CN108379248A - Zeylenone抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及诱导凋亡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Zeylenone抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及诱导凋亡。本发明提供了Zeylenone或其纳米胶束在制备如下1)‑4)中至少一种产品中的应用：1)治疗或预防胃癌产品；2)抑制胃癌细胞增殖或生长的产品；3)诱导胃癌细胞凋亡的产品；4)抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移的产品。本发明首次发现了Zey能抑制胃癌细胞侵袭、迁移并诱导凋亡，因此zey是非常有潜力的治疗药物，确实可以抑制胃癌的生长，同样具有体内抗肿瘤药效。

Description

Zeylenone抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及诱导凋亡

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种Zeylenone抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及诱导凋亡。

背景技术

胃癌因其发病率第四，死亡率第二，而逐渐成为一种健康威胁。有研究表明，每年有超过95万癌症病例，其中就有72万病人死于胃癌。因此，胃癌的疾病负担仍然很高，特别是在亚洲、拉丁美洲、中欧和东欧。值得注意的是，胃癌以不受控制的细胞增殖、侵袭和转移为主要临床特点。因此，大多数患者不是死于原发癌症，而是转移性癌症。然而，在胃癌的治疗策略中，对转移领域的研究相对滞后。因此，在这种情况下，寻找一种能抑制胃癌细胞转移且具有低毒性的新药已成为胃癌研究的重点。

肿瘤转移是一个循序渐进且复杂的过程。近年来，AKT/MMP2/MMP9和MAPK/(ERK)通路受到广泛关注，因为其在肿瘤的发生和进展中起着重要的作用，包括细胞生长、生存、转移和对化疗的耐药性等。另一方面，ERK作为MAPK的重要成员之一，在调控基质金属蛋白酶(MMPs)的表达中起着中心作用。MMPs能水解多种细胞外基质(ECMs)而参与肿瘤的侵袭和转移。特别是MMP-2和MMP-9可以降解大部分ECM成分，导致转移的加速。

低毒且有生物活性的植物化学物质已经成为常规治疗药物的有效替代品。Zeylenone，是从紫玉盘属植物山椒子中分离得到的环己烯类化合物。

发明内容

本发明的一个目的是提供Zeylenone或其纳米胶束的用途。

本发明提供了Zeylenone或其纳米胶束(本发明的胶束直径为30-33nm之间)在制备如下1)-4)中至少一种产品中的应用：

1)治疗或预防胃癌产品；

2)抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移的产品；

3)诱导胃癌细胞凋亡的产品；

4)抑制胃癌细胞增殖或生长的产品。

上述应用中，所述诱导胃癌细胞凋亡为Zeylenone通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡。

上述应用中，所述抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移为Zeylenone通过降低MMP2蛋白水平、MMP9蛋白水平、抑制AKT的磷酸化、抑制mTOR的磷酸化和/或抑制ERK1/2的磷酸化实现。

上述应用中，所述胃癌细胞为胃癌SGC7901、MGC803或BGC823。

本发明另一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分是Zeylenone或其纳米胶束。

上述产品具有如下1)-4)中至少一种功能：

1)治疗或预防胃癌；

2)抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移；

3)诱导胃癌细胞凋亡；

4)抑制胃癌细胞增殖或生长。

上述产品中，所述诱导胃癌细胞凋亡为Zeylenone通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡。

上述产品中，所述抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移为Zeylenone通过降低MMP2蛋白水平、MMP9蛋白水平、抑制AKT的磷酸化、抑制mTOR的磷酸化和/或抑制ERK1/2的磷酸化实现。

上述产品中，所述胃癌细胞为胃癌SGC7901、MGC803或BGC823。

本发明首先确定了Zey对胃癌细胞生长的抑制作用，Zey对胃癌细胞具有细胞毒性，但对正常胃上皮细胞的毒性小，说明zey具有很好的选择性。其次，发现Zey通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡。更重要的是，首次发现，Zey通过降低MMP2和MMP9蛋白水平，抑制AKT、mTOR和ERK1/2的磷酸化，抑制了胃癌细胞的侵袭和迁移。此外，在体内，zey也显著抑制胃癌BGC823荷瘤小鼠的肿瘤生长。综上所述，首次发现了Zey能抑制胃癌细胞侵袭、迁移并诱导凋亡，因此zey是非常有潜力的治疗药物，确实可以抑制胃癌的生长，同样具有体内抗肿瘤药效。

