CN112409183B - 山椒子烯酮及其衍生物、其制备方法和应用 - Google Patents

山椒子烯酮及其衍生物、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种山椒子烯酮及其衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述山椒子烯酮为(+)‑zeylenone构型，分子式如式(I)所示；所述衍生物具有式(II)结构。本发明还提供一种制备山椒子烯酮及其衍生物的制备方法。本发明还提供一种如前所述的山椒子烯酮及其衍生物或如前任意一项所述的山椒子烯酮及其衍生物的制备方法制备得到的山椒子烯酮及其衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自人脑胶质瘤、人鼻咽癌、人肝癌、人肺癌、人神经胶母细胞瘤、人前列腺癌和小鼠胰腺癌中的至少一种。本发明通过的山椒子烯酮及其衍生物灵敏度高且选择性好，能够用于抗肿瘤药物的制备。

Description

山椒子烯酮及其衍生物、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种山椒子烯酮及其衍生物、其制备方法和应用。
背景技术
山椒子烯酮是环己烯酮类化合物。从番茄科紫玉盘属植物山椒子(Uvariagrandiflora Roxb.)中提取得到的山椒子烯酮为(-)-zeylenone构型，CAS编号为193410-84-3，分子式为C21H18O7，结构式为
Figure BDA0002775207530000011
药理活性研究表明，(-)-zeylenone对多种肿瘤细胞具有较好的细胞毒活性，具备作为先导化合物开发成新药的潜力。但是目前山椒子烯酮的来源问题没有得到解决，不能满足体内实验对化合物的大量需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种山椒子烯酮及其衍生物、其制备方法和应用，以解决山椒子烯酮的来源没有得到解决，不能满足体内实验对化合物的大量需求的问题。
基于上述目的，本发明提供了一种山椒子烯酮及其衍生物，所述山椒子烯酮为天然产物(-)-zeylenone的对映异构体(+)-zeylenone，分子式如式(I)所示；所述衍生物具有式(II)结构；
Figure BDA0002775207530000021
本发明实施例还提供一种山椒子烯酮及其衍生物的制备方法，包括：
提供式(V)结构的化合物；
Figure BDA0002775207530000022
将式(V)结构的化合物依次进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护和苯甲酰化保护反应得到式(II)结构的化合物；
或
将式(II)结构的化合物在甲醇中稀盐酸脱保护反应得到式(I)结构的化合物。
在其中一个实施例中，所述式(II)结构的化合物的制备方法具体包括：
将式(V)结构的化合物与一水合对甲苯磺酸和2，2-二甲氧基丙烷进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护；
与苯甲酰氯在三乙胺和DMAP的催化下反应，得到式(II)结构的化合物。
在其中一个实施例中，所述式(V)结构的化合物的制备方法包括：
将第一反应物与不对称双羟化试剂进行不对称双羟化反应，得到第二反应物；将第二反应物与三光气和吡啶进行顺式二羟基的保护反应，得到第三反应物；将第三反应物依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物；
其中，所述第一反应物为式(XI)结构；所述第二反应物为式(XII)结构；所述三反应物为式(XIII)结构；
Figure BDA0002775207530000023
在其中一个实施例中，所述得到第二反应物具体包括：将第一反应物与氢化奎宁1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚在四氢呋喃和水混合溶剂中进行不对称双羟化反应，得到第二反应物。
在其中一个实施例中，所述第三反应物依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物具体包括：
将第三反应物溶于二氯甲烷中，加入等体积四氢呋喃和水混合溶液，室温下进行碳酸酯环的消除反应；
1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯催化在苯回流，得到式(V)结构的化合物。
本发明实施例还提供一种如前所述的山椒子烯酮及其衍生物或如前任意一项所述的山椒子烯酮及其衍生物的制备方法制备得到的山椒子烯酮及其衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自人脑胶质瘤、人鼻咽癌、人肝癌、人肺癌、人神经胶母细胞瘤、人前列腺癌和小鼠胰腺癌中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述肿瘤为人脑胶质瘤。
在其中一个实施例中，所述人脑胶质瘤为人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG或人脑胶质瘤细胞HS 683。
本发明实施例还提供一种用于治疗肿瘤的药物，包括如前所述的山椒子烯酮及其衍生物或如前任一项所述的制备方法制备得到的山椒子烯酮及其衍生物，和医学上可以接受的辅料，所述抗肿瘤的药物选自抗人脑胶质瘤的药物、抗人鼻咽癌的药物、抗人肝癌的药物、抗人肺癌的药物、抗人神经胶母细胞瘤的药物、抗人前列腺癌的药物和抗小鼠胰腺癌的药物中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
在其中一个实施例中，所述用于治疗肿瘤的药物为用于治疗人脑胶质瘤的药物。
在其中一个实施例中，所述用于治疗人脑胶质瘤的药物为用于治疗人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG的药物或用于治疗人脑胶质瘤细胞HS 683。
