CN114767706B - 玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于哮喘治疗药物技术领域，特别是涉及玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用。本发明通过实验研究发现，玉竹多糖能够改善过敏性哮喘相关细胞因子在气道中的释放，降低嗜酸性粒细胞数量，降低血清总IgE，改善过敏情况，并能改善哮喘小鼠肺部炎性浸润、杯状细胞化生、肺实质化等病理状况。因此，玉竹多糖可用于制成治疗哮喘的药物。

Description

玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用
技术领域
本发明属于哮喘治疗药物技术领域，特别是涉及玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用。
背景技术
支气管哮喘(以下简称哮喘)，在全球范围发病率较高。儿童哮喘伴随反复发作的喘息、咳嗽、气促、胸闷等临床表现，具有多种不同的临床和病理生理特征，以慢性气道炎症和气道高反应性为主要特征。
哮喘与免疫调节密切相关。个体易感性、病毒感染、过敏原暴露等因素导致免疫失衡引发哮喘，而且免疫细胞在哮喘的发展过程中起着关键作用。提高免疫力有助于减少病毒、过敏原引起的疾病(如流感、咳嗽等)，从而减少疾病引起的哮喘，但提高免疫力的药物并不都对哮喘有效，且无法避免哮喘的复发。
在早期生命中，免疫系统的成熟与微生物群的形成同时发生。由于肠道微生物对于调节免疫细胞功能和抵抗致病菌有着重要的影响，因此婴幼儿期的肠道微生物定植与失调同包括哮喘在内的众多呼吸系统疾病的发生密切相联。此外，肠道菌群失调诱发肠道损伤及黏膜免疫功能失调，加速了哮喘的发生与发展。故通常情况下，哮喘患者常从幼儿期开始出现症状，并且，哮喘儿童的肠道微生物组成与健康儿童相比有显著差异。但目前没有证据能够证实单纯的肠道菌群调节可以治疗哮喘，所以临床上即使采用益生菌，也仅将其用于辅助治疗。
发明内容
针对以上问题，本发明提供玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用。本发明通过实验研究发现，玉竹多糖能改善过敏性哮喘相关细胞因子在气道中的释放，降低嗜酸性粒细胞数量，降低血清总IgE，并能改善肺部炎性浸润、杯状细胞化生、肺实质化等由哮喘引发的病理状况。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一方面，本发明实施例提供玉竹多糖在制备治疗哮喘的药物中的应用。
玉竹来源于百合科植物黄精属玉竹的干燥根茎，性平，味甘，具有养阴润燥、生津止渴的功能，主要用于肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口渴，内热消渴。现代研究显示玉竹多糖能影响小鼠免疫功能及免疫细胞等，具有增强免疫功能，能够影响D-半乳糖致亚急性衰老小鼠体液免疫功能，能通过降低小鼠T、B淋巴细胞转化、减少CD8+T细胞数、恢复CD4+/CD8+T细胞数比值平衡从而延缓衰老，并有研究发现玉竹提取物抑制脾淋巴细胞分泌IL-2、刺激分泌INF-γ等是抑制脾脏淋巴细胞转化的机制。现代研究还证明了玉竹的两种中性多糖POP-1和PCP-1均能调节巨噬细胞活力。但目前有关玉竹改善过敏性哮喘的作用尚无报道。
过敏性哮喘的慢性炎症多是由常见的、非致病性的过敏原产生的Th2型免疫反应增强所致，且IgE水平升高。Th2细胞产生的细胞因子IL-4、IL-5、IL-9等通过刺激B细胞产生嗜酸性粒细胞和IgE抗体，进而促进肥大细胞释放组胺、5-羟色胺和白三烯，造成支气管收缩及过敏反应。本发明通过实验研究发现，玉竹多糖能够改善过敏性哮喘相关细胞因子在气道中的释放，降低嗜酸性粒细胞数量，降低血清总IgE，改善过敏情况，并能改善哮喘小鼠肺部炎性浸润、杯状细胞化生、肺实质化等病理状况。因此，玉竹多糖可用于制成治疗哮喘的药物。
优选地，所述治疗哮喘的药物为治疗儿童哮喘的药物。
优选地，所述玉竹多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖；所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.5～1.8：1.0～1.3：65～75：1.0～1.3：500～550。进一步优选地，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.6～1.7：1.1～1.2：68～70：1.1～1.2：520～530。
优选地，所述玉竹多糖的制备方法为：将玉竹药材以水回流提取，向所得提取液中加入乙醇至乙醇的体积百分浓度达到75％～85％，静置8h以上，将所得沉淀分离、干燥，即得。