附图说明

图1为Zey显著抑制胃癌SGC7901和MGC803细胞增殖及克隆形成。

图2为Zey在SGC7901和MGC803细胞中诱导凋亡。

图3为Zey通过线粒体凋亡途径诱导凋亡。

图4为Zey抑制SGC7901和MGC803细胞的侵袭和迁移。

图5为Zey对AKT/MMP2/MMP9和ERK通路相关蛋白表达的影响。

图6为Zey体内抑瘤。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的药品为Zeylenone，是一种多氧取代环己烯类化合物，由中国医学科学院药用植物研究所首次从番荔枝科紫玉盘属植物山椒子(Uvaria grandifloraRoxb.)枝叶的乙醇提取物中分离得到。经高效液相色谱法(HPLC)检测其纯度>97.5％。

Zeylenone的化学结构如式1所示：

(式1)。

下述实施例中主要试剂如表1所示：

表1

下述实施例中试剂配制如下：

电泳缓冲液：100mL 10×的电泳缓冲液中加入900mL去离子水，混匀，4℃冰

箱保存。电泳液可重复使用三次。

电转缓冲液：100mL 10×的转膜缓冲液中加入700mL去离子水和200mL甲醇，混匀，4℃冰箱保存。电转液不做重复使用。

1×TBST：100mL 10×的TBST中加入900mL去离子水，混匀，常温保存。TBST不做重复使用。

5％的脱脂奶粉：称取5g脱脂奶粉，加入100mL 1×TBST，混匀。

下述实施例中的细胞株及细胞培养如下：

人胃癌SGC7901、MGC803、BGC823细胞株及正常人胃上皮GES-1细胞株均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，并由本实验室传代并保存。SGC7901、MGC803、BGC823细胞均在含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素混合物的RPMI-1640完全培养基中培养，GES-1细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素混合物的DMEM完全培养基中培养，均放置于37℃，含5％CO₂的细胞培养箱中。

下述实施例中的实验动物：雌性BALB/c裸鼠，体重18-20g,购自购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0002，在SPF级动物房进行规范饲养，保证动物自由饮食饮水。动物实验的实验流程和实验协议经由中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所动物伦理委员会研究审批通过(no.SLXD-17-05-16)。

实施例1、Zeylenone在治疗胃癌中的应用

一、受试化合物的配制

受试化合物Zeylenone(以下简称为Zey)先以DMSO为溶剂配制成10mg/mL的储备液，-20℃冰箱保存。使用时，用细胞培养基稀释到实验所需浓度，其中，DMSO终浓度<0.1％。

Zeylenone纳米胶束制备方法：精密称取3.50mg的Zeylenone和100.00mg的mPEG2000-PDLLA2000(济南岱罡生物工程有限公司)放于25ml圆底烧瓶中(投药量对结果有影响，投药比不能大于3.5:100，大于时，投药量增加载药量反而下降)，加入2ml二氯甲烷溶液，超声使两亲性材料和疏水药物在有机溶液中分散混合均匀。在两性材料和疏水药物溶解完全后，室温(旋蒸温度对结果无影响，考察旋蒸温度为19，40，60℃时结果无差异)减压旋蒸除去有机溶剂，使其在烧瓶中形成一层薄膜。之后将圆底烧瓶在真空干燥箱中室温真空干燥1h除去残留溶剂，加入2ml的30℃的水(水化温度对实验结果有影响，考察20，30，40，50℃不同温度下实验结果，50℃时载药量急剧下降，其他三个温度结果无差异)浴锅中加热2min，取出，超声5min，用0.22μm微孔滤膜过滤，除去未包裹的药物，所得的胶束溶液放于－20℃冰箱中保存(本发明的胶束直径为30-33nm之间)。

