CN111991442A - 一种辛鹅挥发油微乳制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种辛鹅挥发油微乳制剂及其制备方法和用途,属于中药制剂技术领域。该辛鹅挥发油微乳制剂是以辛夷挥发油和鹅不食草挥发油为活性成分,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的微乳制剂。辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合使用可以有效治疗过敏性鼻炎。其中,当辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1、14:1时发挥了协同增效作用,体积比为7:1时治疗效果最佳。辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合可用于制备治疗过敏性鼻炎的药物。辛鹅挥发油制备而成的微乳制剂外观均一,澄清透明、粒径适宜、性质稳定,符合微乳制剂的要求,且体外渗透吸收效果较好,同时治疗效果良好,对黏膜刺激性较小且损伤可逆,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂技术领域,具体涉及一种辛鹅挥发油微乳制剂及其制备方法和用途。
背景技术
鼻炎即鼻腔炎性疾病,是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜的炎症。鼻炎的主要病理改变是鼻腔黏膜充血、肿胀、渗出、增生、萎缩或坏死等。鼻炎的发病机理主要有如下几个方法:(1)病毒感染或在病毒感染的基础上继发细菌感染;(2)遗传因素;(3)鼻粘膜易感性;(4)抗原物质。
我国鼻炎患者众多,尤其在南方地区更为突出,但治愈效果大多不理想,且容易复发,使患者备受其扰。糖皮质激素类药物(如氟替卡松、曲安奈德等)具有抗炎、抗过敏、抗水肿等作用,在临床上一直广为应用,但也伴随较为明显的不良反应,常表现为皮肤过敏、鼻干燥、鼻出血等。而同为一线用药的抗组胺类药物(如西替利嗪、氯雷他定等)则在外周和中枢神经系统以及消化系统方面表现出不良反应,如嗜睡、头昏、腹痛、口干等。这些不良反应限制了这些药物在临床上的使用。
中医治疗鼻炎有许多宝贵的经验。辛夷和鹅不食草均有发散风寒、通鼻窍之功效,都是可用于治疗鼻炎的中药材,将辛夷与鹅不食草两药联用有望治疗鼻炎。鼻通宁滴剂载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第六册,是鹅不食草和辛夷经过水蒸气蒸馏提取芳香水而制成的,具有通利鼻窍的作用,用于鼻塞不通,急慢性鼻窦炎、过敏性鼻炎、伤风感冒。研究表明鹅不食草和辛夷混提后得到的挥发油可用于治疗风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊等。
但是,辛夷和鹅不食草挥发油属于脂溶性成分,其普通制剂存在吸收较差、生物利用度低的问题。为了更好发挥辛夷和鹅不食草挥发油的功效,需要寻找一种新的制剂。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种辛鹅挥发油微乳制剂及其制备方法和用途。
本发明提供了一种辛鹅挥发油微乳制剂,它是以辛夷挥发油和鹅不食草挥发油为活性成分,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的微乳制剂。
进一步地,前述的辛鹅挥发油微乳制剂是由如下质量百分比的原辅料制备而成:
辛鹅混合挥发油1~20%,乳化剂5~50%,助乳化剂1~30%,油相0.2~5%,其余为水;
其中,辛鹅混合挥发油由辛夷挥发油和鹅不食草挥发油组成;所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为(1~28):(1~28);
优选地,所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为(7~14):(1~2);
更优选地,所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为7:1。
进一步地,前述的辛鹅挥发油微乳制剂是由如下质量百分比的原辅料制备而成:
辛鹅混合挥发油1.6%,乳化剂40%,助乳化剂20%,油相1.6%,其余为水;
其中,辛鹅混合挥发油由辛夷挥发油和鹅不食草挥发油组成;所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为7:1。
进一步地,所述辛夷挥发油的制备方法包括如下步骤:称取辛夷药材,加水蒸馏提取,冷凝后油水分离,即得;
优选地,所述辛夷挥发油的制备方法包括如下步骤:称取辛夷药材粉碎,加8~10倍量的水蒸馏提取4~8小时,冷凝后油水分离,即得。
进一步地,所述鹅不食草挥发油的制备方法包括如下步骤:称取鹅不食草药材,加水蒸馏提取,冷凝后油水分离,即得;
优选地,所述鹅不食草挥发油的制备方法包括如下步骤:称取鹅不食草药材粉碎,加8~10倍量的水蒸馏提取6~8小时,冷凝后油水分离,即得。
进一步地,所述乳化剂选自吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、蓖麻油聚氧乙烯醚或吐温20;
和/或,所述助乳化剂选自无水乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇或聚乙二烯400;
和/或,所述油相选自肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或油酸。
进一步地,
所述乳化剂选自吐温80;
和/或,所述助乳化剂选自聚乙二烯400;
和/或,所述油相选择肉豆蔻酸异丙酯。
本发明还提供了一种制备前述的辛鹅挥发油微乳制剂的方法,它包括如下步骤:将辛夷挥发油、鹅不食草挥发油混合后,加入油相,再加入乳化剂及助乳化剂,搅拌均匀后加入水,分散均匀即可;
优选地,所述加入水的温度为20~40℃,搅拌速度为30~100转/分钟;
更优选地,所述加入水的温度为25℃,搅拌速度为40~60转/分钟。
本发明还提供了一种前述的辛鹅挥发油微乳制剂在制备抗炎的药物中的用途。
进一步地,所述药物为治疗鼻炎的药物;
优选地,所述药物为治疗过敏性鼻炎的药物。
辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合使用可以改善过敏性鼻炎症状,有效治疗过敏性鼻炎。其中,当辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1、14:1时发挥了协同增效作用,辛夷挥发油与鹅不食草挥发油体积比为7:1时治疗效果最佳。辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合可用于制备治疗过敏性鼻炎的药物。而将辛鹅挥发油制备成微乳制剂后,该微乳制剂外观均一,澄清透明、粒径适宜、性质稳定,符合微乳制剂的要求,且体外渗透吸收效果较好,同时治疗效果良好,对黏膜刺激性较小且损伤可逆,具有良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为各组大鼠挠鼻次数、喷嚏次数(n=8);图中,#表示与对照组相比,P<0.05;###表示与对照组相比,P<0.001;*表示与模型组相比,P<0.05;***表示与模型组相比,P<0.001;&表示与阳性对照组相比,P<0.05;&&&表示与阳性对照组相比,P<0.001。
图2为各组大鼠鼻黏膜组织病理切片。
图3为不同药物比例对模型大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-4、HIS、IgE含量的影响(n=8);图中,#表示与对照组比较,P<0.05;###表示与对照组比较,P<0.001;*表示与模型组比较,P<0.05;***表示与模型组比较,P<0.001;&表示与阳性对照组比较,P<0.05;&&&表示与阳性对照组比较,P<0.001。
图9为辛鹅挥发油微乳制剂的透射电镜图。
图10为微乳粒径分布图。
图11为微乳的Zeta电位分布图。
图12为桉叶油醇标准曲线。
图14为各组大鼠鼻黏膜组织病理学分析结果。
图15为大鼠血清中的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量。
图16为大鼠鼻腔灌洗液中的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量。
图17为大鼠鼻黏膜组织中IL-17A、COX2、Traf6的表达量。
图19为大鼠鼻黏膜组织中炎症相关蛋白条带图(n=3):A为大鼠鼻黏膜组织中炎症相关蛋白IL-17A、Traf6、COX2、NF-kB p65;B为大鼠鼻黏膜组织分别提取核蛋白和浆蛋白中NF-kB p65的表达量。
图20为大鼠鼻黏膜组织病理切片。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。本发明所用试剂均为AR级。
本发明中,辛夷经由陕西中医药大学药学院胡本祥教授鉴定为木兰科植物玉兰Magnolia denudate Desr.的干燥花蕾。
鹅不食草经由陕西中医药大学药学院胡本祥教授鉴定为菊科植物鹅不食草Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.的干燥全草。
挥发油的化学成分组及含量检测
取挥发油10μl,置于10mL棕色容量瓶中,无水乙醚定容,加适量无水硫酸钠除水,注射器吸取1mL溶液过0.22μm的滤膜,弃去初滤液,取续滤液置于进样瓶,备用。
采用GC-MS测定挥发油的化学成分组及含量。GC-MS测定条件、梯度程序升温见表1和表2。
表1.GC-MS测定条件
表2.梯度升温程序
采集GC-MS图谱,通过标准NIST17库检索及Database数据库,利用面积归一化法对挥发油成分及含量进行鉴定分析。
实施例1、辛夷挥发油的制备
称取100g辛夷药材粉碎成粗粉,至于水蒸汽蒸馏装置中,加10倍量的水,再加热蒸馏,提取4小时,经冷凝后滴入油水分离器中,得辛夷挥发油。
采用GC-MS测定辛夷挥发油的化学成分组及含量。分析结果表明从辛夷挥发油中共分离出44个化学成分,鉴定出42个,鉴定成分中桉叶油醇、杜松萜烯、大根香叶烯D的含量较高,分别占17.45%、6.62%、6.40%。
实施例2、鹅不食草挥发油的制备
称取100g鹅不食草药材粉碎过10目筛得粉末,至于水蒸汽蒸馏装置中,加8倍量的水,再加热蒸馏,提取6小时,经冷凝后滴入油水分离器中,得鹅不食草挥发油。
采用GC-MS测定鹅不食草挥发油的化学成分组及含量。分析结果发现从鹅不食草挥发油中共分离出54个化学成分,鉴定出48个,其成分中反式乙酸菊烯酯、麝香草酚、香芹酚的含量较高,分别占28.06%、11.48%、10.20%。
实施例3、本发明辛鹅挥发油微乳制剂的制备
辛鹅挥发油微乳制剂的处方:辛鹅混合挥发油的质量百分比为1.6%,该辛鹅混合挥发油由实施例1和实施例2提取的辛夷挥发油和鹅不食草挥发油按照体积比7:1混合而得;乳化剂(吐温80,Tween-80)的质量百分比为40%,助乳化剂(聚乙二醇-400)的质量百分比为20%,油相(肉豆蔻酸异丙酯,IPM)的质量百分比为1.6%,余量为水。
辛鹅挥发油微乳制剂的制备方法:将辛夷挥发油和鹅不食草挥发油混合,混合后加入油相IPM,再分别加入乳化剂和助乳化剂,搅拌均匀后,在25℃搅拌速度为40转/分钟下分批次加入水,分散均匀,即得辛鹅挥发油微乳制剂。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、辛鹅挥发油抗炎活性研究
建立大鼠过敏性鼻炎模型,考察辛鹅挥发油不同配伍比例(辛夷挥发油和鹅不食草挥发油分别单提后按照不同比例混合)对模型的干预作用,以大鼠行为学变化、体重变化、鼻黏膜组织病理切片以及血清中IL-2、IL-4、IgE、HIS、TNF-α的含量变化等为指标,评价不同比例辛鹅挥发油对过敏性鼻炎大鼠炎症反应及鼻黏膜的修复作用。
一、实验方法
1、建立过敏性鼻炎大鼠模型
在基础致敏阶段:将等体积的卵清白蛋白(OVA)溶液(0.4mg/mL)和氢氧化铝溶液(40mg/mL)混匀,腹腔注射,1日1次,1次1mL,隔天注射,连续注射7次。对照组给予等体积的生理盐水。
在激发致敏阶段:第15~17天,给予浓度为0.25%的OVA溶液,第18~20天,给予浓度为2%的OVA溶液,第21~23天,给予浓度为5%的OVA溶液。通过鼻孔滴入(滴鼻),1次每个鼻孔各100μL(100μL/鼻孔),一日1次,对照组给予等体积生理盐水滴鼻。
造模开始后观察大鼠精神状态,隔天称体重;末次激发后,观察大鼠行为学,每只观察30min,记录挠鼻次数、喷嚏个数、流涕程度并进行评分。评分标准如表3所示。
表3.造模评分表
注:叠加总积分大于5分时,提示造模成功。
2、给药与分组
将大鼠按照体重分层随机分为对照组、模型组、阳性对照组、治疗组(即不同配伍比例辛鹅挥发油组,辛夷和鹅不食草分别单提得辛夷挥发油和鹅不食草挥发油,将辛夷挥发油和鹅不食草挥发油按不同体积比混合,辛夷挥发油和鹅不食草挥发油体积比分别为7:2、7:1、14:1、28:0、28:1、0:28,分别表示为药物7:2、药物7:1、药物14:1、药物28:0、药物28:1、药物0:28),共9组,每组大鼠8只。4周后评价模型制备成功,治疗组按照不同配比给药干预,给药方式为双侧滴鼻,每次100μL/鼻孔;阳性对照组以盐酸西替利嗪(规格:10mL∶100mg)给药,给药方式为双侧滴鼻,每次100μL/鼻孔;对照组和模型组给予等量的生理盐水;每日给药3次,连续给药3周。
3、动物的一般状态观察
每日记录大鼠的精神状态等,在实验前、造模后、实验结束前称体重,并在末次给药后记录30min内各组大鼠抓鼻次数、打喷嚏次数。
