CN115813908A - 芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制备技术领域，特别是涉及芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。本发明通过液相质谱技术，发现芹菜素是罗欧咳祖帕发挥抗哮喘作用的药效物质之一，采用芹菜素进行体内和体外干预小鼠慢性哮喘和人气道上皮细胞(HBE)凋亡实验。体外结果显示，芹菜素能抑制HBE的凋亡水平、下调线粒体膜电位及相关凋亡蛋白；体内结果显示，芹菜素能降低卵蛋白(OVA)致敏小鼠的气道上皮细胞凋亡、下调线粒体相关凋亡蛋白。结果表明，芹菜素可以抑制气道上皮细胞凋亡，特别是抑制线粒体介导的气道上皮细胞凋亡，进而在体内显示抗哮喘气道重构的作用。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，特别是涉及芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。
背景技术
目前，有相当多的文献报道上皮细胞凋亡可能在哮喘患者发病及气道重塑中起到一定的作用。其发挥作用可能通过JNK、ERK和p38 MAPK三种经典途径。JNK和p38 MAPK在细胞暴露于各种物理、化学和生物应激刺激引起的应激后被明显地激活，被激活的JNK和p38MAPK在细胞生存和死亡中发挥关键作用。目前，大量的文献支持JNK和p38 MAPK介导促凋亡过程，许多Bcl-2家族蛋白在转录水平或转录后水平接受其调节。Bcl-2家族蛋白改变线粒体外膜的通透性并释放细胞色素c，这是内在凋亡途径的关键步骤之一。细胞色素c的释放诱发了caspase-9的激活，随后是caspase-3的激活，导致细胞凋亡。值得注意的是，caspase-9和随后的caspase-3的激活导致Bcl-2蛋白水解，从而促进更多细胞色素c的释放和caspase-9/3的激活，形成一个正反馈，进一步诱发细胞凋亡。
但是现有研究中无法科学的确认罗欧咳祖帕中发挥抗哮喘作用的药效物质，其抗哮喘的机制也需要深入的探索。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。本发明发现芹菜素是罗欧咳祖帕发挥抗哮喘作用的药效物质之一，芹菜素通过MAPK(JNK、ERK和p38 MAPK)和气道上皮细胞凋亡途径发挥抗哮喘作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。
优选的，所述上皮细胞凋亡包括线粒体介导的上皮细胞凋亡。
优选的，所述上皮细胞包括气道上皮细胞。
本发明提供了芹菜素在制备防治哮喘药物中的应用。
优选的，所述哮喘包括慢性哮喘。
优选的，所述慢性哮喘包括哮喘气道重构。
有益效果：
本发明提供了芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。本发明通过液相质谱技术，发现芹菜素是罗欧咳祖帕发挥抗哮喘作用的药效物质之一(见图17和图18)，采用芹菜素进行体内和体外干预小鼠慢性哮喘和人气道上皮细胞(HBE)凋亡实验。体外结果显示，芹菜素能抑制HBE的凋亡水平、下调线粒体膜电位及相关凋亡蛋白；体内结果显示，芹菜素能降低卵蛋白(OVA)致敏小鼠的气道上皮细胞凋亡、下调线粒体相关凋亡蛋白。结果表明，芹菜素可以抑制气道上皮细胞凋亡，特别是抑制线粒体介导的气道上皮细胞凋亡，进而在体内显示抗哮喘气道重构的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为人气道上皮细胞(HBE)凋亡的流式检测结果；
图2为不同组细胞凋亡率计算结果；
图3为活细胞工作站下观察线粒体膜电位结果；
图4为线粒体质量分析的流式分析结果；
图5为相关凋亡蛋白的检测结果；
图6为不同组的TUNEL染色荧光显微镜下观察结果；
图7为不同组气道上皮凋亡程度和相对平均灰度值结果；
图8为Masson染色结果；
图9为不同组胶原沉积百分比结果；
图10为肺组织病理切片气道上皮电镜观察结果；
图11～14为支气管肺泡灌洗液细胞计数及炎症因子的ELISA检测结果；
图15为肺组织病理切片HE染色炎症结果；
图16为不同组的HE评分结果；
图17为罗欧咳祖帕负离子模式下的HPLC-MS色谱图；
图18为罗欧咳祖帕负离子模式下基峰离子的化合物鉴定结果；
其中#为模型组对比正常组P＜0.05，##为P＜0.01；*为给药组对比模型组P＜0.05，**为P＜0.01。
具体实施方式
本发明提供了芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。在本发明中，所述上皮细胞凋亡优选包括线粒体介导的上皮细胞凋亡；所述上皮细胞优选包括气道上皮细胞。
本发明所述芹菜素优选购自上海融禾winherb(THD046)，所述芹菜素属黄酮类化合物，分子式C15H10O5，分子量为270.24，结构式如下所示：