冷冻干燥过程：1毫升的过滤分散剂被转移到7毫升的玻璃小瓶中，在-45℃下，冷冻干燥器中冷冻6h。随后进行初级干燥(-30℃，压力为10Pa保持24h)，初次干燥结束时，温度升高到20℃，进行8小时的二次干燥。最后，将样品从冷冻干燥器中取出，并储存在干燥器里，常温保存。

用于动物实验时，先用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇(1:1，w/w)为溶剂溶解Zeylenone纳米胶束，作为母液(30mg/ml)(原因是：zey纳米胶束在此溶剂下能长期保持稳定性)，给药时再使用生理盐水稀释至所需浓度。

二、细胞培养

1、复苏：将水浴锅预热至37℃，从液氮罐中取出人胃癌SGC7901、MGC803、BGC823细胞株及正常人胃上皮GES-1细胞株冻存管，迅速将其置于37℃的水中并顺时针方向转动使细胞快速解冻，待冻存液融化至半融化状态时，加入适量新鲜培养基将细胞吹匀，并迅速转移至预先加入3mL新鲜培养基的10mL的离心管中，轻轻将细胞吹匀，1000rmp离心5min。弃掉上清液，再将细胞重悬于含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素混合物的RPMI-1640或DMEM完全培养基中，移至细胞培养瓶中，放置于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中进行培养。

2、传代：将细胞用0.25％的胰酶消化后，按照所需比例传代。

3、冻存：将细胞消化后，用移液枪将对数生长期的细胞转移至10mL的离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基，将细胞重悬于配制好的冻存液(10％DMSO+90％胎牛血清)中，并迅速移至提前做好标记的冻存管中(标好细胞名称、冻存日期、培养基名称)，每管1mL。4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置30min，-80℃冰箱过夜，然后将细胞转移至液氮中保存。

4、细胞计数：用75％乙醇清洁细胞计数板及盖玻片。取20μL细胞悬液加至细胞计数板上。在10倍物镜下观察计数板四角大方格(每个大方格中有16个小格)中的总细胞数目。按以下公式计算细胞密度：(细胞悬液的细胞数)/mL＝四个大格子细胞数之和/4×104×稀释倍数，根据铺板密度，计算稀释倍数，细胞悬液用含血清的完全培养基进行适当稀释。

三、Zeylenone在抑制胃癌细胞增殖中的应用

1、MTT法检测Zey体外对肿瘤细胞存活率的影响

分别取上述二得到的对数生长期的人胃癌SGC7901、MGC803及正常人胃上皮GES-1细胞株，按5×10³个/孔接种于96孔板。待细胞适应生长24h后，加入100μL含不同浓度Zey的新鲜培养基(SGC7901和MGC803细胞：Zey的终浓度为0,2.96,5.92,11.84,23.68,47.37μM；GES-1细胞：Zey的终浓度为1,1,2,4,6,8,16,32,64,128μM)，每个剂量组至少设3个平行复孔，于37℃培养箱中继续培养24h后，每孔加入10μL MTT溶液(0.5mg/mL,PBS配制)，继续培养4h。每孔加入150μL DMSO溶解甲簪沉淀，微型振荡器振荡10min充分混匀后，用酶标仪在570nm波长下测定光密度值(OD)，并计算细胞存活率及IC50值。细胞存活率％＝OD_给药组/OD_对照组×100％。根据计算，能够得到在不同浓度的受试化合物作用下细胞的存活率，据此结果绘制曲线，计算该受试化合物诱导50％细胞死亡时的浓度，即为IC50值。

结果如图1A、1B和1C所示，(A)Zey的结构式；(B)MTT分析zey对胃癌细胞SGC7901、MGC803存活率的影响；(C)MTT分析Zey对GES-1的存活率的影响；从图1B和1C可以看出，Zey作用于胃癌细胞24h后能够剂量依赖性的抑制胃癌细胞的生长，且对正常人胃上皮细胞GES-1的抑制作用弱，说明zey能选择性作用于胃癌细胞，抑制胃癌细胞增殖。