从上面所述可以看出，本发明提供的山椒子烯酮及其衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用中，(+)-zeylenone构型的制备方法，能够高效的制备山椒子烯酮为(+)-zeylenone构型，在制备该右旋构型时还能高效制备其衍生物，所得(+)-zeylenone构型及其衍生物灵敏度高且选择性好，能够用于治疗肿瘤药物的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例制备所得山椒子烯酮为(+)-zeylenone构型的CD谱示意图；
图2为本发明实施例制备所得山椒子烯酮为(-)-zeylenone构型的CD谱示意图；
图3为式(II)结构的化合物抑制U-87MG细胞增殖的作用的时间和剂量依赖关系；
图4为式(II)结构的化合物抑制HS 683细胞增殖的作用的时间和剂量依赖关系；
图5为式(II)结构的化合物给药24h后U-87MG细胞形态的变化；
图6为式(II)结构的化合物给药24h后HS 683细胞形态的变化；
图7为式(II)结构的化合物对U-87MG细胞集落形成能力的影响的形态图；
图8为式(II)结构的化合物对HS 683细胞集落形成能力的影响的形态图；
图9为式(II)结构的化合物对U-87MG细胞集落形成能力的影响的数据图；
图10为式(II)结构的化合物对HS 683细胞集落形成能力的影响的数据图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明提供一种山椒子烯酮及其衍生物。其中，所述山椒子烯酮为(+)-zeylenone构型，分子式如式(I)所示。所述衍生物具有式(II)结构。
Figure BDA0002775207530000051
本发明还提供一种如前所述的山椒子烯酮及其衍生物的制备方法，包括：
提供式(V)结构的化合物；
Figure BDA0002775207530000052
将式(V)结构的化合物依次进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护、苯甲酰化保护反应以及稀盐酸脱保护反应得到式(I)结构的化合物；
或
将式(V)结构的化合物依次进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护和苯甲酰化保护反应得到式(II)结构的化合物。
本发明提供的式(V)结构的化合物的制备方法具体可以为：
将第一反应物与不对称双羟化试剂进行不对称双羟化反应，得到第二反应物；将第二反应物与三光气进行顺式二羟基的保护反应，得到第三反应物；将第三反应物依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物。
其中，所述第一反应物为式(XI)结构；所述第二反应物为式(XII)结构；所述三反应物为式(XIII)结构；
Figure BDA0002775207530000053
其中，第一反应物的制备包括：对奎宁酸进行缩醛和环氧化反应，得到醛酮类化合物；
将醛酮类化合物、多聚甲醛和4-二甲氨基吡啶，在咪唑基催化下反应；
将催化所得反应物与苯甲酰氯进行酰化反应，得到所述第一反应物。
第一反应物(化合物QA2-6)的制备具体包括：从商品化奎宁酸出发，经过缩醛和环氧化，得到醛酮类化合物QA2-4；将化合物QA2-4使用多聚甲醛，1M的碳酸氢钠和THF(四氢呋喃)作为溶液，DMAP(4-二甲氨基吡啶)作为碱，imidazole(咪唑基)作为碱催化剂进行Baylis-Hillmann(贝里斯－希尔曼反应)反应，收率可达85％，得到化合物QA2-5，反应化学方程式如式a所示；将化合物用苯甲酰氯进行酰化，得到化合物QA2-6，反应化学方程式如式b所示。
Figure BDA0002775207530000061
其中，得到第二反应物(化合物QA2-7)的步骤具体包括：
通过Sharpless不对称的双羟化反应(asymmetric dihydroxylation,AD)，将不对称的双羟基引入第一反应物(化合物QA2-6)，一步即可产生2个手性中心，得到具有绝对构型的第二反应物(化合物QA2-7)。
不对称双羟化试剂优选为AD-mix-α，其主要成分为(DHQ)2-PHAL(氢化奎宁1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚)。其中，(DHQ)2PHAL的CAS号为140924-50-1，分子式为C48H54N6O4，结构式为式
Figure BDA0002775207530000071
反应条件为将化合物QA2-6和AD-mix-α在四氢呋喃，水混合溶剂中常温反应，进行不对称双羟化。使用该试剂能够高收率的得到第二反应物(化合物QA2-7)，反应化学方程式如式c所示。
Figure BDA0002775207530000072
对于不对称双羟化试剂的筛选请参见表1.1。
表1.1手性配体参与的QA2-6的不对称双羟化条件及产物
Figure BDA0002775207530000073
其中，得到第三反应物(化合物QA2-8)的具体步骤包括：将第二反应物(化合物QA2-7)的顺式二羟基用对酸稳定的碳酸酯环保护，用三光气，在吡啶做缚酸剂，氮气保护下得到第三反应物(化合物QA2-8)，反应化学方程式如式d所示。
Figure BDA0002775207530000074
将第三反应物(化合物QA2-8)依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物(化合物QA2-12)具体包括：
将QA2-8溶于DCM(二氯甲烷)中(0.5mmol/ml)，加入等体积的TFA:H2O(6:1)混合溶液(也即四氢呋喃和水混合溶液)，室温下进行碳酸酯环的消除反应，得到化合物QA2-11。
使用DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)催化在苯回流，使QA2-11转化为QA2-12，从而制备得到式(V)结构的化合物。且式(V)结构的化合物收率较高，可达到65％，反应化学方程式如式e所示。
Figure BDA0002775207530000081
本发明提供的式(II)结构的化合物的制备方法具体为：