4、动物样本取材方法
(1)血清取材
各组大鼠末次给药后禁食不禁水24h后取材,腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉大鼠,刺激眼睑无反应后剪开腹部皮肤,逐层钝性分离暴露出腹主动脉,进行腹主动脉采血,将样本放置室温下静置2h后,经转速4000r·min-1离心10min,取上清液,分装,置于-80℃冰箱保存备用。
(2)鼻黏膜组织取材
大鼠采血后断颈处死,剪下大鼠鼻腔,用剪刀沿鼻中线小心剪开鼻腔,漏出鼻中隔,剥掉牙齿,剥离鼻黏膜,用生理盐水冲洗干净后放入4%多聚甲醛固定,保存备用。
5、鼻黏膜病理切片的制作
称取多聚甲醛400g和0.1mol·L-1的PBS(PH:7.2-7.4)500mL混合后加热至60℃,加入1N NaOH搅拌至清晰透亮,冷却溶液,继续加PBS定容至1000mL,调PH值为7.4左右,得40%的甲醛溶液,分取出100mL并加入6.5g磷酸二氢钠,用900mL蒸馏水稀释,调pH值至7.0左右,得PBS磷酸盐缓冲液;用无水乙醇配制70%、80%和90%的乙醇溶液,即脱水试剂;分别量取适量无水乙醇和纯化水混匀,缓慢加入定量浓盐酸,混匀,配制1%的盐酸-乙醇分化液;精密称取规定量的重铬酸钾加入到纯化水,充分搅拌溶解、混匀,缓慢加入规定量浓硫酸,混匀,得盖玻片清洗液。
将固定后的鼻黏膜组织经全自动脱水机脱水后进行包埋和切片,切片按下表4步骤操作。
表4.鼻黏膜病理切片制作
对切片进行100倍和400倍图像采集,观察具体病变。
6、ELISA测定大鼠血清中相关炎症因子的表达量
(1)试剂准备
开始实验前,将所有试剂放置室温下平衡30min。
按照说明书提示比例配制洗涤液;依据说明书用标准品稀释液将标准品冻干粉定容到规定体积,得标准品母液;按照说明书稀释成标准曲线浓度点;用对应的稀释液按照一定的比例稀释生物素抗原和亲和素-HRP,现配现用。
(2)样品检测
实验前确定实验所用的板条数,取出剩余板条放回铝箔袋内密封,置于4℃保存,备用;根据说明书,设置不同反应孔,将不同浓度的标准品和样本(50μL/孔)加入到相应的孔中,轻轻摇晃并除去气泡,用封板膜封住反应孔,放置37℃恒温孵育箱中孵育30min;重复洗板5次,用吸水纸拍干。标准品孔和样品孔中分别加入50μL亲和素-HRP,轻摇除气泡,封板膜封住反应孔,置于37℃恒温孵育箱中孵育30min,重复洗板5次,拍干。每孔先后加入显色剂A、B各50μL,轻摇混匀,置于37℃恒温孵育箱中,避光显色10min,加入终止液50μL,反应停止,反应孔颜色由蓝色变为黄色,10min内测定OD450值。(具体操作根据相应试剂盒说明书内容进行调整),用软件ELISAcalc的拟合模型logistic曲线(四参数)对数据进行处理。
(3)统计学方法
所有数据以SPSS 22.0软件包进行统计学分析处理,两样本均数的比较用t检验,多个样本均数的比较用One-Way ANOVA分析,数据以均数±标准差表示,以p<0.05为鉴定样本是否具有显著性差异的标准界限。
二、实验结果
1、造模结果
(1)大鼠体重变化
经OVA致敏激发后,各组大鼠的精神、皮毛情况、饮食状况均正常,除对照组外,其余各组大鼠均出现挠鼻、打喷嚏和流涕的症状。
#:对照组相比,有显著性差异(P<0.05)
各组大鼠体重统计结果如表5,经过统计分析发现,与对照组相比,造模组的体重明显下降(P<0.05),说明大鼠在造模过程可能会引起食欲下降,影响体重的变化。
(2)造模评价
通过对各组大鼠的挠鼻次数、喷嚏次数以及流涕等行为学的观察和数据分析,结果显示(表6),除对照组大鼠外,其余组大鼠以上三个症状评分叠加分值大于5分,提示造模成功。
表6.各组大鼠造模评分表
2、大鼠体重变化结果
给药期间,大鼠体重变化如表7所示。
给药期间,各组大鼠体重统计结果如表7,经过统计分析发现,与对照组相比,各组大鼠的体重均无明显差异。
3、大鼠行为学统计结果
各组大鼠在30min分钟内挠鼻次数和喷嚏次数统计结果如表8和图1,经统计分析发现,不同药物比例都能改善过敏性鼻炎鼻部症状,但是改善过敏性鼻炎鼻部症状的效果不同,其中辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1组、14:1组均发挥了协同增效作用,而辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1组,改善效果最佳。
#:与对照组比较,P<0.05;###:与对照组比较,P<0.001;
*:与模型组比较,P<0.05;***:与模型组比较,P<0.001;
&:与阳性对照组比较,P<0.05;&&&:与阳性对照组比较,P<0.001。
4、大鼠鼻黏膜组织病理学变化结果
组织病理变化结果显示(图2),对照组大鼠鼻黏膜上皮层结构呈现较为完整、清晰的状态,细胞排列较整齐且平滑,无炎症细胞浸润现象;阳性对照组大鼠鼻黏膜上皮层结构同样呈现较完整且细胞排列较整齐的状态,黏膜上皮细胞排列紊乱,固有层可见少量炎性细胞浸润现象;模型组大鼠鼻黏膜出现上皮脱落且细胞变性坏死现象,黏膜固有层腺管和血管呈现轻度扩张状态,固有层内出现不同程度的炎细胞浸润现象,主要为中性粒细胞和浆细胞;药物7∶2组大鼠鼻黏膜上皮层结构较完整,黏膜上皮细胞轻度变性坏死,可见黏膜上皮细胞排列紊乱,黏膜上皮不同程度炎细胞浸润,主要为中性粒细胞和少量浆细胞;药物7∶1组大鼠鼻黏膜上皮层结构较完整,细胞排列整齐,黏膜上皮和固有层内偶见炎细胞浸润;药物14∶1组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列较为整齐,可见部分黏膜上皮结构缺失并伴有不等量的中性粒细胞浸润,固有层内出现不同程度炎细胞浸润;药物28∶0组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列较为整齐,可见黏膜上皮出现脱落且有不同程度炎细胞浸润现象;药物28∶1组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列较为紊乱,可见黏膜上皮细胞增生现象,黏膜上皮和固有层内不同程度炎细胞浸润,主要为中性粒细胞和浆细胞;药物0∶28组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列较为整齐,黏膜上皮和固有层内均有大量炎细胞浸润,多为中性粒细胞、浆细胞和少量淋巴细胞。结果表明辛鹅挥发油与鹅不食草挥发油比例为7∶1时大鼠鼻粘膜上皮层结构最接近正常组织。
5、ELISA测定大鼠血清中相关炎症因子的表达量
各组大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-4、HIS和IgE的含量表达如表9和图3所示,统计结果显示,过敏性鼻炎模型组大鼠TNF-α、IL-4、HIS和IgE的含量和对照组相比明显增加,IL-2含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05),提示这些炎症因子参与了过敏性鼻炎的发生。TNF-α、IL-4、HIS、IgE的表达量越高,提示炎症反应越明显,IL-2则反之。