2、克隆原形成试验测定zey对胃癌细胞集落形成能力的影响

取对数生长期胃癌细胞SGC7901和MGC803，配制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为200个/ml，按2ml/孔接种于6孔板内，培养24h后，将细胞培养基替换为含不同浓度zey的新鲜培养基，对照组和处理组均设3个平行孔，化合物持续作用12天后，弃培养基，每孔用PBS洗3次，用甲醇固定液固定10min，静置干燥；加入1ml0.1％结晶紫染色20min后，用自来水冲洗掉多余的染料，室温干燥；计数每孔大于50个细胞的集落，根据下述公式计算集落形成率。

克隆形成率(％)＝集落数/接种细胞数x100％。

细胞的集落形成反映了单个肿瘤细胞的增殖能力，与肿瘤的发生、发展密切相关。

结果如图1D和图1E所示，(D)SGC7901和MGC803的克隆形成试验；(E)两株细胞克隆数目的统计学分析；Zey能够显著抑制胃癌细胞SGC7901和MGC803的克隆形成，在4μM时就已经表现出很强的抑制作用，其克隆形成分别不到对照组的10.51％和20.07％。

四、Zeylenone在诱导胃癌细胞凋亡中的应用

1、Hoechst 33258染色法检测Zey对胃癌细胞的诱导凋亡作用

取10⁶个对数生长期的胃癌细胞SGC7901和MGC803接种于6孔板中，并加入不同浓度的Zey，使其终浓度为0,3.3,6.6,13.2μM。作用24h后，吸出培养液，用PBS洗2次后，用10μg/ml的Hoechst 33258将细胞染色20分钟，立刻于荧光显微镜下观察并拍照。以未给Zey治疗的组别为对照。

结果如图2A所示，可以看出，在Zey治疗后，Hoechst 33342染色实验观察到胃癌细胞SGC7901和MGC803凋亡的特征，细胞核不完整，核固缩，着色较深。而未给Zey治疗组的细胞核和染色质的分布都很均匀，初步说明zey治疗后可能会诱导胃癌细胞凋亡。

2、流式Annexin V-FITC/PI双染色法检测Zey对胃癌细胞凋亡率的影响

将对数生长期的胃癌细胞SGC7901和MGC803用新鲜的RPMI-1640培养基配制成2×10⁵个/mL的单细胞悬液，按2mL/孔接种于6孔板。加入不同浓度的化合物Zey，使其终浓度为0,3.3,6.6,13.2μM。药物作用24h后，1000rmp离心5min，收集细胞，并按照试剂盒操作说明书进行操作，以试剂盒中的1×Binding buffer调节细胞浓度为l×10⁶个/mL，取100μL调节好浓度的细胞悬液到反应试管底部，加入5μL Annexin V-FITC溶液，混匀，然后加入10μLPI溶液，混匀，室温下避光反应15min，加入400μL 1×Binding buffer，混匀后上流式细胞仪检测。以未给Zey治疗的组别为对照。

采用Annexin V/PI双染法检测不同浓度的Zey作用细胞12h，24h后细胞的凋亡情况。Annexin V-FITC/PI双染实验，可在流式细胞仪的检测结果中出现不同标志的细胞群：正常细胞(Annexin V-/PI-)、早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)、晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V+/PI+)。在本研究中，统计的凋亡率为早期凋亡和晚期凋亡的总和(AnnexinV+/PI-和Annexin V+/PI+)。

结果如图2B-图2E所示，(B,C)SGC7901的凋亡及凋亡率统计(D,E)MGC803的凋亡及凋亡率统计；在Zey作用胃癌细胞12h后，就出现了明显的细胞凋亡，与对照组细胞相比有显著性差异，并且呈现良好的剂量依赖性。随着Zey作用时间的延长，SGC7901和MGC803细胞的凋亡率逐渐增加，13.2μM的Zey作用胃癌细胞24h后细胞凋亡率分别高达48.21％和64.58％。这些结果表明，Zey对胃癌细胞有显著的诱导凋亡作用，并且呈现明显的时间和剂量依赖性。

