CN115844876B - 一种防治类风湿关节炎和/或骨关节炎的药物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了羌活醇、灵仙新苷或蛇床子素中的至少一种在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用。本发明还公开了一种治疗或/和预防风湿关节炎和/或骨关节炎的组合物，所述的组合物是以选自羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素中的至少两种成分的组合为有效成分。所述的组合物为羌活醇和灵仙新苷的组合，或羌活醇和蛇床子素的组合，或灵仙新苷和蛇床子素的组合，或羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素的组合。本发明经细胞实验和动物实验证明，由羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素中的至少两种组成的组合物能够预防和/或治疗类风湿关节炎和骨关节炎，且组合物的治疗效果明显优于单一成分。

Description

一种防治类风湿关节炎和/或骨关节炎的药物及应用
技术领域
本发明涉及一种具有抗炎功能的药物，具体涉及一种治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎的药物及应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以侵蚀性，对称性，多关节炎为主要临床表现的慢性全身性自身免疫性疾病。研究表明，RA前期主要累及手腕足等小关节，随着疾病的发展而逐步侵犯大关节及关节外结缔组织，并可引起机体眼部、心肺和神经系统的全身性并发症，严重影响患者的行动能力，降低患者的生活质量，给患者家庭乃至社会都造成了极重的经济负担。流行病学显示，类风湿性关节炎约占全球人口总数的0.5～1％。同时，RA发病率与性别和年龄等因素有关，女性发病率约为男性的三倍，而男性发病率则随着年龄增长而呈现上升的趋势。
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)，也称之为退行性关节炎，是一种以关节软骨损害为主，并累及整个关节组织的最常见的关节疾病。临床上OA的病理特点主要表现为关节软骨变性破坏、软骨下骨硬化、关节边缘骨质增生、滑膜增生和炎症等。流行病学研究显示，OA发病与年龄、性别、体质量指数等密切相关，尤其好发于绝经期女性。随着疾病的进展，OA患者呈现关节变形疼痛、僵硬、肿胀，严重可致残，严重影响患者生活质量。
当前，在临床医学中经常会遇到产生骨关节炎病症以及类风湿性关节炎病症的患者，且临床医学研究表明，类风湿性关节炎在前期的发病机理与骨关节炎的发病机理存在一定的相似性。骨关节炎，它的病理改变为关节软骨变性、软化、消失，并在关节边缘有新骨形成。可能是由于先天性关节解剖异常、损伤骨缺血坏死、关节内感染、结晶体关节内沉积等等。而类风湿关节炎是一种以慢性进行性关节病变为主的自身免疫病。其特征是对称性多关节炎，以双手、腕关节、肘关节、膝关节、踝关节和足关节受累最为常见，全身其他关节亦可受累。临床上，类风湿关节炎和骨关节炎均表现出关节炎症，属于临床病特征相似的两种疾病。目前，临床上用来治疗RA和OA的药物繁多：如具有解热镇痛消炎作用的非甾体抗炎药类；抗风湿药物甲氨碟呤；肾上腺皮质激素等，但都存在着一些缺点，如非甾体抗炎药在体内代谢较快，维持时间短；肾上腺皮质激素若长期使用可能会加剧症状等，且两种疾病需要分别给予不同用途的药物进行治疗，不同种类的药物联合用药可能会存在潜在的不良反应或者毒副作用。
发明内容
角药是以中医基本理论为基础，以辨证论治为前提，以中药气味、性能、七情为配伍原则，三种中药联合使用，在临床应用中可起到减毒增效之作用。羌活、独活具解表散风寒、祛风散湿之功，其中羌活发散解表力强，而独活重祛风湿，威灵仙具祛风散湿、通利关节之功，三者作为角药体现从“寒湿”论治的功效。羌活醇是中药羌活或宽叶羌活的化学成分之一，灵仙新苷、蛇床子素分别是中药威灵仙和独活的化学成分。组分中药具有成分明确、配比清楚的优点，是中药复方用药一个重要发展方向，在疗效上与传统中药的疗效一致或效果更显著，且质量可控，可以用于产业化推广。羌活醇、灵仙新苷和蛇床子分别来自祛风除湿的羌活、威灵仙与独活角药，将选自羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素中的至少两个化合物配伍成组分药物，从而更能发挥多成分、多靶点的协同增效整合作用，用于改善疼痛和发挥抗炎功能，同时还可以增强机体的免疫能力，可以用于治疗类风湿关节炎、骨关节炎及其两种疾病共病，构建了一种用于治疗复杂疾病及其共病的基于传统中药复方的组分联合用药新型治疗方案。
