CN113350365A

CN113350365A - 环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN113350365A
Application number: CN202110681433.8A
Authority: CN
Inventors: 宋刚; 马秋娟; 张功业
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明公开了环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用，通过用RLE‑6TN和Raw264.7构建急性肺损伤细胞模型，以及LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型和博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，从促炎细胞因子的表达、肺组织病理学表现、抗氧化、NF‑κB/Stat3信号通路相关蛋白表达等方面探讨了环烯醚萜类化合物，特别是莫诺苷和马钱苷对急性肺损伤的防护作用及其作用机制，又通过复制肺纤维化的模型，初步证实了马钱苷和莫诺苷对于肺纤维化的防护作用；初步验证了马钱苷和莫诺苷对于急性肺损伤的防护作用可能是通过NF‑κB/Stat3信号通路实现的。

Description

环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及环烯醚萜类化合物的新用途，具体涉及环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用。属于医药技术领域。

背景技术

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)及其严重阶段的急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)和肺纤维化是呼吸系统较难治愈的疾病，严重影响呼吸功能，可导致呼吸衰竭。

急性肺损伤患者中，有很大一部分在出现临床表现10～14天内会出现严重的以间充质细胞增殖、新血管形成、Ⅰ型和Ⅲ型胶原和富含纤维结合蛋白的基质沉积而成的肺泡肉芽组织为特征的纤维增生过程。尽管一般不认为IL-1β是肺损伤的有效纤维化因子，但已有研究表明在大鼠肺中使用腺病毒载体瞬时过表达IL-1β会诱导组织损伤，随后局部产生血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)和转录生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，并导致肺纤维化。

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由于肺内或肺外的各种致病因素导致的肺泡上皮细胞屏障功能障碍和肺泡毛细血管内皮细胞受损，造成弥漫性肺泡及肺间质水肿，表现出低氧血症、呼吸窘迫、以及非心源性肺水肿的呼吸系统疾病，是重症监护室常见的危重症。

肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是指由药物毒性、结缔组织疾病、放疗等多种原因造成的慢性肺间质性疾病，可发展为呼吸衰竭。特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary,IPF)是特发性肺间质性肺炎中最常见和最致命的，5年生存率约为20％。

引起ALI/ARDS的因素众多，可以分为直接因素(肺内因素)和间接因素(肺外因素)，其中肺内因素包括：肺挫伤、各种细菌和病毒引起的肺炎(如SARS引起的肺炎、新型冠状病毒引起的肺炎)、吸入性肺损伤等。肺外因素包括：严重创伤、重度烧伤、溺水、药物过量、非心源性休克等等。

临床上ALI/ARDS的治疗主要包括机械通气、液体管理和药物治疗等综合疗法，但病死率仍很高，肺纤维化的治疗同样缺乏理想药物，因此寻求高效低毒的治疗急性肺损伤和肺纤维化的药物以期改善患者的生活质量、挽救患者的性命，成为亟待解决的课题。

目前的治疗药物中，吡非尼酮和尼达尼布可以有效缓解特发性肺纤维化患者轻度至中度功能障碍，减缓肺功能的恶化，凸显了药物在疾病早发现、早诊断、早治疗的重要性。但是，在临床应用中，由于吡非尼酮和尼达尼布会出现剧烈的胃肠道反应(例如：恶心、呕吐、腹部不适、消化不良和腹泻)和肝酶升高、出血等需要特别关注的不良事件，且两种药物的价格比较昂贵，会导致患者依从性较差，普通患者很难坚持长期服药，因此研制出副作用小、经济、高效的药物具有较深远的意义。

环烯醚萜类化合物是传统中药的有效成份，具有抗炎、抗肿瘤、预防和治疗糖尿病等特性。作为萜类家族中的一员，环烯醚萜(iridoids)是一类有环戊二烯并吡喃环结构的单萜化合物，是臭蚁二醛的缩醛衍生物，最早从伊蚁的分泌物中获得，具有防御作用，是从动物中获取的第一种抗生素。环烯醚萜类化合物广泛的存在于多种双子叶植物中，以茜草科、玄参科、龙胆科最为常见。环烯醚萜类化合物的基本核心结构是环烯醚萜醇，根据其基本核心结构的变式可以将其分为三种类型：环烯醚萜乙缩醛脂类、裂环烯醚萜苷类、环烯醚萜苷类。因环烯醚萜化合物的半缩醛醇羟基性质不稳定，易与糖结合，所以大多数从植物中分离提取的环烯醚萜类化合物多数为环烯醚萜苷类。目前从植物种得到的环烯醚萜类化合物已经有800余种，裂环环烯醚萜类仅仅30多种，非苷类环烯醚萜化合物60余种，剩余的均为环烯醚萜苷类化合物，常用的中药如山茱萸、忍冬叶、马钱子、栀子、胡黄连、车前草等中都含有环烯醚萜苷类化合物。

目前尚无将环烯醚萜苷类化合物用于制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用。

优选的，所述环烯醚萜类化合物为马钱苷或莫诺苷。

优选的，急性肺损伤包括严重阶段的急性呼吸窘迫综合征。

2、一种急性肺损伤或肺纤维化治疗药物，其有效成分为环烯醚萜类化合物。

优选的，所述环烯醚萜类化合物为马钱苷或莫诺苷。

优选的，急性肺损伤包括严重阶段的急性呼吸窘迫综合征。

本发明的有益效果：

本发明通过用RLE-6TN和Raw264.7构建急性肺损伤细胞模型，以及LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型和博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，从促炎细胞因子的表达、肺组织病理学表现、抗氧化、NF-κB/Stat3信号通路相关蛋白表达等方面探讨了环烯醚萜类化合物，特别是莫诺苷和马钱苷对急性肺损伤的防护作用及其作用机制，又通过复制肺纤维化的模型，初步证实了马钱苷和莫诺苷对于肺纤维化的防护作用；初步验证了马钱苷和莫诺苷对于急性肺损伤的防护作用可能是通过NF-κB/Stat3信号通路实现的。

结果显示：环烯醚萜类化合物马钱苷和莫诺苷可以减少急性肺损伤细胞模型中炎症因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达，并下调p-p65和stat3蛋白的表达。在动物实验中发现马钱苷和莫诺苷预处理后可以改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠的一般状态和肺组织炎性细胞浸润、肺泡壁增厚等病理改变；同时可以减少肺组织中IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达和下调p-p65、p-stat3的表达；抗氧化功能指标检测发现，马钱苷和莫诺苷预处理后小鼠的SOD含量上升，MDA含量下降，表明马钱苷和莫诺苷可以提高小鼠机体的抗氧化能力。预防肺纤维化方面，马钱苷和莫诺苷可以上调小鼠体重增长率和外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞的比值，下调肺纤维化小鼠肺组织中胶原纤维和HYP的含量和TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA和CollagenⅠmRNA以及α-SMA蛋白的表达。

附图说明

图1为莫诺苷和马钱苷分别处理对RLE-6TN细胞增殖的影响，其中，A为莫诺苷，B为马钱苷。

图2为不同浓度LPS刺激RLE-6TN产生炎症因子表达量的差异，其中，A.IL-6mRNA表达量；B.IL-1βmRNA表达量；C.TNF-αmRNA表达量。

图3为LPS处理RLE-6TN不同时间IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达，其中，A.IL-6mRNA在1小时上调较其它时间明显；B.IL-1βmRNA在0.5小时上调较明显；C.TNF-αmRNA在2小时上调最为明显(分别与Control组比较，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001)。

图4为莫诺苷和马钱苷可以抑制LPS刺激RLE-6TN导致的炎症因子表达上调，其中，加入莫诺苷后，A.IL-6mRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)，B.IL-1βmRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)，C.TNF-αmRNA(与LPS组比较，**P＜0.01均有下调)；加入马钱苷后，D.IL-6mRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)，E.IL-1βmRNA下调(与LPS组比较，***P＜0.005)，F.TNF-αmRNA下调(与LPS组比较，*P＜0.05)。

图5为莫诺苷和马钱苷对RLE-6TN细胞中p-p65和stat3蛋白表达的影响。

图6为莫诺苷和马钱苷对RAW 264.7增殖的影响，其中，A.莫诺苷浓度梯度处理RAW264.7不同时间(12h、24h、48h)后对于细胞增殖的影响。B.马钱苷浓度梯度处理RAW264.7不同时间(12h、24h、48h)后对于细胞增殖的影响。ns代表无统计学差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001，n＝5。

图7为不同浓度LPS刺激RAW 264.7产生炎症因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达量的差异，其中，A.IL-6mRNA的表达在不同浓度LPS的刺激下均有所上调(与Control组比较，***P＜0.005，****P＜0.0001)，在100ng/mL之后的浓度具有浓度依赖性；B.IL-1βmRNA的表达在不同浓度LPS的刺激下上调(与Control组比较，**P＜0.01，****P＜0.0001)，C.TNF-αmRNA的表达在LPS的刺激下上调(与Control组比较，****P＜0.0001)，在1μg/mL浓度范围内上调倍数并无明显差别。