3、JC-1染色检测Zey对胃癌细胞线粒体膜电位的影响

将对数生长期的胃癌细胞SGC7901和MGC803用新鲜的RPMI-1640培养基配制成2×10⁵个/mL的单细胞悬液，按2mL/孔接种于6孔板。加入不同浓度的化合物Zey，使其终浓度为0,3.3,6.6,13.2μM。药物作用24h后，1000rmp离心5min，收集细胞，并按照试剂盒操作说明书进行操作，以无血清的RPMI-1640培养基洗2遍，洗涤后的细胞沉淀用无血清的RPMI-1640培养基重悬，调节细胞浓度为1×10⁶个/mL，加入JC-1储备液，使之终浓度为2μmol/L，放入37℃培养箱中避光孵育30min，1000rmp离心5min，弃上清，用PBS洗2遍，用流式细胞仪上机分析。以未给Zey治疗的组别为对照。

线粒体膜电位下降被认为是细胞凋亡过程中最早发生的事件之一，将会使细胞进入到不可逆的凋亡阶段。在本研究中，采用JC-1荧光探针来检测Zey作用胃癌细胞24h后，细胞线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位以红色/绿色荧光信号的比值来表示。

结果如图3所示，(A)JC-1法分析Zey诱导线粒体膜电位下降.(B)红/绿信号比率，可以看出，对照组细胞多数呈红色荧光，线粒体膜电位较高。Zey处理后，呈现绿色荧光的细胞数目随着药物浓度增加逐渐增加，在Zey的浓度为13.2μM时呈现绿色荧光的细胞数目最多。Zey作用胃癌细胞24h后，红色/绿色荧光信号的比值逐渐下降，表明Zey可以呈剂量依赖地降低胃癌细胞的线粒体膜电位。

bcl-2蛋白家族在细胞凋亡的调控中扮演着非常重要的角色。从功能上讲，bcl-2家族包括两类，即促凋亡成员(Bad、Bid、Bax等)和抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w等)，二者之间互相制衡，对线粒体膜的通透性(mitochondrial permeability)和膜间隙(intermembrane space，IMS)蛋白的释放进行调控，以此来决定细胞的存活或者凋亡。Zey作用于胃癌细胞24h后，检测了其对bcl-2蛋白家族抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL以及对促凋亡蛋白Bax的影响。

Western blot检测结果如图3C所示，凋亡相关蛋白检测显示，Zey能够显著降低胃癌细胞中Bcl-2、Bcl-xL的表达，并提高Bax的表达，同时，活化Caspase3，使得pro-caspase3表达下降。

五、Zeylenone在抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移中的应用

1、划痕实验

取对数生长期胃癌细胞SGC7901和MGC803，配制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为2.5×10⁵个/mL，按0.5mL/孔接种于24孔板内，适应性贴壁且长满单层后，将无菌直尺放于24孔板上，使用经过消毒灭菌的10μL移液器枪头对准每孔上下缘中心的连接点，以上下两点为连线顺着直尺缓缓划线，划线力度均一，去除每孔中的培养液，PBS轻轻清洗3遍，以去除残留培养液和脱落的细胞，根据之前实验研究结果选取细胞毒性作用较小(细胞存活率在93％以上)的Zey浓度(0、1、2、4μM)来进行本次实验，用无血清的培养液配制出含上述浓度药物的培养液依次加入每孔中，体积为0.5m L/孔。连续观察24h并拍照。划痕愈合率(％)_24h＝100％-划痕面积_24h/划痕面积_0h×100％