本发明目的是针对临床上用于治疗RA和OA的药物存在不同程度毒副作用或不良反应等劣势，发明人将羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素中的至少两种组合为新的组合物，利用羌活醇、灵仙新苷长于镇痛抗炎，蛇床子素增强免疫、镇静和镇痛等对中枢系统的抑制作用，发挥多成分协同增效的整合作用，用于改善疼痛，发挥抗炎功能，治疗类风湿关节炎、骨关节炎及其两种疾病共病。本发明提供了一种源于传统中医药、活性成分联合用药相结合，发挥协同增效作用的药物组合物，能够更加安全有效地预防或治疗类风湿关节炎及/或骨关节炎或上述两种疾病的共病，为其患者提供多一种安全、有效且质量可控的创新组合药物的选择，用于改善患者病理状况并提高其生活质量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
羌活醇、灵仙新苷或蛇床子素中的至少一种在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用。
所述的应用为羌活醇在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用；
或所述的应用为灵仙新苷在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用；
或所述的应用为蛇床子素在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用；
或所述的应用为以羌活醇和灵仙新苷为有效成分在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用；
或所述的应用为以羌活醇和蛇床子素为有效成分在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用；
或所述的应用为以灵仙新苷和蛇床子素为有效成分在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用。
所述的应用为以羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素为有效成分在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用。
所述的药物是以羌活醇、灵仙新苷或蛇床子素中的至少一种为有效成分，与药物上可接受的药物辅料制成药学上可接受的剂型。
本发明的另一个目的是提供一种治疗或/和预防风湿关节炎和/或骨关节炎的组合物，所述的组合物是以选自羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素中的至少两种成分的组合为有效成分。
优选的，所述的组合物为羌活醇和灵仙新苷的组合，或羌活醇和蛇床子素的组合，或灵仙新苷和蛇床子素的组合，或羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素的组合。
所述的组合物为羌活醇和灵仙新苷的组合时，所述的羌活醇和灵仙新苷的摩尔比为5.5:1～1:1.5，具体可以为5.1:1(即羌活醇和灵仙新苷的质量比为1:1)、7:3、1:1、1:1.5，优选为5.1:1、1:1。
所述的组合物为羌活醇和蛇床子素的组合时，所述的羌活醇和蛇床子素的摩尔比为7:3～1:1.5，具体可以为7:3、1:1、1:1.45(即羌活醇和蛇床子素的质量比为1:1)、1:1.5，优选为1:1、1:1.45。
所述的组合物为灵仙新苷和蛇床子素的组合时，所述的灵仙新苷和蛇床子素的摩尔比为7:3～1:7.5，具体可以为7:3、1:1、1:1.5、1:7.4(即灵仙新苷和蛇床子素的质量比为1:1)，优选为1:1、1:7.4。
所述的组合物为羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素的组合时，所述羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素的摩尔比为(1～5.5):1:(1～7.5)，具体可以为1:1:1、5.1:1:7.4(即羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素的质量比为1:1:1)。
本发明的另一个目的是提供所述的组合物在制备具有抗炎功能的预防或/和治疗类风湿关节炎和/或骨关节炎的药物、保健品或功能性食品的应用。
