CN116036091A - 巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为vista激动剂的医药用途及其药物组合物 - Google Patents

巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为vista激动剂的医药用途及其药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为VISTA激动剂的医药用途及其药物组合物，本发明首次提出了巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸可以用于治疗自身免疫性疾病，尤其是红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病，其可以用于制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物。本发明提供了巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为免疫检查点VISTA的激动剂的应用，具体涉及巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸可以激动免疫检查点VISTA从而发挥治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病的用途。

Description

巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为VISTA激动剂的医药用途及其药物组合物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸作为VISTA激动剂的医药用途及其药物组合物。
背景技术
T细胞活化抑制物免疫球蛋白可变区结构域(VISTA，V domain immunoglobulinsuppressor of T-cell activation)是B7家族的免疫检查点蛋白，在调节外周耐受，自身免疫，炎症和调节方面起着多方面的作用。
VISTA对T细胞、树突细胞、巨噬细胞和TCRγδT细胞有抑制作用，在多种自身免疫性疾病中负向调节免疫功能。陈列平等发现VISTA在人类系统性红斑狼疮(Systemic lupuserythematosus,SLE)、盘状红斑性狼疮(Discoid lupus erythematosus,DLE)病变及狼疮小鼠模型(MRL/lpr小鼠)皮损区的免疫细胞中均有高表达，发现VISTA是狼疮发生发展的关键因素，激活VISTA可以有效治疗全身性和皮肤性狼疮。(Sci Transl Med.2019,11:522-536)。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中，应用VISTA阻断抗体(13F3)显著加速疾病进展，加重疾病严重程度(J Exp Med.2011，208:577-592)。在耳部炎症模型中，VISTA通过CD4+T细胞发挥抑制免疫功能的作用，VISTA可以调节IL-23/IL-17炎症轴，对银屑病的发展具有重要的作用(Sci Rep.2017:1486)。2020年，本发明人的课题组报道了VISTA缺陷可以加重银屑病样皮肤炎症发生，并且T细胞和树突状细胞数量显著增加(Theranostics,2020,10:10483-10497)。在小鼠实验性哮喘模型中，VISTA缺失促进了嗜酸性粒细胞在肺部的大量积累，导致先天细胞因子(IL-6，MCP-1和TNF-α)和Th2细胞因子(IL-5和IL-13)等气道炎性细胞因子产生增加。用VISTA激动性单克隆抗体治疗可降低哮喘的严重程度，并减轻肺部炎症(CELL MOL IMMUNOL 2017,15(9))。在小鼠胶原抗体诱导的关节炎(collagenantibody induced arthritis,CAIA)模型中发现髓样细胞上VISTA的表达可诱导关节炎，VISTA敲除或用抗VISTA单克隆抗体(8G8)治疗后，小鼠关节损伤减轻(Arthritis Res The2017,19(1):270.)。因此，VISTA在先天免疫和适应性免疫中重要的负向调控作用使其在自身免疫性疾病和炎症反应中发挥着重要作用。
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，好发于育龄期女性，严重影响人们日常生活。临床表现可以累及全身各系统及组织器官，包括皮肤黏膜、关节肌肉、肾脏、血液、神经等[。SLE的发病机制现在还不完全清楚，大部分学者普遍认为本病具有遗传易感性，受环境、激素、免疫水平等多种因素影响。若治疗不及时，或可造成组织器官的不可逆性损伤，严重者可致患者死亡，目前临床尚不能根治本病，最大程度的减少疾病对各器官系统的损害，延缓病情迅速进展，有效改善预期后果，防止疾病反复发作，是广大学者一直以来追求的目标。目前主要治疗包括糖皮质激素、免疫抑制剂和抗疟药等，长期服用副作用明显，常困扰人们生活。因此，需要开发新型治疗SLE的药物，以满足社会需求。
