CN102631345B

CN102631345B - 用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN102631345B
Application number: CN201210086902.2A
Authority: CN
Inventors: 李锦军; 路平
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF ONCOLOGY
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF ONCOLOGY
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: CN102631345A

Abstract

本发明涉及一种用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用。具体地，本发明公开了一种异紫堇定碱(Isocorydin，ICD)或其药学上可接受的盐的新用途，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。所述药物组合物可提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。

Description

用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是第五大常见的恶性肿瘤，在肿瘤导致死亡人数中排第三位，每年约有600,000人死于肝细胞癌，严重威胁人类健康。对传统化疗药物的耐受是肝细胞癌治疗不成功的重要因素。肿瘤细胞耐药性的产生是一个涉及多因素的复杂过程，其中之一是肿瘤细胞高表达ATP依赖性转运体家族的蛋白。

ABCG2是这个家族的重要一员，并且和肿瘤的多样耐药密切相关，它作为一个转运体，可以外排许多常用化疗药物，如阿霉素，柔红霉素，弥陀蒽醌，拓扑提抗，SN38，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素和顺铂等。此外，ABCG2还和侧群细胞表型有密切的关系。

侧群细胞(side population，SP)存在于多种肿瘤中，如乳腺癌、神经细胞瘤、肺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、肝细胞癌和结肠癌等，并且被认为是富含了肿瘤干细胞的群体。同样肝细胞癌的侧群细胞也表现出肿瘤干细胞样的特征，如自我更新，肿瘤生成和多向分化能力。

除上述干细胞样特征外，我们还发现侧群细胞与肝细胞癌细胞系的耐药密切相关。人肝细胞癌细胞系中，侧群细胞的比例同细胞外排和耐受阿霉素的能力密切相关，MHCC-97L中的侧群细胞，与非侧群细胞相比，有更强的药物外排能力，ABCG2对肝细胞癌的侧群细胞表型形成中具有重要的作用。侧群细胞是一群耐药的细胞，传统化疗药物如阿霉素，弥陀蒽醌，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素和顺铂等难以有效地杀伤侧群细胞。

秃疮花类生物(Dicranostigma leptopodum(Maxim.)Fedde，DLF)在临床上用于治疗肺结核，具有抗结核杆菌的功能。异紫堇定碱是从紫金龙和秃疮花等植物中提取的活性生物碱，是DLF的主要成分之一。

目前，临床应用中，还没有出现能有效地逆转肿瘤细胞耐药性的药物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备治疗肿瘤或逆转肿瘤细胞耐药性的异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明的另一目的是提供异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物在治疗肿瘤、或逆转肿瘤细胞耐药性的应用。

本发明第一方面提供了一种异紫堇定碱(Isocorydin，ICD)或其药学上可接受的盐的用途，用于制备：

(a)逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性的药物组合物；

(b)治疗肿瘤的药物组合物；

(c)抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂；或

(d)诱导肿瘤细胞周期阻滞或凋亡的诱导剂；

在所述的(a)、(b)、(c)和(d)中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括肿瘤侧群细胞和肿瘤非侧群细胞。

在另一优选例中，所述抗肿瘤药物选自下组：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、弥陀蒽醌、拓扑提抗、SN38、长春新碱、顺铂、丝裂霉素、氨甲喋呤和氟脲嘧啶脱氧核。

在另一优选例中，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括：提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。

在另一优选例中，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括：增加肿瘤细胞中抗肿瘤药物的摄入量；和/或减少肿瘤细胞中抗肿瘤药物的外排量；和/或延长肿瘤细胞中抗肿瘤药物的滞留时间。

在另一优选例中，所述药物组合物还用于：

(i)降低肿瘤细胞中侧群细胞的比例；和/或

(ii)下调肿瘤细胞中三磷酸腺苷结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)的表达；和/或

(iii)上调程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达。

在另一优选例中，所述药物组合物还用于：

抑制肿瘤细胞的生长；和/或

诱导肿瘤细胞的G2/M周期阻滞；和/或

诱导肿瘤细胞凋亡。

在另一优选例中，所述药物组合物还用于：

抑制肿瘤细胞中侧群细胞的生长；和/或

诱导肿瘤细胞中侧群细胞的G2/M周期阻滞；和/或

诱导肿瘤细胞中侧群细胞凋亡。

在另一优选例中，所述药物组合物还用于降低侧群细胞诱发肿瘤的体积和重量。

在另一优选例中，所述药物组合物还用于上调侧群细胞中促凋亡因子的表达，和/或下调侧群细胞中抑凋亡因子的表达。

在另一优选例中，所述抑凋亡因子选自下组：Bcl2、Bcl-xl和Mcl-1。

在另一优选例中，所述促凋亡因子选自下组：Fas、Bax、Bim、Bak、Bad、Bid和Bik。

在另一优选例中，所述肿瘤包括肝细胞癌、乳腺癌、神经细胞瘤、肺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾透明细胞癌、或胃癌。