所述的组合物与药学上可接受的药物辅料制成软膏剂、搽剂、贴剂、洗剂、溶液剂、散剂、喷雾剂、糖浆剂、栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂或胃肠溶缓控释制剂。
所述的风湿关节炎和/或骨关节炎为风湿关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎和骨关节炎共病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)、本发明各成分均来自常用的祛风除湿的天然药物，两者或三者联合使用，系统配伍而成，共达散风祛湿、温经通络、通利关节之功效。
(2)、本发明各组合物均由天然药物来源的中药活性单体组成，毒副作用小，成分较为清楚，机理相对明确，在疗效上与传统中药的疗效一致或更显著，且质量可控；
(3)、本发明各组合物均无明显毒性，体外细胞实验显示能够明显改善RAW264.7细胞和滑膜细胞的存活率；
(4)、RAW264.7细胞体外炎症细胞模型结果表明本发明中各组合物均能够下调LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症因子NO水平，具有良好的抗炎活性；不同组合物均能够抑制FLS细胞增殖并诱导其凋亡的活性。
(5)本发明组合物可以减少CIA大鼠与OA大鼠的关节炎性与血清中血清炎性因子的水平，提高抗炎因子水平，具有显著的抗类风湿关节炎、骨关节炎及其两者疾病共病的可能。
附图说明
图1为不同处理组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及VEGF含量；其中，Con：正常组组，Mod：模型组，Ibu：阳性对照组(布洛芬)，Tri：阳性对照组(雷公藤多苷片)，Not：羌活醇，Cle：灵仙新苷，Ost：蛇床子素，N+C：羌活醇+蛇床子素，N+O：羌活醇+灵仙新苷，C+O：灵仙新苷+蛇床子，N+C+O：羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素；与空白组相比，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图2为不同处理组II型胶原诱导关节炎大鼠踝关节HE染色结果；其中，A：正常组组，B模型组，C：阳性对照组(布洛芬)，D：阳性对照组(雷公藤多苷片)，E：羌活醇，F：灵仙新苷，G：蛇床子素，H：羌活醇+蛇床子素，I：羌活醇+灵仙新苷，G：灵仙新苷+蛇床子素，K：羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
RAW264.7细胞活性验证
关节炎的病因复杂，主要与自身免疫反应、感染、代谢紊乱、创伤、退行性病变等因素有关。根据病因可将关节炎分为骨性、类风湿性等。RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)是主要的免疫效应细胞，在炎症、免疫、凋亡研究中应用广泛。因此，有效地抑制RAW264.7细胞的活化增殖和降低炎症因子水平是抗炎的关键。本发明采用脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞建立体外炎症细胞模型，利用CCK-8法和Griess实验考察本发明组合物对细胞活力及炎症因子NO的影响。
阳性对照药：地塞米松。
1实验方法
1.1CCK-8法检测细胞活力
LPS溶液配制：称取LPS粉末4mg，溶于40mL DMEM培养基中，得100μg/mL母液，分装于1.5mL EP管中，每管200μL，保存于-80℃。
取对数生长期RAW264.7细胞，接种于96孔板，细胞接种密度为5×103/mL，每孔100μL细胞悬液，置于孵箱内培养24h；分别设置空白组、模型组(LPS)、阳性对照组(地塞米松)和给药组(按照表1给予羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素)，阳性对照组和给药组中均先加入LPS刺激造模10h，再每孔加入待测样品和细胞悬液；空白组每孔不加样只加培养液；每组分别设置5个复孔；再放入培养箱中继续培养24h后，每孔避光加入10μL CCK-8试剂，继续培养1h。用酶标仪测定OD450，计算细胞存活率。
(1)空白组(CON)：DMEM培养基；
(2)模型组(MOD)：DMEM培养基+LPS(1μg/mL)；
(3)阳性对照组：DMEM培养基+地塞米松(20μM，终浓度)+LPS(1μg/mL)；