图8为莫诺苷和马钱苷可以抑制LPS刺激RAW 264.7导致的细胞炎症因子的表达上调，其中，A.B.C：莫诺苷预处理后促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达下调；D.E.F：马钱苷处理后促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达下调。

图9为莫诺苷和马钱苷对RAW264.7细胞中p-p65和stat3蛋白表达变化的影响。

图10为莫诺苷和马钱苷对急性肺损伤小鼠模型体重变化的影响，其中，A.莫诺苷治疗对LPS导致的小鼠体重下降无缓解作用；B.马钱苷治疗对LPS导致的小鼠体重下降无缓解作用。

图11为小鼠肺损伤组织切片HE染色(×400)，其中，A为莫诺苷，B为马钱苷。

图12为莫诺苷和马钱苷对小鼠肺组织SOD活性的影响，其中，A.Control组的SOD活性平均为26.83±0.7363(U/mg肺组织湿重)，n＝8；LPS组的SOD活性平均值为17.07±0.5678(U/mg肺组织湿重)，与Control组比较，LPS组SOD活性下降，***P＜0.005,n＝8；LPS+Morroniside组的SOD活性平均值为29.66±1.317(U/mg肺组织湿重)，与LPS组比较，LPS+Morroniside组SOD活性上升，###P＜0.005,n＝8。B.马钱苷预保护组数据，与莫诺苷预保护具有相同趋势(LPS vs Control，**P＜0.01；LPS+Loganin vs LPS，##P＜0.01，n＝8)。

图13为莫诺苷和马钱苷对小鼠肺组织MDA的含量的影响，其中，A.LPS组小鼠肺组织MDA的含量比Control组高，**P＜0.01，n＝8。在造模前提前莫诺苷灌胃后，小鼠肺组织MDA的含量降低，##P＜0.01，n＝8。B.LPS组较Control组小鼠肺组织中MDA含量高(**P＜0.01)。与LPS组比较，LPS+Loganin组小鼠肺组织中MDA含量降低(#P＜0.05)。

图14为莫诺苷和马钱苷对肺组织中IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达水平的影响，其中，A.B.C.：在给予莫诺苷预保护实验组小鼠中，LPS组较Control组促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达升高(****P＜0.0001，n＝8)，LPS+Morroniside组比LPS组促炎因子表达量低(####P＜0.0001，n＝8)；D.E.F.：在给与马钱苷预保护实验组小鼠中，与Control组相比，LPS组IL-6mRNA表达升高(**P＜0.01，n＝8)、IL-1βmRNA表达升高(****P＜0.0001，n＝8)、TNF-αmRNA表达升高(**P＜0.01，n＝8)。LPS+Loganin组与LPS组相比，IL-6mRNA、IL-1βmRNA表达减少(##P＜0.01，n＝8)、TNF-αmRNA表达同样呈现出下降趋势(#P＜0.05，n＝8)。

图15为莫诺苷和马钱苷可以下调小鼠肺组织中NF-κB/STAT3信号通路中p-p65和p-stat3蛋白的表达。其中，A.LPS导致的p-p65和p-stat3的表达升高被莫诺苷下调；B.LPS导致的p-p65和p-stat3的表达升高被马钱苷下调。

图16为马钱苷和莫诺苷预防护可以提高肺纤维化小鼠体重增长率，其中，A.为每周小鼠体重的增长趋势图，B.为体重增长率统计图，对照组和治疗组与BLM组比较，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001。

图17为肺纤维化小鼠肺组织切片染色，其中，A.HE染色；B.Masson染色。

图18为马钱苷和莫诺苷处理后小鼠肺组织中HYP含量变化。

图19为不同处理组小鼠外周血中CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化，其中，A.Control组与BLM组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞的表达，B.不同浓度Loganin组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺的表达，C.不同浓度Morroniside组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺的表达，D.不同处理组小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化统计图(分别与BLM组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005，n＝8)。

图20为不同处理组小鼠肺组织TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA、CollagenⅠmRNA的表达，其中，A.空白对照组和马钱苷及莫诺苷治疗组的TGF-β1mRNA的表达均低于BLM组，且****P＜0.0001(图中未标注)。B-C.空白对照组和马钱苷及莫诺苷治疗组的α-SMA mRNA和CollagenⅠmRNA的表达均低于BLM组，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001,n＝8。

图21为不同处理组小鼠肺组织α-SMA蛋白表达情况，其中，A.博莱霉素模型组小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达较对照组呈现上调趋势，B为α-SMA的相对表达量。C.E.从低浓度到高浓度的马钱苷治疗组及莫诺苷治疗组，α-SMA的表达呈现下降趋势。D.F.从低浓度到高浓度的马钱苷治疗组及莫诺苷治疗组，α-SMA的相对表达量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实验过程

1、10％APS：称取过硫酸铵(Ammonium persulfate,APS)2g，溶解于20mL超纯水中，经涡旋振荡器溶解混匀，分装至1.5mL EP管，-20℃保存。

2、10％SDS：称取十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)5g，溶解于40mL超纯水中，完全溶解后定容至50mL，室温保存。

3、pH 6.8Tris-HCl(1M)：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.57g溶解于400mL超纯水中，用浓盐酸调pH至6.8，超纯水定容至500mL即可，4℃保存。

4、pH 8.8Tris-HCl(1.5M)：称取Tris 90.9g溶解于400mL超纯水中，用浓HCl调pH值至8.8，超纯水定容至500mL，4℃保存。

5、Loading buffer(5×)：取2g十二烷基硫酸钠(SDS)，10g溴酚蓝，5mL PH 6.8的1mol/L Tris-HCl，10mL甘油，加ddH₂O定容至20mL。用时取900ul加入100ul的巯基乙醇，分装置1.5mLEP管，室温保存。

6、Running Buffer(10×)：用电子天平称量甘氨酸(Glycine)144g，Tris 30g，10gSDS，溶解于1000mL双蒸水中，即为10×电泳缓冲液，室温保存。临用时取100mL 10×Running buffer加超纯水稀释至1L即可。

7、Transfer Buffer(10×)：称取甘氨酸(Glycine)720g，Tris152g，溶于4L超纯水中，磁力搅拌器搅拌均匀后加超纯水定容至5L，室温保存。临用时取100mL transferbuffer和200mL甲醇，稀释于700mL超纯水中即可。

8、PBS(10×)：称量NaCl 80g，Na₂HPO₄.12H₂O 36.3g，KCl 2g，KH₂PO₄ 2.4g溶于800mL超纯水中，磁力搅拌器搅拌，定容至1L，调pH值至7.2-7.4。临用时加超纯水稀释至1×，若培养细胞用，需高压灭菌。

9、TBS缓冲液(10×)：称取88g NaCl、Tris 12.11g溶于800mL超纯水中，pH调至7.5，用超纯水定容至1L，保存于室温。用时取500mL TBS(10×)，Tween-20 5mL溶于4000mL超纯水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后定容至5L，室温保存。

10、RIPA细胞裂解液(1×)：将EDTA 0.0292g，EGTA 0.038g，Tris 0.121g，NaCl0.87g，Triton-100 1mL加入90mL超纯水中，调pH值至7.4，定容至100mL，4℃保存。

11、PMSF(100mM,100×)：取PMSF 1.74g溶于100mL异丙醇中，搅拌均匀后，4℃保存。

12、β-磷酸甘油(500mM，100×)：称取β-磷酸甘油1.08g,溶于10mL超纯水，1.5mLEP管分装，-20℃保存。

13、8％SDS-PAGE分离胶(15mL)：移液器吸取6.9mL ddH₂O、30％Acr-Bis 4mL、1.5MTris-HCl(pH8.8)3.8mL、10％SDS 150μL、10％过硫酸铵(APS)150μL、TEMED 10μL于50mL EP管中，现配现用。

14、5％SDS-PAGE浓缩胶(6mL)：4.1mL ddH₂O、30％Acr-Bis 1mL、1.0M Tris-HCl(pH6.8)750μL、10％SDS 80μL、10％过硫酸铵(APS)80μL、TEMED 6μL于10mL EP管中，现配现用。

15、封闭液(5％脱脂牛奶)：临用时，称取2g奶粉溶到40mL TBST中，振荡混匀。

16、5mg/mL MTT溶液：称取0.05g MTT粉末溶解于10mL 1×PBS溶液中，超净工作台中0.22μm过滤膜过滤除菌，分装于锡箔纸包裹的1.5mL EP管中，保存于-20℃。