哮喘(asthma)是一种慢性支气管炎性疾病，过敏性哮喘是哮喘的最常见形式，过敏性哮喘是一种由遗传因素与环境抗原相互作用所致的气道炎症性疾病。其临床特征包括喘息、气短、胸闷和咳嗽；病理特征包括肺嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞化生、增生、上皮粘蛋白增加、气道高反应性和血清过敏原特异性IgE浓度升高。目前治疗哮喘的药物主要是β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂和吸入皮质类固醇。然而，短效β2激动剂并不能降低发作的风险，成人和儿童对吸入皮质类固醇的依从性非常差。因此，近十几年来，科学家致力于开发一些针对于哮喘相关细胞因子的单克隆抗体以及研究新的靶点。
银屑病俗称牛皮癣，是皮肤科常见的以红斑，鳞屑为主要表现的慢性炎症性自身免疫性疾病，全球患病率2％-3％。本病病程长，难治易复发，严重影响患者的生活质量。银屑病的发病机制涉及遗传、环境和免疫因素。发病过程中会出现表皮细胞过度增殖、伴角质化不全及真皮淋巴细胞浸润等病理现象。
巴洛沙韦酯(Baloxavir marboxil)，是流感病毒聚合酶复合物聚合酶酸性(PA)蛋白亚基的一类小分子抑制剂。口服给药后，巴洛沙韦酯被代谢为活性形式巴洛沙韦酸(Baloxavir acid)；因此巴洛沙韦酯是巴洛沙韦的前药。巴洛沙韦通过抑制PA蛋白的帽依赖性核酸内切酶活性来阻止流感病毒复制。在临床前体外研究中，巴洛沙韦酯抑制了病毒RNA转录和复制。巴洛沙韦酯对甲型和乙型流感病毒有效，包括奥司他韦耐药株和禽流感病毒株(H7N9、H5N1)。现已获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，用于治疗出现症状不超过48小时的12岁及以上患者的急性无并发症流感。
Figure BDA0004109301140000021
迄今为止，无任何文献报道巴洛沙韦酯通过VISTA这个靶点对红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病的效应。
发明内容
发明目的：为解决目前临床上缺乏有效的治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病的药物这一问题，本发明提供了巴洛沙韦酯作为VISTA激动剂在预防或治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病中的一种新用途。
本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾的药物组合物。
技术方案：为了实现以上技术目的，本发明提供巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐在制备VISTA激动剂中的用途。
本发明巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐作为VISTA激动剂在制备预防或治疗由VISTA介导的疾病的药物中的用途。
其中，所述由VISTA介导的疾病为自身免疫性疾病。
本发明所述巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
其中，所述自身免疫性疾病包括红斑狼疮、哮喘、银屑病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎或类风湿性关节炎。
其中，所述自身免疫性疾病为红斑狼疮、哮喘或者银屑病。
进一步地，所述红斑狼疮包括：皮肤型红斑狼疮(颊部红斑、大疱性狼疮、丘疹样皮疹以及光过敏样狼疮、银屑病样皮疹和环状多形样皮疹样、疣状红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、深在性红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、盘状狼疮、红斑狼疮与扁平苔藓重叠综合征)、系统性红斑狼疮(盘状红斑、口鼻部溃疡、抗磷脂综合征、雷诺现象、脱发、溶血性贫血、狼疮性肾炎、狼疮性的神经性的病变、狼疮性关节炎、心包炎以及胸膜炎)或者药物诱导性红斑狼疮；所述哮喘包括：过敏性哮喘、非过敏性哮喘、晚发性哮喘、有固定气流限制的哮喘、重症哮喘、难治性哮喘或者肥胖哮喘；所述银屑病为斑块状银屑病、泛发性脓疱型银屑病、红皮病型牛皮癣或者银屑病关节炎。