第二方面，本发明实施例还提供了一种治疗哮喘的药物，所述药物的活性成分包括玉竹多糖。
优选地，所述玉竹多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖；所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.5～1.8：1.0～1.3：65～75：1.0～1.3：500～550。进一步优选地，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.6～1.7：1.1～1.2：68～70：1.1～1.2：520～530。
优选地，所述玉竹多糖的制备方法为：将玉竹药材以水回流提取，向所得提取液中加入乙醇至乙醇的体积百分浓度达到75％～85％，静置8h以上，将所得沉淀分离、干燥，即得。
优选地，所述药物为口服制剂或注射制剂。
将本发明所提供的组合物制成口服制剂和注射制剂后，通过口服、注射的给药方式，即可发挥治疗哮喘的作用。
优选地，所述药物为口服制剂时，还包括药学上可接受的口服制剂药用辅料。
优选地，所述药物为注射制剂时，还包括药学上可接受的注射制剂药用辅料。
附图说明
图1为本发明实施例4中各组OVA哮喘小鼠的IL-13、IL-5、IL-4；
图2为本发明实施例5中各组OVA哮喘小鼠支气管灌洗液中的嗜酸性粒细胞的影响；其中A为瑞氏-姬姆萨染色结果，B为嗜酸性粒细胞计数，**表示P<0.01，#表示P<0.05；
图3为本发明实施例6中各组OVA哮喘小鼠血清总IgE，其中**表示P<0.01，#表示P<0.05；
图4为本发明实施例7中各组OVA哮喘小鼠肺组织HE染色结果；
图5为本发明实施例7中各组OVA哮喘小鼠肺组织PAS染色结果；
图6为本发明实施例8中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群Alpha多样性分析中的Shannon指数，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图7为本发明实施例8中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群Alpha多样性分析中的Simpson指数，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图8为本发明实施例8中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群Alpha多样性分析中的Ace指数，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图9为本发明实施例8中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群Alpha多样性分析中的Chao1指数，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图10为本发明实施例8中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群Beta多样性PCoA分析结果；
图11为本发明实施例9中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群结构在门水平上物种组成相对丰度及差异分析结果，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图12为本发明实施例9中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群结构在属水平上物种组成相对丰度及差异分析结果，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图13为本发明实施例9中各组OVA哮喘小鼠肠道菌群结构在种水平上物种组成相对丰度及差异分析结果，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图14为本发明实施例10中标准品的色谱图；
图15为本发明实施例10中样品的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步举例说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所采用的玉竹多糖通过以下方法制备得到：
称取2kg玉竹饮片，打碎机打碎，按10：1的液料比加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀后充分浸泡1h，使药和水充分混合浸湿，加热至微沸，开始计时2h。待药液冷却置常温后用9层纱布过滤药渣，滤得的药渣按8：1的液料比进行第二次提取，提取时间2h，两次滤液合并后在4度下存放。采用95％乙醇调节乙醇的终浓度为80％，4℃静置醇沉过夜。用旋转蒸发仪将沉淀中的乙醇完全旋出，冷冻干燥后得玉竹多糖254g，呈淡黄色固体粉末。