17、4％多聚甲醛：称取40g多聚甲醛，溶解到900mL 1xPBS溶液中，因多聚甲醛不易溶解，缓慢加入少量氢氧化钠促进溶解，待多聚甲醛溶解后调PH值至7.4，定容于1L，保存于4℃冷库。

18、LPS溶液配制：将10mg的LPS冻干粉溶于2mL的生理盐水中，制成5mg/mL LPS溶液，分装至1.5mL EP管中，保存于冰箱-20℃。临用时稀释至1mg/mL。

19、莫诺苷溶液配制：称量90mg的莫诺苷冻干粉(成都瑞芬思)溶于5mL的生理盐水中配制成18mg/mL的莫诺苷溶液，保存于-20℃冰箱。

20、马钱苷溶液配制：准确称量120mg的马钱苷冻干粉(成都瑞芬思)溶于6mL的生理盐水中配制成20mg/mL的马钱苷溶液，保存于-20℃冰箱，用时按需稀释。

1.1实验方法

1.1.1细胞实验

1.1.1.1细胞培养及传代

1、将RLE-6TN接种于完全培养基中(体积百分比89％DMEM、10％FBS、1％青/链霉素双抗)。

2、细胞放在37℃，CO₂体积含量5％，相对湿度90％的恒温培养箱中培养。

3、镜下观察细胞密度及形态，细胞长至可以覆盖80％培养皿面积时，可以传代。

4、弃掉旧的培养基，沿培养皿边缘加入PBS润洗。向培养皿中加入1mL胰酶，轻轻摇晃覆盖整个皿底，放置培养箱静置3min，显微镜下观察，若细胞回缩变圆，弃掉胰酶，加入1mL培养液，终止消化，轻轻吹打细胞致其脱落，将细胞悬液转移到1.5mL离心管中，1000rpm离心3min。

5、取出离心管，弃上清，可1:2-1:3进行细胞传代。镜下观察，见细胞均匀铺至皿底后转移至细胞培养箱。每天观察细胞状态，必要时更换培养液。

1.1.1.2细胞冻存

1、4℃冰箱取出培养液、胰酶、PBS、细胞冻存液等复温。

2、镜下观察细胞长至合适密度，且细胞状态良好时，可以收集细胞并将其冻存。

3、弃掉培养皿里面的旧的培养基，PBS 1mL润洗一遍，清洗掉残余的培养基以及细胞的代谢废物。

4、弃掉PBS，加入1mL胰酶消化，将细胞吹打下来转移到1.5mLEP管内，1000rpm离心3min。

5、弃上清，加入1mL的冻存液重悬，重悬后转移至细胞冻存管。-80℃或者液氮保存。

6、归纳整理超净台并用体积浓度75％酒精擦拭表面。关闭超净台、离心机、显微镜等。

1.1.1.3细胞复苏

1、水浴锅加热至37℃。从-80℃取出细胞，放入37℃水浴锅，不断晃动，快速将细胞解冻。

2、解冻后的细胞1000rpm，离心3min。

3、弃掉冻存管内的上清液，1mL完全培养基将细胞重悬后均匀铺至合适规格的培养皿中，十字摇匀后放进培养箱培养即可。

1.1.1.4提取蛋白

1、配制适量细胞裂解液，各组分质量比为RIPA裂解液：PMSF(苯甲基磺酰氟)：β-磷酸甘油：蛋白磷酸酶抑制剂：Na₃VO₄＝100：1：1：1：1

2、弃掉培养皿中的培养液，PBS清洗两次。六孔板每孔加入裂解液120μL，刮刀刮下细胞。注意：刮刀用完后使用75％酒精及超纯水清洗并用纸擦干，避免细胞交叉污染，影响实验结果。全程冰上操作。

3、细胞收集至1.5mLEP管，打开超声波细胞破碎仪并将其频率调到25％。

4、超纯水清洗探头，用纸轻轻擦干探头后进行超声破碎，每次2秒，间隔3秒，共计10次。注意不要将探头插的太深或太浅以及超出泡沫，全程在冰上进行。

5、预冷离心机至4℃，13200rpm 4℃，15-30min。

6、小心吸取上清，并转移至标记好的新的EP管，充分混匀后测量蛋白浓度。

7、测蛋白浓度时，制作标准曲线。取一个96孔板，选定第一孔加入10μL NaCl；第二孔加入9μL NaCl，1μL BSA(牛血清白蛋白)；第三孔加入8μL NaCl，2μL BSA；第四孔加入6μLNaCl，4μL BSA；第五孔加入2μL NaCl，8μL BSA；第六孔加入10μL BSA。依次向后面的测量孔中加入8μL NaCl和2μL待测蛋白样品。为保证蛋白浓度的准确性，可根据需要设置复孔，NaCl的质量浓度为9％，BSA的浓度为2mg/mL。

8、取BCA蛋白浓度测定试剂盒中A液和B液，按照说明书，根据标准曲线孔和测量孔的个数配制工作液，200μL/孔，A液：B液＝50：1，混匀后避光保存，现配现用，不宜保存过久。由于移液枪的误差，可适当多配制1-2孔的测试液。

9、将A液和B液混合后的工作液加入96孔板，放入37℃生化培养箱孵育20-25分钟；

10、孵育结束，打开酶标仪，调用本实验室测蛋白浓度程序，测量标准曲线孔及蛋白样品孔的吸光度值；

11、拷贝吸光度值至Excel表格，以吸光度值为横坐标，BSA蛋白浓度为纵坐标，插入散点图，添加趋势线，显示公式，并显示R²值，绘制标准曲线，R²需大于0.99。

12、根据标准曲线所得公式，代入蛋白样品的吸光度值，求得蛋白样品的浓度。根据蛋白浓度，加5×或2×Loading buffer煮沸15-20min，使蛋白变性，直接用于westernblot上样或者保存至-20℃。计算加入Loading buffer后实际待测蛋白浓度。

1.1.1.5 Western Blot检测蛋白表达

1、制备分离胶与浓缩胶

(1)清洁并晾干制胶所需的薄板和厚板，将晾干后的薄板与厚板放到制胶夹板中，边缘对齐扣紧；

(2)对照SDS-PAGE分离胶配方表，根据待检测蛋白分子量大小，配制相应浓度的分离胶；

(3)将配制好的分离胶涡旋振荡后，小心倒入薄板与厚板之间的夹层中，液层在梳子下方1cm处比较合适，75％乙醇液封；

(4)分离胶静置30分钟左右，分离胶与上层酒精间可见明显分界线代表下层分离胶已经凝固，弃上层75％乙醇，倒置晾干；

(5)按照SDS-PAGE浓缩胶配方表配制所需的浓缩胶，涡旋振荡后注入薄厚胶板之间，达薄板上边缘即可；

(6)将加样梳插入浓缩胶，注意双手持梳，从一侧插入；

(7)静置20-30分钟，浓缩胶凝固，拔出梳子，直接用于上样或者保存于4℃备用。

2、待测蛋白上样及电泳和电转

(1)从冰箱-20℃取出待测蛋白样品，沸水浴5-10min，掌型离心机离心20-30sec，使挂于管壁的蒸汽液完全沉于管底，刚制备的蛋白样品，可直接离心后上样；

(2)将制备好的胶板置入电泳胶板夹装置，放入配套的装有1×Running Buffer电泳槽；

(3)根据待测样品的实际浓度以及待测样品的上样质量(30-50μg)计算出上样体积，待测蛋白样品上样完成之后，紧贴样品孔上蛋白marker 2-3μL标记蛋白分子量大小；

(4)打开电泳仪，调节电压90V，30min，marker标记分开，此时可以将电压调至120-150V，待marker所标记条带分开至所需要的区间，结束电泳；

(5)准备好电转液、转膜夹、海绵、滤纸、PVDF膜、冰块等物品；

(6)打开胶板，切角标记上样顺序，PVDF膜同样剪一小角并在甲醇中浸润；

(7)把电转液倒入电转专用容器中，将转膜夹在电转液中打开，转膜夹黑色面在下，白色面在上，转膜夹黑白面之间依次放入海绵、厚滤纸、胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵，并注意各层之间不要有气泡；

