DFSK对CS-LPS诱导的大鼠COPD模型血清炎症因子水平(IL-17、M-CSF、MIP-3α)的影响。组间比较采用单因素方差分析(One Way Analysis ofVariance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细的说明。但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
实施例1DFSK的制备
DFSK的制备参考文献中毛喉鞘蕊花化学成分的提取分离方法进行(汪亚勤. 毛喉鞘蕊花的化学成分及其提取物的含量测定[D].复旦大学，2009.)。
(1)取10kg滇产毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)干品，在室温下用50升 95％乙醇(ethanol)提取3次，提取液经减压浓缩得到乙醇提取物，提取物加入少量水拌匀后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩后，得到各自的提取物。
(2)取乙酸乙酯提取物上硅胶柱，用递增比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，以薄层层析TLC监测洗脱结果，得到有效部位CF-E。有效部位CF-E再经过反复硅胶柱层析、RP-C18柱层析、凝胶柱层析、重结晶纯化，可以获得毛喉鞘蕊花的纯粹的单体成分DFSK。
(3)将DFSK加入淀粉或相应的辅料，混匀后制粒，压制成片剂或胶囊等口服制剂，或者加入其他辅料制成口服液、喷雾气雾剂、贴膏剂等，或者加入注射溶媒及其他辅料等制成注射剂。
实施例2DFSK的理化性质
1、实验方法
脂水分配系数的测定：精密称取DFSK适量溶于水饱和的正辛醇，配成质量浓度为10mg/mL的溶液。取该溶液1mL于4mL具塞试管中，分别加入水以及 pH值为3.5、5.5和6.5的磷酸盐缓冲液1mL，25℃恒温振荡72h，12000r/min 离心10min，取水相20μL注入色谱仪，记录峰面积，计算脂水分配系数LogP。
平衡溶解度的测定：称取过量的DFSK，置10mL具塞试管中，加入5mL 的去离子水，0.1mol/L盐酸溶液和pH值为2.7、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的磷酸盐缓冲液，置25℃条件下振荡24小时，12000r/min离心10min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液20μL注入色谱仪，测定峰面积，计算浓度。
2、实验结果
如表1所示，在水以及pH＝3.5、5.5、6.5的磷酸缓冲液中，DFSK的脂水分配系数范围为2.28～2.31。一般认为药物的LogP7.4在1～3范围内有较好的胃肠道吸收(LipinskiCA.J Pharmacol Tox Met.2000,44(1):235-249.)，因此DFSK的脂水分配系数较为理想。
如表2所示，在不同pH的溶液中，DFSK的平衡溶解度范围为535.58～786.19 μg/mL。结果表明，DFSK具有良好的平衡溶解度。
表1 DFSK的脂水分配系数
Figure BDA0002001706550000041
Figure BDA0002001706550000051
表2 DFSK在不同溶剂中溶解度
Figure BDA0002001706550000052
实施例3DFSK激动AC8的活性
1、实验方法
微滴式数字PCR检测：配制20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡的样品孔中，再加入70μL微滴发生油至oil孔中，利用QX200TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴；将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔，用铝膜热封后，于PCR仪(Bio-Rad T100)上进行扩增。将PCR 扩增后的96孔板放入QX200TM微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，采用 QuantaSoft软件处理数据。