划痕实验结果如图4A和4B所示，(A)划痕愈合分析(B)划痕愈合率，zey对胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移愈合能力均有一定程度的抑制作用。在MGC8003细胞中，经不同浓度zey处理24h后细胞迁移能力均有所下降，并且随着药物剂量的增加，细胞迁移能力下降更加明显，其中4μM药物浓度抑制MGC803细胞迁移作用最显著，细胞迁移面积明显小于对照组和其它浓度组。而且zey对SGC7901细胞迁移能力的影响基本与MGC803细胞一致，均表现出剂量依赖性，且具有显著性差异。

2、侵袭和迁移实验

I、侵袭实验

1).Transwell小室的制备

A.包被基底膜

a)提前将保存于-20℃的Matrigel置于4℃冰箱使其缓慢为液状，然后用预冷过的无FBS的1640将Matrigel胶按照1:5的比例进行稀释；

b)用预冷的枪头吸取65μL基质胶稀释液包被到Transwell小室上室内的聚碳酸酯滤膜上，注意避免气泡产生，37℃培养箱过夜或放置30min，使液态的基质胶聚合成凝胶状态。

注意事项：基底膜的包被过程应在超净工作台内无菌进行，由于Matrigel在4℃环境下为液态，37℃环境下即凝为固体凝胶状，且不可逆，因此整个配制过程应快速操作，吸取基质胶的枪头也应在使用前在4度冰箱提前预冷。另外包被基底膜是Matrigel稀释液的体积不宜过多，以刚刚把聚碳酸酯滤膜浸润为好。

2).制备细胞悬液

A.制备细胞悬液前先将胃癌细胞SGC7901和MGC803铺板，加不同浓度的Zey浓度处理24h；

B.用胰酶消化细胞，终止消化后将细胞悬液1000rpm条件下离心5分钟，弃除上清，PBS清洗1遍；

C.用含无血清的RPMI1640重悬细胞，显微镜下计数，调整细胞浓度为2×10⁵。

3).接种细胞

A.取含10％胎牛血清的RPMI1640培养基700μL加入Transwell小室的下室，

取各个药物浓度的细胞悬液各150μL加入小室的上室，注意小室与下层培养液之间应避免出现气泡；

B.将24孔板置于培养箱中常规培养24h。

4).细胞固定染色

A.取出小室，用灭菌处理过的棉签仔细擦去上室内的细胞和基质胶，并蘸取PBS

反复擦拭干净。将小室移至盛有PBS的培养孔内，轻轻漂洗2遍；

B.将小室浸泡于甲醇中固定20分钟，PBS漂洗3遍；

C.在室温条件下用0.1％的结晶紫染液染色细胞20min，PBS漂洗3遍；

D.在倒置显微镜下随机选取5个视野观察并拍照。

II、迁移实验

1)孔板铺板，1*10⁵/ml胃癌细胞SGC7901和MGC803，2ml/孔，贴壁24h后，加不同浓度zey药物(0、1、2、4μM)作用24h；

2)水化基底膜：消化计数细胞前，加入200μL无FBS的1640到小室内，37℃孵育1h

3)胰酶消化，收集细胞；

4)计数细胞，调整细胞密度为2*10⁵/ml，取0.2ml(注：此时的细胞悬液为不含FBS的1640细胞悬液)加入到上室中；

5)700μL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基加入到下室，轻拍板子四周，放入到培养箱中培养24h；

6)细胞固定以及染色同细胞侵袭实验。

细胞侵袭率/％＝给药组侵袭数量/对照组侵袭数量×100％

细胞迁移率/％＝给药组迁移数量/对照组迁移数量×100％

Transwell侵袭、迁移实验结果如图4C和4D，(C)Transwell侵袭和迁移分析(D)侵袭率及迁移率统计，zey作用后，MGC803细胞穿过小室人工基底膜的细胞数较对照组明显减少，且有剂量依赖性。在SGC7901细胞中也显示出类似的实验结果。所以，zey能够抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。

3、WB实验

收集zey处理24h后的胃癌细胞(0,3.3,6.6,13.2μM)，经过总蛋白提取，蛋白定量，电泳，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗后，用ECL化学发光检测蛋白条带，用凝胶图象处理系统(BIO-RAD)中进行扫描及拍照，检测分析目标条带及其灰度值。使用Image J图像处理软件对蛋白条带的灰度值进行分析，将GAPDH作为内参，目的条带与GAPDH条带灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达量。