(8)将电转内槽放入电转槽，含胶的转膜夹和冰块放入电转槽，电转液倒入电转槽，盖上盖子，接通电源，将电压调至100V，时间调至60min。

(9)电转装置停止工作后，从转膜夹中迅速取出PVDF膜，可见膜上有清晰可见的红蓝条带(蛋白Maker),放入提前配制好的封闭液中。

(10)盛有封闭液的封闭槽放置在摇床上，转速调慢，室温下孵育60min；

(11)封闭完成后，弃掉封闭液，用TBST清洗掉PVDF膜上残存的封闭液；

(12)裁下蛋白条带，放入塑封膜，加入一抗孵育液，放入4℃冷库摇床，速度调慢，过夜孵育；

(13)回收一抗，把孵育过一抗的蛋白条带放入洗膜槽，用TBST洗涤三次，每次10分钟；

(14)洗涤后孵育二抗，孵育方法同一抗，孵育条件为室温，摇床慢摇，时间为1小时；

(15)二抗回收或直接弃掉，孵育过二抗的蛋白条带BST洗涤三次，同样每次10分钟；

(16)准备ECL发光液，打开显影机器，预冷机器，调用程序，将ECL发光液均匀的铺在含有蛋白条带的PVDF膜上，放进显影机器暗箱，等待曝光，保存显影后的条带。

1.1.1.6提取RNA与qPCR

1、提取总RNA

(1)准备RNA free枪头及总RNA提取试剂盒。

(2)处理细胞样本：用胰酶消化后收集细胞到1.5mL离心管中，加入裂解液R1 100μL，移液枪吹打混匀，室温静置1min。

(3)在预处理的细胞样本中加入裂解液R2 600μL，颠倒混匀，室温静置5min。

(4)把上清液转移到接有移液管的纯化柱，12000rpm离心1min。

(5)弃去接液管中的废液，向纯化柱加入洗涤液600μL，12000rpm离心1min。

(6)重复步骤(5)。

(7)弃去接液管液体，空管空柱离心1min，并将纯化柱转移到新的1.5mL离心管。

(8)向纯化柱中加入洗脱液20μL，室温静置1min，12000rpm离心1min，1.5mL离心管中的液体即为总RNA。

2、逆转录合成cDNA

(1)准备工作。制作简易冰盒，将测完浓度的RNA及RNA反转录所需要的试剂盒置于冰上，gDNA digester和HifairⅡSuperMix plus短暂离心，混合均匀。准备好PCR反应管，移液枪等；

(2)取1μg RNA进行反转。根据RNA浓度计算所需RNA体积；

(3)去除基因组残留的DNA。取备好的RNase free的PCR反应管，加入RNA、5×gDNAdigester Buffer 2μL、gDNA digester 1μL，然后加RNase free ddH₂O至PCR反应管内的总体积至10μL；

(4)用移液器将PCR管内的预混液轻轻吹打混匀，在PCR仪中42℃孵育2分钟；

(5)取出PCR仪中孵育好的10μL预混液，加入2×HifairⅡSuperMix plus 10μL，配制成20μL的逆转录反应体系，吹打混匀，设置PCR仪反转录反应程序：25℃5min，42℃30min，85℃5min，程序结束后，cDNA保存于-20℃。

3、实时定量PCR

(1)准备工作：制做简易冰盒，将qPCR试剂盒、cDNA置于冰上，并准备好移液枪、八联管等；

(2)根据Monad公司建议的qPCR反应体系计算好各基因所需的MonAmp^TM ChemoHSqPCR Mix、正向引物、反向引物、Nucleasse-Free water并预混于1.5EP管中，反应体系见表1。

表1.反应体系

荧光定量PCR引物序列与大小见表2。

表2.PCR引物

(3)将预混液加入8联管中，每孔8μL，然后根据反应体系将cDNA模板加入八联管中，将混合液振荡混匀后，离心至管底，放置罗氏PCR仪中，进行qPCR，三步法反应程序见表3。

表3.反应程序

变性、退火、延伸需40个循环。

注意：退火温度是根据引物的Tm值来设定的，一般设计引物的时候引物的Tm值一般选在55-65℃。

(4)将结果拷贝出来，在电脑LC96软件上进行分析数据。

1.1.1.7 MTT检测细胞的存活率

1、在细胞间超净工作台将细胞用1mL培养液重悬。

2、细胞计数仪计数，接种至96孔板，每孔5000-10000个细胞。

3、细胞贴壁后长到合适密度后加入药物，设置阴性对照孔。

4、培养至预设时间点后加入5mg/mL MTT 20μL，继续培养。

5、4小时后弃掉96孔板中的上清液，每孔加入150μL的DMSO，避光包裹后放置摇床快摇15分钟，打开酶标仪，MTT程序测定各孔吸光度值。

1.1.2动物实验

1.1.2.1动物模型

购回BALB/c小鼠后(购自厦门大学实验动物中心)，在本实验室适应性喂养一周后，称量体重。

1、急性肺损伤模型

(1)将BALB/c小鼠(24只，月龄6周，体重18-20g)随机分为三组，每组8只：生理盐水组(Control组)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)5mg/kg造模损伤组(LPS组)、5mg/kg脂多糖+180mg/kg莫诺苷组(Morroniside组)或5mg/kg脂多糖+150mg/kg马钱苷组(Loganin组)。

(2)动物造模方法：LPS组和Morroniside组、Loganin组以腹腔注射方式给与LPS，Control组腹腔注射等体积的生理盐水。Morroniside组Loganin组分别将莫诺苷溶液和马钱苷溶液在腹腔注射LPS造模前一天灌胃给予，2次/每天。Control组及LPS组等体积生理盐水灌胃。

(3)观察一般情况并分离肺组织

腹腔注射LPS后，观察三组小鼠呼吸、进食、口鼻眼部分泌物以及大小便等一般情况。12小时后颈椎脱臼处死小鼠，并开胸取肺部组织。

2、肺纤维化模型

(1)动物分组：将BALB/c小鼠随机分为8组：生理盐水组(Control组)、博莱霉素+生理盐水组(BLM组)、博莱霉素+低浓度马钱苷组(BLM+loganin 80mg/kg)、博莱霉素+中浓度马钱苷组(BLM+loganin 160mg/kg)、博莱霉素+高浓度马钱苷组(BLM+loganin 200mg/kg)组、博莱霉素+低浓度莫诺苷组(BLM+morroniside 50mg/kg),博莱霉素+中浓度莫诺苷组(BLM+morroniside 100mg/kg)、博莱霉素+高浓度莫诺苷组(BLM+morroniside 200mg/kg)，每组8只。

(2)动物造模方法：BLM组、BLM+loganin组和BLM+morroniside组腹腔注射BLM35mg/kg，3次/周，持续8周。同时，从第一周起，莫诺苷和马钱苷灌胃，2次/周。

(3)造模期间，阶段性的称量小鼠体重。8周后颈椎脱臼处死小鼠，开胸肺部组织取材。

3、将全肺分为5部分放入EP管中。分别做肺组织病理学检测、小鼠肺部干/湿比、提取蛋白质、提取RNA、酶学检测。如未及时检测，肺组织-80℃保存。

1.1.2.2提取小鼠肺组织总RNA

1、Trizol(Takara)，无水乙醇，异丙醇，氯仿，DEPC水、RNase free的枪头、RNasefree EP管、高压过的研磨棒等实验所需物品做好标记，置入超净工作台，提前紫外照射10分种；

2、1.5mL EP管中的肺组织剪刀剪碎后加入500μL Trizol，研磨棒研磨至肺组织稀碎后每管再加入300μL Trizol，用移液枪吹打均匀，盖紧EP管盖子，剧烈震荡10秒钟，室温放置10分钟；

3、10分钟后，EP管中加入160μL(氯仿：Trizol体积比为1:5)的三氯甲烷，盖紧盖子，剧烈震荡至颜色变为粉色浊液，室温放置10分钟。打开离心机预冷至4℃；

4、将EP管转移至离心机，13200rpm 4℃离心15分钟；

5、取出EP管，可见此时液体已分为三层，小心吸取EP管内上层清液转移到1.5mLRNase free EP管内，注意不要吸取到中间层和下层液体；

6、向盛有上清的RNase free EP管内加入异丙醇1mL，颠倒混匀后室温静置10分钟，转移至离心机。

7、13200rpm 4℃离心15分钟，取出离心管，可以看见EP管底白色沉淀，此为提取的总RNA。

8、弃上清，用小量程移液枪将管底残留的液体小心吸弃至废液瓶。每管加入500μL的70％乙醇(由无水乙醇和DEPC水配制而成)，并用移液枪轻轻将蛋白沉淀吹起(注意不要将其吹散)，转移至已预冷离心机。

9、13200rpm 4℃离心5分钟后弃去EP管中洗涤液，并重复上一步骤。

10、13200rpm 4℃离心后吸尽EP管内残留的液体，将EP管盖全部打开，超净台风速调至最大，干燥10-20分钟。

11、根据EP管底的沉淀的RNA量加入适量的DEPC水溶解。

12、取2μL已溶解的RNA测量其浓度及纯度。若浓度过大，根据需要稀释至所需浓度。测完浓度及时将其反转录，放置-80℃保存。

13、逆转录合成cDNA和Real-time PCR方法如前文细胞实验所述，不再赘述。

1.1.2.3小鼠肺组织蛋白提取

1、将分装于1.5mL EP管中的小鼠肺组织用剪刀剪碎，根据肺组织大小加入适量的裂解液(裂解液现配现用，组成为：RIPA裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂、β-磷酸甘油、Na₃VO₄)，研磨棒研碎之后，静置5分钟。全程在冰上操作。