物性参数：外观性状呈黄色针状结晶(吡啶水溶液)，几乎不溶于水，部分溶于热酒精，溶于稀KOH溶液。密度1.548，熔点345～350℃，沸点：555.5℃at 760mmHg。溶解度：DMSO：27mg/mL。
本发明分别以屋尘螨(HDM)刺激人气道上皮细胞系HBE建立体外凋亡模型，以卵蛋白(OVA)致敏C57BL/6J小鼠建立慢性哮喘动物模型，采用芹菜素干预，并以地塞米松为对照，观察芹菜素对体外HBE凋亡、线粒体膜电位、凋亡相关蛋白的影响，以及对慢性哮喘小鼠的气道上皮细胞凋亡与气道重构的影响。体外结果显示，芹菜素能抑制HBE的凋亡水平、下调线粒体膜电位及相关凋亡蛋白；体内结果显示，芹菜素能降低卵蛋白(OVA)致敏小鼠的气道上皮细胞凋亡、下调线粒体相关凋亡蛋白。结果表明，芹菜素可以抑制气道上皮细胞凋亡，特别是抑制线粒体介导的气道上皮细胞凋亡，进而在体内显示抗哮喘气道重构的作用，为芹菜素制备为防治慢性哮喘的有效药物提供了理论基础。
本发明还提供了芹菜素在制备防治哮喘药物中的应用。
在本发明中，所述哮喘优选包括慢性哮喘；所述慢性哮喘优选包括哮喘气道重构。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
芹菜素抑制人气道上皮细胞凋亡实验
1.细胞株：HBE细胞来自中国科学院(中国上海)。细胞在37℃，5％CO2和95％空气的湿润环境中培养。使用含有10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis，MO)的DMEM高糖培养基进行培养，48h更换培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化传代，2天传代1次，传代3次后的HBE细胞用于后续实验。
2.药品与主要试剂：芹菜素纯度＞98％，购自上海融禾winherb(THD046)；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(Beyotime，北京，中国)。
3.模型制备与分组药物：
①正常对照组：将HBE细胞培养在6孔板中，细胞数为100000个/孔，每孔加入2mL10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis，MO)的DMEM高糖培养基，同时加入20μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照，处理16小时；
②HDM组：和正常对照组相似，唯一区别在于，将磷酸盐缓冲盐水(PBS)替换为浓度为10mg/mL的屋尘螨提取物(HDM，Dermatophagoidespteronyssinus，STALLERGENES GREER，Lenoir，NC，批号381017)，使10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis,MO)的DMEM高糖培养基中的HDM浓度为200μg/mL，处理16小时；
③HDM+API 10μM组：和正常对照组相似，唯一区别在于，将磷酸盐缓冲盐水(PBS)替换为HDM与Apigenin，使10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis,MO)的DMEM高糖培养基中的HDM浓度为200μg/mL，Apigenin浓度为10μM，处理16小时；
④HDM+API 20μM组：和正常对照组相似，唯一区别在于，将磷酸盐缓冲盐水(PBS)替换为HDM与Apigenin，使10％胎牛血清(FBS，Sigma，St.Louis,MO)的DMEM高糖培养基中的HDM浓度为200μg/mL，Apigenin浓度为20μM，处理16小时；
4.人气道上皮细胞(HBE)凋亡的流式检测：通过AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(Beyotime，北京，中国)按照制造商的说明进行检测。将步骤3不同组处理16小时的细胞分别用不含EDTA的胰酶消化下来，PBS洗一次，使用含5％胎牛血清的PBS重悬，调整细胞浓度为1×105/mL，离心后用195μLAnnexin V-EGFP结合液重悬，加入5μLAnnexinV-EGFP和10μLPI，室温(20～25℃)避光孵育20分钟，随后置于冰浴中，避光孵育，避光孵育过程中可以重悬细胞3次以改善染色效果，随即进行流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)检测，结果见图1。每个样品细胞收取数10000个细胞，每组进行3次平行重复实验，用FlowJo进行分析，计算细胞凋亡率，结果见图2和表1。
表1不同组细胞凋亡率
| 组别 | 细胞凋亡率 |
| 正常对照组 | 8.71±3.13 |
| HDM组 | 26.74±8.42 |