与过敏性鼻炎模型组大鼠相比,不同药物比例治疗组大鼠血清中的TNF-α、IL-4、IL-2、HIS和IgE的含量都有不同程度的变化,其中TNF-α的含量都有下降,药物7∶2、药物7∶1和药物14∶1组有明显下降,具有统计学差异(P<0.05),其余组虽有下降但不明显,不具有统计学差异(P>0.05);IL-2的含量都有增加,药物7∶1和药物14∶1组有明显增加,具有统计学差异(P<0.05),其余组虽有增加但不明显,不具有统计学差异(P>0.05);IL-4含量中,药物7∶1和药物14∶1组有明显降低,具有统计学差异(P<0.05),其余组虽有降低,但不具有统计学差异(P>0.05);HIS含量均有下降,但只有药物7∶1组具有统计学差异(P<0.05),其余组均不具有统计学差异(P>0.05);IgE含量均下降,药物7:2、药物7∶1、药物14∶1、药物28∶0和药物28∶1组均有明显差异,具有统计学差异(P<0.05),药物0∶28组没有明显差异(P>0.05)。
与阳性对照组相比,药物7∶2、药物7∶1和药物14∶1组TNF-α的含量均无明显差异(P<0.05);在IL-2含量中,药物7∶1和药物14∶1组无明显差异(P<0.05);在IL-4含量中,药物7∶2、药物7∶1、药物14∶1和药物28∶0组无明显差异(P<0.05),在HIS含量中,药物7∶1组无明显差异(P<0.05);在IgE含量中,药物7∶2、药物7∶1、药物14∶1、药物28∶0和药物28∶1组均无明显差异(P<0.05),说明其与阳性药物治疗作用相近。
#:与对照组比较,P<0.05;###:与对照组比较,P<0.001;
*:与模型组比较,P<0.05;***:与模型组比较,P<0.001;
&:与阳性对照组比较,P<0.05;&&&:与阳性对照组比较,P<0.001。
试验结果表明:辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合使用可以改善过敏性鼻炎症状,有效治疗过敏性鼻炎。其中,辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1组、14:1组均发挥了协同增效作用,而辛夷挥发油与鹅不食草挥发油体积比为7:1时效果最佳。
试验例2、本发明辛鹅挥发油微乳制剂工艺参数筛选
一、实验方法
1、乳化剂的筛选
采用实施例3所述的制备方法制备辛鹅挥发油微乳制剂,改变乳化剂的种类,乳化剂分别选自吐温80(Tween80)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40)、蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)和吐温20(Tween20)。研究乳化剂对微乳制剂的影响。
2、助乳化剂的筛选
采用实施例3所述的制备方法制备辛鹅挥发油微乳制剂,改变助乳化剂的种类,助乳化剂分别选自聚乙二烯400(PEG-400)、无水乙醇、丙三醇和1,2-丙二醇。研究助乳化剂对微乳制剂的影响。
3、油相的筛选
采用实施例3所述的制备方法制备辛鹅挥发油微乳制剂,改变油相的种类种类,油相分别选自肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、棕榈酸异丙酯(IPP)和油酸。研究油相对微乳制剂的影响。
4、不同Km值对微乳形成的影响
采用实施例3所述的制备方法制备辛鹅挥发油微乳制剂,改变乳化剂与助乳化剂的质量之比(Km值),Km值分别选自1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。乳化剂与助乳化剂的总质量百分比为60%。研究乳化剂与助乳化剂的质量之比(Km值)对微乳制剂的影响。
5、温度对微乳形成的影响
采用实施例3所述的制备方法制备辛鹅挥发油微乳制剂,改变制备温度,制备温度分别选自25℃、30℃、40℃、50℃。研究温度对微乳制剂的影响。
二、实验结果
1、乳化剂的筛选结果
记录可形成微乳组别的乳化剂、混合油相(混合油相为辛夷挥发油、鹅不食草挥发油与油相IPM)的用量,数据输入Origin8.0绘图软件绘制伪三元相图,考察RH-40、EL-40、Tween-80、Tween-20四种不同乳化剂对微乳形成的影响。考察结果如下图4和表10所示,其微乳区域面积占比分别为SRH-40=0.0283,SEL-40=0.0287,STween-80=0.0298,Tween-20组中各比例均不能形成微乳,故无法绘制伪三元相图。结果显示,乳化剂为Tween-80时形成的微乳面积最大,且形成的微乳粒径、外观、以及初步离心稳定性良好,故选择Tween-80作为辛鹅挥发油微乳的乳化剂。
2、助乳化剂的筛选结果
助乳化剂的筛选结果见图5和表11。其微乳区域面积占比分别为SPEG-400=0.0782,S无水乙醇=0.0522,S1,2-丙二醇=0.0417,S丙三醇=0.0414。PEG-400的微乳面积占比最大,且形成的微乳粒径、外观、以及初步离心稳定性良好,故选择PEG-400作为辛鹅挥发油微乳的助乳化剂。
3、油相的筛选结果
油相筛选结果见图6和表12。其微乳区域面积占比分别为SIPP=0.0530,SIPM=0.0766,S油酸=0.0441。IPM的微乳面积最大,且形成的微乳粒径、外观、以及初步离心稳定性良好,故选择IPM作为辛鹅挥发油微乳的油相。
4、Km的筛选结果
Km值筛选结果见图7和表13。其微乳区域面积占比分别为S1∶1=0.0450,S2∶1=0.0766,S3∶1=0.0540,S4∶1=0.0398,Km为2∶1时的微乳面积最大,且形成的微乳粒径、外观、以及初步离心稳定性良好,故确定2:1为最佳Km值。
5、温度的筛选结果
制备温度筛选结果如图8和表14。其微乳区域面积占比分别为S25℃=0.0766,S30℃=0.0696,S40℃=0.0650,S50℃=0.0613,且形成的微乳粒径、外观、以及初步离心稳定性良好,故确定25℃为最佳制备温度。
本节通过转相乳化法制备辛鹅挥发油微乳制剂,利用伪三元相图形成微乳面积大小以及微乳外观、粒径以及高速离心稳定性筛选出适宜辛鹅挥发油微乳制剂的乳化剂、助乳化剂、油相、Km值以及制备温度。最终确定微乳处方:乳化剂为Tween-80,助乳化剂为PEG-400,辛鹅挥发油与IPM(油相)等质量比混合作为混合油相,乳化剂与助乳化剂的比值Km=2,制备温度为25℃,乳化剂与混合油相的质量比为12.5∶1,其中微乳制剂中,辛鹅挥发油的质量百分比为1.6%(辛鹅混合挥发油由辛夷挥发油和鹅不食草挥发油按照体积比7:1混合而得),乳化剂的质量百分比为40%,助乳化剂的质量百分比为20%,油相IPM的质量百分比为1.6%,水相的质量百分比为36.8%。制备的微乳为O/W型,其外观呈现澄清透明、均一状态,经13000r/min,30min离心后,无沉淀出现且并未分层,平均粒径为14.11±3.980,PDI=0.063,符合微乳质量要求。
