CN112245448A

CN112245448A - 灵仙新苷在抗结直肠癌中的应用

Info

Publication number: CN112245448A
Application number: CN202011115167.4A
Authority: CN
Inventors: 李运曼; 郝鹏; 胡雅慧; 方伟蓉; 李丰文; 刘丽芳; 朱兴祥
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112245448B

Abstract

本发明公开了灵仙新苷在制备抗肿瘤产品和/或抗肿癌细胞产品中的应用。本发明研究表明，AR能够显著抑制人结直肠癌细胞的生长、增殖；AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠的主要器官包括肝、脾、肺、肾、结肠和股骨的组织病理学无明显影响，表明AR对上述器官无明显毒性作用；AR通过下调HIF‑1α/ERK/Caspase‑3/VEGFR2通路发挥肿瘤抑制作用及抗肿瘤血管生成的作用。且安全性较高，总体安全性优于伊利替康。

Description

灵仙新苷在抗结直肠癌中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及灵仙新苷在抗结直肠癌中的应用。

背景技术

灵仙新苷(AR)是从我国威灵仙药材的毛莨科植物威灵仙的干燥根及根茎中提取纯化的一种单体，前期研究表明，灵仙新苷具有治疗关节炎。调血脂。抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血作用。

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，尽管近十年来结直肠癌患者的死亡率由局部干预治疗、早期诊断筛查、手术等技术进步有所降低，但仍有部分结直肠癌患者在确诊时已经发现远端转移，并且这些确诊转移的晚期结直肠癌患者5年存活率依然很低。因此结直肠癌的治疗仍然需要寻找新的手段和策略。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供灵仙新苷在制备抗肿瘤产品(如药品、疫苗、保健品和/或食品)和/或抗肿瘤细胞产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

灵仙新苷在制备抗肿瘤产品((如药品、疫苗、保健品和/或食品))和/或抗肿癌细胞产品((如药品、疫苗、保健品和/或食品))中的应用。

作为本申请的优选技术方案，所述抗肿瘤产品和/抗肿瘤细胞产品的活性成分为灵仙新苷。

优选的，所述抗肿瘤产品和/或抗肿瘤细胞产品中的活性成分还可以含有其他生物成分或非生物成分，该产品的其他活性成分本领域技术人员可根据抗肿瘤效果确定。

作为本申请的优选技术方案，所述肿瘤为实体肿瘤，所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞。

作为本申请的优选技术方案，所述实体肿瘤为结直肠癌，所述实体肿瘤细胞为结直肠癌细胞。

作为本申请的优选技术方案，所述结直肠癌为人结直肠癌，所述结直肠癌细胞为人结直肠癌细胞。

优选的，所述人结直肠癌细胞为Dukes B型人结直肠腺癌细胞，如SW480细胞。

另外，本发明还保护灵仙新苷在制备促进肿瘤自噬和/或促进肿瘤细胞自噬的产品(如细胞模型或动物模型)中的应用，或灵仙新苷在制备阻滞肿瘤细胞周期的产品(如细胞模型或动物模型)中的应用也属于本发明的保护范围。

作为本申请的优选技术方案，所述促进肿瘤自噬或/和促进肿瘤细胞自噬的产品的活性成分可为灵仙新苷；所述促进肿瘤自噬或/和促进肿瘤细胞自噬的产品的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，该产品的其它活性成分本领域技术人员可根据抗肿瘤效果确定；所述阻滞肿瘤细胞周期的产品的活性成分可为灵仙新苷；所述阻滞肿瘤细胞周期的产品的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，该产品的其它活性成分本领域技术人员可根据抗肿瘤效果确定。上述应用中，所述肿瘤可为实体肿瘤。