以下实施例中所采用的实验动物为5周龄的SPF级BALB/c雄性小鼠，体重为14±2g，由北京维通利华动物实验中心提供。小鼠在天津中医药大学实验动物中心(天津)饲养，室温(22±2℃)，相对湿度58-65％，光周期12h交替。
以下实施例中所采用的其他原料、试剂或仪器等，如未注明生产厂商或特殊说明，均为从商业途径获得的常规产品。未注明具体条件的试验，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1
本发明实施例提供了一种玉竹多糖的制备方法：
称取2kg玉竹饮片，打碎机打碎，按10：1的液料比加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀后充分浸泡1h，使药和水充分混合浸湿，加热至微沸，开始计时2h。待药液冷却置常温后用9层纱布过滤药渣，滤得的药渣按8：1的液料比进行第二次提取，提取时间2h，两次滤液合并后在4℃下存放。采用95％乙醇调节乙醇的终浓度为80％，4℃静置醇沉过夜。用旋转蒸发仪将沉淀中的乙醇完全旋出，冷冻干燥后得玉竹多糖254g，呈淡黄色固体粉末。
实施例2
本发明实施例提供了一种玉竹多糖的制备方法：
称取2kg玉竹饮片，打碎机打碎，按9：1的液料比加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀后充分浸泡1h，使药和水充分混合浸湿，加热至微沸，开始计时2h。待药液冷却置常温后用9层纱布过滤药渣，滤得的药渣按7：1的液料比进行第二次提取，提取时间2h，两次滤液合并后在4℃下存放。采用95％乙醇调节乙醇的终浓度为75％，4℃静置醇沉过夜。用旋转蒸发仪将沉淀中的乙醇完全旋出，冷冻干燥后得玉竹多糖246g，呈淡黄色固体粉末。
实施例3
本发明实施例提供了一种玉竹多糖的制备方法：
称取2kg玉竹饮片，打碎机打碎，按11：1的液料比加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀后充分浸泡1h，使药和水充分混合浸湿，加热至微沸，开始计时2h。待药液冷却置常温后用9层纱布过滤药渣，滤得的药渣按9：1的液料比进行第二次提取，提取时间2h，两次滤液合并后在4℃下存放。采用95％乙醇调节乙醇的终浓度为85％，4℃静置醇沉过夜。用旋转蒸发仪将沉淀中的乙醇完全旋出，冷冻干燥后得玉竹多糖249g，呈淡黄色固体粉末。
实施例4
本发明实施例提供了玉竹多糖在降低BALB/c小鼠支气管灌洗液(BAL)中Th2细胞因子水平的作用。本实施例所采用的玉竹多糖为实施例1制得的玉竹多糖。
如表1所示，实验共分三组，对照组(3周)、模型组(3周)、给药组(3周)，每组测试6只相同处理的小鼠，给药前各组小鼠适应性饲养一周。给药前和实验期间的饲料均满足SPF级饲养和营养需要。各组小鼠给药方式为：
模型组(3周)：每只给予0.2mL OVA致敏剂(含有50μgOVA，4mg氢氧化铝凝胶)，每隔7天腹腔注射一次，共3次，最后一次致敏(7周龄)后一天起使用2％OVA激发剂连续雾化激发5天，最后一次激发后一天(8周龄)取材；
给药组(3周)：按模型组的方式进行造模，并同时给与实施例1制得的玉竹多糖200mg/kg，剂量为按每10g体重灌服0.1mL计算，连续喂养3周(最后一次激发)；
对照组(3周)：按模型组的给药方式进行给药，腹腔注射、雾化及灌胃均使用同等体积生理盐水。
表1玉竹多糖对于OVA哮喘动物实验给药分组及剂量
分组(给药/时间) 分组缩写 给药量
对照组(3周) Sham -
模型组(3周) Model -
给药组(3周) YZDT 玉竹多糖200mg/kg
分别以三组实验小鼠的支气管灌洗液细胞因子作为检测样品。
支气管灌洗液制备：
暴露气管，气管下埋线，进行气管插管(切忌过度伸入，以防刺穿肺脏)，固定气管插管。注射器中吸入0.6mL生理盐水，接上气管插管，注射入肺内。轻按摩胸腔10s，吸出生理盐水，加入1.5mL离心管。重复3次，加入同一个1.5mL离心管。将该1.5mL离心管300g离心5min，取上清用于细胞因子检测。ELISA检测：
提前将SEA077Mu、SEA078Mu、SEA060Mu试剂盒(武汉云克隆公司，中国)和样本平衡至室温(18-25℃)后，按照下述步骤进行实验。