试验例3、辛鹅挥发油微乳制剂体系的质量评价
对实施例3制备得到的辛鹅挥发油微乳制剂进行质量评价。
一、实验方法
1、微乳的外观性状
将镀碳支持膜铜网放到封口膜上,向支持膜上滴加体积约30μL的样品,保持5~10min后,滤纸吸去多余的溶液,滤纸上放置1min左右。彻底干燥后的支持膜放到封口膜上,滴一滴醋酸双氧铀染液,染色90s,滤纸吸去多余的染液,夹到滤纸上吸水干燥3h后,用透射电镜观察。
2、染色法鉴定微乳类型
染色法是根据“相似相溶”原理,直观的观察染色剂苏丹III(油溶性)、亚甲基蓝(水溶性)在微乳中扩散的快慢来判断微乳的类型,当亚甲基蓝(蓝色)扩散速度快于苏丹III(红色)时,微乳为O/W型;反之,则为W/O型。
3、微乳理化参数的测定
(1)微乳pH值的测定
分别取3批不同批次的微乳各1.0g,用适量纯净水稀释后,在25℃条件下用pH计进行测定。
(2)微乳折光率的测定
分别取3批不同批次的微乳各1.0g,用适量纯净水稀释后,在25℃条件下用阿贝折射仪进行测定。
(3)微乳粒径的测定
分别取3批不同批次的微乳1.0mL,分别加10倍水进行稀释,利用马尔文粒度仪对新制备的微乳进行粒度测定。
(4)微乳Zeta电位的测定
分别取3批不同批次的微乳1.0mL,利用马尔文粒度仪对新制备的微乳进行Zeta电位测定。
4、辛鹅挥发油微乳的稳定性研究
(1)微乳物理稳定性
取3份等量的微乳于离心管中,置于转速13000r·min-1的高速离心机中离心30min,观察微乳的透明度以及是否出现分层现象,以此判定微乳离心稳定性。
(2)微乳的热力学稳定性实验
加热-冷却循环实验:取3份等量的辛鹅挥发油微乳置于离心管中,在40℃温度下放置24h,取出后立即放入4℃温度下冷藏24h,如此循环,反复进行6次,结束后观察微乳外观透明度以及是否出现分层现象,以此判断微乳的热力学稳定性。
冷冻-解冻循环实验:取3份等量的辛鹅挥发油微乳置于离心管中,在-20℃温度下冷冻24h,取出后在室温下放置24h解冻,如此循环,反复进行6次,观察微乳外观透明度以及是否出现分层现象,以此判断微乳的热力学稳定性。
加速稳定性实验:取3份等量的辛鹅挥发油微乳放入称量瓶内密封,于温度为30℃±2℃,湿度为65%±5%的条件下保存3个月,每月末取样检测微乳的外观、电导率、粒径、折光率以及指标性成分含量,以此判定微乳的稳定性。
二、试验结果
1、微乳的外观性状
将辛鹅挥发油微乳放置在透射电镜下观察,通过电镜扫描图片(图9)可以看出,辛鹅挥发油微乳呈外观圆整,轮廓分明,粒径分布均匀球体。
2、染色法鉴定微乳类型、
苏丹III和亚甲基蓝两种染色剂在新制微乳中扩散速度对比实验中,蓝色的扩散速度明显快于红色的扩散速度,故微乳为O/W型。
3、微乳理化参数的测定
①微乳pH值的测定:25℃恒温下测得辛鹅挥发油微乳pH值为6.64±0.04,该微乳为弱酸性。
②微乳折光率的测定:25℃恒温下测得辛鹅挥发油微乳折光率为1.4198±0.0011nd。
③微乳粒径的测定:鹅挥发油微乳的粒径检测图如图10,其粒径的平均值为14.62±0.4576nm,PDI的平均值为0.0747±0.0265(n=3)。
④微乳Zeta电位的测定:辛鹅挥发油微乳的Zeta电位检测图如图11,其电位平均值为-4.06±0.0702mV(n=3)。
4、辛鹅挥发油微乳的稳定性研究结果
①微乳的外观性状:实施例3制得的辛鹅挥发油微乳制剂为均一、清澈透明液体。
②微乳物理稳定性:3份辛鹅挥发油微乳于高速离心机中以转速为13000r·min-1,离心30min后其外观均为澄清透明,且未出现分层现象,故辛鹅挥发油微乳离心稳定性良好。
③微乳的热力学稳定性实验:
加热-冷却循环实验:辛鹅挥发油微乳于离心管中,在40℃与4℃之间连续加热-冷却循环6次后,其外观均为澄清透明,且未出现分层现象,故辛鹅挥发油微乳加热-冷却稳定性良好。
冷冻-解冻循环实验:辛鹅微乳于离心管中,于冰箱内-20℃冷冻24h,取出室温解冻24h,连续冷冻-解冻6次循环实验,其外观透明度仍然澄清透明,并未出现分层现象,辛鹅微乳冷冻-解冻稳定性良好,适宜室温或冷藏保存。
加速稳定性实验:辛鹅挥发油微乳于温度30℃±2℃,湿度为65%±5%环境中放置3个月,根据每个月末取样检测,结果显示(表15),微乳的离心稳定性稳定,外观澄清透明、均一、无分离分层现象,pH值、电导率、折光率和粒径随着储存时间的延长均无明显变化,随着储存时间的延长,指标性成分桉叶油醇的含量略微减低,储存至三个月时桉叶油醇的含量降低为原来的95.31%。在加速稳定性实验中,虽然各项指标随着时间的延长都有变化,但变化并不明显,说明该微乳在此实验条件下较为稳定。
本实验用透射电镜对微乳进行表征,发现其外观圆整,粒径分布相对均匀。在微乳类型鉴别过程中,发现亚甲基蓝的扩散速度明显快于苏丹III,因此判定其为O/W型微乳。通过理化参数的测定,发现微乳的pH值、折光率较为稳定,且粒径符合要求。通常认为稳定体系的Zeta电位相对值应大于30mV,且其稳定性随数值的增大而更加稳定,该体系的Zeta电位为-4.06±0.0702mV(n=3),但并不代表微乳体系不稳定,因为微乳为热力学稳定体系,因此Zeta电位对其稳定性影响较小。在微乳稳定性实验中,发现微乳本身较为稳定,经高速离心以及加热-冷却循环实验和冷冻-解冻循环实验后微乳依然澄清透明,且未分层。在加速稳定性实验过程中,微乳体系在3个月内始终为澄清透明、均一液体,外观和理化参数均无明显变化。
试验例4、辛鹅挥发油微乳离体透皮吸收研究
一、实验方法
1、GC-MS条件的建立
GC-MS条件、梯度程序升温见下表16及17。
表16.GC-MS条件
表17.梯度升温程序
2、样品溶液的制备
2.1对照品溶液制备
精密称取桉叶油醇对照品0.10034g,无水乙醚定容至10mL棕色容量瓶中,得浓度为10.034mg·mL-1的标准品母液。
2.2微乳制剂的制备
采用实施例3所述方法制备辛鹅挥发油微乳制剂。
2.3油溶液的制备
按照微乳制剂中辛鹅挥发油的载药量,精密称取辛夷挥发油0.4375g,鹅不食草挥发油0.0625g置于离心管中,用液体石蜡配制成浓度为1.4045%的溶液,置于高速离心机中,设置转速为3000r·min-1,离心10min后,取上层溶液作为油溶液剂。
3、桉叶油醇标准曲线的建立
精密吸取桉叶油醇对照品母液5、10、20、40、80、160μL对照品分别置于10mL棕色容量瓶中,用无水乙醚定容,制成5.017、10.034、20.068、40.136、80.272、160.544μg·mL-1的桉叶油醇对照品溶液,表16的色谱条件进样,测定峰面积,以浓度(C)与峰面积(A)分别作为横坐标和纵坐标,建立桉叶油醇标准曲线。
4、辛鹅挥发油微乳制剂的离体透皮行为研究
4.1实验动物皮肤剥离
剪下牛蛙腹部皮肤,剥离脂肪及皮下组织,清洗,现取现用。