本发明第二方面提供了一种非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤细胞，从而抑制所述细胞的生长。

本发明第三方面提供了一种非治疗性的抑制肿瘤侧群细胞生长的方法，包括步骤：在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤侧群细胞，从而抑制所述细胞的生长。

本发明第四方面提供了一种治疗方法，包括步骤：给需要的对象施用药学有效剂量的异紫堇定碱或其药学上可接受的盐、或含异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物。

在另一优选例中，所述方法用于：

(a)逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性；

(b)治疗肿瘤；

(c)抑制肿瘤细胞增殖；或

(d)诱导肿瘤细胞周期阻滞或凋亡；

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了用150μg/ml、250μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L、MHCC-97H，MHCC-LM324h后侧群细胞流式细胞分析的代表性散点图。

图1B显示了150μg/ml、50μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L、MHCC-97H和MHCC-LM324h后，侧群细胞的比例发生显著的变化，10μg/ml阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，对侧群细胞比例的影响。

图2A显示了Western blot检测不同浓度的异紫堇定碱和阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后ABCG2的蛋白表达。

图2B显示了免疫细胞荧光化学显示150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后ABCG2荧光强度的变化；

每个细胞中，左图绿色荧光为单克隆抗体标记，FITC联合二抗标记的ABCG2，中图蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，右图为左图和中图的合并。

图3A显示了分选后的侧群细胞和非侧群细胞的纯度检测。

图3B显示了Western blot检测分选后的侧群细胞和非侧群细胞中ABCG2的蛋白表达水平。

图3C显示了BrdU掺入试验检测不同浓度异紫堇定碱和不同浓度阿霉素处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后对细胞增殖的抑制作用。

图3D显示了流式细胞术检测150μg/ml处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞12h，24h，48h后对细胞周期分布的影响。

图4显示了异紫堇定碱诱导侧群细胞早期和后期凋亡(C2和C4区域)。

Annexin V/7-AAD双标记法检测150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞48h后细胞早期和后期凋亡情况。

图5A显示了150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后caspase家族成员的起始分子的表达改变。

图5B显示了150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后细胞膜和线粒体膜上凋亡相关分子的表达改变。

图6A显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤体积的的影响。

图6B显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤瘤重的影响。*，P＜0.05。

图7A显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠移植瘤组织的caspase家族起始分子的表达影响。

图7B显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠移植瘤组织的细胞膜和线粒体膜凋亡相关分子的表达影响。

图8显示了异紫堇定碱对裸小鼠体重的影响。

图9显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的敏感性的改变。BrdU细胞增殖检测试验显示150μg/ml异紫堇定碱和10μg/ml阿霉素分别处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，对细胞系对阿霉素的敏感性的影响。

图10显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的摄入、外排和滞留的影响。150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，对阿霉素的摄入、外排和滞留的影响，柱状图是对阳性细胞率的统计结果。

图11显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3PDCD4蛋白表达的改变。用不同浓度的异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM3细胞系24h后，Western blot检测PDCD4的蛋白表达水平。

图12A显示了PDCD4在MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞的蛋白表达水平。

图12B显示了150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM3侧群细胞和非侧群细胞后，PDCD4蛋白表达水平的改变。

图12C显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤组织中PDCD4的表达水平的的改变。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现，异紫堇定碱或其药学上可接受的盐可显著上调一系列促凋亡因子(如Bcl2，Bcl-xl，Mcl-1等)，下调抑凋亡因子(如Fas，Bax，Bim等)，从而诱导侧群细胞发生凋亡，显著抑制侧群细胞的生长，降低肝细胞癌细胞系的侧群细胞比例，降低癌细胞中ABCG2的表达水平，可改善肿瘤侧群细胞中PDCD4蛋白的低表达，可以减小侧群细胞诱发肿瘤的体积和重量，而对非侧群细胞生成的肿瘤没有显著的影响，可以有效地逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物(尤其是阿霉素)的耐药性。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明所用“A和/或B”表示具有A、或具有B、或同时具有A和B。例如“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。”表示具有“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性”的作用，或具有“降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性”的作用，以及同时具有“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性”和“降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性”两个作用。