(4)给药组：DMEM培养基+不同配伍的化合物组合的溶液(30μM，终浓度)+LPS(1μg/mL)。
1.2Griess实验
取对数生长期RAW264.7细胞，接种于96孔板，细胞接种密度为2×105个/mL，每孔100μL细胞悬液，置于孵箱内培养24h，弃去上清；分别设置空白组、模型组(LPS)、阳性对照组(地塞米松)及给药组，阳性对照组和给药组中均先加入LPS刺激造模10h，再每孔加入待测样品和细胞悬液；空白组每孔不加样只加培养液；每组分别设置5个复孔。培养箱中培养24h后，每孔各取上清100μL转至干净96孔板，每孔均加入Griess试剂100μL，充分混合，避光显色10min，测定其OD540。将测得的OD540代入以亚硝酸钠标准溶液绘制的标准方程，计算出RAW264.7细胞上清液中释放的NO的含量。
根据下列公式计算NO抑制率：
NO抑制率(％)＝(C模型-C给药)/(C模型-C空白)×100％
其中，C模型表示模型组的浓度值，C给药表示阳性对照组或给药组的浓度值，C空白表示空白组的浓度值。
2实验结果
表1显示，给予羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素干预，均可抑制NO的产生，说明具有一定的体外抗炎活性，且组合物的效果显著优于单一药物。
表1.不同组合物对LPS诱导的RAW264.7细胞活力及NO释放作用(n＝5，x±SD)
注：化合物的用量比为摩尔比；与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001，与阳性对照组相比，&&P<0.01，有显著性差异。
实施例2
药物对TNFα刺激下FLS-RA细胞增殖的影响
RA的一个主要病变表现为滑膜组织的增生，滑膜细胞凋亡缺陷是RA发病的一个重要病理机制。滑膜细胞能够响应并且介导炎症反应，直接破坏软骨和骨组织并介导其他细胞破坏软组织，因此成为了关节炎治疗的一个重要靶点。滑膜成纤维细胞(FLS)是滑膜组织的重要组成部分。因此，本发明采用肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor，TNFα)诱导的滑膜成纤维细胞增殖模型和滑膜成纤维细胞凋亡模型，考察本发明组合物对滑膜成纤维细胞增殖及其凋亡的影响。
1实验方法
1.1CCK-8法检测药物对FLS细胞的增殖抑制作用
取对数生长期FLS细胞，胰蛋白酶消化后接种于96孔培养板中，接种密度为1×104/孔，每孔200μL，37℃恒温培养箱培养24h，弃上清液，分别设置：空白组(含0.01％DMSO的DMEM培养基)、模型组(含0.01％ DMSO的DMEM培养基+10ng/mL TNFα)、给药组(含0.01％DMSO的DMEM培养基+10ng/mL TNFα，给药组中加入TNFα刺激造模12h，再按照表2分别给予羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素)，每组分别设置5个复孔。置于培养箱处理48h，按照CCK8试剂:DMEM培养基体积比＝1:10孵育2h，以酶标仪检测450nm处OD值。
1.2流式细胞仪法检测FLS细胞凋亡情况
取对数生长期FLS细胞铺6孔板，接种密度2.5×104/孔，细胞培养过夜，以预温(37℃)PBS洗涤后将细胞静息6h，分组和加药情况和“1.1CCK-8法检测药物对FLS细胞的增殖抑制作用”相同，加药48h后以流式细胞仪考察细胞凋亡情况。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测根据试剂盒说明书进行实验：转移细胞液至离心管，细胞以PBS洗涤两次，胰酶消化后以1000g离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。此后加入5μL Annexin V-FITC，混匀，加入10μL碘化丙啶染色液，混匀。室温避光孵育20min，孵育过程中重悬细胞3次以改善染色效果，最后以流式细胞仪检测荧光强度(Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光)。
2实验结果
结果见表2：单一药物和不同组合物均能够抑制FLS细胞增殖活性，尤其是不同组合物的效果优于单一药物，提示可能具有抗炎活性作用。同时，不同组合物也具有诱导FLS细胞凋亡的作用，不同组合物的效果也显著优于单一药物，与其抗炎活性作用的结果相一致。
表2.不同组合物对TNFα诱导FLS细胞增殖抑制及诱导FLS细胞凋亡作用(n＝5，)
注：化合物的用量比为摩尔比；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例3