Zey对AKT/MMP2/MMP9及ERK表达的影响结果如图5所示，(A)免疫印迹分析.(B)蛋白相对表达量分析，可以看出，Zey能够显著降低胃癌细胞中MMP2和MMP9的表达，降低细胞外基质的分解，从而降低胃癌侵袭转移,以上结果提示，Zey对胃癌细胞的侵袭迁移的抑制作用可能是通过调节AKT/MMP2/MMP9，ERK信号转导通路来介导的。

六、体内实验方法

将BGC823胃癌细胞皮下接种至小鼠的右腋(2×10⁷个/只)。每2天测一次肿瘤体积，肿瘤体积(V)用公式V＝(L×W²)/2计算，其中L为最大直径，W为垂直于宽度的直径。当肿瘤达到100-150mm³,老鼠被随机分为5组(n＝5)处理：

对照组：0.1ml/10g生理盐水,1次/2天,尾静脉注射；

紫杉醇组：15毫克紫杉醇/公斤体重,0.1ml/10g，1次/2天,尾静脉注射。

Zey(7.5mg/kg)组：7.5毫克/公斤Zeylenone纳米胶束，0.1ml/10g，1次/2天，尾静脉注射

Zey(15mg/kg)组：15毫克/公斤Zeylenone纳米胶束，0.1ml/10g，1次/2天，尾静脉注射

Zey(30mg/kg)组：30毫克/公斤Zeylenone纳米胶束，0.1ml/10g，1次/2天，尾静脉注射

处理后10天后对小鼠进行安乐死，并对其进行切除肿瘤、称重、贮存，并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的相对体积。与此同时，每2天测量一次小鼠体重。

实验结果如图6，(A)肿瘤体积(B)肿瘤重量(C)肿瘤拍照(D)体重；与阴性对照组相比，给药组肿瘤生长缓慢，给药10天后，阴性对照组的平均体积400mm³。而Zey高剂量组(30mg/kg)和阳性对照组(15mg/kg)肿瘤的平均体积显著降低，分别为222.9mm³和211.3mm³。

统计瘤重和计算抑瘤率(抑瘤率＝给药组瘤重/对照组瘤重×100％)结果如表2所示，从抑瘤率上来看，对照组和高剂量给药组，抑瘤率分别为48.11％、47.95％，与对照组相比，具有显著性差异。

表2

组别	对照组	紫杉醇	Zey(7.5mg/kg)	Zey(15mg/kg)	Zey(30mg/kg)
						平均瘤重(mg)	234.08	121.46	191.08	170.83	121.84
SD	18.61	19.67	18.58	10.43	20.13
						抑瘤率(％)		48.11	18.37	27.02	47.95

Claims (7)

1.Zeylenone或其纳米胶束在制备如下1)-4)中至少一种产品中的应用：

1)治疗或预防胃癌产品；

2)抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移的产品；

3)诱导胃癌细胞凋亡的产品；

4)抑制胃癌细胞增殖或生长的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述诱导胃癌细胞凋亡为Zeylenone通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移为Zeylenone通过降低MMP2蛋白水平、MMP9蛋白水平、抑制AKT的磷酸化、抑制mTOR的磷酸化和/或抑制ERK1/2的磷酸化实现。

4.一种产品，其活性成分是Zeylenone或其纳米胶束。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品具有如下1)-4)中至少一种功能：

1)治疗或预防胃癌；

2)抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移；

3)诱导胃癌细胞凋亡；

4)抑制胃癌细胞增殖或生长。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：

所述诱导胃癌细胞凋亡为Zeylenone通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡。

7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：

所述抑制胃癌细胞侵袭和/或迁移为Zeylenone通过降低MMP2蛋白水平、MMP9蛋白水平、抑制AKT的磷酸化、抑制mTOR的磷酸化和/或抑制ERK1/2的磷酸化实现。