2、余下步骤同细胞实验中相应部分。

1.1.2.4 Western Blot检测组织蛋白表达变化

同细胞实验中Western Blot部分，此处略。

1.1.2.5肺组织病理学检查

1、将小鼠右肺上叶置于4％多聚甲醛水溶液中室温固定48小时以上，固定液的量为固定组织体积块的10-15倍，组织固定完成后用流水冲洗组织2-3小时后装入包埋框以备后续实验；

2、组织脱水透明浸蜡。目的是将组织中的水分先置换为乙醇再将乙醇置换为二甲苯，然后将二甲苯再置换为石蜡，这一过程在厦门大学医学院中心实验室进行，使用仪器为全自动组织脱水机ASP200S，设定程序如下：

(1)50％乙醇6h；(2)70％乙醇7h；(3)80％乙醇1h；(4)90％乙醇1h；(5)95％乙醇1h；(6)无水乙醇①1h；(7)无水乙醇②1h；(8)二甲苯①1h；(9)二甲苯②1h；(10)软蜡30min；(11)硬蜡①1h；(12)硬蜡②1h；

3、包埋在医学院中心实验室进行，所用仪器为包埋机EG1150H。用时提前30min打开仪器加热化蜡，根据需求，调整组织角度进行包埋；

4、切片在医学院中心实验室进行，使用的仪器为石蜡切片机RM2245，展片机和烤片机为石蜡切片机配套仪器，切片厚度为4μm；

5、用铅笔标记玻片，展片机的温度调至37℃，展片至褶皱完全展开且没有松散分离，用玻片把组织蜡片捞出，放置烤片机烤片，42℃过夜或60℃1h，水分烤干年后放置切片盒保存或直接用于蜡片脱蜡；

6、脱蜡、复水的目的是将石蜡组织切片中的石蜡置换为有机溶剂二甲苯(石蜡二甲苯互溶)，再把有机溶剂置换为乙醇(乙醇和二甲苯互溶)，最后用梯度乙醇将组织中的乙醇置换为水，即可用水溶性染料进行染色，脱蜡复水的具体步骤如下：

脱蜡：(1)二甲苯①15min；(2)二甲苯②15min；

复水：(1)无水乙醇①5min；(2)无水乙醇②5min；(3)95％乙醇3min；(4)80％乙醇2min；(5)70％乙醇2min；(6)超纯水

7、HE染色：苏木素与细胞内酸性物质结合呈现蓝紫色，伊红与细胞质结合呈现红色，具体步骤如下：

(1)苏木素染色5min后用自来水洗掉多余的染料，镜下观察；

(2)伊红染料染色3min，可根据组织是否容易上色，适当的增加或者缩短染色时间，自来水洗去多余的染料，封片前镜检确认染色效果；

(3)组织染完苏木素和伊红后进行脱水和封片，脱水的目的是将切片中的水先置换为乙醇，再将乙醇置换为二甲苯，方便本实验室使用的非水溶性封片剂中性树胶封片，步骤如下：

1)体积浓度70％乙醇5秒钟；

2)体积浓度80％乙醇10秒钟；

3)体积浓度95％乙醇1分钟；

4)无水乙醇①2分钟；

5)无水乙醇②2分钟；

6)二甲苯①5分钟；

7)二甲苯②5分钟；

8)中性树胶封片；

(4)封片后再次镜检，若染色不满意，可把玻片侵入二甲苯，移除盖玻片，可重新染色；

8、Masson染色

(1)检查试剂盒内R1核染液、R2浆染液、R3分色液、R4复染液、R5冲洗液是否充足。

(2)处理样本：将石蜡切片脱蜡、复水，复水的乙醇梯度(体积)为95％、70％、30％、超纯水，各2min。复水后用30-40℃温热水清洗2次。

(3)取200μL移液枪吸取R1核染液滴在玻片有组织切片的位置，染色60秒后用自来水冲洗。

用移液枪吸取R2浆染液染组织切片30-60秒，自来水冲洗30秒。

(5)R3分色液分色6-8分钟，镜检，组织样本中的胶原纤维部分应为淡粉色，倒丢分色液。

(6)R4复染液染色5分钟，弃去复染液，梯度乙醇脱水后镜检。

1.1.2.6肺组织湿/干(W/D)比

取出1.5mL EP管中的右肺中叶，用滤纸吸干组织表面的液体，用电子分析天平称量并记录其湿重(W)，放进65℃烘箱烘干48小时至恒重，称量并记录干重(D)。肺组织的湿/干(W/D)的值可以反应肺组织的水肿程度。

1.1.2.7小鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD)含量测定

1、根据待测样品及标准品的数量，配制WST-8/酶工作液。每个待测样品反应需用160μL的工作液，其中SOD检测缓冲液151μL，WST-8 8μL，酶溶液1μL。工作液现配现用，4℃保存不易超过24小时。

2、根据待测样品和标准品的数量配制反应启动工作液。将40×的反应启动液用SOD检测缓冲液稀释，比例为1μL的40×反应启动液加39μL的SOD检测缓冲液。现配现用或4℃保存，当天使用。

3、称量放置在EP管中的部分左肺组织，10mg的组织需加入100μL的样品制备液，冰浴匀浆，12000g,4℃离心5min，取上层清液，并测定其浓度，每个待测样品需准备20-100μg的蛋白用作于后续检测。

4、因后续检测中的抑制百分率须在30％-70％中间，抑制百分率高时，稀释样品；抑制百分率低时，重新制备较高浓度的待测样品。

5、依照表4依次加入缓冲液、工作液和待测样品，冰上操作，注意吹打混匀。因肺组织呈粉红色，所以需要设置空白对照3来消除干扰。

表4.待测样品配制

	样品孔	空白对照孔1	空白对照孔2	空白对照组3
					待测样品	20μL	－	－	20μL
SOD检测缓冲液	－	20μL	40μL	20μL
					WST-8/酶工作液	160μl	160μl	160μl	160μl
反应启动工作液	20μL	20μL	－	－

6、37℃孵育30min。

7、用医学院中心实验室的全波长酶标仪测定吸光度，以650nm作为参考波长，450nm作为测定波长，450nm吸光度值减去650nm的吸光度值即为实测读数。

8、计算待测样品总的SOD活力

计算公式如下：

(注：A为吸光度)

待测样品中

根据蛋白浓度及稀释倍数换算出蛋白质量，将SOD活力单位换算为U/g或者U/mg。

1.1.2.8小鼠肺组织丙二醛(MDA)含量测定

1、配制TBA储存液：25mg的TBA加入到6.76mLTBA配制液中即得到了0.37％TBA储存液。TBA配制液需要加热到70℃以促进溶解，已配制好的0.37％TBA储存液可以室温保存三个月。

2、配制MDA检测工作液。MDA检测工作液由TBA储存液、TBA稀释液和抗氧化剂组成，当天使用，比例如表5所示。

表5.MDA检测工作液的配制

检测样品数	10个	20个	50个
				TBA稀释液	1500μL	3000μL	7500μL
TBA储存液	500μL	1000μL	2500μL
				抗氧化剂	30μL	60μL	150μL

3、稀释标准品。将1mM的标准品用超纯水稀释至1、2、5、10、20、50、100μM，总体积100μL。具体做法如表6所示。

表6.标准品稀释

为了确保标准曲线的准确性，也可先将1mM的标准品稀释为10μM，再将10μM稀释为5μM、2μM、1μM。

4、准备组织样品：组织用Western细胞裂解液裂解，裂解后，12000g 4℃离心10min后取上层清液，并用BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋白的浓度，用来计算单位蛋白重量的组织内MDA含量。

5、向离心管中混匀检测反应体系，反应体系如表7所示。

表7.反应体系

	空白对照管	标准品管	样品管
				裂解液	0.1mL	－	－
标准品	－	0.1mL	－
				待测样品	－	－	0.1mL
MDA检测工作液	0.2mL	0.2mL	0.2mL

混匀各管液体后，100℃沸水浴15℃。冷却至室温后转速1000g离心10分钟。

6、离心后取200μL的上层清液到96孔板中，打开全波长酶标仪，以λ＝450nm为参考波长，λ＝532nm为测定波长，测定各个样品的吸光度值。

7、根据标准品的吸光度值和浓度，绘制标准曲线，计算待测样品的MDA含量。由蛋白浓度及体积计算出蛋白质量，最后根据MDA含量和蛋白质量计算出单位质量的蛋白或组织中MDA的含量，以μmoL/mg蛋白或者μmoL/mg组织来表示。