将式(V)结构的化合物(化合物QA2-12)与一水合对甲苯磺酸和2，2-二甲氧基丙烷进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护，得到式(IX-7)所示结构的化合物(化合物QA2-13)；与苯甲酰氯在三乙胺和DMAP的催化下反应，得到式(II)所示结构的化合物(化合物QA2-14)，反应化学方程式如式h所示。
Figure BDA0002775207530000082
本发明提供的式(I)结构的化合物的制备方法具体为：
将式(V)结构的化合物(化合物QA2-12)与一水合对甲苯磺酸和2，2-二甲氧基丙烷进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护，得到式(IX-7)所示结构的化合物(化合物QA2-13)；与苯甲酰氯在在三乙胺和DMAP的催化下反应，得到式(II)所示结构的化合物(化合物QA2-14)；在甲醇中稀盐酸脱保护得到式(I)结构的化合物，反应化学方程式如式f所示。也即，将式(II)结构的化合物在甲醇中稀盐酸脱保护反应得到式(I)结构的化合物。
Figure BDA0002775207530000091
更为具体的，从化合物奎宁酸出发，经过制备化合物制备得到式(I)结构的化合物QA2-4；化合物QA2-4进行Baylis-Hillmann(贝里斯-希尔曼)反应，及苯甲酰化得到化合物QA2-6；利用化合物QA2-6的3位的手性中心及sharpless(夏普莱斯)不对称双羟化反应，实现中间体构型与(+)-zeylennone终产物的一致，解决了关键的手性问题，得到化合物QA2-7；QA2-7的顺式二羟基进行碳酸酯环保护得到QA2-8；QA2-8三氟乙酸水解得到化合物QA2-11和QA2-12；其中QA2-11通过DBU，苯的消除得到QA2-12；QA2-12经过丙酮缩醛保护，苯甲酰化，稀盐酸水解，最终得到目标化合物(+)-zeylennone，合成路线如式g所示。
Figure BDA0002775207530000092
对式(I)结构(+)-zeylennone构型的山椒子烯酮，进行一系列测定，得到其核磁，质谱和红外数据，并与天然产物的山椒子烯酮(-)-zeylenone对照品进行比较，核磁，质谱和红外数据均一致。
分别对式(I)结构的山椒子烯酮((+)-zeylennone构型)和天然产物的山椒子烯酮((-)-zeylenone构型)进行旋光数据和CD值的测定，得到(+)-zeylennone构型旋光值为[α]21D＝+26.1(c＝0.2,MeOH)，与天然产物标准品(-)-zeylenone构型的旋光值[α]20D＝-26.1(c＝0.28,MeOH)相反。请参阅图1和图2，(+)-zeylennone构型的CD谱图在225nm处有正的cotton效应(卡滕效应)，与(-)-zeylenone构型相反。
通过该方法制备得到的(+)-zeylenone的总收率为8.8％。通过一步双羟化制备得到3位碳手性的中间体化合物QA2-7，实现对三个手性碳立体构型的控制。
本发明实施例还提供一种如前所述的山椒子烯酮及其衍生物或如前所述的山椒子烯酮及其衍生物的制备方法制备得到的山椒子烯酮及其衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自人脑胶质瘤、人鼻咽癌、人肝癌、人肺癌、人神经胶母细胞瘤、人前列腺癌和小鼠胰腺癌中的至少一种。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤为人脑胶质瘤。
在本发明的一个实施例中，所述人脑胶质瘤为人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG或人脑胶质瘤细胞HS 683。
本发明实施例还提供一种抗肿瘤的药物，包括前所述的山椒子烯酮及其衍生物或如前所述的制备方法制备得到的山椒子烯酮及其衍生物，和医学上可以接受的辅料，所述抗肿瘤的药物选自抗人脑胶质瘤的药物、抗人鼻咽癌的药物、抗人肝癌的药物、抗人肺癌的药物、抗人神经胶母细胞瘤的药物、抗人前列腺癌的药物和抗小鼠胰腺癌的药物中的至少一种。
在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的口服给药剂型或外用给药剂型。
在本发明的一个实施例中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
在本发明的一个实施例中，所述抗肿瘤的药物为抗人脑胶质瘤的药物。
在本发明的一个实施例中，所述抗肿瘤的药物为抗人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG的药物或抗人脑胶质瘤细胞HS 683的药物。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种山椒子烯酮及其衍生物、制备方法和应用进行详细描述。
实施例1化合物QA2-1的合成
将奎宁酸(5.5g,23.6mmol)，溶于100mL无水甲醇中，搅拌下加入2，3-丁二酮(4.53mL,86mmol)，原甲酸三甲酯(12.89mL,118mmol)，(±)樟脑磺酸(4.53mL,86mmol)，70℃下回流反应10h。加三乙胺5mL，淬灭反应，浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷-甲醇,30:1-20:1)得化合物QA2-1(6.69g)，白色粉末，收率为90％。
1HNMR(600MHz,MeOD)δ4.31(ddd,J＝12.0,10.2,4.5Hz,1H),4.12-4.10(m,1H),3.77(s,3H),3.55(dd,J＝10.2,2.9Hz,1H),3.28(s,3H),3.28(s,3H),2.08-2.04(m,3H),1.87(t,J＝12.5Hz,1H),1.34(s,3H),1.29(s,3H).13CNMR(150MHz,MeOD)δ173.97(s),99.58(s),99.17(s),75.34(s),72.62(s),68.15(s),62.11(s),51.23(s),46.38(s),37.78(s),36.98(s),16.35(s),16.25(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C13H21O7[M+H]+:289.1287,found289.1297.