不同组合物对II型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠模型的作用
1.实验方法
1.1实验分组
8周龄左右的雌性SPF级健康Wistar大鼠，体重130～150g，随机分为9组，每组一笼饲养：正常组、模型组、阳性药组(共两组阳性药组，每组分别给予布洛芬、雷公藤多苷片)及给药组(给予羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素)，除正常组外，其余各组均用II型胶原蛋白诱导构建关节炎大鼠模型。具体造模方法为：第一次免疫，II型胶原蛋白溶于0.05M冰醋酸中，配制得到浓度为2mg/mL的胶原溶液，4℃过夜；将胶原溶液和CFA(完全弗氏佐剂)按体积1:1混合后置于冰上乳化，每只大鼠尾部皮下注射200μgII型胶原蛋白；一周后进行二次免疫，用相同方法乳化胶原溶液和IFA(不完全弗氏佐剂)，每只大鼠皮下注射200μgII型胶原蛋白，造模共计两周(第一次免疫当日为第1天)，得到II型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型。
在此模型基础上，第15天开始连续灌胃给药21天，布洛芬给药剂量为6.75mg/kg/d，雷公藤多苷片给药剂量为18.90mg/kg/d；各给药组中，总给药剂量均为20mg/kg/d，其中，组合物给药时，羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素中，两种药物的质量比均是1:1，羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素中，三种药物的质量比是1:1:1。
1.2HE染色观察
按照“1.1实验分组”分组，大鼠给药培养21天，分别取空白组、模型组、阳性对照组及不同给药组大鼠踝关节，进行冰冻切片，再进行HE染色。
将大鼠踝关节用4％多聚甲醛固定24h后用10％EDTA 37℃脱钙，移入磷酸盐缓冲液中进行梯度脱水。脱水后通过冰冻切片机切片，贴于明胶处理过的载玻片上晾干。水洗1-2s，95％乙醇洗1-2s，无水乙醇洗1-2s，二甲苯洗2-3s，中性树胶封片后置于显微镜下观察拍片。
1.3ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及VEGF浓度
按照“1.1实验分组”分组，大鼠给药培养21天，用体积分数10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠腹主动脉取血，3000r·min-1离心10min后取血清。ELISA法检测空白组、模型组、阳性对照组及不同给药组大鼠血清中TNF-α，IL-1β、IL-6及VEGF的水平。
2实验结果
在造模阶段，与正常组相比，模型组大鼠足红肿，踝关节肿大；模型建立后，分别给药后肿胀度下降，炎症消退。在造模后第14天起进行炎症评分，结果显示模型组与正常组有显著差异，提示造模成功。
如图1所示，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及VEGF水平均显著上升，给予阳性药(布洛芬或雷公藤多苷片)、羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素后，阳性药、单一药物和不同组合物对大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及VEGF均呈现抑制作用，且组合物的抑制效果均显著优于单体化合物。
HE染色结果见图2，表明模型组滑膜细胞增生明显，可见组织充血、炎性细胞浸润；阳性药组和不同给药组均可见不同程度的的病理改变，但与模型组相比，病理均有所改善，且组合物效果优于单一药物，说明可能具有抗类风湿关节炎的活性作用。
实施例4
不同组合物对骨关节炎大鼠模型的作用
1.实验方法
1.1实验分组
雄性SPF级健康Wistar大鼠，体重130～150g，随机分为9组，每组一笼饲养：正常组、模型组、阳性对照组(盐酸氨基葡萄糖胶囊)及不同给药组(给予羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素)。除正常组大鼠外，其余各组大鼠均腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，用剃毛器将造模侧向关节腔膝关节周围毛发剔除干净，大鼠膝关节屈曲，除正常组外其余各组大鼠双膝关节腔内注入50μL含3mg碘乙酸钠的生理盐水诱导大鼠骨关节炎模型，1次/天，连续注入14天；正常组注射等体积生理盐水。在末次膝关节腔内注射碘乙酸钠溶液后，阳性对照组(盐酸氨基葡萄糖胶囊)、各给药组分别灌胃给予相应浓度受试药，每日1次，共计给药4周。