AC8亚型酶活性检测：采用课题组前期构建的人胚肾细胞(HEK-293)AC8 基因稳定表达细胞株和对照稳转株实验，并按LANCE Ultra cAMP Assay试剂盒说明书操作。用stimulation buffer调整细胞密度，并配制系列浓度梯度的DFSK 和ISOF溶液。取10μL重悬细胞和药物于Topsealtm-A-96板中(20μL体系)，孵育30min；分别加入10μL Eu-cAMPtracer和10μL ULight-anti-cAMP，孵育 60min，TR-FRET酶标仪检测615nm和665nm处吸光度值。
2、实验结果
文献报道，AC8在肺组织中的表达较高(Defer N,et al.Am J Physiol RenalPhysiol.2000,279(3):F400-16.)。本发明采用数字PCR技术验证了AC8在人外周血PBMC中的表达(相对GAPDH的拷贝数为0.012±0.006)。并在特异表达AC8 亚型酶的细胞株上，比较检测了DFSK和ISOF激动AC8的活性。结果显示， DFSK和ISOF均可浓度依赖的激动AC8，其EC50分别为0.992±0.023μM和 1.816±0.048μM，表明DFSK激动AC8的活性约为ISOF的2倍(表3)。
表3 DFSK和ISOF对AC8的激活活性
Figure BDA0002001706550000061
实施例4在PPE诱导大鼠COPD模型上，DFSK对COPD预防和治疗作用的实验研究
1、实验方法
实验分为正常对照组、模型对照组、氢化可的松(HC，8mg/kg)阳性对照组、罗氟司特(ROFL，2mg/kg)阳性对照组、DFSK(4、8mg/kg)组(n＝7～14)。除正常组和模型组灌胃等体积混合溶媒，其余各组分别灌胃相应受试药物，于灌胃第四天采用气管滴入PPE诱导大鼠COPD模型。
PPE造模方法：用10％水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位，对大鼠进行气管插管术，然后用可调节容量移液器直接向大鼠肺部注入弹性蛋白酶25U/100g。PPE造模后连续灌胃给药7d，7d后采用麻醉动物肺功能仪检测动物肺功能。
2、实验结果
麻醉动物肺功能的检测结果如表4和图1所示。与正常组相比，模型组的 FEV0.3/FVC显著减小(P<0.001)；与模型组相比，各给药组FEV0.3/FVC均明显升高，其中HC 8mg/kg组(P<0.001)、ROFL 2mg/kg(P<0.01)、DFSK 4mg/kg 组(P<0.001)、DFSK 8mg/kg组(P<0.001)。结果表明：在PPE(25U/100g，气管滴入)诱导COPD大鼠模型上，大鼠的肺功能通气指标下降，而DFSK(4、8 mg/kg，ig)能在一定程度升高肺损伤大鼠通气指标，改善大鼠的肺功能。
表4.DFSK对PPE诱导大鼠COPD模型FEV0.3/FVC的影响(Mean±SEM)
Figure BDA0002001706550000071
FEV0.3/FVC：0.3s用力呼气量与用力肺活量的百分比。组间比较采用单因素方差分析(One Way Analysis of Variance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。
实施例5在CS-LPS诱导大鼠COPD模型上，DFSK对COPD预防和治疗作用的实验研究
1、实验方法
(1)COPD动物模型的建立
采用CS-LPS(100μg/kg)连续诱导三个月建立大鼠COPD模型。除正常组给予空气暴露及采用生理盐水雾化外，其余各组均分别进行CS暴露(1支烟/ 只大鼠/天)，并从CS暴露第5周开始每周1次按100μg/kg给予相应体积的LPS 雾化诱导(共4次，4周)，同时进行CS暴露至第13周完成造模。从CS暴露第5周开始给药，正常组和模型组每天灌胃等体积混合溶媒，罗氟司特(ROFL， 1、2mg/kg)阳性对照组、DFSK 2mg/kg组、DFSK 4mg/kg组按照每组剂量分别灌胃相应的药物，连续灌胃给药9周，直至第13周结束。