实施例2化合物QA2-2和QA2-3的合成
将化合物QA2-1(6.69g,21.2mmol)，溶于100mL无水甲醇中，搅拌下分批次加入硼氢化钠(1.9g,50mmol)，0℃下剧烈搅拌反应2h。TLC检测反应结束，加5mL水淬灭，加入稀盐酸5mL静置，浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷-甲醇,10:1)得化合物QA2-2粗品(5.4g)，白色粉末，收率为87％，无需纯化，直接用于下步。
在装有QA2-2粗品(5.4g,18.44mmol)的反应瓶中，加入磷酸盐缓冲液(0.2M,ph＝7),冰浴下，分批次加入高碘酸钠。室温下反应，TLC检测反应结束，加100mL×3二氯甲烷萃取，浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯,2:1)得化合物QA2-3(3.8g)，白色粉末，收率为80％。
1HNMR(600MHz,CDCl3)δ4.27(dd,J＝12.7,10.2Hz,1H),3.88(d,J＝8.1Hz,1H),3.30(s,3H),3.23(s,3H),2.65(dd,J＝14.2,2.1Hz,1H),2.51-2.47(m,2H),1.34(s,3H),1.30(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ205.74(s),100.42(s),99.41(s),72.40(s),67.83(s),63.42(s),48.32(s),48.19(s),46.36(s),44.88(s),17.89(s),17.76(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C12H20NaO6[M+Na]+:283.1158,found 283.1173
实施例3化合物QA2-4的合成
将化合物QA2-3(3.8g,14.5mmol)溶于二氯甲烷中，加入三乙胺(5.5ml，42mmol)，冰浴下，再将甲基磺酰氯(1.6ml，21.75mmol)的10ml DCM溶液，用滴定漏斗缓慢加入反应液中。室温下反应，TLC检测反应结束。饱和碳酸氢钠溶液淬灭，DCM萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚-乙酸乙酯,体积比3:1)得化合物QA2-4(2.98g)，白色粉末，收率为85％。
1HNMR(600MHz,CDCl3)δ6.87(dd,J＝10.1,1.7Hz,1H),6.00(ddd,J＝10.1,2.6,1.0Hz,1H),4.51(ddd,J＝9.1,2.6,1.8Hz,1H),4.05(ddd,J＝13.7,9.1,4.8Hz,1H),3.33(s,3H),3.27(s,3H),2.75(ddd,J＝16.4,4.8,1.0Hz,1H),2.49(dd,J＝16.4,13.5Hz,1H),1.37(s,3H),1.34(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ196.90(s),148.59(s),130.10(s),100.79(s),99.71(s),69.23(s),68.08(s),48.24(s),48.16(s),42.02(s),17.73(s),17.68(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C12H18NaO5[M+Na]+:265.1052,found 265.1053.
实施例4化合物QA2-5的合成
将化合物QA2-4(3.26g,12mmol)溶于50ml THF中，加入50ml碳酸氢钠溶液(1M),咪唑(0.9g，13.2mmol)，多聚甲醛(720mg,24mmol)。室温下反应2h，加50mL×3乙酸乙酯萃取，浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯,1:1)得化合物QA2-5(2.78g)，白色粉末，收率为85％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ6.83(d,J＝1.4Hz,1H),4.50(d,J＝6.0,3.6Hz,1H),4.33(d,J＝11.2Hz,1H),4.21(d,J＝12.0Hz,1H),4.01(ddd,J＝13.8,9.0,4.8,Hz,1H),3.30(s,3H),3.24(s,3H),2.74(ddd,J＝16.4,4.8,2.0Hz,1H),2.51(dd,,J＝16.4,13.8Hz,1H),2.40(bs,1H,OH),1.34(s,3H),1.31(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ197.39(s),144.50(s),139.28(s),100.94(s),99.90(s),69.25(s),68.18(s),60.83(s),48.38(s),48.30(s),42.30(s),17.87(s),17.82(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C13H20NaO6[M+Na]+:295.1158,found 295.1175
实施例5化合物QA2-6的合成
将化合物QA2-5(3.32g,12mmol)溶于50ml DCM中，依次加入三乙胺(1.3ml,24mmol),DMAP(150mg,1.2mmol)，苯甲酰氯(2.1ml,18mmol)。室温下反应1h，饱和碳酸氢钠溶液淬灭，DCM(50mL×3)萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯,体积比4:1)得化合物QA2-6(4.5g)，白色粉末，收率为98％。.1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.09(d,J＝6.3Hz,2H),7.61(s,1H),7.49(d,J＝6.3Hz,2H),6.93(s,1H),5.05(dd,J＝48.6,13.3Hz,2H),4.58(d,J＝5.6Hz,1H),4.09(s,1H),3.34(s,3H),3.32(s,3H),2.85(dd,J＝15.7,4.2Hz,1H),2.59(t,J＝14.5Hz,1H),1.39(s,3H),1.36(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ195.17(s),165.99(s),144.80(s),135.45(s),133.28(s),129.79(s),128.48(s),100.85(s),99.75(s),69.20(s),67.92(s),60.77(s),48.35(s),48.21(s),42.09(s),17.75(s),17.69(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C20H24NaO7[M+Na]+:399.1420,found 399.1440.