盐酸氨基葡萄糖胶囊(GH)给药剂量为25mg/kg/d；其余各给药组的总给药剂量均为20mg/kg/d，组合物给药时，羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素中，两种药物的质量比均是1:1，羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素中，三种药物的质量比是1:1:1。
1.2膝关节宏观观察和评分
肉眼观察膝关节软骨表面光泽度、完整度及是否存裂隙、糜烂和缺损等，并采用Pelletier评分方法对大鼠膝关节股骨踝和胫骨平台进行评分。
评分标准：0分，关节面完整平滑，色泽如常；1分，关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分，关节面糜烂，软骨侵蚀延伸至表层或中层；3分，关节面溃疡形成，软骨侵蚀达软骨深层；4分，软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
1.3HE染色观察
按照“1.1实验分组”分组，大鼠给药培养4周，分别取空白组、模型组、阳性对照组及不同给药组大鼠膝关节，将大鼠膝关节用4％多聚甲醛固定24h后用10％EDTA37℃脱钙，移入磷酸盐缓冲液中进行梯度脱水。脱水后通过冰冻切片机切片，贴于明胶处理过的载玻片上晾干。水洗1-2s，95％乙醇洗1-2s，无水乙醇洗1-2s，二甲苯洗2-3s，中性树胶封片后置于显微镜下观察拍片。
1.4ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α、IL-10浓度
用体积分数10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，3000r·min-1离心10min后取血清。ELISA 法检测空白组、模型组、阳性对照组及不同给药组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平。
2实验结果
表3.大鼠膝关节股骨髁和胫骨平台软骨宏观观察评分表(n＝6)
注：###P<0.001，表示模型组与正常组相比，具有显著性差异；不同给药组与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，有显著性差异，与阳性对照组相比，&&&P<0.001，有显著性差异。
通过宏观评分结果见表3，发现，与正常组相比，在造模阶段模型组大鼠膝关节肿大；正常组大鼠膝关节关节软骨面完整、光滑，模型组关节软骨剥脱，软骨下骨暴露。给予阳性药、羌活醇、灵仙新苷、蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素、羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素后，大鼠膝关节肿胀度下降；与模型组相比，阳性对照组和不同给药组均可不同程度地减轻软骨破坏，尤其是不同组合物给药组的大鼠关节软骨仅呈现轻微损伤。此外，模型组关节软骨损伤严重，软骨下骨外露，不同给药组软骨破坏程度有所减轻，大鼠的膝关节出现轻微的软骨变化，关节间隙几乎恢复正常，且组合物效果优于单一药物，提示可能具有抗故关节炎的活性作用。
膝关节HE染色结果显示，正常组大鼠膝关节软骨表面光滑、完整，关节间隙正常。模型组大鼠膝关节软骨缺损严重，关节间隙增大。各给药组与模型组大鼠膝关节有相似病理变化，但软骨缺损减轻，关节间隙恢复。其中，不同给药组大鼠的膝关节软骨相对较为完整，关节间隙基本恢复正常。取分离的膝关节股骨髁组织进行HE染色，观察关节软骨变化。正常组大鼠股骨髁组织软骨表面光滑。模型组股骨髁软骨表面粗糙、不规整，软骨缺损严重。阳性对照组大鼠股骨髁软骨增生，并伴有软骨缺损，表面凹凸不平。给予羌活醇、灵仙新苷或蛇床子素后，大鼠股骨髁组织软骨损伤严重，但较模型组轻。羌活醇+灵仙新苷、羌活醇+蛇床子素、灵仙新苷+蛇床子素及羌活醇+灵仙新苷+蛇床子素组的软骨缺损程度均较轻，尤其是羌活醇+蛇床子素组软骨表面相对光滑。说明不同给药组别均可以改善软骨的病变，尤其是组合物的效果优于单一成分给药组。
如表4，与正常组大鼠相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平均显著上升，给予阳性药和单一药物、不同组合物，均对对大鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-10呈现抑制作用，且组合物效果优于单一药物，可能具有抗骨关节炎的活性作用。