药物组合物

活性成分

如本文所用，术语“本发明化合物”指异紫堇定碱或其药学上可接受的盐。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐，包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸等无机酸，草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

药物组合物和施用方法

本发明化合物或含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由侧群细胞介导的疾病，例如但不限于癌症。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”应能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效，且适合于人使用，必须有足够的纯度和足够低的毒性。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明主要优点：

1.提供了一种异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物能显著抑制肿瘤细胞中侧群细胞生长，有效降低肿瘤细胞中侧群细胞的比例，降低ABCG2的蛋白表达，上调PDCD4的蛋白表达，逆转肿瘤细胞对一些传统抗肿瘤药物的耐药性。

2.提供了异紫堇定碱或其药学上可接受的盐在提高肿瘤细胞对传统抗肿瘤药物的敏感性，从而用于治疗肿瘤方面的应用。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明所用“ICD”是指异紫堇定碱；“SP”是指侧群细胞；“non SP”是指非侧群细胞；“DXR”是指阿霉素；本发明所用“cleaved”表示截断的。本发明所用“Xenograft”表示异体移植瘤。

实施例

材料与方法

1材料

1.1细胞系及实验动物

人肝癌细胞系：MHCC-LM3，MHCC-97H，MHCC-97L，购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所。

6-8周龄的雄性BALB/c(nu/nu)小鼠，购自上海肿瘤研究所病理学研究组。

1.2主要试剂

本发明所用的主要试剂如表1所示。

表1

表1中所述的一抗具体如表2所示。

表2第一抗体

表1中所述的二抗具体如表3所示。

表3第二抗体

1.3主要仪器

CO₂培养箱 (REVCO Scientific)；

Epics Altra流式细胞仪 (Beckman Coulter)；

INNOVA 90-CA5紫外激光 (Coherent)；

酶标仪 (Mulyidksn MK3，Thermo Scientific)；

Mini PROTEIN 3微型垂直电泳槽 (Bio-Rad)；

Mini Trans-Blot微型电泳转移槽 (Bio-Rad)；

低温低速离心机 (Thermo Scientific)；

Axioskop 2显微镜 (Carl Zeiss)；

PE 160电子天平 (Mettler)。

1.4常用溶液

1.30％丙烯酰胺：29％(W/V)丙烯酰胺，1％(W/V)N，N-亚甲双丙烯酰胺；

2.电泳缓冲液：25mM Tris-Cl(pH 8.0)，250mM甘氨酸，0.1％SDS(pH 8.3)，1.5MTris-Cl(pH 8.8)，1.0M Tris-Cl(pH 6.8)；

3.丙烯酰胺凝胶

试剂	8ml 10％分离胶	8ml 12％分离胶	5ml 5％积层胶
				H<sub>2</sub>O	3.2	2.64	3.4
30％丙烯酰胺	2.64	3.，2	0.83
				Tris-Cl	2	2	0.63
10％SDS	0.08	0.08	0.05
				10％过硫酸铵	0.08	0.08	0.05
TEMED	0.0032	0.0032	0.005

4.转膜液：48mM Tris Base，，39mM甘氨酸，20％甲醇；

5.封闭液：0.01M PBS，pH7.4配制的5％脱脂奶粉；

6.完全培养基：(DMEM，10％FBS，100IU青霉素，100μg/ml链霉素)；

7.Western blot所用的PBST(PBS，1‰Tween)；

8.免疫细胞荧光化学所用的PBST(PBS，0.5‰Tween)。

2.实验方法

本发明所用相关的实验方法按本领域普通技术人员所熟知的方法进行，优选按如下所述进行。

2.1细胞培养

细胞均在37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下进行培养，培养基为DMEM完全培养基，包含10％胎牛血清、100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素。

2.2分析和分选侧群细胞

用流式细胞术上分析或分选侧群细胞，具体操作例如(但不限于)：

用胰酶把待分析或分选的细胞从培养皿上消化下来，用PBS清洗一次，用含10mMHEPES和2％FBS的DMEM培液重悬细胞，并调整细胞悬液浓度至1×10⁶个/ml，置于离心管中。