作为本申请的优选技术方案，所述实体肿瘤可为结直肠癌。所述结直肠癌可为人结直肠癌。

作为本申请的优选技术方案，，所述人结直肠癌可为人结直肠腺癌。所述人结直肠腺癌可为Dukes B型人结直肠腺癌。

作为本申请的优选技术方案，所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞。

作为本申请的优选技术方案，所述实体肿瘤细胞可为结直肠癌细胞。所述结直肠癌细胞可为人结直肠癌细胞。

作为本申请的优选技术方案，所述灵仙新苷为灵仙新苷或包含灵仙新苷的组合组。

作为本申请的优选技术方案，所述组合物为灵仙新苷添加药学上可接受的辅料制备而成的药物制剂。

优选的，所述药物剂型为片剂、胶囊、注射剂、颗粒剂、散剂、丸剂等。

优选的，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、湿润及或润滑剂。

有益效果

发明人发现，AR能够显著抑制人结直肠癌细胞的生长、增殖；AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠的主要器官包括肝、脾、肺、肾、结肠和股骨的组织病理学无明显影响；表明AR对上述器官无明显毒性作用。

AR通过下调HIF-1α/ERK/Caspase-3/VEGFR2通路发挥肿瘤抑制作用及抗肿瘤血管生成的作用。且安全性较高，总体安全性优于伊利替康。

附图说明

图1为荷瘤鼠照片；

图2为肿瘤照片；

图3为AR对SW480裸鼠皮下移植瘤肿瘤体积的影响(数据采用Mean±SEM表示，n＝6)；

图4为AR对SW480裸鼠皮下移植瘤肿瘤重量的影响(数据采用mean±SEM表示，n＝6)；

图5为AR对SW480裸鼠皮下移植瘤脾脏指数的抑制作用(数据采用Mean±SEM表示，n＝6)；

图6为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织脂质沉积改变的影响(苏丹III染色)(A)苏丹III染色各组代表图；(B)脂肪沉积率统计(×400，n＝3)；

图7为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织病理学改变的影响(HE染色)(×400，n＝6)；

图8为AR对SW480裸鼠皮下移植瘤超微结构的影响(透射电镜图)(×5000，n＝3)；

图9为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡的影响(TUNEL染色)(A)TUNEL染色各组代表图；(B)积分光密度统计(×400，数据采用Mean±SEM表示，n＝6)；

图10为AR对SW480荷瘤裸鼠体重的影响(数据采用mean±SEM表示，n＝6)；

图11为AR对SW480荷瘤裸鼠每两天每只进食的影响(数据采用mean±SEM表示，n＝2笼)；

图12为AR对SW480荷瘤裸鼠每两天每只饮水量的影响(数据采用mean±SEM表示，n＝2笼)；

图13为AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠的主要器官组织病理学的影响(HE染色，×400，n＝6)；

图14为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞增殖因子(Ki67)蛋白表达水平的影响(免疫组织化法)(A)免疫组化各组代表图；(B)积分光密度统计(×400，数据采用Mean±SEM表示，n＝6)；

图15为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤组织血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)蛋白表达水平的影响(免疫组织化法)(A)免疫组化各组代表图；(B)积分光密度统计(×400数据采用Mean±SEM表示，n＝6)；

图16为AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤中磷酸化细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(p-ERK 1/2/ERK 1/2)、细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和VEGFR2的影响(Western blot法)(A)Western blot条带代表图；(B)p-ERK 1/2/ERK 1/2表达量统计；(C)Caspase-3表达量统计；(D)HIF-1α表达量统计；(E)VEGFR2表达量统计(数据采用Mean±SEM表示，n＝3)；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实验材料

1、受试药物

灵仙新苷(AR)：性状：棕黄色粉末；分子量1806；纯度：92％；提供单位：由中国药科大学中药学院中药制剂教研室提供。药物配制：临用前用0.9％氯化钠注射液溶解成所需浓度的澄清溶液。

药物配制：临用前称取相应质量的AR，用0.9％氯化钠注射液充分溶解，配制成所需浓度的淡黄色药液。以6.4mg/mL作为高剂量的给药浓度，按比为2:1稀释为3.2mg/mL作为低剂量组给药剂量的给药浓度。

2、药品与试剂

注射用盐酸伊利替康：含量：100mg，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，批号：180513AF，临用前将注射液用生理盐水稀释，配制成所需浓度的均匀药液。

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基：江苏凯基生物技术股份有限公司提供，批号：20170221。