1.1.2.9小鼠肺组织羟脯氨酸含量测定

1、配制试剂一：将羟脯氨酸试剂盒中试剂一的粉剂溶解于10mL甲液中，完全混合后，加入20mL乙液。最好现配现用，4℃保存3个月。

2、配制试剂三：将试剂盒中试剂三粉剂加入到30mL溶剂中溶解，宜现配现用，4℃避光保存30天有效。

3、配制标准贮备液：将羟脯氨酸标准品用30mL超纯水完全溶解后，定容至50mL，配制成100μg/mL的标准贮备液。4℃保存2周。临用时配制成5μg/mL的标准应用液。

4、精确称取肺组织湿重15-50mg放入1.5mL EP管中加入水解液500μL，吹打混匀后沸水浴20分钟，注意每10分钟混匀一次。

5、调节PH值6.0-6.8左右：流水冲洗冷却各EP管后滴加指示剂5μL混匀，并加入调PH甲液500μL，混匀，用200μL移液枪滴加调PH乙液(约50-250μL)，每加一滴，混匀，直至指示剂颜色红色消失变为黄绿色。

6、加超纯水至5mL混匀后取2mL水解液加活性炭适量(约15mg)，3500g，10min离心后取500μL上清液做检测。

7、按照表8所示操作。

表8.操作条件

8、冷却，3500g/min，离心10min，取上清加入到96孔板，调波长550nm，测量各孔吸光度值。

9、计算组织羟脯氨酸含量，公式如下：

1.1.2.10流式细胞术

1、样本处理：EP管内加200μL抗凝剂和500μL红细胞裂解液，小鼠尾静脉取血2-3滴加入上述EP管内，室温裂解30分钟，1500rpm离心3min。弃上清后加入500μL PBS重悬，1500rpm离心3min，重复两次。弃上清，100μL PBS重悬备用。

2、配制抗体预混液：每个样品加入20μL的抗体预混液，抗体预混液中包含CD8(0.1μL)、CD4(0.02μL)、PBS(19.88μL)。

3、将抗体预混液加入各样品中，冰上染色30分钟，1500rpm离心3min，PBS洗涤两遍后，300μL PBS重悬并转移至流式管备用。

4、打开流式细胞仪Fortessa，调整各项参数，上样，拷贝数据，分析结果。

1.2统计学处理

采用prism 7.0进行数据分析，所有数据来自至少三次的独立实验，计量资料以mean±SD表示，组间两两比较用T检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

实验结果

1.3细胞实验

急性肺损伤时肺部细胞功能有不同程度的受损，肺泡细胞和免疫细胞是肺损伤时炎症反应的靶细胞，炎症反应失控时会导致肺泡细胞功能受损造成表面活性物质减少，从而导致小气道关闭、肺泡萎陷和肺不张，进而引起呼吸障碍，加重肺水肿和肺损伤。因此，申请人选用大鼠肺泡Ⅱ型细胞RLE-6TN和小鼠巨噬细胞RAW 264.7来作为急性肺损伤的细胞模型。

1.3.1 RLE-6TN细胞实验

1.3.1.1莫诺苷和马钱苷分别处理对大鼠肺泡Ⅱ型细胞RLE-6TN细胞增殖活力的影响

目前研究表明，环烯醚萜类化合物类有抗肿瘤、保护神经系统等作用，但是单独应用莫诺苷和马钱苷时是否对正常肺泡细胞有杀伤作用目前暂无报道。查阅相关资料，选择合适的浓度和作用时间进行MTT实验来验证莫诺苷和马钱苷对正常的大鼠肺泡Ⅱ型细胞RLE-6TN增殖活力的影响。实验结果表明(图1)：在莫诺苷和马钱苷的剂量为10μM、50μM、100μM时，作用48小时内对细胞的增殖均无影响。

在图1中，A.不同剂量(10μM、50μM、100μM)莫诺苷作用RLE-6TN细胞不同时间(12h、24h和48h)对细胞增殖的影响(P＞0.05，n＝5)。B.不同剂量(10μM、50μM、100μM)马钱苷作用RLE-6TN细胞不同时间(12h、24h和48h)对细胞增殖的影响(P＞0.05，n＝5)。不同剂量的莫诺苷和马钱苷分别作用RLE-6TN同一时间时对细胞的增殖的影响也无明显差异，结果未显示。

1.3.1.2不同浓度的LPS刺激RLE-6TN细胞产生炎症相关因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA相对表达量的差异

虽然肺泡Ⅱ型细胞仅占肺泡上皮细胞的14％-16％，但是却被认为是肺泡上皮的干细胞，可以分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞，也可以增殖为新的肺泡Ⅱ型上皮细胞以及分泌表面活性物质等功能，因此选择大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞RLE-6TN作为肺损伤的细胞模型。用DMEN培养基稀释LPS工作液，配制含有不同浓度LPS的DMEM培养液。细胞分为4组，培养液组(Control)、LPS 2μg/mL处理组、LPS 5μg/mL处理组、LPS 10μg/mL处理组，6孔板培养细胞，细胞长至合适浓度，加入含有相应浓度LPS的DMEM培养液，继续培养1小时。RT-PCR检测IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达量的变化。如图2(A.IL-6mRNA表达量；B.IL-1βmRNA表达量；C.TNF-αmRNA表达量)所示，RLE-6TN可以积极响应LPS的刺激，在预设的三种浓度下，炎症因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA均上调(分别与Control组比较，***P＜0.005，****P＜0.0001)。IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA在LPS浓度为2μg/mL时上调最为明显。后续实验采用LPS 2μg/mL进行肺损伤细胞模型造模。

1.3.1.3 LPS处理不同时间对RLE-6TN细胞产生炎症相关因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA相对表达量的影响

前文我们已经证明，LPS处理RLE-6TN细胞可以炎症因子的表达量上调。为了摸索细胞造模的LPS最佳作用时间，用DMEM完全培养基稀释LPS工作液至2μg/mL，细胞长到合适密度时，于收集细胞前6h、3h、2h、1h、0.5h将完全培养液更换为添加有LPS(2μg/mL)的细胞培养液继续培养。RT-PCR检测IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达量的变化。结果如图3所示：LPS处理6小时内，炎症因子的表达量均有上调，后续实验均选取LPS作用1小时作为细胞模型的造模时间。其中，A.IL-6mRNA在1小时上调较其它时间明显；B.IL-1βmRNA在0.5小时上调较明显；C.TNF-αmRNA在2小时上调最为明显(分别与Control组比较，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001)。

1.3.1.4环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷抑制LPS刺激RLE-6TN产生细胞炎性因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达上调

申请人已经通过实验得到了用LPS刺激RLE-6TN细胞造模的时间和浓度，时间为1小时，浓度为2μg/mL。莫诺苷和马钱苷是否对急性肺损伤有保护作用目前尚不得知，因此我们用莫诺苷和马钱苷预处理肺损伤RLE-6TN细胞模型来初步验证莫诺苷和马钱苷的抗炎作用。将配制好的莫诺苷和马钱苷的工作液稀释到10μM。将细胞分为三组：Control组、LPS组、Morroniside+LPS组或Loganin+LPS组。细胞培养至合适密度后加入10μM的马钱苷或莫诺苷，继续培养24小时，相应孔加入2μg/mL LPS继续培养1小时收集细胞，q-PCR检测IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达水平。结果如图4所示，用莫诺苷和马钱苷可以降低LPS刺激RLE-6TN引起的炎性因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA上调。其中，A.加入莫诺苷后IL-6mRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)、IL-1βmRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)、TNF-αmRNA(与LPS组比较，**P＜0.01均有下调)；B.加入马钱苷后IL-6mRNA下调(与LPS组比较，****P＜0.0001)、IL-1βmRNA下调(与LPS组比较，***P＜0.005)、TNF-αmRNA下调(与LPS组比较，*P＜0.05)。

1.3.1.5莫诺苷和马钱苷减轻LPS刺激RLE-6TN细胞产生炎症反应与NF-κB/Stat3信号通路有关

急性肺损伤发病机制包含复杂的炎性级联反应，LPS是NF-κB信号通路激活剂，NF-κB信号通路激活后可以刺激炎性细胞因子的转录，IL-6可以调控Stat3信号通路，因此我们考虑从NF-κB/Stat3信号通路来探究莫诺苷和马钱苷的作用机制。细胞分为四组：Control组、LPS组、Morroniside+LPS组和Loganin+LPS组。莫诺苷、马钱苷和LPS的作用时间以及使用浓度与3.1.1.4中一致。结果如图5：在LPS刺激下，p-p65和stat3的表达上调，而在提前加入莫诺苷和马钱苷时，p-p65和Stat3的蛋白表达均有所下调。