4.2经皮渗透性实验
采用透皮扩散试验仪法,将剥离脂肪及皮下组织的牛蛙腹部皮肤用生理盐水反复冲洗后展开固定在扩散池的扩散界面上,真皮层面向接受池。配制20%的乙醇-生理盐水作为接受液,超声后注入到接受池中,排尽气泡,设置温度(37±0.2℃)循环水浴,350r·min-1恒速搅拌。预平衡30min后,分别取辛鹅挥发油微乳和鹅挥发油油溶液各2.0g放入供给池中。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h不同时间点取样1.0mL,同时向接收池中补充等体积的空白接收液,排尽气泡。吸取的接收液用无水乙醚萃取三次,合并萃取液,用高速离心机(10000r·min-1,4℃)离心10min,取上清液,吸取适量,过0.22μm的滤膜得到接收液供试品,表16的色谱条件对桉叶油醇峰面积进行测定,依据以下公式计算累计透过量:
式中,Qn为第n个时间点的单位面积累积透过量;A为有效透皮面积(1.54cm2,d=1.4cm);Cn为第n个点测得的药物质量浓度;V为接收池体积(15mL);Vi为每次取样体积;Ci为浓度。
二、实验结果
1、标准曲线的建立
按照对照品浓度梯度进样,根据其相应色谱峰面积,以桉叶油醇对照品浓度为横坐标,对应峰面积为纵坐标进行线性回归,得线性回归方程y=112177x+2×106,R2=0.9994,标准曲线见图12,结果表明在5.017~160.544μg·mL-1浓度梯度范围内,桉叶油醇对照品的线性关系良好。
2、微乳离体渗透性实验结果
通过上述公式分别计算微乳和油溶液各时间点单位面积的累积透过量,以药物的累积透过量Qn(μg·cm-2)为纵坐标,以取样时间t为横坐标作曲线,并对曲线进行线性回归,所得直线斜率即为稳态透皮速率Js(μg·cm-2·h-1)。由结果可知,微乳与油溶液中的桉叶油醇累积透过量分别为(301.0800±2.80)μg·cm-2,(73.3491±2.19)μg·cm-2,稳态透皮速率分别为9.4349μg·cm-2·h-1,2.0082μg·cm-2·h-1,且两者的时间模型拟合方程均符合一级动力学方程,具体见表18、19及图13。
本研究选用与鼻黏膜相似的牛蛙腹部皮肤作为透皮介质,对辛鹅挥发油微乳和辛鹅挥发油溶液进行体外经皮渗透量对比考察,建立了桉叶油醇的标准曲线,根据实验结果,桉叶油醇5.017~160.544μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,微乳与油溶液中的桉叶油醇累积透过量分别为(301.0800±2.80)μg·cm-2,(73.3491±2.19)μg·cm-2,稳态透皮速率分别为9.4349μg·cm-2·h-1,2.0082μg·cm-2·h-1,微乳24h的累积透过量是油溶液的4.10倍,稳态透皮速率是油溶液的4.70倍,表明微乳基质有利于药物的经皮渗透。辛鹅挥发油微乳体外透皮性能较好。
试验例5、辛鹅挥发油微乳制剂对过敏性鼻炎大鼠的药效评价
一、实验动物
SPF级Wistar雄性大鼠,购于成都达硕实验动物有限责任公司,动物许可证:SCXK(川)2015-030,体重110~120g,恒温,恒压,温度为20±2℃,相对湿度为65±2%,保持通风良好,动物自由进食、进水,适应性饲养七天。
二、实验方法
1、建立过敏性鼻炎大鼠模型
建立过敏性鼻炎大鼠模型的方法同试验例1“一、实验方法”中的“1、建立过敏性鼻炎大鼠模型”。
2、给药与分组
将大鼠按照体重分层随机分为对照组、模型组、阳性对照组、药物组(实施例3制备的辛鹅挥发油微乳制剂),每组大鼠6只。4周后评价模型制备成功,开始药物干预,药物组以辛鹅挥发油微乳制剂给药,给药方式为双侧滴鼻,每次100μL/鼻孔;阳性对照组同样方式给予同等体积的盐酸西替利嗪(规格:10mL∶100mg);对照组和模型组给予等量的生理盐水;每日给药1次,连续给药3周。
3、动物的一般状态观察
同试验例1“一、实验方法”中的“3、动物的一般状态观察”。
4、动物样本取材方法
(1)血清取材
同试验例1“一、实验方法”中的“4、动物样本取材方法”项下的“(1)血清取材”。
(2)鼻腔灌洗液取材
将取完血的大鼠咽喉处皮肤剪开,剥离气管周围组织,暴露气管,剪一个斜口,将一次性采血针的橡皮管,插入斜口,用液体石蜡浸润的脱脂棉堵住咽喉(防止冲洗液流出),吸取1mL生理盐水冲洗,收集冲洗液,反复三次,合并冲洗液,置于转速为4000r·min-1的离心机中离心10min后取上清液,分装,置于-80℃冰箱保存备用。
(3)鼻黏膜组织取材
同试验例1“一、实验方法”中的“4、动物样本取材方法”项下的“(2)鼻黏膜组织取材”。
5、鼻黏膜病理切片的制作
同试验例1“一、实验方法”中“5、鼻黏膜病理切片的制作”。
6、ELISA测定大鼠血清和鼻腔灌洗液中相关炎症因子的表达量
同试验例1中“一、实验方法”中“6、ELISA测定大鼠血清中相关炎症因子的表达量”。
7、PCR检测微乳对大鼠鼻黏膜组织中相关炎症因子的含量影响
大鼠鼻黏膜组织加入TRIpure裂解液,按照说明书操作,提取总RNA并进行纯化,使用GoScript Reverse Transcription System将mRNA转化为cDNA,如表20。取出表21中试剂置室温融化并混匀后,4℃,2000rpm离心30s,置于冰上,用ddH2O补足至20μL,反应体系和反应条件如下表21、表22,利用2-△△CT方法分析数据。
表20.基因的引物序列
表21.反应体系
表22.PCR反应条件
8、Western Blot检测微乳对鼻黏膜组织中相关炎症因子的含量影响
鼻黏膜组织加入蛋白裂解液,冰上静置5min,离心,取上清,利用BCA法按照说明书绘制BAS蛋白标准曲线,并计算样品的蛋白浓度。SDS-PAGE电泳将样品蛋白分离,然后转移到PVDF膜上进行转印。转印结束后取出PVDF膜浸入到TBST溶液中洗膜5min,再用5%脱脂奶粉封闭1h,将一抗稀释液倒入杂交袋中,封闭好PVDF膜,在一抗中经4℃下孵育过夜。结束后用TBST溶液洗膜四次,然后将二抗工作液(IgG-HRP)倒入杂交袋中,封闭好PVDF膜,在37℃下孵育45min,结束后用TBST溶液洗膜六次,最后,用ECL试剂对膜进行发光,所得数据经Bio-Rad软件进行分析。
9、数据分析
同试验例1“一、实验方法”中“6、ELISA测定大鼠血清中相关炎症因子的表达量”项下的“(3)统计学方法”。
三、实验结果
1、动物的一般活动状态
各组大鼠的精神、皮毛情况、饮食状况均正常,除对照组外,其余各组大鼠均出现挠鼻、打喷嚏和流涕的症状。
2、造模评价
评价方法(造模评分)同试验例1中表3。结果如表23所示。
表23.各组大鼠造模评价结果
3、行为学变化
行为学结果如表24,模型组挠鼻次数和喷嚏次数明显高于对照组,具有显著性差异。与模型组相比,阳性对照组和药物组的挠鼻次数和喷嚏次数低于模型组,具有显著性差异,提示辛鹅挥发油微乳对过敏性鼻炎大鼠的鼻部不适症状有改善作用。