本发明所述药物组合物在制备预防或治疗自身免疫性疾病中的用途，所述药物组合物其含有巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体。
其中，所述自身免疫性疾病包括红斑狼疮、哮喘、银屑病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎或类风湿性关节炎。
其中，所述的药物组合物的剂型是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明首先通过表面等离子共振(SPR)技术初步筛选出selleck化合物库中与人VISTA蛋白的亲和能力较好的化合物，接着通过细胞水平实验首次发现巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸与其体内活性代谢物巴洛沙韦酸均可显著地与VISTA蛋白结合，并激动其下游信号通路，进而抑制IFN-γ、TNF-α和IL-2等炎症因子的释放。因此，巴洛沙韦酯可用于制备VISTA激动剂。
对于所述的系统性红斑狼疮，本发明采用cGVHD样的系统性红斑狼疮小鼠为实验对象。在小鼠动物实验水平，巴洛沙韦酯的给药量为50mg/kg，所述化合物可通过商业化途径购买。本发明人发现，巴洛沙韦酯有效降低了狼疮小鼠尿蛋白、外周血中尿素氮、肌酐以及抗dsDNA抗体、肾脏中炎症因子IL-6/MCP-1/TNF-α/TGF-β/IL-1β、肾脏中免疫复合物IgG的沉积，并减轻了狼疮小鼠肾脏病理损害；对于所述的哮喘，本发明通过卵清蛋白(OVA)诱导Balb/c小鼠建立哮喘模型，在小鼠动物实验水平，巴洛沙韦酯的给药量为50mg/kg，所述化合物可通过商业化途径购买。本发明人发现，巴洛沙韦酯可以降低小鼠血清中IgE含量，能够改善小鼠肺部炎性细胞浸润，减少肺部粘液与杯状细胞增生，减少支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-4分泌；对于所述的银屑病，本发明采用咪喹莫特诱导的银屑病小鼠为实验对象。在小鼠动物实验水平，巴洛沙韦酯的给药量为50mg/kg，所述化合物可通过商业途径购买。本发明人发现，巴洛沙韦酯有效降低了银屑病小鼠耳厚度以及皮肤和耳朵损伤程度。同时，口服给药后，巴洛沙韦酯被代谢为活性形式巴洛沙韦酸(Baloxavir acid)(Clin Drug Investig,2018,38(12):1189-1196)本发明证明巴洛沙韦酸同样可以作为靶向VISTA的激动剂，用于各类自身免疫性疾病的治疗
有益效果：与现有技术相比，巴洛沙韦酯能够有效改善狼疮小鼠病情，具体表现如下：(1)巴洛沙韦酯处理后狼疮小鼠尿蛋白水平明显下降；(2)巴洛沙韦酯能够降低狼疮小鼠外周血中尿素氮、肌酐以及抗dsDNA抗体水平；(3)用巴洛沙韦酯进行干预后，狼疮小鼠肾脏病理损害明显减轻、肾脏中炎症因子IL-6/MCP-1/TNF-α/TGF-β/KIM-1以及免疫复合物IgG沉积也同样减少。同时巴洛沙韦酯能够有效改善哮喘小鼠病情，具体表现如下：(1)巴洛沙韦酯可以在动物水平降低小鼠血清中IgE含量；(2)巴洛沙韦酯能够改善小鼠肺部炎性细胞浸润，减少肺部粘液与杯状细胞增生；(3)减少支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-4分泌。在另外一方面，巴洛沙韦酯能够有效改善银屑病小鼠病情，具体表现如下：巴洛沙韦酯处理后银屑病小鼠耳厚度、皮肤和耳朵损伤程度降低。
本发明首次提供了巴洛沙韦酯(Baloxavir marboxil)作为免疫检查点VISTA激动剂的应用，具体涉及巴洛沙韦酯可以激动免疫检查点VISTA，从而发挥治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病的用途。此外，巴洛沙韦酯是一种已经应用于临床的抗病毒药物，其安全性以及毒副作用已经过临床考验，本发明通过体内外实验已经验证其可以作为VISTA激动剂治疗或预防红斑狼疮、哮喘以及银屑病的进展，从而加速药物的临床研究，推动临床用药，以解决现有系统性红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病治疗药物匮乏、副作用大、价格昂贵的问题。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次提供了巴洛沙韦酯(Baloxavir marboxil)或者巴洛沙韦酸(Baloxavir acid)作为免疫检查点VISTA激动剂的应用，具体涉及巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸可以激动免疫检查点VISTA，从而发挥治疗红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病的用途。此外，巴洛沙韦酯是一种已经应用于临床的抗病毒药物，其安全性以及毒副作用已经过临床考验，本发明通过体内外实验已经验证其可以作为VISTA激动剂治疗或预防红斑狼疮、哮喘以及银屑病的进展，从而加速药物的临床研究，推动临床用药，以解决现有系统性红斑狼疮、哮喘以及银屑病等自身免疫性疾病治疗药物匮乏、副作用大、价格昂贵的问题。