1.3.2 RAW 264.7细胞实验

1.3.2.1莫诺苷和马钱苷分别处理对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7增殖活力的影响

小鼠巨噬细胞系细胞RAW 264.7可以积极响应外界刺激，常用其建立细胞炎症模型。同理，虽然环烯醚萜类化合物在抗炎作用方面已有报道，但是单独应用莫诺苷和马钱苷是否会对RAW 264.7的增殖产生影响未见报道。MTT检测莫诺苷和马钱苷处理对RAW 264.7增殖的影响。实验结果如图6，A.莫诺苷浓度梯度处理RAW 264.7不同时间(12h、24h、48h)后对于细胞增殖的影响。B.马钱苷浓度梯度处理RAW 264.7不同时间(12h、24h、48h)后对于细胞增殖的影响。莫诺苷和马钱苷10μM、100μM、200μM作用于RAW 264.7细胞12小时和24小时，并未表现出对细胞具有杀伤作用，反而可以促进细胞的增殖；在48小时，各浓度的莫诺苷对细胞的增殖无明显影响，而马钱苷在10μM时可以促进细胞的RAW 264.7增殖。

1.3.2.2不同浓度的LPS刺激RAW 264.7细胞产生炎症相关因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA相对表达量的差异

RAW 264.7作为一种免疫细胞，不同于正常的肺泡Ⅱ型细胞，低浓度的LPS刺激即可促进促炎因子表达量的剧烈变化。根据文献资料，做了LPS 1μg/mL以下的浓度梯度来确定造模的最佳作用浓度。将细胞分为6组：Control组，LPS 50ng/mL组、LPS 100ng/mL组、LPS200ng/mL组、LPS 500ng/mL组、LPS 1μg/mL组。当细胞长至合适浓度，按照标记好的分组，各孔加入含有相应LPS浓度的完全培养基后继续培养12小时，收集细胞，q-PCR检测促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达情况。结果如图7所示，在相对较低的LPS浓度刺激下，RAW 264.7中促炎因子mRNA的表达明显上调。其中，A.IL-6mRNA的表达在不同浓度LPS的刺激下均有所上调(与Control组比较，***P＜0.005，****P＜0.0001)，在100ng/mL之后的浓度具有浓度依赖性；B.IL-1βmRNA的表达在不同浓度LPS的刺激下上调(与Control组比较，**P＜0.01，****P＜0.0001)，C.TNF-αmRNA的表达在LPS的刺激下上调(与Control组比较，****P＜0.0001)，在1μg/mL浓度范围内上调倍数并无明显差别。

1.3.2.3环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷可以抑制LPS刺激RAW 264.7导致的IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达

在RAW 264.7加入LPS处理前分别先加入环烯醚萜苷类化合物莫诺苷和马钱苷来验证莫诺苷和马钱苷可以对LPS引起的细胞炎症反应起到保护作用。与大鼠肺泡Ⅱ型细胞不同的是，作用于RAW 264.7的LPS浓度为500ng/mL，时间为12小时；马钱苷的处理浓度和时间为：25μM，24小时；莫诺苷处理浓度和时间和RLE-6TN相同，为10μM，24小时。结果如图8所示：单独使用莫诺苷和马钱苷可以抑制LPS刺激RAW 264.7导致的IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达量上升。在图8中，A.莫诺苷预处理后促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达下调；B.马钱苷处理后促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达下调。

1.3.2.4莫诺苷和马钱苷预处理RAW264.7细胞后对NF-κB/Stat3信号通路相关蛋白表达的影响

前面的实验检测了莫诺苷和马钱苷细胞模型对大鼠肺泡Ⅱ型细胞肺损伤模型信号通路蛋白的变化，同样，我们对RAW 264.7细胞做相似的分组和处理。结果如图9所示，加入环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷后可以减少LPS刺激引起的p-p65和stat3的蛋白表达上调。

综上，通过利用LPS诱导RLE-6TN和RAW 264.7的急性肺损伤细胞模型，可以初步确定，环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷通过减少炎症因子的产生，可以减轻肺部细胞及组织的进一步损伤；p-p65和Stat3蛋白表达的变化表明，莫诺苷和马钱苷对炎症反应的抑制作用可能是通过NF-κB/Stat3信号通路来调控的。

1.4动物实验

急性肺损伤动物实验分两批进行，第一批使用莫诺苷(180mg/kg)对急性肺损伤小鼠进行预保护，第二批使用马钱苷(150mg/kg)对急性肺损伤小鼠进行预防护。实验数据同样分两批进行处理，所以下文有关急性肺损伤动物模型实验结果如无特殊备注，A组均表示莫诺苷预防护的第一批小鼠，B组表示马钱苷预防护的第二批小鼠。

1.4.1小鼠的一般情况

Control组小鼠毛发正常，活动自如，进食正常，口、鼻、眼、肛门正常，未见异常分泌物。LPS组和Morroniside+LPS组或者Loganin+LPS组小鼠毛发不荣，不思进食，懒动、眼部及肛门可见大量分泌物阻塞，但Morroniside+LPS组或者Loganin+LPS组可以观察到至处死前其状态有所恢复，活动量增加。体重变化可以一定程度反应小鼠的进食量、活动度等基本情况。由于造模12小时后开始取材，其体重变化不明显，统计了小鼠的体重变化以及其体重变化率，结果如图10所示：LPS组与Control组比较，体重下降率(体重下降克数/造模前体重克数)明显增高(****P＜0.0001，n＝8),LPS组与Morroniside+LPS组或Loganin+LPS组比较，体重下降率无明显差别。Control组小鼠的体重变化最小，其体重变化率在5％以下；LPS组的体重下降率和Morroniside+LPS组或者Loganin+LPS组的体重下降率在15％左右。

1.4.2小鼠肺组织HE染色

如图11(A为莫诺苷，B为马钱苷)所示：Control组小鼠，肺泡细胞结构清晰，肺泡内及肺泡间质无炎性细胞的浸润。LPS组小鼠肺泡及肺泡间质可见大量炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚。莫诺苷组和马钱苷组较LPS组肺泡及间质炎性细胞浸润明显减少，肺泡间隔增厚也有所减轻。可以得出结论，环烯醚萜类化合物可以减轻LPS造成的小鼠急性肺损伤炎性细胞的渗出以及细胞结构的破坏。

1.4.3小鼠肺组织湿/干比(W/D)

急性肺损伤时会造成肺内组织液的生成和回流失去平衡肺水肿，积聚在肺泡和肺间质内，导致通气与换气功能障碍，出现呼吸困难。我们用肺组织的湿重与干重的比值来代表肺水肿的程度，结果如表9和表10所示：莫诺苷和马钱苷可以缓解LPS腹腔注射诱导的小鼠急性肺损伤造成的肺水肿。

表9.小鼠肺组织湿/干质量的比值

表10.肺组织湿/干质量的比值

由表9和表10可知，与Control组相比，LPS组肺组织W/D的值增高，说明LPS处理后小鼠肺组织有积液产生；莫诺苷或者马钱苷处理与LPS组相比较，W/D的比值有所降低。**P＜0.01vs Control组，*P＜0.05vs LPS组，Mean±SD，n＝8。

1.4.4小鼠肺组织抗氧化功能指标SOD、MDA的检测

1.4.4.1小鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性检测

超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于生物界的金属酶，能够催化生物体内超氧自由基发生歧化反应，清除细胞代谢或者损伤时产生的过量的超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，具有抗氧化、提高免疫力、抗炎、抗衰老等作用。SOD活力的高低可以间接反应机体清除氧自由基的能力。急性肺损伤作为一个复杂的病理生理过程，体内超氧化物歧化酶的活性在疾病的发生过程中也有非常重要的地位。我们实验结果表明(图12)：小鼠急性肺损伤时，SOD活性下降；给予急性肺损伤小鼠环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷预防护时，可以使小鼠体内的SOD活性含量增高，提高了小鼠清除氧自由基的能力。在图12中，A.Control组的SOD活性平均为26.83±0.7363(U/mg肺组织湿重)，n＝8；LPS组的SOD活性平均值为17.07±0.5678(U/mg肺组织湿重)，与Control组比较，LPS组SOD活性下降，***P＜0.005,n＝8；LPS+Morroniside组的SOD活性平均值为29.66±1.317(U/mg肺组织湿重)，与LPS组比较，LPS+Morroniside组SOD活性上升，###P＜0.005,n＝8。B.马钱苷预保护组数据，与莫诺苷预保护具有相同趋势(LPS vs Control，**P＜0.01；LPS+Loganin vs LPS，##P＜0.01，n＝8)。

1.4.4.2小鼠肺组织丙二醛(MDA)

当机体清除氧自由的能力下降时，过量的氧自由基作用于生物膜，引起脂质发生过氧化反应，产生脂质过氧化产物，导致体内细胞损伤及代谢功能障碍。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的重要产物，MDA的含量可以间接反应机体受到自由基攻击的严重程度。我们通过MDA试剂盒检测了MDA含量，结果如图13所示：莫诺苷和马钱苷减弱了氧自由基对肺组织的毒害作用。在图13中，A.LPS组小鼠肺组织MDA的含量比Control组高，**P＜0.01，n＝8。在造模前提前莫诺苷灌胃后，小鼠肺组织MDA的含量降低，##P＜0.01，n＝8。B.LPS组较Control组小鼠肺组织中MDA含量高(**P＜0.01)。与LPS组比较，LPS+Loganin组小鼠肺组织中MDA含量降低(#P＜0.05)。