表24.行为学评价分析结果
###:与对照组相比,有显著性差异(P<0.001);
***:对模型组相比,有显著性差异(P<0.001)。
4、组织病理学变化
组织病理变化结果见图14,对照组大鼠鼻黏膜上皮层结构较为完整、清晰,细胞排列较整齐,平滑而无断裂,未见炎细胞浸润;模型组大鼠鼻黏膜上皮细胞变性坏死并出现部分脱落,黏膜上皮细胞排列不整,坏死细胞空泡化,胞核固缩或碎裂,并伴有炎细胞浸润;阳性药物组大鼠鼻黏膜上皮层结构较完整,细胞排列较整齐,细胞间可见杯状细胞分布,固有层内伴有少量炎细胞浸润;药物组黏膜上皮层结构较完整,细胞排列较整齐,细胞间可见杯状细胞分布,偶见炎细胞浸润,提示辛鹅挥发油微乳对过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织的病变状态具有改善作用。
5、ELISA测定大鼠血清和鼻腔灌洗液中的相关炎症因子的表达量
ELISA测定血清中炎症因子表达量变化的结果如下表25以及图15所示,模型组的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量明显高于对照组,具有显著性差异,与模型组相比,阳性对照组和药物组中的相关因子表达量均显著降低;鼻腔灌洗液中炎症因子表达量变化的结果如下表26和图16所示,与对照组相比,模型组的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量明显高于对照组,具有显著性差异;与模型组相比,阳性对照组和药物组中的相关因子表达量均显著降低,说明辛鹅挥发油治疗过敏性鼻炎与调节IL-17、IL-6、TNF-α的表达量有关。
表25.大鼠血清中的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量
###:与对照组相比,有显著性差异(P<0.001);
***:对模型组相比,有显著性差异(P<0.001)。
表26.大鼠鼻腔灌洗液中的IL-17、IL-6、TNF-α的表达量
###:与对照组相比,有显著性差异(P<0.001);
***:对模型组相比,有显著性差异(P<0.001)。
6、PCR测定大鼠鼻黏膜组织中相关炎症因子的表达量
PCR测定的结果提示(表27和图17),模型组中IL-17A、COX2、Traf6的表达量与对照组相比明显升高,说明经OVA刺激后,大鼠过敏性鼻炎的发生涉及了基因层面的IL-17A、COX2、Traf6的变化,与模型组相比,阳性对照组和药物组均有显著性变化,两组鼻黏膜组织中的IL-17A、COX2、Traf6的表达量均降低,说明阳性对照组和药物组治疗过敏性鼻炎的作用机制与调节IL-17A、COX2、Traf6的表达量有关。
表27.大鼠鼻黏膜组织中IL-17A、COX2、Traf6的表达量
#:与对照组比较,P<0.05;###:与对照组比较,P<0.001;
*:与模型组比较,P<0.05;***:与模型组比较,P<0.001;
&:与阳性对照组比较,P<0.05;&&&:与阳性对照组比较,P<0.001。
7、Western Blot检测鼻黏膜组织中相关炎症因子的表达量
各组中大鼠鼻黏膜组织中炎症相关蛋白IL-17A、Traf6、COX2的表达如下表28、图18及图19(A)所示,分析结果发现,与对照组大鼠相比,过敏性鼻炎模型组大鼠鼻黏膜中IL-17A、Traf6、COX2的蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,阳性药物组和药物组的IL-17A、Traf6、COX2蛋白表达明显降低,差异具有统计学差异(P<0.05),提示药物对大鼠鼻黏膜中IL-17A、Traf6、COX2的表达有改善作用。
各组大鼠鼻黏膜组织分别提取核蛋白和浆蛋白,测定其中NF-kB p65的表达量,如下表28、图18及图19(B)所示,分析结果发现,在核蛋白中,与对照组大鼠相比,过敏性鼻炎模型组大鼠鼻黏膜中NF-kB p65的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,阳性药物组和药物组中的NF-kB p65表达明显降低,差异具有统计学差异(P<0.05);但在浆蛋白中,与对照组大鼠相比,模型组NF-kB p65的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,阳性药物组和药物组中的NF-kB p65表达明显上升,差异具有统计学差异(P<0.05);提示药物对大鼠鼻黏膜中的NF-kB p65表达有改善作用。
#:与对照组比较,P<0.05;###:与对照组比较,P<0.001;
*:与模型组比较,P<0.05;***:与模型组比较,P<0.001;
&:与阳性对照组比较,P<0.05;&&&:与阳性对照组比较,P<0.001。
综上所述,本实验说明辛鹅挥发油微乳可通过调节IL-17信号通路上的IL-17A、Traf6、NF-kB p65、COX2相关炎症因子的含量表达,改善炎性症状,重塑组织,从而对过敏性鼻炎起到治疗作用。
试验例6、辛鹅挥发油微乳制剂的刺激性评价
鼻腔局部给药能够提高局部有效药物的浓度,从而增加药物的疗效,且能有效减少全身毒副作用。新型局部给药制剂是通过鼻黏膜吸收发挥治疗作用,由于药物会直接刺激到鼻黏膜,故可能会对鼻黏膜造成破损。
一、实验动物
SPF级体重在180~220g的雄性Wistar大鼠30只,恒温,恒压,温度为20±2℃,相对湿度保持在65±2%,通风良好,自由进食、进水,适应性饲养三天。
二、实验方法
1、分组及剂量
大鼠适应性饲养三天后,按照体重分层随机分为5组:生理盐水组、空白微乳组、微乳组(实施例3制备的辛鹅挥发油微乳制剂)、阳性对照组和油溶液组,每组6只,药物组给予辛鹅挥发油微乳,阳性对照组给予盐酸西替利嗪,油溶液组给予辛鹅挥发油,空白微乳组给予不含药物的空白微乳,100μL/孔。
2、给药及操作
生理盐水组组给予生理盐水,其余各组大鼠每日经两侧鼻孔各滴入相应体积药物,1日1次,连续7天,给药后观察30min,记录每只大鼠打喷嚏以及挠鼻次数,并记录体重变化。7天给药结束后,立即处死,取鼻黏膜,置于4%多聚甲醛溶液中固定处理,HE染色后,在显微镜下观察各组大鼠鼻粘膜组织损伤情况,根据“局部黏膜刺激反应分级标准”(表29)对病理组织切片进行评分。
3、观察评价指标
3.1整体观察
生活状态、行为动作、分泌物、局部刺激症状如打喷嚏、挠鼻、流涕等症状。
3.2鼻黏膜刺激性
表29.局部黏膜刺激反应分级标准
注:评分平均分值在0.0~0.40之间,为无刺激性;平均值在0.41~1.50之间,为轻度刺激性;平均分值在1.51~2.50之间,为中度刺激性;平均分值大于2.51时,为重度刺激性。
4、鼻黏膜病理切片的制作
同试验例1“一、实验方法”中的“5、鼻黏膜病理切片的制作”。
5、数据分析
同试验例1“一、实验方法”中的“6、ELISA测定大鼠血清中相关炎症因子的表达量”项下的“(3)统计学方法”。
三、实验结果