本发明首次提出巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，包括红斑狼疮、哮喘和银屑病。本发明通过体内实验能够有效改善狼疮小鼠病情，具体表现如下：(1)巴洛沙韦酯处理后狼疮小鼠尿蛋白水平明显下降；(2)巴洛沙韦酯能够降低狼疮小鼠外周血中尿素氮、肌酐以及抗dsDNA抗体水平；(3)用巴洛沙韦酯进行干预后，狼疮小鼠肾脏病理损害明显减轻、肾脏中炎症因子IL-6/MCP-1/TNF-α/TGF-β/KIM-1以及免疫复合物IgG沉积也同样减少。同时巴洛沙韦酯能够有效改善哮喘小鼠病情，具体表现如下：(1)巴洛沙韦酯可以在动物水平降低小鼠血清中IgE含量；(2)巴洛沙韦酯能够改善小鼠肺部炎性细胞浸润，减少肺部粘液与杯状细胞增生；(3)减少支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-4分泌。在另外一方面，巴洛沙韦酯能够有效改善银屑病小鼠病情，具体表现如下：巴洛沙韦酯处理后银屑病小鼠耳厚度、皮肤和耳朵损伤程度降低。
所以，本发明首次发现巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐可以作为靶向免疫检查点VISTA激动剂，能高效、特异性激活VISTA，因而可用于制备在制备预防或治疗由VISTA介导的疾病的药物中的用途。附图说明
图1为表面等离子共振(SPR)中VISTA蛋白的pH预富集以及蛋白偶联量结果；
图2为表面等离子共振(SPR)检测化合物巴洛沙韦酯与人VISTA蛋白亲和力测试结果；
图3为CCK-8评价化合物巴洛沙韦酯对Jurkat以及PBMC细胞的毒性的效应图；
图4为人VISTA蛋白抑制Jurkat细胞IL-2分泌的效应图；
图5为化合物巴洛沙韦酯影响人VISTA蛋白对Jurkat细胞IL-2分泌的影响图；
图6为人VISTA蛋白抑制PBMC细胞上清中IFN-γ、TNF-α以及IL-2分泌的效应图；
图7为化合物巴洛沙韦酯影响人VISTA蛋白对PBMC细胞上清中IFN-γ、TNF-α以及IL-2分泌的影响图；
图8为CFSE实验建立human VISTA蛋白的PBMC激动模型效应图；
图9为CFSE检测化合物巴洛沙韦酯对PBMC细胞的增殖影响效果图；
图10为化合物巴洛沙韦酯对Jurkat-EV/FL细胞IL-2的抑制率的影响的效果图；
图11为从野生型(wild type,WT)和VISTA敲除(knockout，KO)小鼠脾脏中提取出CD4+T细胞纯度的效果图；
图12为化合物巴洛沙韦酯对野生型(wild type,WT)和VISTA敲除(knockout,KO)小鼠CD4+T细胞IL-2的抑制率的影响；
图13为表面等离子共振(SPR)检测化合物巴洛沙韦酸与人VISTA蛋白亲和力测试结果；
图14为CCK-8评价化合物巴洛沙韦酸对Jurkat以及PBMC细胞的毒性的效应图；
图15为化合物巴洛沙韦酸影响人VISTA蛋白对Jurkat细胞IL-2分泌的影响图；
图16为化合物巴洛沙韦酸影响人VISTA蛋白对PBMC细胞上清中IFN-γ、TNF-α以及IL-2分泌的影响图；CFSE检测化合物巴洛沙韦酸对PBMC细胞的增殖影响效果；
图17为化合物巴洛沙韦酸对Jurkat-EV/FL细胞IL-2的抑制率的影响的效果图；
图18为化合物巴洛沙韦酸对野生型(wild type,WT)和VISTA敲除(knockout,KO)小鼠CD4+T细胞IL-2的抑制率的影响；
图19为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠血清中anti-dsDNA抗体、尿素氮以及肌酐水平影响图；
图20为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠尿液中尿蛋白含量水平影响图；
图21为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠脾脏重量的影响图；
图22为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β以及KIM-1的mRNA水平影响图；
图23为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠肾脏的HE染色图；
图24为化合物巴洛沙韦酯对cGVHD样SLE小鼠肾脏免疫复合物沉积的影响效果图；