| HDM+API10μM组 | 27.56±8.35 |
| HDM+API200μM组 | 21.00±8.70 |
由图1～2和表1可知，芹菜素能抑制HBE细胞的凋亡，HDM组HBE细胞凋亡率明显增加，HDM+芹菜素20μM组和芹菜素10μM组减少，说明芹菜素能抑制HBE细胞凋亡。
5.线粒体膜电位的荧光检测：
步骤3不同组处理16小时后吸除培养液，用PBS洗涤细胞一次，分别加入1mL细胞培养液，然后加入1mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37度孵育30分钟，之后吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，最后加入2mL细胞培养液，在活细胞工作站下观察线粒体膜电位，结果见图3。
由图3可知，芹菜素逆转了HDM引起的MMP的下降。
6.线粒体质量分析流式分析：
步骤3不同组处理16小时后吸除培养液，用不含EDTA的胰酶消化下来，PBS洗一次用PBS洗涤细胞一次，加入1mLTMRE染色工作液，之后于细胞培养箱中37度孵育20分钟，随即进行流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)检测，每个样品收取10000个细胞，每组进行3次平行重复实验，用FlowJo进行分析，结果见图4和表2。
表2不同处理组线粒体质量荧光强度
| 组别 | 线粒体质量荧光强度 |
| 正常对照组 | 490.00±9.17 |
| HDM组 | 265.33±50.20 |
| HDM+API10μM组 | 345.33±34.07 |
| HDM+API200μM组 | 355.67±15.70 |
由图4和表2可知，HDM降低了HBE细胞的线粒体质量，而芹菜素减弱了HDM引起的线粒体质量的降低。
7.相关凋亡蛋白的检测：
步骤3不同组处理16小时后，从6孔板中提取总蛋白，在六孔板中加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的冷RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国北京)，在4℃，14000g下离心10分钟。测量上清液总蛋白质的浓度并加入样品装载缓冲液(Beyotime，中国北京)，使样品蛋白浓度为1μg/μL。样品通过10％的SDS-PAGE分离并转移到0.25微米的PVDF膜上。然后在室温下用快速阻断液阻断膜，分别用不同的一抗(抗体1：1000倍稀释)在4℃下孵育过夜，然后用HRP结合的二抗(Beyotime，中国北京，1：1000倍稀释)孵育1小时；所述一抗为：抗Bax、抗Bcl-2、抗裂解caspase-3、抗细胞色素c和抗-Tubulin，均购自Cell SignalingTechnology(Danvers，MA，USA)。用ECL检测试剂盒(Millipore)检测条带，用LAS4000成像系统(Fujifilm公司，东京，日本)采集，结果见图5。
由图5可知，与对照组相比，HDM组的细胞色素c、Bax和裂解caspase-3的表达增加，Bcl-2的表达减少。在芹菜素干预组，细胞色素c、Bax和裂解caspase-3的表达下调，Bcl-2的表达上调，值得注意的是，当芹菜素为20μM时，芹菜素对细胞凋亡的抑制更为明显。
实施例2
芹菜素抗小鼠哮喘气道上皮凋亡实验
1.实验动物：SPF级，雄性C57/BL6小鼠，4～5周龄，上海杰思捷实验动物有限公司提供。
2.药品与主要试剂：芹菜素纯度＞98％，购自上海融禾winherb(THD046)；TUNELAssay凋亡检测试剂盒(Beyotime，中国北京)
3.动物模型制备与分组药物：将60只小鼠随机分为正常组(12只)和模型制备组(48只)。模型制备组小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射含有卵蛋白(OVA，grade V，Sigma，USA)100μg和氢氧化铝[Al(OH)3]1mg的生理盐水混悬液0.2mL；
第21天，进行干预处理，具体如下：模型制备组48只小鼠按照随机数字法分为4组：模型组(OVA/生理盐水组)、芹菜素低剂量组(10mg/kg/d，其中kg为小鼠体重，下同)、芹菜素高剂量组(20mg/kg/d)、地塞米松阳性对照组(2mg/kg/d)，并分别灌胃给予相应规格的药物进行干预，正常组灌胃给予相同体积的生理盐水进行对照操作；第21天开始，重复上述干预处理，每日一次持续6周；
从第21天至第62天，将小鼠暴露于用超声雾化器(402AI，鱼跃)超声雾化3％OVA(Ⅱ级，g/100mL)溶液30分钟(灌药后半小时开始雾化)每周三次，持续6周。