实施例6化合物QA2-7的合成
将化合物QA2-6(3.76g,10mmol)溶于50ml THF中，加入50ml水，搅拌下，加入AD-mix-a(1g,equiv：0.1g/mmol)，室温下反应7h，加入饱和硫代硫酸钠溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯,体积比1:1)得化合物QA2-7(2.66g)，白色粉末，收率为65％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.99–7.97(m,2H),7.62(m,1H),7.47(m,2H),5.00–4.99(m,1H),4.05–4.00(m,1H),3.94–3.90(m,1H),3.85(d,J＝10.4Hz,1H),3.51–3.48(m,1H),3.35(s,3H),3.32(s,3H),2.96(dd,J＝18.7,5.9Hz,1H),2.74(dd,J＝18.6,11.9Hz,1H),1.41(s,3H),1.35(s,3H)；13CNMR(150MHz,CDCl3)δ196.13(s),164.92(s),133.35(s),129.78(s),129.42(s),128.48(s),99.61(s),99.43(s),82.02(s),79.40(s),71.97(s),60.54(s),48.49(s),48.43(s),41.44(s),17.52(s),17.45(s)；HRMS(ESI):m/z calcd.C20H26NaO9[M+Na]+:433.1475,found 433.1499
实施例7化合物QA2-8的合成
将化合物QA2-7(2g,5mmol)溶于20ml DCM中，0℃，N2保护下，加入三光气(2.2g,7.5mmol)的20ml DCM溶液，三乙胺(1.5mL,10mmol)，rt下反应0.5h。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，(30mL×3)萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯,体积比3:1)得化合物QA2-8(2.0g)，白色粉末，收率为93％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.01-8.00(m,2H),7.65(m,1H),7.49(m,2H),4.91(d,J＝8.4Hz,1H),4.67(d,J＝12.3Hz,1H),4.60(d,J＝12.2Hz,1H),4.08(td,J＝11.2,6.6Hz,1H),3.94(dd,J＝11.1,8.5Hz,1H),3.34(s,3H),3.28(s,3H),3.02(dd,J＝18.6,6.5Hz,1H),2.78(dd,J＝18.6,11.3Hz,1H),1.38(s,3H),1.34(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ196.85(s),168.61(s),167.51(s),134.11(s),129.88(s),128.78(s),128.17(s),99.57(s),99.44(s),83.02(s),78.33(s),72.09(s),64.47(s),60.48(s),48.47(s),41.25(s),17.50(s),17.43(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C21H24NaO10[M+Na]+:459.1267,found459.1292.
实施例8化合物QA2-11和化合物QA2-12的合成
将化合物QA2-8(2g,5mmol)溶于20ml DCM中，加入3ml的TFA:H2O(6：1)混合液，rt下反应1h。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，(30mL×3)乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化，分别用(DCM:甲醇,体积比20:1)得化合物QA2-11(858mg)，透明结晶，收率为58％，(DCM:甲醇,体积比10:1)得QA2-12(450mg)，白色粉末，收率为24％。
化合物QA2-11(800mg,2.7mmol)装入的封管中加入溶于10ml苯中，加入DBU(228μL,1.5mmol),100℃下密封反应12h，反应液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(DCM:甲醇,体积比10:1)得化合物QA2-12(480mg)，白色粉末，收率分别为65％。
QA2-11:1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝7.6Hz,2H),7.54(s,1H),7.40(t,J＝7.6Hz,2H),4.93(s,1H),4.70(d,J＝12.3Hz,1H),4.64(d,J＝12.6Hz,1H),4.46(s,1H),4.25(s,1H),3.98(s,1H),3.13–3.10(m,1H),2.77–2.74(m,1H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ200.24(s),165.92(s),133.96(s),129.82(s),128.73(s),128.39(s),82.27(s),82.02(s),68.64(s),67.92(s),64.38(s),41.51(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C14H16NaO7[M+Na]+:319.0794,found 319.0803