图25为HE染色观察巴洛沙韦酯对哮喘小鼠肺组织病理学改变；
图26为PAS染色观察巴洛沙韦酯对哮喘小鼠肺组织病理学改变；
图27为酶联免疫吸附实验检测巴洛沙韦酯对免疫球蛋白IgE水平的影响对比图；
图28为酶联免疫吸附实验检测巴洛沙韦酯对哮喘小鼠BALF中细胞因子水平的影响；其中(A)巴洛沙韦酯对BALF中IL-4分泌的影响图，(B)巴洛沙韦酯对BALF中IFN-γ分泌的影响图，(C)巴洛沙韦酯对BALF中IL-10分泌的影响图；
图29为收集小鼠肺组织，提取其总RNA后，用qRT-PCR方法测定IL-6，MCP-1，Arg-1和Ym-1mRNA的表达情况；其中(A)巴洛沙韦酯对肺组织中IL-6mRNA的影响图，(B)巴洛沙韦酯对肺组织中MCP-1mRNA的影响图，(C)巴洛沙韦酯对肺组织中Arg-1mRNA的影响图，(D)巴洛沙韦酯对肺组织中Ym1mRNA的影响图；
图30为收集小鼠肺组织，提取其总蛋白后，用蛋白质印迹法测定pSTAT3与STAT3表达情况；
图31化合物巴洛沙韦酯对银屑病模型小鼠耳厚度以及皮肤红肿程度评分的影响效果图；
图32为化合物巴洛沙韦酯对银屑病模型小鼠皮肤以及耳朵的HE染色图。
具体实施方式
下面通过实施例具体地说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下面通过实施例具体地说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
巴洛沙韦酯购买于上海sellcek公司,其CAS号为1985606-14-1。
巴洛沙韦酸购买于上海sellcek公司,其CAS号为1985605-59-1。
实施例1
表面等离子共振(SPR)初筛30个老药(selleck化合物库)与human VISTA蛋白的亲和力
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时，可引起金属自由电子的共振，由于共振致使电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。当表面等离子波和消逝波共振时检测到的反射光能量大幅度减弱，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角为共振角也就是SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。SPR实验将人VISTA蛋白(RD system,Cat#7126-B7)通过氨基偶联的方式固定至CM5芯片(GE Healthcare,Cat#BR-1005-30)上，使用BiacoreT200(GE Healthcare)仪器，25℃检测不同浓度的化合物流经CM5芯片表面的响应值。
①VISTA蛋白的pH预富集：实验中所用的芯片为CM5，人VISTA蛋白用醋酸钠pH4.5、5.0、5.5分别稀释到10μg/ml，各准备100μl流速为10μl/min，依次进样180s，50mM的氢氧化钠为洗脱液，1x PBS-P+(GE Healthcare,Cat#28-9950-84)为整个流路系统的缓冲溶液。通过预富集实验，确定PH＝5.0的条件为最佳偶联条件。故用pH＝5.0醋酸钠将VISTA蛋白稀释至10μg/ml，200μl进行正式的偶联操作，结果如图1。
②VISTA蛋白配体偶联：以最适pH＝5.0的醋酸钠溶液将人VISTA蛋白稀释至20μg/ml,通过氨基偶联的方式偶联至CM5芯片的Flow cell 2样品通道，其中Flow cell 1为空白通道作为背景扣除，设置VISTA蛋白最大目标偶联量为10000RU。1x PBS-P+为整个流路系统的缓冲溶液，将EDC与NHS以1:1比例混合后，注射入系统来活化芯片表面。VISTA蛋白以10μl/min流速，流经600s，与CMS芯片表面充分结合。最后注射乙醇胺至流路，封闭芯片表面的剩余酯基团。结果如图1所示，显示芯片表面的偶联最为10375RU。已达到目标偶联量，即蛋白偶联成功结果。
③溶剂校正：小分子样品的运行缓冲液选用含5％ DMSO(Sigma,Cat#d8418)的1xPBS-P+。按照如下表1混合4.5％和5.8％DMSO母液，配置5％DMSO浓度校正曲线。
表1运行缓冲液配方
序号 1 2 3 4 5 6 7 8
4.5％DMSO(μl) 0 100 200 300 400 500 600 700
5.8％DMSO(μl) 700 600 500 400 300 200 100 0