1.4.5小鼠肺组织促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达变化

在小鼠急性肺损伤细胞模型中，检测到LPS刺激RLE-6TN细胞和RAW 264.7后促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达是上调的。但是肺组织是由肺泡Ⅰ型细胞、肺泡Ⅱ型细胞、肺泡巨噬细胞、肺泡毛细血管内皮细胞等细胞组成，比单一种类细胞发生的炎症反应要复杂很多，所以我们提取了肺组织中总的RNA，检测小鼠肺组织促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达情况。结果如图14所示：环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷可以减少小鼠急性肺损伤肺组织中促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA的表达。在图14中，A.在给予莫诺苷预保护实验组小鼠中，LPS组较Control组促炎因子IL-6mRNA、IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达升高(****P＜0.0001，n＝8)，LPS+Morroniside组比LPS组促炎因子表达量低(####P＜0.0001，n＝8)。B.在给与马钱苷预保护实验组小鼠中，与Control组相比，LPS组IL-6mRNA、TNF-αmRNA表达升高(**P＜0.01，n＝8)、IL-1βmRNA表达同样升高(****P＜0.0001，n＝8)。LPS+Loganin组与LPS组相比，IL-6mRNA、IL-1βmRNA表达减少(##P＜0.01，n＝8)、TNF-αmRNA表达同样呈现出下降趋势(#P＜0.05，n＝8)。

1.4.6小鼠肺组织中NF-κB/Stat3信号通路相关蛋白表达情况

急性肺损伤是复杂的病理生理过程，是全身炎性反应综合征与代偿性抗炎反应综合征失衡的结果，我们检测了比较经典的炎症信号通路中相关蛋白的表达，并试图了解环烯醚萜类化合物莫诺苷和马钱苷对急性肺损伤有预防护作用的机制，结果如图15所示：莫诺苷和马钱苷可以下调NF-κB/Stat3信号通路中p-p65和p-stat3蛋白的表达。

从细胞模型和小鼠急性肺损伤模型，可以得出初步结论：环烯醚萜类化合物可以通过减少炎症介质的释放以及抗氧化作用对急性肺损伤有一定的预防和治疗作用。但对于慢性炎症、药物毒性作用、放化疗等原因造成的肺纤维化甚至特发性肺纤维化是否具有防护作用，我们通过用博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型来做了一系列研究，对马钱苷和莫诺苷对于小鼠肺纤维化的作用进行了初步探索。

1.4.7小鼠肺纤维化模型中体重变化

造模周期为8周，每周称量并记录小鼠体重，小鼠体重如下图所示：对照组(Control组)小鼠体重呈现稳步增长趋势，腹腔注射博莱霉素组(BLM组)小鼠体重增长较缓慢，而不同浓度环烯醚萜类化合物马钱苷和莫诺苷治疗组，其增长速度介于Control组和BLM组之间。同时，我们统计了在第八周末各组小鼠体重增长率，结果如图16所示：BLM组小鼠体重增长率最低。在图16中，A.为每周小鼠体重的增长趋势图，B.为体重增长率统计图，对照组和治疗组与BLM组比较，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001。

1.4.8肺纤维化小鼠肺组织HE染色和Masson染色

Masson染色是用于显示组织中纤维的染色方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。对不同实验组小鼠的肺组织切片，我们进行了HE染色和Masson染色，结果如图17所示，其中，A.HE染色；B.Masson染色。BLM组小鼠肺泡结构受损，肺间质增厚，肺泡内及其间质内炎症细胞浸润明显，呈蓝色的胶原纤维含量也增多，而马钱苷或莫诺苷预先干预的小鼠，其肺泡结构以及肺间质炎症浸润情况明显好转，胶原纤维含量较BLM组也降低。

1.4.9肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)是胶原组织的主要成分，通过测定组织中的HYP的含量，可以判断纤维化的程度，我们测定了不同组小鼠肺组织HYP的含量，结果如图18所示：与Control组相比，BLM组小鼠HYP的含量有所升高(****P＜0.0001，n＝8)，药物治疗组的HYP含量较BLM组呈现下降趋势。结果表明，马钱苷和莫诺苷可以降低博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化所致的HYP含量增高，在一定程度上缓解了小鼠肺纤维化进程。

马钱苷和莫诺苷可以提高肺纤维化小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞比值

在机体正常的免疫系统中，T淋巴细胞亚群是一类很重要的细胞亚群。CD4⁺T细胞识别抗原肽后分化为辅助T细胞(helper T cell,Th)，分泌细胞因子调节细胞免疫和体液免疫。CD8⁺T细胞活化后分化成细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte),可以特异性识别内源性抗原肽-MHCⅠ类分子，杀伤靶细胞。CD4⁺/CD8⁺T细胞在正常情况下维持着合适的比例，CD4⁺/CD8⁺T细胞的比例降低导致免疫系统出现损害并出现相应的病理变化。从实验结果(图19)得知：与Control组相比，BLM组小鼠CD4⁺/CD8⁺T细胞比值下降，而使用马钱苷和莫诺苷预防护组小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞比值均有所提高。在图19中，不同处理组小鼠外周血中CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化，其中，A.Control组与BLM组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞的表达，B.不同浓度Loganin组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺的表达，C.不同浓度Morroniside组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺的表达，D.不同处理组小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺T细胞比值变化统计图(分别与BLM组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005，n＝8)。

1.4.10马钱苷和莫诺苷可以降低纤维化小鼠肺组织TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA、CollagenⅠmRNA表达

在肺纤维化的过程中，转化生长因子-β1(TGF-β1)具有非常重要的作用^[42]，可以导致肌成纤维细胞的异常活化，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖等细胞外基质成分的过量产生，造成肺组织结构重塑和肺功能受损。从HE和Masson的实验结果可以得知，环烯醚萜类化合物马钱苷和莫诺苷可以缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，但是具体作用机制和作用途径目前尚未得知，于是检测了纤维化相关基因TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA以及CollagenⅠmRNA表达情况，结果如图20所示：在博莱霉素组小鼠中，TGF-β1mRNA、α-SMA mRNA和CollagenⅠmRNA的表达量均上升，给予药物治疗组三者的表达呈现下降趋势，且具有一定的浓度依赖性。在图20中，A.空白对照组和马钱苷及莫诺苷治疗组的TGF-β1mRNA的表达均低于BLM组，且****P＜0.0001(图中未标注)。B-C.空白对照组和马钱苷及莫诺苷治疗组的α-SMA mRNA和CollagenⅠmRNA的表达均低于BLM组，**P＜0.01，***P＜0.005，****P＜0.0001,n＝8。

1.4.11马钱苷和莫诺苷可以降低肺纤维化小鼠肺组织中α-SMA蛋白的表达

同样，在本次研究中还检测了α-SMA蛋白在不同处理组小鼠中的表达(图21.A-C左)，并做了灰度分析(图21.A-C右)。首先，我们检测了Control组和BLM组小鼠中α-SMA蛋白的表达，结果如图21A所示：BLM组小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达呈现上调趋势，佐证我们建立了有效的小鼠肺纤维化模型。其次，我们检测了不同浓度Loganin组和Morroniside组中α-SMA蛋白的表达，结果如图21B-C所示：从低浓度到高浓度马钱苷组，α-SMA的表达呈现下降趋势，即马钱苷对肺纤维化小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达调控呈现出浓度依赖趋势；莫诺苷对肺纤维小鼠肺组织中α-SMA蛋白表达也呈现出一定的浓度依赖趋势，低浓度组(Morroniside 100mg/kg)中α-SMA蛋白表达比中浓度组(Morroniside 100mg/kg)和高浓度组(Morroniside 200mg/kg)高，中浓度组和高浓度组α-SMA蛋白的表达无差别。以上结果提示马钱苷和莫诺苷可能是通过下调TGF-β1相关信号通路中蛋白(如α-SMA)的表达从而对小鼠肺纤维化具有一定的防护作用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.环烯醚萜类化合物在制备急性肺损伤或肺纤维化治疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环烯醚萜类化合物为马钱苷或莫诺苷。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，急性肺损伤包括严重阶段的急性呼吸窘迫综合征。

4.一种急性肺损伤或肺纤维化治疗药物，其特征在于，其有效成分为环烯醚萜类化合物。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述环烯醚萜类化合物为马钱苷或莫诺苷。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，急性肺损伤包括严重阶段的急性呼吸窘迫综合征。