FBS(胎牛血清)：Gibco赛默飞世尔科技有限公司提供，批号：42A0378K。

DMSO(二甲基亚砜)：GENERAL-REAGENT，批号：G75927B。

蛋白质定量试剂盒(BCA法)：北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1511。

BUN(尿素氮)试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20191210。CRE(肌酐)试剂盒、LDL-C(低密度脂蛋白)试剂盒、HDL-C(高密度脂蛋白)试剂盒、TG(甘油三酯)试剂盒、T-CHO(总胆固醇)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号皆为：20191209。AST(谷草转氨酶)试剂盒、ALT(谷丙转氨酶)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号皆为：20191206。

蛋白磷酸酶抑制剂混合物(All-in-One,100X)：北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1260。蛋白质定量试剂盒(BCA法)：北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1511。

RIPS蛋白裂解液(强)：上海碧云天生物技术有限公司，批号：051018180521。

PMSF蛋白酶抑制剂：上海碧云天生物技术有限公司，批号：ST506。

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)：上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0015L。

磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK 1/2)抗体：Rabbit-mAb:AffinityBiosciences,Inc.(USA)，批号：67b4599。

细胞外信号调节激酶抗体(ERK 1/2)抗体：Rabbit-pAb:沈阳万类生物科技有限公司，批号：WL01864。

低氧诱导因子-1α(HIF-1α)抗体：Rabbit-pAb:沈阳万类生物科技有限公司，批号：WL01607。

血管内皮生长因子2(VEGFR2)抗体：Rabbit-pAb：沈阳万类生物科技有限公司，批号：WL02294；北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs10412R

细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)抗体：Rabbit-pAb：沈阳万类生物科技有限公司，批号：WL04004。

β-Actin抗体：上海碧云天生物技术有限公司，批号：AA128-1。

肿瘤细胞增殖因子(Ki67)抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-23105R。

Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat anti-rabbit：上海碧云天生物技术有限公司；南京贝斯特生物技术有限公司，批号：BK0027。

Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat anti-mouse：上海碧云天生物技术有限公司，批号：A0216。

无水乙醇：上海久亿化学试剂有限公司，批号：46-17-5；二甲苯：上海久亿化学试剂有限公，批号：1330-20-7。

苏木素：武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G1004。

DAB：碧云天生物技术有限公司，批号：KGP1045-100。

30％H2O2：南京化学试剂股份有限公司，批号：7722-84-1。

伊红：武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G1001。

盐酸：南京化学试剂股份有限公司，批号：7647-01-0。

中性树胶：国药集团化学试剂有限公司，批号：10004160。

苏丹Ⅲ：MACKUN，批号：S6310。

甘油：国药集团化学试剂有限公司，批号：10010618。

TUNEL凋亡检测试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA704。

电镜固定液：武汉谷歌生物ke剂有限公司，批号：G1102。

无水乙醇、丙酮均购自国药集团化学试剂有限公司。

812包埋剂：SPI科技有限公司，批号：90529-77-4。

Tris-base：生兴生物，批号：8E178E17。

吐温20：南京化学试剂有限公司，批号：13030510264。

甲醇：江苏汉邦科技有限公司，批号：173515

十二烷基硫酸钠(SDS)：生兴生物，批号：3K223K22。

甘氨酸：Juyou chemistery Co.Ltd，批号：A04E020209。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝胶快速制备试剂盒(10％)：上海雅酶生物科技有限公司，批号：02293320。

双色预染蛋白Maker(10-250kDa)：上海雅酶生物科技有限公司，批号：02281506。

PVDF膜：Biosharp life sciences，批号：BS-PVDF-22。

ECL超敏发光液：Tanon High-sig ECL Western Blotting Substrate，批号：180-501。

聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene difluoride，PVDF)膜：Biosharp lifesciences，批号：BS-PVDF-22。

3、实验动物

BALB/C-nu小鼠，SPF级，雌雄各半，14～16g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物质量合格证编号：No.1103241911026496。