用5μg/ml Hoechst 33342标记细胞，取1ml含荧光染料的细胞悬液置于另一离心管并加入10μM FTC作为阴性对照。将离心管置于37℃水浴中孵育90min，每隔10min摇晃离心管一次，保证细胞始终处于悬浮状态。

孵育结束后，用低温离心机在4℃，1500rpm的条件下离心15min收集细胞，用预冷的含2μg/ml PI的HBSS重悬细胞。

然后在流式细胞仪上分析或分选侧群细胞，用351nm的紫外激光激发Hoechst的荧光，用450DF20(Hoechst blue)和675ALP(Hoechst red)滤片收集荧光信号。

2.3细胞周期分析

用流式细胞术检测其细胞周期，具体操作例如(但不限于)：

将2×10⁵个待分析的细胞接种在6孔板上，24h后，换新鲜的含1mM TdR的培养液，使细胞周期同步化，再培养24h后，换新鲜的培养液，加入一定浓度的异紫堇定碱处理一定时间之后，用胰酶消化细胞，收集细胞(包括上清中的死细胞)，用PBS清洗一次，用2ml预冷的70％乙醇固定细胞，-20℃过夜。

800rpm常温离心5min，弃除上清后，用PBS清洗三次，用500μl预冷的PI/TritonX-100缓冲液重悬细胞，室温避光孵育30min后，用流式细胞术检测其细胞周期。

数据由EXPO32ADC software(Beckman Coulter Epics Altra，USA)分析。

2.4凋亡分析

用流式细胞术检测细胞凋亡情况，具体操作例如(但不限于)：

用胰酶将待检测的细胞从培养皿上消化下来，收集至离心管，用PBS清洗一次，用结合缓冲液(Binding buffer)重悬，并调整浓度至1×10⁶个/ml。

取100μl细胞悬液移至另一离心管，加入5μl Annexin V和5μl 7-AAD，避光孵育15min，再加入400μl结合缓冲液，混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.5BrdU细胞增殖实验

采用BrdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖情况，具体操作例如(但不限于)：

将待检测细胞接种97孔板，5000个/孔，细胞恢复24h，然后加药物(异紫堇定碱)处理一定的时间，之后采用BrdU细胞增殖检测试剂盒(Rohce Diagnostics)，根据说明书进行BrdU掺入试验，OD值用用酶标仪(Mltiskan MK3，Thermo Scientific)测量。

2.6蛋白免疫印记(Western blot、WB)

本发明的蛋白免疫印记实验方法可以是本领域普通技术人员所熟知的方法，具体操作例如(但不限于)，

配制适宜浓度的十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(根据所检测分子的分子量选择)。

将已变性并按比例加入5×上样缓冲液(loading buffer)的待检测蛋白样品按20-40μg/ml上样，积层胶80V电泳，分离胶120V电泳。

电泳结束后，用湿转法将SDS-PAGE中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜，0.22A恒流转膜40min。

转膜结束后，5％脱脂牛奶在室温条件下封闭1h。

然后将膜浸入用封闭液按一定比例稀释的一抗，4℃过夜孵育。次日，用PBST洗膜10min，重复3次。

然后将膜浸入用封闭液按一定比例稀释的二抗，室温孵育1-2h，再用PBST洗膜10min，重复3次。

用化学发光试剂盒(SuperSignal显色试剂盒)显色并分析特异性条带。

2.7免疫细胞荧光化学(IF)