④亲和力测定：用1.05x PBS-P+稀释0.4mM的小分子母液20倍，得到20μM在5％DMSO中的小分子，20μM作为最高进样浓度。之后用配好的5％DMSO运行缓冲液将分析物浓度向下对半稀释至少5个浓度梯度(根据实际样品亲和力强弱进行浓度梯度调整)，并增加一个0浓度，作为空白对照。含5％DMSO的1x PBS-P+运行缓冲液以10μl/min的流速进样，设定样品结合时间与解离时间均为60s。通过Biacore T200 Evaluation软件进行检测和数据处理。实验结果表明(如图2和图13所示)，化合物巴洛沙韦酯和其活性代谢物巴洛沙韦酸与人VISTA蛋白结合能力较强。
实施例2
CCK-8评价化合物对PBMC以及Jurkat细胞的细胞毒性的效应
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)(Beyotime,Cat#C0038)，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。CCK-8试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
使用CCK-8试剂盒进行操作，首先将复苏的PBMC细胞(Allcells,Cat#PB003F-C-10M)的密度调整为1x106个/ml，Jurkat细胞的密度调整至2x105个/ml，以100μl/孔接种于96孔板中，同时每孔加入100μl的化合物处理细胞，每个浓度3个副孔，控制巴洛沙韦酯的终浓度为0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM，控制巴洛沙韦酸的终浓度为0.09765625μM，0.1953125μM，0.390625μM，0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、和6.25μM，细细胞在37℃培养箱中培养48h后，弃去培养基，每孔避光加入含10％CCK-8的新鲜培养基100μl，继续培养4小时，然后在微孔震荡仪上震摇5分钟，酶标仪读取450nm处的吸光度值。结果如图3所示化合物巴洛沙韦酯在0～50μM时没有毒性，如图14所示化合物巴洛沙韦酸在0～6.25μM时没有毒性。
实施例3
Jurkat T细胞激动模型的建立，用于鉴定化合物细胞活性
PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)作为佛波酯的一种和外源凝集素(Phytohemagglutinin，PHA)可联合激动Jurkat T细胞，刺激T细胞的增殖和白介素2的分泌。在细胞激活的同时，若体系中存在VISTA蛋白产生的抑制信号，则激动效果减弱。在细胞模型的构建过程中，同时给予激动剂与VISTA蛋白，通过分析细胞上清中细胞因子的分泌情况判断T细胞被活化的情况。
①Jurkat细胞激活实验
第一天：在96孔板中包被human VISTA蛋白溶液。使用PBS将human VISTA蛋白(RDsystem,Cat#7126-B7)分别稀释至5μg/ml、10μg/ml。每孔加入100μl蛋白溶液，4℃包被过夜。
第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。每孔加入100μlJurkat细胞(中国科学院细胞库)，每孔2x105个细胞。每孔再加入100μl PMA(Beyotime,Cat#S1819)与PHA(Sigma,Cat#L1668)的混合液，控制PMA的终浓度为1ng/ml，PHA的终浓度为6μg/ml。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48h后收集细胞上清用ELISA试剂盒(Biolegend,Cat#431804)检测IL-2的分泌量(组别设置如表2所示)。结果如图4所示，5μg/ml和10μg/ml的人VISTA蛋白均能抑制PMA-PHA诱导的Jurkat T细胞IL-2的分泌。
表2T细胞激活实验组别设置
Figure BDA0004109301140000081
②化合物活性检测实验
第一天：在96孔板中包被human VISTA蛋白溶液。使用PBS将human VISTA蛋白稀释至5μg/ml。每孔加入100μl蛋白溶液，4℃包被过夜。
第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μL。每孔先加入100μlJurkat的细胞，每孔2x105个细胞。化合物检测组加入100μl含有待测化合物的PMA与PHA的混合液，同时控制巴洛沙韦酯的终浓度为10μM、25μM和50μM。巴洛沙韦酸的终浓度为3.125μM和6.25μM。对照组加入100μl PMA与PHA的混合液。空白组加入100μL的完全培养基。组间控制PMA的终浓度为1ng/ml，PHA的终浓度为6μg/ml。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48h后收集细胞上清检测IL-2的分泌量(组别设置如表3所示)。结果如图5所示，化合物巴洛沙韦酯在5μM、20μM和50μM均能减少PMA-PHA诱导的Jurkat细胞IL-2分泌并且具有剂量依赖性，如图15所示，化合物巴洛沙韦酸在3.125μM和6.25μM均能减少PMA-PHA诱导的Jurkat细胞IL-2分泌并且具有剂量依赖性，表明化合物巴洛沙韦酯和巴洛沙韦酸促进了VISTA蛋白的抑制作用，是VISTA蛋白的激动剂。