所有动物饲料及垫料均由江苏省青龙山动物繁殖场提供，所有动物实验均按照中国药科大学批准的实验动物护理和操作指南进行。

4、实验仪器

GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司产品；Sartorius BS 2245电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司生产；游标卡尺：桂林广陆数字测控股份有限公司；Mikro 22R型高速冷冻离心机：德国Hettich公司产品；680酶标仪：美国BIO-RAD公司产品；TS-1QRBITAL水平摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；EPED-20TF实验室超纯水器：南京易普易达科技发展有限公司产品；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司产品；培清JS-860B凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司产品；DYY-7C型电泳仪：北京市六一仪器厂产品；Leica CM1950冰冻切片机：德国Leica公司产品；脱水机：武汉俊杰电子有限公司产品；石蜡包埋机：武汉俊杰电子有限公司产品；石蜡超薄切片机：上海徕卡仪器有限公司产品；冻台：武汉俊杰电子有限公司产品；组织摊片机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品；烤箱：上海慧泰仪器制造有限公司产品；载玻片及盖玻片：江苏世泰实验器材有限公司产品；光学显微镜：日本尼康有限公司产品；成像系统：日本尼康有限公司产品；微波炉：中国美的集团产品；恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司产品；鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司产品；钻石切片刀：Daitome设备有限公司产品；透射电子显微镜：HITACHI设备有限公司产品。

实验方法与结果

1、AR抗人结直肠癌SW480裸鼠移植瘤的药效学研究

1.1 SW480结肠癌细胞移植瘤模型建立

1)复苏并扩增SW480结肠癌细胞(由中国人民解放军东部战区空军医院王晶老师惠赠)；

2)待扩增到足够的细胞，收集SW480细胞，用无血清DMEM配成4*10⁷/mL的细胞悬液，共4mL；

3)取4-6周龄(16-18g)的BALB/c裸鼠36只，雌雄各半。裸鼠皮下接种，每只小鼠0.1mL，即4*10⁶/mouse，共接种36只；

4)观察小鼠，7d后，待瘤体长至直径约0.7-1.2cm，瘤体体积为200-300mm³左右时随机分组。按体重随机分为4组，雌雄各半：模型组(给予等容积的生理盐水)，AR高剂量组(64mg/kg)，AR低剂量组(32mg/kg)，阳性对照伊立替康组(45mg/kg)，每组8-10只，分组当天记为Day1，当天开始腹腔注射给药，给药体积为0.1mL/10g，共连续给药23天。期间每两天测量一次肿瘤大小，末次给药后1h摘眼球取血至死，对以下指标进行检测(统计时去除初次肿瘤测量大小不达标数据，且由于指标较多，每组按n＝6统计)：

1.2肿瘤体积(tumor volume，TV)，TV＝1/6×π*a×b²，其中a、b分别表示长、宽；

1.3肿瘤重量(tumor weight，TW)，末次给药后各组肿瘤重量；

1.4瘤重抑瘤率IR(％)，IR(％)＝(CTW-TTW)/CTW×100，TTW：治疗组瘤重；CTW：空白对照组瘤重；

1.5脾脏指数(spleen index,SI,％),SI＝SW/MW×100％，SW:脾脏重量，MW：裸鼠重量。

由图1、2可见，与模型组相比，伊立替康45mg/kg组，AR 64mg/kg及32mg/kg组肿瘤体积较小，初步证明AR与伊立替康均具有较好的抑瘤作用。

结果由图3可见，与模型组相比，给药第23天时，AR 64mg/kg及伊立替康45mg/kg组裸鼠的肿瘤体积均显著减小(p<0.01)，证明AR与阳性药伊立替康均表现出较强的抑瘤作用。

表1 AR对SW480裸鼠肿瘤重量和抑瘤率的影响

**p<0.01,*p<0.05vs模型组(数据采用Mean±SEM表示，n＝6)。

由表1和图4可见，与模型组相比，AR高、低剂量组与伊立替康给药组(45mg/kg)的肿瘤重量有极显著的差异(p<0.01)，试验终点时抑瘤率分别达到42.122％、39.505％和29.209％。表明AR和伊利替康均有具有较好的抗肿瘤作用。

结果如图5所示，与模型组相比，AR(64mg/kg)与伊立替康给药组(45mg/kg)均可显著降低脾脏指数(p<0.01)；AR(32mg/kg)也可显著降低脾脏指数(p<0.05)。

1.6 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织脂质沉积改变的影响(苏丹III染色)