4.小鼠肺部细胞凋亡水平检测：将右肺上叶分离，并在4％多聚甲醛溶液中固定，固定好的肺组织经脱水处理后，进行石蜡包埋，制作切片，使用TUNEL Assay凋亡检测试剂盒(Servicebio，中国武汉)检测DNA片段。室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟，重复3次；然后无水乙醇浸泡5分钟，重复2次；最后用梯度乙醇(85％、75％)、双蒸水各浸泡1次，每次5分钟；用PBS润洗切片，并去掉样本周围多余液体；使用组化笔沿组织外围轮廓画一个与组织间隔2-3mm的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；配制Proteinase K工作液：按1：9体积比，用PBS作为稀释液来稀释Proteinase K(200μg/mL)原液，使其终浓度为20μg/mL；每个样本上滴加100μL上述Proteinase K工作液，完全覆盖组织，37度孵育20分钟；用PBS溶液浸润清洗样本3次，每次5分钟，去掉样本上多余的液体，将适量破膜液滴加到组织上，充分浸润组织，室温处理20分钟；破膜处理成后同样的用PBS溶液润洗样本3次，每次5分钟；处理后的样本放在湿盒中保持样本湿润。
平衡：每个样本滴加50μL EquilibrationBuffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10分钟；在冰上解冻TMR-5-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer，并按照Recombinant TdT enzyme：TMR-5-dUTP Labeling Mix：Equilibration Buffer＝1μL：5μL：50μL(1：5：50)比例混合足够用于所有实验的TdT孵育缓冲液，同时准备一份不含Recombinant TdT enzyme的对照TdT孵育缓冲液，用ddH2O替代；
标记：去掉平衡的Equilibration Buffer，然后在每份组织样本上加入56μLTdT孵育缓冲液，在37度孵育1h；注意不能干片，载玻片要避光；立即用PBS润洗组织样本，清洗4次，每次5分钟；用滤纸轻轻擦掉样本周围的PBS溶液；
核染色：样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有DAPI溶液(用PBS新鲜配制并稀释)的染色缸，室温放置8分钟；
封片：样本染色完成后，用PBS清洗组织样本3次，每次5分钟，然后轻轻去掉多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂封片；
镜检：立即在荧光显微镜下分析样本，并以每200倍视野中气道上皮周围TUNEL阳性染色细胞数的平均值表示结果，结果见图6、图7和表3。
表3不同组气道上皮凋亡程度
| 组别 | 气道上皮凋亡程度(TUNEL+光密度) |
| 正常组 | 27.96±4.536 |
| 模型组 | 59.02±6.76 |
| 地塞米松阳性对照组 | 43.88±6.57 |
| 芹菜素低剂量组 | 41.74±9.86 |
| 芹菜素高剂量组 | 32.07±5.38 |
由图6、图7和表3可知，与正常组相比，模型组的气道周围上皮细胞出现了明显的凋亡，而在哮喘+地塞米松2mg/kg组、哮喘+芹菜素10mg/kg组、哮喘+芹菜素20mg/kg组，上皮细胞的凋亡受到了抑制。且哮喘+芹菜素20mg/kg组效果优于哮喘+地塞米松2mg/kg组，两组间有统计学意义，P<0.05，如图7中的C，其中哮喘+地塞米松2mg/kg的相对平均灰度值为41.73，芹菜素高剂量组的相对平均灰度值为32.066。
5.肺组织病理切片气道重构塑评估：将右肺上叶分离，并在4％多聚甲醛溶液中固定，固定好的肺组织经脱水处理后，进行石蜡包埋，制作病理切片，之后进行masson染色评估气道重构纤维化，具体步骤为：
石蜡切片脱蜡：将肺组织放入二甲苯中脱蜡20分钟，重复一次；无水乙醇洗去二甲苯10分钟，重复一次；95％乙醇溶液处理10分钟，再分别以85％和75％的乙醇溶液依次处理5分钟；去离子水洗1分钟。
苏木素染细胞核：将上述去离子水洗1分钟后的肺组织用苏木素染色2分钟；流水冲洗1分钟，1％的盐酸酒精分色3s；流水冲洗1分钟；温水返蓝；流水冲洗1分钟；
将上述流水冲洗1分钟后的肺组织用Masson丽春红染色6分钟；1％磷钼酸水溶液分化5分钟，流水沖洗1分钟；温水返蓝；
Masson丽春红染色：将上述温水反蓝后的肺组织用Masson丽春红染色6分钟；1％磷钼酸水溶液分化5分钟(镜下观察着色度)；1％苯胺蓝染5分钟；1％冰醋酸水溶液分化3s，得到Masson丽春红染色的肺组织切片；