QA2-12:1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝7.6Hz,2H),7.57(d,J＝7.3Hz,1H),7.43(t,J＝7.6Hz,2H),6.92(dd,J＝10.2,2.5Hz,1H),6.17(d,J＝10.2Hz,1H),4.79(d,J＝11.3Hz,1H),4.70(s,1H),4.59(d,J＝11.3Hz,1H),3.97(d,J＝4.7Hz,1H),3.63(s,1H),3.48–3.42(m,1H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ195.33(s),166.94(s),147.88(s),133.68(s),129.91(s),129.01(s),128.56(s),126.96(s),74.08(s),68.00(s),64.12(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C14H14NaO6[M+Na]+:301.0688,found 301.0703
实施例9化合物QA2-13的合成
将化合物QA2-12(900mg,3.2mmol)溶于10ml丙酮中，加入一水合对甲苯磺酸(55mg,0.3mmol)，2，2-二甲氧基丙烷(620μL)，室温下反应2h。反应液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化，分别用(石油醚:乙酸乙酯,体积比3:1)得化合物QA2-13(890mg)，白色固体，收率为88％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝7.7Hz,2H),7.61(t,J＝7.3Hz,1H),7.47(t,J＝7.5Hz,2H),7.00(dd,J＝10.0,4.6Hz,1H),6.26(d,J＝10.2Hz,1H),4.71(d,J＝11.6Hz,2H),4.58(d,J＝11.5Hz,1H),4.54(s,1H),2.68(s,1H),1.47(s,3H),1.39(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ195.95(s),166.11(s),145.71(s),133.69(s),129.73(s),128.69(s),128.63(s),109.61(s),80.36(s),79.87(s),64.67(s),64.54(s),27.42(s),26.34(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C17H18NaO6[M+Na]+:341.1001,found 341.1015.
实施例10化合物QA2-14的合成
将化合物QA2-13(850mg,2.7mmol)溶于5ml DCM中，三乙胺(0.6ml,4mmol),DMAP(25mg,0.2mmol)，苯甲酰氯(360μL,3mmol)。室温下反应1h，，饱和碳酸氢钠，淬灭(10mL×3)DCM萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯,体积比4:1)分别得化合物QA2-14(1.0g)，白色粉末，收率分别为95％。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝7.9Hz,2H),7.88(d,J＝7.9Hz,2H),7.53(ddd,J＝10.5,9.9,4.0Hz,2H),7.39(dd,J＝11.0,4.3Hz,2H),7.31(d,J＝7.5Hz,2H),7.09(ddd,J＝10.0,4.8,1.7Hz,1H),6.41(d,J＝10.2Hz,1H),6.00(d,J＝4.8Hz,1H),4.72(m,2H),4.62(d,J＝12.0Hz,1H),1.51(s,3H),1.44(s,3H).13CNMR(150MHz,CDCl3)δ195.61(s),165.67(s),165.25(s),141.49(s),133.68(s),133.41(s),130.68(s),129.77(s),129.72(s),129.14(s),128.50(s),128.48(s),110.07(s),80.02(s),77.70(s),65.99(s),63.91(s),27.41(s),26.42(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C24H22NaO7[M+Na]+:445.1263,found 445.1291
实施例11+(-)zeylenone的合成
将化合物QA2-14(1.0g,2.3mmol)溶于5ml甲醇中，加入2毫升1N稀盐酸。室温下反应1h，，饱和碳酸氢钠，反应液浓缩得粗产物。通过硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯,体积比2:1)得化合物+(-)zeylenone(792mg)，白色粉末，收率分别为90％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.03–8.01(m,2H),7.94–7.93(m,2H),7.56(dt,J＝10.2,7.5Hz,2H),7.42(dt,J＝16.0,7.9Hz,4H),6.97(ddd,J＝10.2,4.1,1.2Hz,1H),6.35(d,J＝10.2Hz,1H),5.96(t,J＝3.7Hz,1H),4.85(d,J＝11.5Hz,1H),4.60(d,J＝11.5Hz,1H),4.38(s,1H),4.09(s,1H,OH),3.20(d,J＝2.4Hz,OH).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ196.42(s),166.37(s),165.48(s),142.85(s),133.98(s),133.63(s),129.97(s),129.90(s),128.84(s),128.73(s),128.63(s),71.80(s),69.31(s),65.61(s).HRMS(ESI):m/z calcd.C21H18NaO7[M+Na]+:405.0950,found405.0972。