每组取6只裸鼠的肿瘤组织，进行苏丹III染色，步骤如下：冷冻切片厚10um，用50％乙醇1min，苏丹Ⅲ染液10min，用50％乙醇稍洗，流水冲洗，苏木素复染细胞核30s，甘油封片。结果判定:细胞核呈蓝色，脂质呈桔红色。

苏丹III是鉴别脂肪的染液，脂质沉积在肿瘤中是药物能够干扰肿瘤代谢的证明，肿瘤组织细胞内的脂质聚集率高表明其向良性瘤转化的几率就大。如图6结果显示，苏丹III染色结果表明，模型对照组裸鼠肿瘤组织细胞内有较少的脂质聚集。与模型对照组相比，AR高剂量组脂质沉积率显著升高(p<0.05)，伊利替康组也能升高肿瘤组织细胞内的脂质聚集率，但与模型对照组比较无显著差异。表明AR能够干预肿瘤细胞的脂质代谢，该作用可能是通过影响脂代谢过程中的特定环节而实现其抗肿瘤作用的，肿瘤组织细胞内的脂质聚集率高表明其向良性瘤转化的几率就大。揭示AR可能具有分子靶向抗肿瘤药物的潜能，其具体的选择性抗肿瘤作用机制有待于下一步深入研究。

1.7 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织病理学改变的影响(HE染色)

裸鼠摘眼球取血处死后，取瘤组织，称重、测量体积后立即于4％多聚甲醛溶液中固定进行H&E染色，步骤如下：将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水：75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h；包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用；取石蜡切片，经过以下步骤脱蜡：二甲苯(Ⅰ)10min→二甲苯(Ⅱ)10min→100％乙醇(Ⅰ)5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→50％乙醇5min→蒸馏水5min；脱蜡后按以下流程进行HE染色：将切片置于苏木素染缸中染色5min后，流水洗去苏木素液，1％盐酸乙醇2s，水洗反蓝10min，置于0.5％伊红液染色2min；切片分别经以上染色后按下述步骤脱水：50％乙醇1-2s→70％乙醇1-2s→80％乙醇1-2s→无水乙醇5-10min→二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)2min；切片脱水后，使用中性树胶封片，通风厨中晾干后，置于显微镜下观察，图像采集分析。

结果如图7所示，病理检测(HE染色)可见，模型对照组肿瘤组织内部细胞密集，且排列整齐，生长旺盛且状态良好，细胞核清晰可见；AR与伊立替康治疗组肿瘤组织细胞呈现一定的坏死区域；AR 64mg/kg和32mg/kg组可见大面积的坏死区域，其肿瘤组织疏松，细胞排列不规则，可见微小颗粒形成，表明AR具有促进肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤生长的作用。

1.8 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织超微结构的影响(透射电镜)

取每组3例移植瘤组织，2.5％戊二醛固定，透射电镜(×5000)下观察肿瘤细胞的超微结构及坏死情况，步骤如下：取材固定：新鲜组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，组织体积一般不超过1mm×1mm×1mm，迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次，每次15min；后固定：1％的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)室温(20℃)固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次，每次15min；脱水：组织依次入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精-100％丙酮-100％丙酮上行脱水，每次15min；渗透：丙酮︰812包埋剂＝1︰1 2-4h，丙酮︰812包埋剂＝2︰1渗透过夜，纯812包埋剂5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜；包埋：60℃烤箱聚合48h；切片：超薄切片机切片60—80nm超薄切片；染色：铀铅双染色(2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜；透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

结果由图8可见，透射电镜观察结果表明，模型组肿瘤细胞体积较大，细胞核形态规整，染色均匀，且核质比较大(细胞核如标注所示)，而AR和伊立替康组肿瘤细胞与之相比体积变小，细胞质浓缩，细胞核固缩、细胞核边缘化。其中AR低剂量(32mg/kg)组细胞胞膜皱缩，细胞核染色不均，细胞核固缩，呈现凋亡早期特点；AR高剂量(64mg/kg)和伊立替康组镜下可见大量空泡，细胞核裂解，出现凋亡现象。

1.9 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡的影响(TUNEL染色)