本发明的免疫细胞荧光化学实验方法可以是本领域普通技术人员所熟知的方法，具体操作例如(但不限于)，

将待检测细胞接种于包被了多聚赖氨酸的载玻片上，培养24h后，用4％多聚甲醛在4℃条件下固定20min，然后用封闭液室温封闭30min。

用封闭液按一定比例稀释的一抗孵育4℃过夜，PBST轻轻清洗三次，每次5min。

再用封闭液按一定比例稀释的二抗和DAPI共孵育室温30min，PBST轻轻漂洗三次，每次5min。

浸在PBST中保存，用荧光显微镜拍照分析。

2.8动物实验

本发明的动物实验均在SPF级动物实验室进行，可以是本领域普通技术人员所熟知的实验方法，优选操作如下：

所用动物为6-8周龄的雄性BALB/c(nu/nu)裸小鼠。将流式细胞术分选的8×10⁴个侧群细胞或非侧群细胞通过接种到小鼠皮下。

三周后，当皮下出现可观察到的肿瘤组织团块时，将侧群细胞组和非侧群细胞组的小鼠分别分成处理组和对照组。

处理组：通过尾静脉注射给异紫堇定碱，0.4mg/kg，5次/周；

对照组：以PBS代替异紫堇定碱处理。

给药四周后，无痛苦处死小鼠，取出皮下肿瘤组织，称重进行统计学分析。

2.9阿霉素摄入、外排和滞留实验

本发明的对阿霉素进行摄入、外排和滞留的实验方法可以是本领域普通技术人员所熟知的方法，具体操作例如(但不限于)，

接种2×10⁵个待检测的经异紫堇定碱预处理的细胞在12孔板，培养24h，换新鲜培液，加入20μg/ml阿霉素共培养4h，PBS清洗三次，换新鲜无阿霉素的培液，在孵育结束后0h，4h，24h时间点时用荧光显微镜观察阿霉素的摄入、外排和滞留的情况。

以红色荧光集中在细胞核处的细胞为阳性细胞，计数后进行统计学分析。

2.10统计学分析

数据的表达形式为平均数±标准差。用Student’s t-test对数据进行分析。P＜0.05认为有统计学意义。

实施例1异紫堇定碱对肝细胞癌细胞系侧群细胞比例的影响

1.1检测异紫堇定碱和阿霉素对肝细胞癌细胞系侧群细胞比例的影响

1.1.1用流式细胞术检测异紫堇定碱处理组和对照组的肝细胞癌细胞系中侧群细胞比例的改变。

对照组：用两种不同浓度的异紫堇定碱(150μg/ml，250μg/ml)处理MHCC-97L，MHCC-97H和MHCC-LM324h。

空白对照组：用PBS处理MHCC-97L，MHCC-97H和MHCC-LM324h。

阴性对照组：用FTC处理MHCC-97L，MHCC-97H和MHCC-LM324h。

结果表明：与空白对照组对比可知，处理组的肝细胞癌细胞中侧群细胞的比例均发生了显著的下降。

图1A是流式散点图，250μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L，MHCC-97H和MHCC-LM324h后，侧群细胞的比例(红色荧光部分，即实线框内细胞)显著下降。

图1B显示：对分别用150μg/ml和250μg/ml异紫堇定碱处理上述三种细胞系的结果进行了统计，发现异紫堇定碱能够显著降低三种细胞系中侧群细胞比例，并呈现出浓度依赖性的趋势：侧群细胞的比例随着处理中异紫堇定碱的浓度升高而降低。

1.1.2用流式细胞术检测阿霉素处理组和对照组的肝细胞癌细胞系中侧群细胞比例的改变。

处理组：用10μg/ml阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

结果如图1B所示，发现与异紫堇定碱的作用相反，阿霉素显著升高了侧群细胞的比例，在MHCC-97L和MHCC-LM3两种细胞系中都得到了相同的结果。

结论：与现有的抗肿瘤药物阿霉素相比，异紫堇定碱可显著降低肝癌细胞中侧群细胞的比例，且呈现浓度依赖性下降趋势。

1.2检测异紫堇定碱和阿霉素对肝细胞癌细胞系的ABCG2表达的影响

1.2.1用Western blot检测异紫堇定碱处理组和对照组的肝细胞癌细胞系的ABCG2表达水平。

处理组：用不同浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/m1)的异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

1.2.2用Western blot检测阿霉素处理组和对照组的肝细胞癌细胞系的ABCG2表达水平。

处理组：用不同浓度(5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml)的阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

Western blot结果如图2A所示：

异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM3后，ABCG2的表达随着异紫堇定碱浓度的增加而下降，在两种细胞系中得到相似的结果，与流式细胞术检测的侧群细胞的变化趋势一致。

阿霉素处理两个细胞系24h后，ABCG2的表达呈现出浓度依赖性的上调趋势，同样与阿霉素对侧群细胞比例的影响一致。

1.3免疫细胞荧光化学检测异紫堇定碱对ABCG2表达的影响

用免疫细胞荧光化学检测异紫堇定碱对肝细胞癌细胞中ABCG2的表达水平。

结果如图2B所示：异紫堇定碱对ABCG2具有下调作用，在两种细胞系中，150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，ABCG2的荧光强度显著减弱，和Western blot的结果一致。