脱水封片：将所述Masson丽春红染色的肺组织切片放入95％酒精5分钟，重复一次；1％苯胺蓝染5分钟；1％冰醋酸水溶液分化3s脱水封片：将切片放入95％酒精3分钟，重复一次；再放入无水乙醇3分钟，重复一次；最后放入二甲苯3分钟，重复一次；脱水透明，切片晾干后，中性树胶封片。之后镜下观察，对Masson's三色染色的支气管周围区域进行量化，以评估上皮下纤维化的程度。气道平滑肌层的厚度通过a-SMA的免疫染色进行评估。结果以支气管基底膜每毫米长度的a-SMA阳性染色面积(平方微米)表示。对气道上皮和上皮下(平滑肌区)的PCNA+细胞进行计数，并通过除以基底膜的周长对气道大小进行标准化计算，结果见图8、图9和表4。
表4不同组胶原沉积百分比
| 组别 | 胶原沉积百分比 |
| 正常组 | 9.03±2.85 |
| 模型组 | 32.52±10.03 |
| 地塞米松阳性对照组 | 18.71±5.97 |
| 芹菜素低剂量组 | 19.88±3.42 |
| 芹菜素高剂量组 | 12.50±4.62 |
由见图8、图9和表4可知，哮喘组小鼠的肺组织中支气管周围胶原蛋白沉积明显增加。用芹菜20mg/kg治疗的小鼠比用地塞米松2mg/kg治疗的小鼠更明显地抑制了肺组织中支气管周围胶原蛋白的沉积。
6.肺组织病理切片气道上皮电镜观察：具体操作分以下过程，取材：快速取下新鲜肺组织，切成1×1mm大小的立方形组织，迅速转移至由0.1M磷酸缓冲液配制的2.5％戊二醛固定液中固定2h；0.1M磷酸漂洗液漂洗15分钟，ddH2O漂洗5分钟，再依次磷酸漂洗和ddH2O漂洗，重复三次。碳化：碳化船舱四氧化锇熏蒸灼烧1.5h。漂洗转移：100％丙酮漂洗5分钟，重复一次。包埋：留存覆盖组织面的丙酮，加环氧树脂与100％丙酮混合液，混匀后室温静置15分钟，置入烘箱2h(38℃)，去除浸透液后，置换纯环氧树脂至烘箱1h；包埋、加标签。固化：40℃烘箱1小时；70℃烘箱10小时；在光学显微镜下找到气管后，再进行超薄切片机切片(70nm)染色：3％醋酸铀-枸橼酸铅，双染色。拍片：透射电镜JEOLJEM-1230(80KV)观察，拍片，结果见图10。
由图10可知，正常组的上皮细胞核清晰完整，细胞线粒体的形态也正常。哮喘组中，细胞核有皱纹，线粒体形态肿胀变形。芹菜素给药组中，气道上皮细胞的核和线粒体形态保持相对正常。这进一步提示了芹菜素能够抑制线粒体介导的上皮细胞凋亡。
7.支气管肺泡灌洗液细胞技术及炎症因子的ELISA检测：
方法：为了收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，将300μL4℃PBS灌入小鼠气管，冲洗肺部组织两次。之后，将BALF以1000g离心10分钟，上清液储存在-80℃用于细胞因子检测，细胞沉淀物重新悬浮在50μL的PBS中用于炎症细胞的计数和分类(Hemavet950仪器，英国)。检测免疫球蛋白(IgE)、骨髓过氧化物酶(MPO)、白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)、白介素-5(IL-5)、白介素-17(IL-17)的水平。肿瘤坏死因子和干扰素-γ在BALF中的含量是用ELISA试剂盒(Biotechwell，上海，中国)进行测定的。
具体操作为：1)将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(所需抗原包被量为每孔20μg)，每孔抗原加入100μL，置37℃，4h；弃去孔中液体(为避免蒸发，板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)；
2)封闭酶标反应孔：5％小牛血清置37℃封闭40min；封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min；洗涤方法：吸干孔内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤3次；
3)加入待检测样品，建立合适的浓度梯度：检测时，采用1：100的稀释度，应采用较大稀释体积进行，保证样品吸取量>20μL，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μL，置于37℃，40min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min；
4)加入酶标抗体：根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行；37℃，30min；每孔加100μL酶标抗体，洗涤同前；
5)加入底物液(现用现配)：每孔100μL，置37℃避光放置5分钟，加入终止液显色；
6)每孔加入终止液50μL终止反应，于20min内测定实验结果
7)结果判断：OPD显色后采用492nm波长，TMB反应产物检测需要450nm波长；检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价。结果见图11～图14、表5和表6。
表5不同组白细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞的测定结果