1、行为学观察结果
各组大鼠外观、行为、分泌物均正常,无红斑、水肿、糜烂、溃疡等症状,各组出现个别大鼠挠鼻、打喷嚏的行为,分析结果显示,各组大鼠体重均上升,但并无显著性差异,与生理盐水组相比,油溶液组大鼠的挠鼻次数和喷嚏次数有显著性差异(P<0.05),其余组均无显著差异。与阳性药物组相比,微乳组大鼠的挠鼻次数和喷嚏次数均无明显差异,提示辛鹅微乳对大鼠鼻黏膜刺激性较小。
表30.行为学评价分析表
注:*:与生理盐水组比较,有显著性差异(P<0.05)。
2、鼻黏膜刺激性实验结果
分析结果发现,与生理盐水组相比,空白微乳组、微乳组和阳性对照组均无明显差异(P>0.05),油溶液组有明显的差异(P<0.05),由图20可以看出,生理盐水组和空白微乳组中鼻黏膜组织结构较为连续、完整,层次清晰,黏膜柱状上皮排列较为整齐,细胞形态较为正常;微乳组鼻黏膜组织结构较为连续、完整,层次清晰,黏膜上皮排列较为整齐,固有层轻微出血并伴少量中性粒细胞;阳性药物组鼻黏膜组织结构较为连续、完整,层次清晰,部分黏膜上皮出现不同程度的变性、坏死或脱落,固有层有轻微出血,并伴有少量中性粒细胞和淋巴细胞;油溶液组鼻黏膜组织结构遭到严重破坏,部分上皮结构缺失,黏膜上皮及固有层细胞出现不同程度的变性、坏死或脱落,坏死区可见不同程度的中性粒细胞、淋巴细胞及少量浆细胞等炎细胞浸润。
注:*:与生理盐水组比较,无显著性差异(P>0.05);#:有显著性差异(P<0.05)
本实验通过鼻腔给药的方式,以生理盐水、空白微乳、盐酸西替利嗪、油溶液作为对照,考察辛鹅挥发油微乳连续给药7天对大鼠鼻黏膜的刺激性,将各组药物滴于大鼠两侧鼻孔,考察其安全性。在考察周期结束后,显微镜下观察发现生理盐水组、空白微乳组、阳性药物组和药物组鼻黏膜组织充血、水肿等指标变化不明显,但油溶液组较为明显,由实验结果可知,本发明辛鹅挥发油微乳制剂黏膜刺激性较小且损伤可逆。
综上,辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合使用可以改善过敏性鼻炎症状,有效治疗过敏性鼻炎。其中,当辛鹅挥发油和鹅不食草挥发油体积比为7∶1、14:1时发挥了协同增效作用,辛夷挥发油与鹅不食草挥发油体积比为7:1时治疗效果最佳。辛夷挥发油与鹅不食草挥发油联合可用于制备治疗过敏性鼻炎的药物。而将辛鹅挥发油制备成微乳制剂后,该微乳制剂外观均一,澄清透明、粒径适宜、性质稳定,符合微乳制剂的要求,且体外渗透吸收效果较好,同时治疗效果良好,对黏膜刺激性较小且损伤可逆,具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西中医药大学
<120> 一种辛鹅挥发油微乳制剂及其制备方法和用途
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Claims (10)
1.一种辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:它是以辛夷挥发油和鹅不食草挥发油为活性成分,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的微乳制剂。
2.根据权利要求1所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:它是由如下质量百分比的原辅料制备而成:
辛鹅混合挥发油1~20%,乳化剂5~50%,助乳化剂1~30%,油相0.2~5%,其余为水;
其中,辛鹅混合挥发油由辛夷挥发油和鹅不食草挥发油组成;所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为(1~28):(1~28);
优选地,所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为(7~14):(1~2);
更优选地,所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为7:1。
3.根据权利要求2所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:它是由如下质量百分比的原辅料制备而成:
辛鹅混合挥发油1.6%,乳化剂40%,助乳化剂20%,油相1.6%,其余为水;
其中,辛鹅混合挥发油由辛夷挥发油和鹅不食草挥发油组成;所述辛夷挥发油和鹅不食草挥发油的体积比为7:1。
4.根据权利要求1~3任一项所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:所述辛夷挥发油的制备方法包括如下步骤:称取辛夷药材,加水蒸馏提取,冷凝后油水分离,即得;
优选地,所述辛夷挥发油的制备方法包括如下步骤:称取辛夷药材粉碎,加8~10倍量的水蒸馏提取4~8小时,冷凝后油水分离,即得。
5.根据权利要求1~3任一项所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:所述鹅不食草挥发油的制备方法包括如下步骤:称取鹅不食草药材,加水蒸馏提取,冷凝后油水分离,即得;
优选地,所述鹅不食草挥发油的制备方法包括如下步骤:称取鹅不食草药材粉碎,加8~10倍量的水蒸馏提取6~8小时,冷凝后油水分离,即得。
6.根据权利要求1~3任一项所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:所述乳化剂选自吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、蓖麻油聚氧乙烯醚或吐温20;
和/或,所述助乳化剂选自无水乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇或聚乙二烯400;
和/或,所述油相选自肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或油酸。
7.根据权利要求6所述的辛鹅挥发油微乳制剂,其特征在于:
所述乳化剂选自吐温80;
和/或,所述助乳化剂选自聚乙二烯400;
和/或,所述油相选择肉豆蔻酸异丙酯。
8.一种制备权利要求1~7任一项所述的辛鹅挥发油微乳制剂的方法,其特征在于:它包括如下步骤:将辛夷挥发油、鹅不食草挥发油混合后,加入油相,再加入乳化剂及助乳化剂,搅拌均匀后加入水,分散均匀即可;
优选地,所述加入水的温度为20~40℃,搅拌速度为30~100转/分钟;
更优选地,所述加入水的温度为25℃,搅拌速度为40~60转/分钟。
9.一种权利要求1~7任一项所述的辛鹅挥发油微乳制剂在制备抗炎的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:所述药物为治疗鼻炎的药物;
优选地,所述药物为治疗过敏性鼻炎的药物。
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