每组取6例移植瘤组织，进行原位末端标记法(TUNEL)凋亡染色，步骤如下：取材：新鲜组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h；包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用；取石蜡切片，经过以下步骤操作；二甲苯(Ⅰ)15min→二甲苯(Ⅱ)15min→二甲苯：无水乙醇＝1:1 2min→100％乙醇(Ⅰ)5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→50％乙醇5min→蒸馏水5min；PBS洗3次，每次5min；proteinase工作液通透，37℃反应20min；PBS洗3次，每次5min；切片放入3％H₂O₂溶液，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS洗3次，每次5min；TDT酶连接液连接，37℃反应1h；PBS洗3次，每次5min；HRP工作液标记，37℃反应30min；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每张切片加50-100μl新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色，用蒸馏水冲洗；苏木素染色25s，用自来水流水冲洗3-5min返蓝；切片分别经以上染色后按下述步骤脱水：50％乙醇1-2s→70％乙醇1-2s→80％乙醇1-2s→无水乙醇5-10min→二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)2min；切片脱水后，使用中性树胶封片，通风厨中晾干后，置于显微镜下观察，图像采集分析。注：全部数据以Mean±SEM表示，使用SPSS单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间差异性比较(IBM SPSS Statistics v22.0),p<0.05和p<0.01均表示具有显著性差异。

由图9可见，TUNEL染色显示，与模型组相比，AR高剂量组、低剂量组和伊利替康组均能显著提高肿瘤组织凋亡细胞数量，凋亡细胞占比也有显著性的提高(p<0.01)，证明AR具有较强的促凋亡、抗肿瘤细胞作用。

2.AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠的毒性作用

2.1 AR对SW480移植瘤裸鼠体重变化、进食和饮水量的影响

连续给药23天期间，每两天一次对裸鼠进行称重，并称量每组裸鼠的饮食饮水量，计算平均每只裸鼠每两天饮食饮水量。

体重变化结果由图10可见，AR两个剂量组(64mg/kg，32mg/kg)和模型组动物体重呈现稳定上升情况，与模型组相比，AR 64mg/kg和32mg/kg组体重均无显著性差异，给药过程中未见体重明显下降情况，且未出现动物状态差的状况。说明AR无明显毒性。而伊立替康组小鼠有明显体重抑制现象，与模型组和AR 64mg/kg及32mg/kg组均有显著性差异(p<0.01)。证明AR与伊立替康相比，毒性更低、安全性更高。

进食和饮水量的影响结果由图11-12可见，AR两个剂量组、伊利替康组和模型组每只动物每两天饮食饮水量变化均无显著差异，其中伊利替康组的两天饮水量较其他三组明显较少，进一步证明AR与伊立替康相比，毒性更低、安全性更高。

2.2 AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠血浆生化指标的影响

取每组6只裸鼠，脱臼处死前裸鼠摘眼球取血到含0.38％枸橼酸钠抗凝剂的EP管中，全血经3000rpm，4℃离心10分钟得血浆，-80℃保存，按照试剂盒说明的步骤检测血浆中总胆固醇(TC)、甘油三醋(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血肌酐(Cr)、尿素(Urae)含量和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活力。

表2 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠血浆生化指标的影响

(数据采用Mean±SEM表示，n＝6)

由表2可见，与模型组相比，AR两个剂量组和伊利替康组对荷瘤裸鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量均无显著影响。

2.3 AR对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠主要脏器(肺、脾、肝、肾、结肠)及股骨组织病理学的影响(HE染色)

摘眼球取血致死后，每组取6只裸鼠主要脏器(肝、脾、肺、肾、结肠和股骨)进行H&E染色，步骤参考上述1.1.7所述³。

统计学方法：全部数据以Mean±SEM表示，使用SPSS单因素方差分析(One-WayANOVA)进行组间差异性比较(IBM SPSS Statistics v22.0),p<0.05和p<0.01均表示具有显著性差异。

结果由图13可见，AR和伊利替康对人结直肠癌SW480移植瘤裸鼠的主要器官包括肝、脾、肺、肾、结肠和股骨的组织病理学无明显影响。表明在本实验条件下，AR对上述器官无明显毒性作用。