实验例1
试验目的：检验山椒子烯酮及其衍生物的抗癌瘤谱。
实验材料：1)式(II)结构的山椒子烯酮的衍生物(即化合物QA2-14)的含药培养液、式(I)结构的山椒子烯酮(即(+)-Zeylenone)的含药培养液、阳性药物顺铂和TMZ(替莫唑胺胶囊)；2)对数期的人脑胶质瘤、人鼻咽癌、人肝癌、人肺癌、人神经胶母细胞瘤、人前列腺癌和小鼠胰腺癌细胞。
实验方法：采用CCK-8法检测细胞活性，在多组织来源的人脑胶质瘤、鼻咽癌、肝癌、肺癌、神经胶母细胞瘤、人前列腺癌和小鼠胰腺癌细胞培养板中加入含药培养液，使式(II)结构的山椒子烯酮的衍生物(即化合物QA2-14)的终浓度分别为0、0.235、0.47、0.94、1.88、3.77、7.54μmol·L-1，使式(I)结构的山椒子烯酮(即(+)-Zeylenone)的终浓度为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μmol·L-1，每组设4个复孔，作用24h，采用CCK-8法检测各细胞的存活率，统计IC50值。
实验例2
实验目的：检测化合物QA2-14抑制人脑胶质瘤细胞生长的时效和量效关系
实验方法：在U-87MG(人脑星形胶质母细胞瘤细胞)和HS 683(人脑胶质瘤细胞)细胞培养板中加入含药培养液，使QA2-14的终浓度分别为0、0.188、0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0μmol·L-1。设4个时间点，分别作用12h、24h、48h、72h。
给药结束后，弃去旧的培养液，每孔加入含10％CCK-8溶液的无血清培养基，根据不同细胞的显色情况，继续孵育1～2h，充分反应后取出，震荡30s，测定A450nm，计算各组细胞存活率及IC50值。
实验例3
实验目的：检测化合物QA2-14对U-87MG和HS 683细胞集落形成的影响
实验方法：
1)细胞克隆形成及给药
将处于对数生长期的U-87MG和HS 683细胞消化、计数、稀释，以400个/孔接种于6孔板中，适应性培养1～2d后，可观察到细胞贴壁良好，弃去原培养液，分别加入含化合物QA2-14的完全培养液，使化合物QA2-14的终浓度分别为0、0.188、0.375、0.75μmol·L-1。药物作用10～14天，每两天镜下观察一次，查看克隆形成情况。
2)染色计数
预热37℃孵箱；
配制固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)；
配制0.1％结晶紫染色液：1％结晶紫染色液10mL+蒸馏水90mL+冰醋酸0.25mL，混匀备用；
取出细胞培养板，弃去培养液，加入固定液2mL/孔，固定15min，弃固定液，倒扣孔板，静置晾干；
加入0.1％结晶紫染色液，1mL/孔，37℃孵育15min，弃去染料，自来水温和冲洗去除多余染料，倒扣孔板晾干水分；
计数：选择光强度合适的地点，水平且稳定的平台，铺白纸，将六孔板倒扣在白纸上，保持镜头与所有样品板底相同的距离，用相机拍照。拍照后的图像用Image J软件进行分析，计数直径为0.3～1.0mm的集落。
克隆形成率/％＝给药组克隆形成数/对照组克隆形成数×100％。
实验例4
实验目的：化合物QA2-14对U-87MG和HS 683细胞形态学变化的影响
实验方法：取对数生长期的U-87MG和HS 683细胞，消化、计数，以8×104·mL-1接种于24孔板中，每孔0.5mL，适应性培养24h后，加入0.5mL的含药培养液，使化合物QA2-14的终浓度为0、0.75、1.5、3.0μmol·L-1，继续作用24h后，显微镜下观察细胞数量、形态变化和死亡情况，并拍照。
以下为本发明的山椒子烯酮及其衍生物的实验测试结果。
1)式(II)结构的山椒子烯酮的衍生物(即化合物QA2-14)、式(I)结构的山椒子烯酮(即(+)-Zeylenone)的抗癌瘤谱。
化合物QA2-14对多组织来源的肿瘤细胞存活率的影响，IC50结果见表1。由表1可知，化合物QA2-14对人脑胶质瘤、鼻咽癌、肝癌、肺癌、神经胶母细胞瘤和小鼠胰腺癌细胞都有着良好的抑制作用。对人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG和人脑胶质瘤细胞HS 683的IC50值最小，且作用时间延长至48h后，IC50值明显低于其他细胞。
表1化合物QA2-14对不同组织来源的肿瘤细胞的抑制作用
Figure BDA0002775207530000181
2)式(II)结构的山椒子烯酮的衍生物(即化合物QA2-14)与式(I)结构的山椒子烯酮(即(+)-Zeylenone)、阳性药顺铂和TMZ对CNE、U-87 MG、A549和DU 145的抗癌作用对比。
TMZ为脑胶质瘤临床治疗一线用药，顺铂为人鼻咽癌临床口服一线用药。TMZ、顺铂、化合物QA2-14以及(+)-Zeylenone的抗肿瘤活性对比结果见表2。
由表2可知，化合物QA2-14对U-87MG(人脑星形胶质母细胞瘤细胞)、A549(人肺癌细胞)和DU 145(人前列腺癌细胞)的IC50值与(+)-Zeylenone相比明显降低，表明其抗肿瘤活性的提升。同时，其抗肿瘤作用与顺铂和TMZ相比也具有明显的优势。
表2化合物QA2-14与(+)-Zeylenone、阳性药抗肿瘤作用对比(24h)
Figure BDA0002775207530000191
3)化合物QA2-14抑制U-87MG和HS 683增殖的时效和量效。
不同浓度的化合物QA2-14作用于U-87MG和HS 683细胞12h、24h、48h、72h后细胞存活率的变化结果见图3和图4。其中，
Figure BDA0002775207530000192