使用标准品稀释液按照以下浓度稀释IL-4、IL-5、IL-13ELISA试剂盒中对应的标准品冻干粉：共1000、500、250、125、62.5、25、31.2、15.6、0pg/mL九个浓度。使用检测稀释液按照1:100的比例稀释检测溶液A(生物素化的IL-13、IL-5、IL-4抗体)或检测溶液B，充分混匀，现用现配。将20mL 30×洗涤液原液加入580mL超纯水中，以获得1×洗涤液。在96孔Elisa板中依次加入100μL各浓度标准品及待测样本，在酶标板上覆盖防蒸发膜，置于恒温孵育箱中37℃恒温孵育2h。吸取液体，甩干(不用洗涤)。每孔加入100μL新鲜配置的检测溶液A，覆盖防蒸发膜，置于恒温孵育箱中37℃恒温孵育1h。吸取液体，每孔加入350μL洗涤液并置于摇床上清洗1-2min，去除孔内液体；洗涤过程重复操作3次，最后一次洗涤后甩干，每孔加入100μL新鲜配置的检测溶液B(辣根过氧化物酶标记的亲和素)，覆盖防蒸发膜，置于恒温孵育箱中37℃恒温孵育30min。吸取液体，每孔加入350μL洗涤液并置于摇床上清洗1-2min，去除孔内液体；洗涤过程重复操作5次，最后一次洗涤后甩干，加底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液90μL，覆盖防蒸发膜，置于恒温孵育箱中37℃恒温避光孵育15-25min。待标准品前4孔呈现阶梯蓝色，立刻加入50μL终止液终止反应，于酶标仪在450nm波长下检测吸光度(OD值)，计算样品浓度。实验结果：
图1显示，与对照组相比，模型组支气管灌洗液中IL-13、IL-5、IL-4水平显著升高(p<0.01)，且与模型组相比，给药组的IL-13、IL-5、IL-4水平显著降低(p<0.01)。由以上结果可见，玉竹多糖可显著降低OVA哮喘小鼠Th2细胞相关细胞因子，改善过敏性哮喘相关细胞因子在气道中的释放。
实施例5
本发明实施例提供了玉竹多糖降低BALB/c小鼠支气管灌洗液(BAL)中嗜酸性粒细胞数量的作用。
取实施例4中的支气管灌洗液进行300g离心5min，取下层细胞进行瑞氏-姬姆萨染色。
瑞氏-姬姆萨染色步骤：
支气管灌洗液沉淀细胞使用100μL PBS重悬细胞，均匀涂片，自然风干。滴加瑞氏-吉姆萨染液于涂片上，并让染液覆盖整个标本涂片，染色。将等量的磷酸盐缓冲液滴加于瑞氏-吉姆萨染液上面，以洗耳球使两液充分混合，染色。水洗，冲洗时不能先倒掉染色液，可缓慢从玻片一端冲洗，以防有沉渣沉淀在标本上。干燥、镜检、拍照。
实验结果：
图2显示，与对照组相比，模型组支气管灌洗液中出现显著的嗜酸性粒细胞增多(p<0.01)。在给与玉竹多糖后，与模型组相比，给药组的嗜酸性粒细胞显著减少(p<0.05)。由以上结果可见，玉竹多糖可显著降低OVA哮喘小鼠的嗜酸性粒细胞增多的情况。
实施例6
本发明实施例提供了玉竹多糖降低BALB/c小鼠血清总IgE的作用。本实施例所采用的玉竹多糖为实施例1制得的玉竹多糖。
按实施例4中的分组和给药方法对实验动物进行分组和给药(本实施例的小鼠与实施例4中的小鼠为同一批次的不同小鼠)，每组测试6只相同处理的小鼠。各组小鼠在最后一次激发后转天进行内眦取血，采集后2h内4℃低温离心，分装上层血清于1.5mL EP管中。
实验结果：
小鼠血清总IgE结果显示(图3)，与对照组相比，模型组血清总IgE显著升高(p<0.01)，给药组与模型组相比能明显降低总IgE(p<0.05)。提示玉竹多糖可显著降低OVA哮喘小鼠血清总IgE，改善小鼠过敏情况。
实施例7
本发明实施例提供了玉竹多糖改善BALB/c小鼠肺部病理的情况。
哮喘发生后，小鼠气道上皮及肺泡发生损伤，肺部病理学形态发生改变。本实验选择HE染色和PAS染色对实施例6中完成内眦取血的小鼠进行肺部病变比较，从而观察玉竹多糖对OVA哮喘小鼠肺部形态学的影响。
取实施例6中完成内眦取血的小鼠右下肺于4％多聚甲醛组织固定液中固定7天。将组织块放于包埋盒内，置于福尔马林溶液中。将包埋盒置于提篮内插好，放入脱水室，进行脱水处理。50％v/v乙醇，2h；75％v/v乙醇，2h；95％v/v乙醇I，1h；95％v/v乙醇II，1h；无水乙醇，2h；无水乙醇，2h；二甲苯I，20min；二甲苯II，20min；石蜡I，0.5h；石蜡II，0.5h；石蜡III，0.5h。将包埋蜡温度设定为58℃，操作台上包埋后即刻放在冷台上降温，带蜡块完全变硬后，将其置于阴暗环境中保存。将切片厚度设定为5mm，将展片池温度设定为40℃，捞片后标记，并放置于烤片机上以60℃烤片2h。
HE染色方法：
将石蜡切片放于烤箱60℃10min；将脱蜡后的切片取出，于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10min，再于无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95％v/v乙醇、75％v/v乙醇中各浸泡5min，流水冲洗5min。l％伊红溶液染色1-2min，流水冲洗15-30sec；75％v/v乙醇浸泡3min，95％v/v乙醇浸泡3min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各浸泡3-5min，上行梯度脱水；于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中各浸泡5min进行透明。中性树胶滴加玻片组织周围，后用盖玻片覆盖封片。观察：光镜显微镜下观察并拍照、记录。