3、AR对抗人结直肠癌SW480裸鼠移植瘤药效的研究

3.1 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤组织中肿瘤细胞增殖因子(Ki67)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)蛋白表达水平的影响(免疫组织化学法)

取每组6例移植瘤组织，免疫组织化学法检测肿瘤组织中VEGFR2蛋白表达水平和肿瘤微血管密度(×400，MVD)，步骤如下：取材：将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h；包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用；取石蜡切片，经过以下步骤操作；二甲苯(Ⅰ)15min→二甲苯(Ⅱ)15min→二甲苯：无水乙醇＝1:12min→100％乙醇(Ⅰ)5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min→50％乙醇5min→蒸馏水5min；PBS洗3次，每次5min；抗原修复(高火至沸，转为低火20min)，自然冷却；PBS洗3次，每次5min；切片放入3％H2O2溶液，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min；去除BSA液，，每张切片加入50μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的二抗，室温孵育50min；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每张切片加50-100μl新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色，用蒸馏水冲洗；苏木素染色25s，用自来水流水冲洗3-5min返蓝；切片分别经以上染色后按下述步骤脱水：50％乙醇1-2s→70％乙醇1-2s→80％乙醇1-2s→无水乙醇5-10min→二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)2min；切片脱水后，使用中性树胶封片，通风厨中晾干后，置于显微镜下观察，图像采集分析。

结果如14-15所示，各组肿瘤细胞增殖因子(Ki67)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的免疫组化结果显示(褐色着色越深，表示Ki67或VEGFR2表达越多)：与模型组相比，AR 64mg/kg，32mg/kg剂量组和伊立替康45mg/kg组均可显著减少Ki67的表达(p<0.01)；同时AR 64mg/kg剂量组和伊立替康45mg/kg组明显降低VEGFR2的表达(p<0.05)。证明AR具有抑制肿瘤增大和抑制血管生成的作用。

3.2 AR对SW480皮下移植瘤裸鼠肿瘤中磷酸化细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(p-ERK 1/2/ERK 1/2)、细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和VEGFR2的影响(Western blot法)

用裂解液提取每组肿瘤组织中的蛋白并用BCA法按照标准方法进行Western blot检测：用10％SDS-PAGE定量分离总蛋白，并将其转至PVDF膜。主要的抗体包括低氧诱导因子(HIF)、VEGFR2、磷酸化细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(p-ERK 1/2/ERK 1/2)、细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)和β-actin(1:20 00)。孵化在4℃过夜。然后膜被孵育辣根过氧化物酶标记的二抗在RT下持续2小时，用透射电镜观察蛋白条带的变化增强的化学发光检测系统，利用Image J软件进行量化。每组3只裸鼠，肿瘤组织3个样本在每只大鼠中分别收集。每个指标重复三次。注：统计方法：全部数据以Mean±SEM表示，使用SPSS单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间差异性比较(IBM SPSS Statistics v22.0),p<0.05和p<0.01均表示具有显著性差异。

结果由图16可见，与模型组相比，AR 64mg/kg剂量组和伊利替康组能显著降低p-ERK 1/2/ERK 1/2、Caspase-3、HIF-1α和VEGFR2表达量(p<0.01)；AR 32mg/kg剂量组能显著降低p-ERK 1/2/ERK 1/2(p<0.05)、Caspase-3、HIF-1α和VEGFR2的表达量(p<0.01)；证明AR具有与伊利替康相当的肿瘤抑制作用、血管抑制作用和促凋亡作用。

综上，AR通过下调HIF-1α/ERK/Caspase-3/VEGFR2通路发挥肿瘤抑制作用及抗肿瘤血管生成的作用。且安全性较高，总体安全性优于伊利替康。灵仙新苷具有抗人结直肠癌细胞和人结直肠癌的活性，可以用于制备抗结直肠癌或抗结直肠癌细胞产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims

1.灵仙新苷在制备抗肿瘤产品和/或抗肿癌细胞产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤，所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤为结直肠癌，所述实体肿瘤细胞为结直肠癌细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌为人结直肠癌，所述结直肠癌细胞为人结直肠癌细胞。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤产品和/或抗肿瘤细胞产品的活性成分为灵仙新苷。