n＝4，与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
由图3和图4可知，化合物QA2-14能够呈剂量、时间依赖性抑制U-87MG和HS 683细胞的增殖。图3表明，U-87MG细胞在化合物QA2-14浓度大于等于0.75μmol·L-1，作用时间延长至48h～72h后，细胞存活率呈断崖式下降。而对于HS 683细胞，在QA2-14给药24h就表现出较好的抑制作用。
因此，化合物QA2-14对两种人脑胶质瘤细胞的抑制作用均有很好剂量依赖性。而对于时间依赖性，在中等浓度时，U-87MG细胞表现出更为明显的时间依赖性；高浓度时，两种细胞区别不大。
4)化合物QA2-14对人脑胶质瘤细胞U-87MG和HS 683形态学变化的影响
化合物QA2-14给药24h后，人脑胶质瘤细胞U-87MG和HS 683的细胞形态变化结果分别见图5和图6。如图5所示，化合物QA2-14给药后，随着给药剂量和时间的延长，可明显观察到U-87MG和HS 683细胞形态和生长状态的改变。见图5，正常的U-87MG细胞呈多角形、星形，触角很长，随着QA2-14给药浓度的增加，细胞触角逐渐收缩，贴壁性下降，当浓度达到6.0μmol·L-1时，细胞聚集成团，死亡明显。如图6，正常HS 683细胞呈长梭形，细胞生长密集，临近细胞边缘紧贴，随着QA2-14给药浓度的增加，细胞数量明显减少，逐渐变圆，皱缩，贴壁性下降，在6.0μmol·L-1的剂量下，镜下可见大量细胞漂浮，残存贴壁细胞很少，各给药组细胞呈剂量依赖性死亡。
因此，浓度为6.0μmol·L-1化合物QA2-14在作用24h后，即可使人脑胶质瘤细胞U-87MG和HS 683发生明显的形态变化，聚集成团，死亡。
5)给药14天后，化合物QA2-14抑制人脑胶质瘤细胞U-87MG和HS683集落形成的效果
给药14天后，化合物QA2-14抑制人脑胶质瘤细胞U-87MG集落形成的效果，请参见图7和图9。化合物QA2-14抑制人脑胶质瘤细胞HS 683集落形成的效果，请参见图8和图10。其中，在图9和图10中
Figure BDA0002775207530000201
n＝3，与对照组相比，**P<0.01。
由图7至图10可以看出，正常组的U-87MG和HS 683细胞(即对照组细胞)在给药14天后形成明显的集落，数量很多，随着给药浓度的增加，集落形成数量明显减少，集落形成率显著降低(P<0.01)，当给药浓度增加到0.75μmol·L-1时，形成的集落数目只有个位数，集落形成率趋近于0。
可见，化合物QA2-14可呈剂量依赖性地抑制两种人脑胶质瘤细胞U-87 MG和HS683的集落形成。
测试结果表明，具有结构式(II)的化合物山椒子烯酮的衍生物，也即化合物QA2-14具有优良的削弱人脑胶质瘤细胞体外增殖能力和独立生存能力，从而控制肿瘤的发展过程。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种山椒子烯酮衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤选自人脑胶质瘤、人鼻咽癌、人肝癌、人神经胶母细胞瘤和人前列腺癌的至少一种；
其中，所述衍生物具有式(II)结构；
Figure FDA0003885334180000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，山椒子烯酮衍生物的制备方法包括：
提供式(V)结构的化合物；
Figure FDA0003885334180000012
将式(V)结构的化合物依次进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护和苯甲酰化保护反应得到式(II)结构的化合物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述式(II)结构的化合物的制备方法具体包括：
将式(V)结构的化合物与一水合对甲苯磺酸和2，2-二甲氧基丙烷进行顺式二羟基的丙酮缩醛保护；
与苯甲酰氯在三乙胺和DMAP的催化下反应，得到式(II)结构的化合物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述式(V)结构的化合物的制备方法包括：
将第一反应物与不对称双羟化试剂进行不对称双羟化反应，得到第二反应物；将第二反应物与三光气和吡啶进行顺式二羟基的保护反应，得到第三反应物；将第三反应物依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物；
其中，所述第一反应物为式(XI)结构；所述第二反应物为式(XII)结构；所述三反应物为式(XIII)结构；
Figure FDA0003885334180000021
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述得到第二反应物具体包括：将第一反应物与氢化奎宁1,4-(2,3-二氮杂萘)二醚在四氢呋喃和水混合溶剂中进行不对称双羟化反应，得到第二反应物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第三反应物依次进行消除反应及苯回流反应，得到式(V)结构的化合物具体包括：
将第三反应物溶于二氯甲烷中，加入等体积四氢呋喃和水混合溶液，室温下进行碳酸酯环的消除反应；
1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯催化在苯回流，得到式(V)结构的化合物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为人脑胶质瘤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人脑胶质瘤为人脑星形胶质母细胞瘤细胞U-87MG或人脑胶质瘤细胞HS 683。
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