结论：与现有的抗肿瘤药物阿霉素相比，异紫堇定碱可显著降低肝细胞癌细胞中ABCG2的表达，且呈现浓度依赖性下降趋势。

实施例2异紫堇定碱对侧群细胞有更强的生长抑制作用

侧群细胞和非侧群细胞的分选

从MHCC-97L中分选出侧群细胞和非侧群细胞，分选方法参见方法2.2，并检测分选的纯度。分选后的侧群细胞和非侧群细胞的纯度均达到99％以上(如图3A所示)，提取分选后细胞的总蛋白，用Western blot检测其中ABCG2的表达水平，ABCG2在侧群细胞中相对高表达(如图3B所示)，进一步证明分选成功。

2.1BrdU细胞增殖检测试验

将分选出的侧群细胞和非侧群细胞接种96孔板，分别用50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml的异紫堇定碱处理上述两种细胞24h后，用BrdU细胞增殖检测试验检测细胞在异紫堇定碱处理后的增殖抑制情况。

结果显示：异紫堇定碱对侧群细胞的抑制率明显高于非侧群细胞，说明异紫堇定碱对侧群细胞有更强的生长抑制作用。相反，阿霉素对侧群细胞的抑制明显低于非侧群细胞(如图3C所示)。

可见，侧群细胞对常规抗肿瘤药阿霉素相对耐受，而对异紫堇定碱相对敏感。

2.2检测异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞的周期阻滞作用

用流式细胞术检测异紫堇定碱处理组和对照组分别对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞的周期阻滞作用。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞12h、24h、48h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞12h、24h、48h。

结果如图3D所示：异紫堇定碱处理后，发现异紫堇定碱对侧群细胞和非侧群细胞均有G2/M周期阻滞作用，并且在侧群细胞中，处于周期阻滞的细胞(约占细胞总数的49～56％)明显多于非侧群细胞(约占细胞总数的28～30％)。

可见，异紫堇定碱通过诱导更多侧群细胞G2/M期阻滞从而对侧群细胞表现出更强的生长抑制作用，进一步证实了BrdU细胞增殖检测试验的结果。

2.3异紫堇定碱诱导MHCC-97L侧群细胞凋亡

异紫堇定碱短时间处理通过将细胞阻滞在G2/M期抑制细胞生长，处理晚期(如48小时后)则诱导细胞发生凋亡，采用Annexin V/7-AAD双标记法在流式细胞仪上检测异紫堇定碱处理组和对照组的MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞发生凋亡的情况。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞48h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞48h。

结果如图4所示：

侧群细胞和非侧群细胞都有凋亡现象发生；与非侧群细胞的细胞凋亡数量相比，侧群细胞中凋亡细胞的总数量明显多于非侧群细胞；

异紫堇定碱处理48h后，早期和后期均有细胞凋亡现象，侧群细胞的后期凋亡细胞的数量明显高于早期凋亡细胞的数量，且与非侧群细胞的细胞凋亡数量相比，侧群细胞的后期凋亡细胞的数量明显高于非侧群细胞。

2.4参与异紫堇定碱诱导凋亡的凋亡相关分子

2.4.1用Western blot检测异紫堇定碱处理组和对照组的MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞中与凋亡相关分子的表达水平。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h。

结果如图5A所示：Caspase家族成员中的起始分子caspase-8，caspase-9和caspase-3均出现了剪切的活化形式，异紫堇定碱处理后，cleaved-caspase-8，cleaved-caspase-9和caspase-12表达量明显增加，说明三条主要的凋亡通路：死亡受体途径，线粒体途径和内质网途径可能都参与了异紫堇定碱诱导的凋亡。

2.4.2用Western blot检测异紫堇定碱处理组和对照组的MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞中细胞膜以及线粒体膜上与凋亡相关分子的表达水平。

对照组：用PBS处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h。

结果如图5B所示，死亡受体途径的Fas以及线粒体途径的Bcl2家族的促凋亡分子(见表4)和抑凋亡分子(见表4)都发生了相应的变化：MHCC-97L细胞经ICD处理后，细胞中的促凋亡因子表达量增加，而抑凋亡因子表达量减少，其中Fas，Bcl2，puma，Bak，Bax，Bad，Bim等变化尤为明显。

表4

促凋亡因子	抑凋亡因子
		Fas	Bcl2
Bax	Bcl-xL
		Bim	Mcl1
Bad
		Puma
Bak
		Bik

可见，与非侧群细胞相比，活化形式的caspase成员，如cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和cleaved caspase-3在侧群细胞中表达较少，促凋亡因子如Fas、Bax、Bim等在侧群细胞中表达水平较低，而抑凋亡分子如Bcl2在侧群细胞中表达水平则较高(如图5A和图5B所示)。