| 组别/指标 | Total | Neu | Eos | Lym |
| 正常组 | 1.37±0.76 | 0.18±0.08 | 0.58±0.34 | 0.45±0.33 |
| 模型组 | 8.57±3.46 | 1.60±0.66 | 2.81±0.53 | 1.54±1.03 |
| 地塞米松阳性对照组 | 2.71±0.81 | 0.56±0.24 | 1.11±0.29 | 0.53±0.19 |
| 芹菜素低剂量组 | 2.35±1.03 | 0.52±0.30 | 0.82±0.37 | 0.56±0.51 |
| 芹菜素高剂量组 | 1.99±0.68 | 0.51±0.27 | 0.79±0.29 | 0.31±0.07 |
表6不同组IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A和IgE的测定结果
由图11和表5可知，对各组BALF中的炎症细胞分析显示，与正常对照组相比，哮喘组的白细胞总数(Total)、中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eos)、淋巴细胞(Lym)的数量都有所增加(p＜0.01)。用芹菜素(20毫克/公斤)或地塞米松(2毫克/公斤)治疗后，观察到白细胞总数(p＜0.01)、Eos(p＜0.01)、Neu(p<0.01)、Lym(p＜0.01)都有不同程度的下降。
本发明检查了肺泡灌洗液中IgE、TH2驱动的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和TH17驱动的细胞因子IL-17的表达水平。由图12～14和表6的结果可知，与对照组相比，哮喘组小鼠的IgE、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17的水平明显增加。芹菜素处理明显减少了卵子诱导的IgE、IL-4、IL-5、IL-13和IL-17的增加。
8.肺组织病理切片炎症评估(体现气道重构)：肺组织病理切片气道重构塑评估的masson染色反应了肺部的纤维化，以评估重构的情况。
具体操作方法：1)肺组织固定后切成4微米薄片；2)37℃温BSS漂洗3次，每次3min；3)中性福尔马林固定30min；4)蒸馏水漂洗1次；5)用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染10min；6)自来水洗；7)置人1％NaHCO3液中漂洗至蓝紫色；8)伊红染液染1min；9)蒸馏水洗；10)迅速通过丙酮2次，每次5min；11)通过2：1丙酮-二甲苯3次，每次2min；12)纯二甲苯10min；13)树胶封片，在镜下观察并评分。
支气管周围炎症的程度根据以下组织学分级系统进行评估：(1)没有支气管周围炎症细胞；(2)少数分散的支气管周围炎症细胞，涉及支气管周长的25％以下；(3)局灶性支气管周围炎症细胞浸润不完全围绕支气管(即，涉及支气管周长的25-75％)；(4)一个明确的支气管周围炎症细胞层完全围绕支气管；(5)两个明确的支气管周围炎症细胞层完全围绕支气管；(6)三个或三个以上的支气管周围炎症细胞层完全围绕支气管，结果见图15、图16和表7。
表7不同组的HE评分结果
由图15、图16和表7可知，与对照组相比，OVA诱导的哮喘模型组的小鼠支气管周围和血管周围结缔组织中有密集的炎症细胞浸润(P＜0.01)。各芹菜素组处理后，明显减少炎症细胞浸润。
综上所述，芹菜素可通过介导线粒体抑制上皮细胞凋亡，特别是抑制气道上皮细胞凋亡，进而在体内显示抗哮喘气道重构的作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.芹菜素在制备拮抗上皮细胞凋亡药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述上皮细胞凋亡包括线粒体介导的上皮细胞凋亡。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述上皮细胞包括气道上皮细胞。
4.芹菜素在制备防治哮喘药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述哮喘包括慢性哮喘。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述慢性哮喘包括哮喘气道重构。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李红岩等: "芹菜素对哮喘小鼠肺组织ＯＸ４０表达、 气道炎症和气道高反应性的影响", 《江苏医药》, vol. 42, no. 6, pages 621 - 624 * |
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