表4.大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平含量测定(n＝6)
注：###P<0.001，表示模型组与正常组相比，具有显著性差异；不同给药组与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001，有显著性差异，与阳性对照组相比，&&P<0.01和&&&P<0.001，有显著性差异。
综上，发明人通过细胞实验，分别建立了RAW264.7细胞和滑膜细胞体外模型。结果表明，单一化合物或者化合物之间的不同组合均能够下调LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症因子NO水平；不同组合物均能够抑制TNFα诱导的FLS细胞增殖作用，还能在一定程度诱导FLS细胞的凋亡，表现出一定的抗炎活性。细胞实验结果表明，本发明单一中药活性成分或其组合均能够有效预防和治疗类风湿关节炎和骨关节炎，且组合物效果显著优于单一成分。
通过动物实验，建立了胶原II型关节炎(CIA)大鼠模型和碘乙酸钠诱导的大鼠OA模型。在探究单一化合物和组合物对胶原诱导的类风湿关节炎大鼠炎症的作用中，Wistar大鼠被随机分为正常组、模型组、阳性药组(布洛芬和雷公藤多苷片)及羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素以及上述三个化合物不同组合的给药组，除正常组外，其余各组均用自制鸡II型胶原蛋白诱导构建关节炎大鼠模型。在此模型基础上，第15天开始连续灌胃给药21天。同样的，Wistar大鼠被分为正常组、模型组、阳性药组(盐酸氨基葡萄糖)及羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素以及上述三个化合物不同组合的给药组，除正常组外，其余各组大鼠双膝关节腔内注入50μL含3mg的碘乙酸钠生理盐水诱导大鼠骨关节炎模型，1次/天，连续注入14天，在末次膝关节腔内注射碘乙酸钠溶液后，阳性对照组及各给药组分别灌胃给予相应浓度受试药，每日1次，共计给药4周。
结果表明CIA大鼠模型组的肿胀度、关节炎性评分，血清TNF-α，IL-1β，IL-10水平均显著上升；病理结果表明模型组大鼠关节滑膜细胞增生，间质水肿伴炎性细胞浸润；分别以阳性药、羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素以及上述三个化合物不同组合处理后，上述指标均有不同程度的改善。在碘乙酸钠诱导的大鼠OA模型中，模型组的膝关节肿胀度，血清TNF-α，IL-1β，IL-10水平均显著上升，分别以阳性药、羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素以及上述三个化合物不同组合处理后，上述指标均有不同程度的改善。另外，发明人还发现组合物的药效优于单一药物，能明显改善动物模型的症状，具有抗类风湿关节炎和骨关节炎的活性。
因此，发明人发现羌活醇、灵仙新苷和蛇床子素以及上述三个化合物的不同组合适用于预防或改善RA患者、OA患者、尤其是RA和OA共病患者的症状，尤其是将三个化合物中的其中两个化合物进行组合或者将三个化合物进行组合，可以通过发挥双重效果的药物组合物来替代多种单独起效的药物，使合并症患者减少因同时服用多种药物而带来的身体负担，并减少花费，同时也可在一定程度上避免联合用药所产生的毒副作用或不良反应。在发挥协同增效的同时，本发明药物组合物还有可以减少药物服用种类和剂量。

Claims (4)

1.一种治疗或/和预防风湿关节炎和/或骨关节炎的组合物，其特征在于：所述的组合物为羌活醇和灵仙新苷的组合，所述的羌活醇和灵仙新苷的摩尔比为5.5:1～1:1.5。
2.权利要求1所述的组合物在制备具有抗炎功能的预防或/和治疗类风湿关节炎和/或骨关节炎的药物的应用。
3.权利要求1所述的组合物在制备治疗或/和预防类风湿关节炎和/或骨关节炎药物中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的组合物与药学上可接受的药物辅料制成软膏剂、搽剂、贴剂、洗剂、溶液剂、散剂、喷雾剂、糖浆剂、栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂或胃肠溶缓控释制剂。
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