在经异紫堇定碱处理后，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9、cleavedcaspase-3、caspase-12表达水平提高，促凋亡因子的表达水平也显著提高，而抑凋亡因子的表达量下降。

实施例3异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞裸小鼠皮下成瘤的影响

从MHCC-97L细胞中分选出侧群细胞和非侧群细胞，分别接种在裸小鼠皮下，待肿瘤形成后，分为两组进行：

处理组：包括侧群细胞皮下成瘤处理组和非侧群细胞皮下成瘤处理组；

分别通过尾静脉注射的方式给予处理组每只小鼠异紫堇定碱溶液(0.4mg/200μlPBS)；每周5次，给药4周后，分别将两组裸小鼠无痛苦处死，取出肿瘤组织。

对照组：包括侧群细胞皮下成瘤对照组和非侧群细胞皮下成瘤对照组；

用PBS代替异紫堇定碱作为对照，4周后，分别将两组小鼠无痛苦处死，取出肿瘤组织。

3.1异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞皮下肿瘤体积和重量的影响

分别将处理组和对照组的肿瘤组织称重并统计。

测试结果：如图6A所示，表明对于侧群细胞形成的肿瘤，异紫堇定碱处理组的肿瘤显著小于对照组的肿瘤，而对于非侧群细胞形成的肿瘤，处理组和对照组没有明显的差异。如图6B所示，表明侧群细胞形成的肿瘤略大于非侧群细胞形成的肿瘤，但二者之间没有统计学意义。

可见，异紫堇定碱选择性地降低了MHCC-97L侧群细胞裸鼠皮下生成肿瘤的体积和重量，与体外实验(实施例2的2.1)观察到“异紫堇定碱对侧群细胞的抑制作用更为显著”现象一致。

3.2异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞裸鼠皮下成瘤的凋亡相关分子的影响

分别从处理组和对照组取出的肿瘤组织中提取组织总蛋白，用Western blot检测凋亡相关分子。

所述相关分子包括：caspase家族成员(如图7A所示)以及细胞膜和线粒体膜上相关的分子(如图7B所示)。

结果显示，caspase-9，caspase-8和caspase-12的活化情况与体外实验(实施例2的2.4)基本一致：与非侧群细胞相比，cleaved-caspase-9和caspase-8，以及caspase-12的表达较少，Fas表达较少，Bcl2表达较高。

在异紫堇定碱处理后的侧群细胞皮下肿瘤中，cleaved-caspase-9和caspase-8，以及caspase-12的表达量明显增加，Fas的表达水平明显提高，而Bcl2的表达水平明显下降。

结果说明异紫堇定碱在体内通过诱导侧群细胞凋亡从而选择性地降低了侧群细胞肿瘤的体积和重量。

3.3异紫堇定碱对裸鼠体重的影响

将处理组和对照组的裸鼠体重进行统计分析后发现异紫堇定碱没有对裸鼠的体重产生明显的影响，间接说明异紫堇定碱对小鼠的生长没有抑制作用(如图8所示)。

实施例4紫堇定碱对肝癌细胞系对阿霉素敏感性的影响

4.1异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的敏感性

用BrdU增殖实验检测异紫堇定碱处理组和对照组的MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的敏感性。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱和10μg/ml阿霉素分别预处理MHCC-97L和MHCC-LM324h；

对照组：用PBS预处理MHCC-97L和MHCC-LM324h；

结果如图9所示，与对照组(PBS)相比，异紫堇定预处理的细胞对阿霉素更加敏感。阿霉素对异紫堇定碱预处理的细胞的抑制率明显高于对照组；阿霉素预处理后剩下的细胞，则对阿霉素产生了耐药，阿霉素预处理的细胞对阿霉素的耐受能力明显高于对照组。

4.2异紫堇定碱影响肝细胞癌细胞系对阿霉素的摄入、外排和滞留的时间

检测异紫堇定碱处理组和对照组的肝细胞癌细胞系对阿霉素的摄入、外排和滞留的时间，检测方法参见方法2.9。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h；