PAS染色：
石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，70％酒精洗。浸入高碘酸酒精溶液10min(溶液温度为17-20℃)。70％酒精洗后，浸入还原液中1min(溶液温度为17-20℃)。70％酒精洗后，浸入无色盐基性品红溶液1-1.5h。流水冲洗10min，用Mayer's苏木素复染液复染细胞核3-5min，再用1％盐酸酒精分化。流水冲洗后，脱水，透明，封固。光镜显微镜下观察并拍照、记录。
实验结果：
肺组织经HE染色(图4)后，于显微镜下拍照，观察各组小鼠肺组织的病理改变。与对照组相比，模型组小鼠肺组织支气管周围出现炎细胞浸润、气管壁增厚，肺泡壁增厚，肺实质化增加。在给与玉竹多糖后，肺部病理明显改善。
PAS染色(图5)结果显示模型组气道出现明显的杯状细胞化生、粘液分泌的现象。相较于模型组，给药组杯状细胞化生显著被抑制，且粘液分泌显著减少。研究结果显示，玉竹多糖可以显著改善了OVA哮喘小鼠肺部炎性浸润、杯状细胞化生、肺实质化等病理状况。
实施例8
本发明实施例提供了玉竹多糖对OVA哮喘小鼠肠道菌群多样性的调节作用。本实施例所采用的玉竹多糖为实施例1制得的玉竹多糖。
按实施例4中的分组和给药方法对实验动物进行分组和给药(本实施例的小鼠与实施例4中的小鼠为同一批次的不同小鼠)，每组测试6只相同处理的小鼠。给药3周后，用手指按摩小鼠下腹部，找几个干净并灭菌的盒子，在盒子底部垫上几张灭菌后的滤纸，把小鼠放到滤纸上等待，收集所需的粪便。用干净的镊子放到灭菌过的EP管中，立即密封，将所有样品置于-80℃保存后送检。
Alpha多样性分析指数包括Chao1和Ace(确定物种丰富度)、Shannon和Simpson指数(确定物种多样性)，以描述不同处理样品中细菌的组成。
Alpha多样性和Beta多样性分析的方法：首先对不同样品在97％一致性阈值下的Alpha多样性分析指数(shannon、simpson、chao1、Ace)进行统计，分析样本物种多样性的复杂性。使用的UPARSE软件(version 7.1http://drive5.com/uparse/)，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库(SSU123)，设置比对阈值为70％。基于Unweighted Unifrac距离来进行主坐标分析(PCoA，PrincipalCo-ordinates Analysis)分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行做图展示。样品距离越接近，表示物种组成结构越相似。使用QIIME计算Beta多样性距离矩阵，然后用R软件(Version 2.15.3)绘制PCoA。
实验结果：
如图6～图9所示，与模型组相比，给药后可提高Shannon指数、Chao指数和Ace指数，降低Simpson指数。由该结果可见，玉竹多糖对Alpha多样性有提高作用，但无明显差异，而各组间相对丰度没有显著差异。
如图10所示，基于UniFrac的Beta多样性PCoA分析显示了各个组的微生物群组成的明显聚类，进行OVA哮喘造模后，肠道菌群结构发生了明显改变，同样在玉竹多糖给药后也明显改变。
实施例9
Th1细胞可分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β等促进巨噬细胞介导的免疫应答过程。研究表明，Th1/Th2平衡及Treg细胞的免疫功能受到肠道微生物的调节。例如，肠道分节丝状菌(segmented filamentous bacteria，SFB)直接刺激Th17细胞分化，梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)参与诱导Treg产生，拟杆菌参与调节Th1/Th2平衡。本发明实施例提供了玉竹多糖对OVA哮喘小鼠肠道菌群结构的调节作用。待测样品为实施例8中各组小鼠的粪便。
利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对所有样品的全部Effective Tags进行聚类，默认以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：phylum(门)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用fdr多重检验校正，使用Kruskal-Wallis Htest，简称克氏秩和检验，对多组样本的物种进行显著性差异分析。
实验结果：