其中CS暴露的方法如下：采用北京慧荣和生物科技有限公司大小鼠口鼻暴露系统，新建烟雾暴露模式，设定暴露染毒的相关参数，为保证暴露染毒过程中系统轻微负压，抽气流量一般设置要比气溶胶流量与稀释流量总和多1.5L/min。分别设定气溶胶流量(0L/min)，稀释流量为(5L/min)，抽气流量为(6.5L/min)，暴露期间氧浓度控制为(20.5±0.5)％，空气湿度控制为(80±5)％。使用SM-120 单通道智能点烟机依次点燃卷烟(1支烟/只大鼠/天)，卷烟抽吸参数按照国际标准参数设置：抽吸时间2s，时间间隔2s，抽吸频次10s，抽吸流量35mL。除正常组暴露空气外，模型组及其各给药组给予烟雾暴露，大鼠烟气染毒口鼻暴露连续12周，每天一次，每次每组1h。
(2)清醒动物肺功能评价
从第五周开始应用Emka清醒式肺功能检测系统检测大鼠肺功能，之后连续每周测定一次。运用Emka清醒式肺功能检测系统新建检测四只大鼠肺功能的模式，然后加载命名之后校正腔体，再对应动物编号分别放入动物，待动物在腔体内平静5-10min后，检测大鼠的最大吸气量(PIF)、最大呼气量(PEF)、每分钟通气量(MV)、50％的呼气流速(EF50)等肺功能指标，数据由软件自动导出用于分析处理。
(3)麻醉动物肺功能测定
十三周后将350g体重以下大鼠与flexiVent FX4震荡式动物肺功能检测仪连接，350g以上体重大鼠与flexiVent FX5震荡式动物肺功能检测仪连接，用10％水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位，将大鼠固定在实验台上，用手术剪将大鼠颈部毛剪去一部分，再用75％乙醇消毒颈部区皮肤，剪开颈部皮肤，钝性分离颈部组织，充分暴露气管，用手术线环穿气管后在气管软组织之间做一个倒“T”型切口，在切口处往气管内插入不锈钢气管针，将手术线扎紧带有不锈钢气管针的气管，腹腔注射肌松剂维库溴铵(6mg/kg)，等待3分钟左右，待药效发挥，然后选择flexiWare软件检测大鼠的呼吸系统弹性(Ers)、组织弹性(H)、0.3秒用力呼气量(FEV0.3)、FEV0.3/FVC等肺功能指标，由flexiWare 软件自动导出数据用于分析处理。
(4)肺病理组织学分析
肺功能检测结束后处死大鼠，取大鼠左肺组织放入4％多聚甲醛溶液中固定 24小时以上；脱水透明：用由低浓度到高浓度的酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精；浸蜡包埋：将已透明的组织块放入已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，包埋后方可进行切片、烤片操作。HE染色制片：切片经环保脱蜡液脱蜡，酒精(浓度由高到低：100％、95％、75％)洗净环保脱蜡液至流水冲洗，然后过苏木素3-5分钟，流水冲洗后入1％的盐酸酒精分化后水洗(洗掉多余未与细胞核结合的苏木素)，1％氨水返蓝后水洗，放入伊红染色 10～20秒，流水冲洗后放入酒精脱水(浓度由低到高：75％、95％、100％)，吹干后放入环保脱蜡液中透明，最后用中性树脂封片。显微镜下观察病理组织学变化。选取左肺切片在40倍镜下的视野用OLYMPUS-BX51病理图像采集系统采集图片，用Image-Pro Plus 17.0图像分析软件处理。
(5)血清炎症因子水平检测
测定完动物肺功能后，打开腹腔暴露出腹主动脉，用一次性定量真空采血管 (无抗凝剂)采血，室温放置30min以上，离心(1000g，10min)后取动物血清保存于-80℃冰箱。血清炎症因子水平检测采用Bio-Plex 200悬液芯片系统，按照大鼠多因子检测试剂盒(Bio-Plex ProTM Rat Cytokine Group I Panel)说明书操作。
2、实验结果
(1)DFSK对CS-LPS诱导COPD大鼠肺组织病理形态学的影响