对照组：用PBS处理MHCC-97L和MHCC-LM324h；

通过阿霉素外排和滞留实验观察异紫堇定碱处理后的细胞对阿霉素在细胞内分布的情况，细胞核呈现集中的红色荧光的细胞被认为是阳性的细胞。

用0h，4h和24h时间点的观察结果分别反映细胞对阿霉素的摄入、外排和滞留的情况。结果如图10所示：和对照组(PBS)相比，在三个时间点的观察结果显示，异紫堇定碱处理组的细胞阳性数明显多于PBS组。

可见，异紫堇定碱处理后的细胞对阿霉素的摄入增加，外排减少，阿霉素的滞留时间延长，与BrdU细胞增殖试验检测的结果一致，异紫堇定碱通过增加阿霉素的摄入，减少阿霉素的外排，延长阿霉素在细胞核内的滞留时间，增加了细胞系对与阿霉素的敏感性。

实施例5PDCD4在异紫堇定碱靶向肝细胞癌侧群细胞中的作用

5.1异紫堇定碱对肝细胞癌细胞系中PDCD4表达水平的影响

用western blot检测处理组和对照组的肝细胞癌细胞中PDCD4的表达水平。

处理组：用不同浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml)的异紫堇定碱分别处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

对照组：用PBS处理MHCC-97L和MHCC-LM324h。

结果如图11所示：在两个细胞系中，在异紫堇定碱处理后，PDCD4蛋白表达水平均显著上升，并且PDCD4表达水平随着浓度的增加而上升，呈现出异紫堇定碱浓度依赖性的趋势。

5.2异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3中侧群细胞和非侧群细胞PDCD4表达水平的影响

分别从MHCC-97L和MHCC-LM3中分选出侧群细胞和非侧群细胞，待用。

5.2.1体外实验

1.用Western blot检测从MHCC-97L分选出的侧群细胞和非侧群细胞中的PDCD4蛋白表达水平。

结果如图12A所示，MHCC-97L中，相比较非侧群细胞而言，侧群细胞中PDCD4的表达水平较低。

2.用Western blot检测异紫堇定碱处理组和对照组的侧群细胞和非侧群细胞的PDCD4的表达水平。

处理组：用150μg/ml异紫堇定碱处理从MHCC-97L和MHCC-LM3中分选出的侧群细胞和非侧群细胞24h。

对照组：用PBS处理从MHCC-97L和MHCC-LM3中分选出的侧群细胞和非侧群细胞24h。

结果如图12B所示：两种细胞系中，在异紫堇定碱处理后，侧群细胞和非侧群细胞的PDCD4的表达水平都显著上升；与非侧群细胞相比，在侧群细胞中的上调更明显。

5.2.2体内实验

异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸鼠皮下成瘤组织中PDCD4的表达水平的影响

将从MHCC-97L中分选出的侧群细胞和非侧群细胞接种在裸鼠皮下，肿瘤形成后，提取成瘤中蛋白，分为两组进行：

分别通过尾静脉注射的方式给予处理组每只小鼠异紫堇定碱(0.4mg/200μlPBS)；每周5次，给药4周后，分别将两组裸小鼠无痛苦处死，取出肿瘤组织。

分别通过尾静脉注射的方式给予对照组每只小鼠200μl PBS，每周5次，给药4周后，将小鼠无痛苦处死，取出肿瘤组织。

从处理组和对照组取出的肿瘤组织中提取组织总蛋白，用Western blot检测PDCD4的表达水平。

结果如图12C所示，异紫堇定碱均提高了侧群细胞和非侧群细胞裸鼠皮下成瘤组织中PDCD4的蛋白表达水平，且与非侧群细胞相比，异紫堇定碱对侧群细胞皮下成瘤组织的PDCD4的蛋白表达水平上调更明显。

由实施例5可知，体内和体外实验均证明，异紫堇定碱提高了侧群细胞中PDCD4的蛋白表达水平，从而有利于肿瘤细胞中侧群细胞的凋亡。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种非治疗性的逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药性的方法，其特征在于，包括步骤：在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐和抗肿瘤药物的存在下，体外培养肿瘤细胞，从而逆转所述细胞对所述抗肿瘤药物的耐药性，其中，所述肿瘤细胞为选自下组的肿瘤的肿瘤侧群细胞，并且所述肿瘤包括肝细胞癌，所述抗肿瘤药物选自下组：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、弥陀蒽醌、拓扑提抗、SN38、长春新碱、顺铂、丝裂霉素、氨甲喋呤和氟脲嘧啶脱氧核，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括：提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物为阿霉素。