图11显示了小鼠肠道菌群中最丰富的门，在门水平上，拟杆菌(Bacteroidota)、厚壁菌(Firmicutes)、疣微菌(Verrucomicrobiota)、弯曲菌(Campilobacterota)和脱硫菌(Desulfobacterota)构成了所有样品中的五个优势门。与对照组相比，模型组肠道菌群中厚壁菌、疣微菌丰度较高，拟杆菌、弯曲菌和脱硫菌丰度较低。给药后，弯曲菌和脱硫菌(p<0.05)增多，其他均没有显著差异。
在属水平上(图12)，丰度较高的是norank_f_Muribaculaceae、乳杆菌(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae NK4A136 group)、拟杆菌(Bacteroides)、一种未定等级的梭菌UCG-014(norank_f_norank_o_Clostridia UCG-014)、一种未分类的毛螺菌(unclassified_f_Lachnospiraceae)、一种未定等级的毛螺菌(unrank_f_Lachnospiraceae)、Alistipes、理研菌科RC9(Rikenellaceae RC9 gutgroup)、拟普雷沃菌(Alloprevotella)。与对照组相比，模型组中乳杆菌、拟杆菌、拟普雷沃菌丰度降低，一种未定等级的梭菌UCG-014、一种未定等级的毛螺菌、理研菌科RC9丰度升高。给药后，乳杆菌(p<0.01)、拟杆菌增多，一种未定等级的梭菌UCG-014、一种未定等级的毛螺菌、理研菌科RC9丰度减少。结果表明，玉竹多糖对OVA哮喘小鼠肠道菌群结构具有正向调节作用。
在种水平上(图13)，模型组乳杆菌中鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)等丰度降低，给药后丰度升高，其中鼠乳杆菌显著增多(p<0.01)。综上，玉竹多糖可通过增加鼠乳杆菌等乳杆菌的肠道定植，改善肠道菌群稳态。
给药后所升高的肠道菌群如表2和表3所示。
表2玉竹多糖给药后升高的肠道菌群
中文名 拉丁名
弯曲菌 Campilobacterota
脱硫菌 Desulfobacterota
乳杆菌属 Lactobacillus
鼠乳杆菌 Lactobacillus murinus
罗伊氏乳杆菌 Lactobacillus reuteri
约氏乳杆菌 Lactobacillus johnsonii
拟杆菌属 Bacteroides
表3玉竹多糖给药后降低的肠道菌群
Figure BDA0003526925380000131
Figure BDA0003526925380000141
实施例10
本发明实施例测定了实施例1制得的玉竹多糖的单糖组成。
多糖类化合物结构复杂，测定玉竹多糖的单糖及含量可以为其结构表征提供重要信息。本实施例通过酸解将实施例1制得的玉竹多糖分解为单糖，经过离子交换色谱柱进行分离，电化学检测器进行测定。由测定结果可知，实施例1制得的玉竹多糖中含有的单糖种类及质量如表4所示：
表4
Figure BDA0003526925380000142
注：“-”表示该项目未检测到该物质，原因可能是样本中该物质含量低于仪器检出限或样本中不含有该物质。
实施例11
本发明实施例提供了一种治疗哮喘的片剂，活性成分为玉竹多糖，辅料为药学可接受的片剂辅料。其中玉竹多糖按实施例1、实施例2或实施例3的制备方法制得。
实施例12
本发明实施例提供了一种治疗哮喘的注射液，活性成分为玉竹多糖，辅料为药学可接受的注射液辅料。其中玉竹多糖按实施例1、实施例2或实施例3的制备方法制得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.玉竹多糖在制备治疗过敏性哮喘的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗过敏性哮喘的药物为治疗儿童过敏性哮喘的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述玉竹多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖；所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.5~1.8：1.0~1.3：65~75：1.0~1.3：500~550。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖的质量比为1.6~1.7：1.1~1.2：68~70：1.1~1.2：520~530。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉竹多糖的制备方法为：将玉竹药材以水回流提取，向所得提取液中加入乙醇至乙醇的体积百分浓度达到75%~85%，静置8h以上，将所得沉淀分离、干燥，即得。
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