结果如图2所示。肺组织显微镜观察：正常组大鼠肺组织结构完整、清晰，肺泡壁完整，无肺大泡等形成；模型组大鼠肺组织结构破损，肺泡壁断裂，有肺大泡形成，肺气肿明显，且气管、支气管环内有炎性细胞、淋巴细胞浸润；ROFL 和DFSK各剂量组大鼠肺组织损伤病变程度明显减轻，肺泡壁破裂减少，肺气肿程度减轻。用Image-Pro Plus 17.0图像分析软件处理照片，计算平均肺泡面积 (MAA)及平均肺泡数(MAN)。与正常组比较，模型组大鼠肺组织的MAA增大、MAN减少，提示CS-LPS诱导的COPD大鼠肺组织明显损伤；与模型组比较，给药组ROFL、DFSK大鼠肺组织的MAA减少、MAN增多。结果表明DFSK 对CS-LPS诱导的大鼠COPD模型肺组织病理损害有一定的改善作用。
(2)DFSK对CS-LPS诱导COPD大鼠清醒动物肺功能的影响
结果如图3所示。与正常组比较，从第九周到第十三周，模型组CS-LPS诱导的COPD大鼠的最大吸气量(PIF)、最大呼气量(PEF)、每分钟通气量(MV)、 50％的呼气流速(EF50)显著下降(P<0.05)，提示CS-LPS诱导的COPD大鼠从第九周开始出现通气障碍。与模型组比较，ROFL(1、2mg/kg)组大鼠的PIF、 PEF、MV、EF50均有升高的趋势；DFSK(2、4mg/kg)给药组大鼠的PIF、PEF、 MV、EF50在第十、十二和十三周显著升高(P<0.05)。
结果提示一定剂量的DFSK能提高COPD大鼠的PIF、PEF、MV、EF50，表明DFSK对CS-LPS诱导的COPD大鼠肺功能有一定的保护作用。
(3)DFSK对CS-LPS诱导COPD大鼠麻醉动物肺功能的影响
结果如图4及表5所示。与正常组比较，CS-LPS诱导的COPD大鼠呼吸系统弹性(Ers)下降(P<0.05)、肺功能组织弹性指标(H)显著下降(P<0.05)、 0.3秒用力呼气量(FEV0.3)显著降低(P<0.05)、0.3秒用力呼气流量占用力肺活量的百分比值(FEV0.3/FVC)明显降低(P<0.05)，提示CS-LPS诱导的COPD 大鼠模型基本形成。
与模型组比较，ROFL(1、2mg/kg)组大鼠的Ers有升高趋势，H、FEV0.3、 FEV0.3/FVC显著升高(P<0.05)；DFSK(2、4mg/kg)组大鼠的Ers、H、FEV0.3、 FEV0.3/FVC均显著升高(P<0.05)，结果表明DFSK(2、4mg/kg)可明显改善 CS-LPS诱导的COPD大鼠模型的肺功能。
表5.DFSK对CS-LPS诱导的COPD大鼠Ers、H、FEV0.3、FEV0.3/FVC的影响(Mean±SEM)
Figure BDA0002001706550000101
Ers：呼吸系统弹性；H：组织弹性；FEV0.3：0.3秒用力呼气量；FEV0.3/FVC：0.3秒用力呼气流量占用力肺活量的百分比值。组间比较采用单因素方差分析(One Way Analysis ofVariance)，P<0.05差异有统计学意义。与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。
(4)DFSK对CS-LPS诱导COPD大鼠血清炎症因子水平的影响
结果如图5所示。与正常组比较，CS-LPS诱导的COPD大鼠血清IL-17、 M-CSF、MIP-3α显著升高(P<0.01)，提示CS-LPS诱导的COPD大鼠血清炎症因子水平提高。与模型组比较，ROFL(1mg/kg)组大鼠血清M-CSF、MIP-3α显著下降(P<0.05)，IL-17有下降趋势；DFSK(2mg/kg)组IL-17、M-CSF、 MIP-3α均显著下降(P<0.05)，表明DFSK可抑制COPD大鼠多种炎症因子水平。

Claims (4)

1.去乙酰佛司可林在制备慢性阻塞性肺病预防和治疗药物中的应用，所述去乙酰佛司可林的结构如下所示：
Figure 391243DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求 1所述的应用，其特征在于所述去乙酰佛司可林具有AC8亚型酶激动剂的作用。
3.如权利要求 1 所述的应用，其特征在于所述药物包括去乙酰佛司可林以及药学上可接受的载体。
4.如权利要求 1所述的应用， 其特征在于所述药物为口服剂、注射剂或吸入剂。
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