表3化合物细胞活性实验组别设置
Figure BDA0004109301140000082
实施例4
PBMC细胞激动模型的建立，用于鉴定化合物细胞活性
Anti-CD3与T细胞上的T细胞受体(TCR)结合激活了TCR相关信号通路，而CD28是作为共刺激分子，与抗原呈递细胞(APC)的B7结合后可以加强TCR信号刺激，所以anti-CD28就是模拟APC的作用，与CD28结合后而强化TCR信号，进而刺激T细胞的增殖和细胞因子的分泌。在细胞激活的同时，若体系中存在人VISTA蛋白产生的抑制信号，则激动效果减弱。在细胞模型的构建过程中，同时给予激动剂与VISTA蛋白，通过分析细胞上清中细胞因子的分泌情况判断T细胞被活化的情况。
①PBMC细胞激活实验
第一天：在96孔板中用PBS包被空白组，激动组使用PBS将抗anti-human-CD-3抗体(Biolegend,Cat#317326)和anti-human-CD28抗体(Biolegend,Cat#302934)稀释至2.5μg/ml，抑制组保持anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体浓度不变，同时设置humanVISTA蛋白浓度为2.5μg/ml、
5μg/ml、10μg/ml；包被时每孔加入100μl蛋白混合溶液(蛋白均用PBS稀释)，4℃
包被18小时。
第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。对照组与空白组均加入100μl完全细胞培养基，37℃孵箱预处理30min。然后每孔加入100μl的已复苏的PBMC(Allcells,Cat#PB003F-C-10M)，每孔细胞1x105个(组别设置如表4所示)。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清用ELISA试剂盒(Biolegend)检测IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌量，结果如图6A、B和C所示。表明human VISTA蛋白浓度在2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml均能抑制Anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体诱导的PBMC细胞IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。
表4T细胞激活实验组别设置
Figure BDA0004109301140000091
②化合物活性检测实验
第一天：在96孔板中用PBS包被空白组，激动组使用PBS将anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体稀释至2.5μg/ml，抑制组以及化合物组保持anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体浓度不变，human VISTA蛋白浓度为2.5μg/ml包被时每孔加入100μl蛋白混合溶液，4℃包被18小时。
第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。化合物检测组每孔加入100μl待测化合物，同时控制巴洛沙韦酯的终浓度为10μM、
25μM和50μM。巴洛沙韦酸的终浓度为3.125μM和6.25μM。对照组与空白组均加入100μl完全细胞培养基，37℃孵箱预处理30min。然后每孔加入100μl的已复苏的PBMC(Allcells,Cat#PB003F-C-10M)细胞，每孔细胞1x105个(组别设置如表5所示)。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清用ELISA试剂盒(Biolegend)检测IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌量，结果如图7A、B和C所示。巴洛沙韦酯能减少anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体诱导的PBMC细胞IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌并且具有剂量依赖性，表明化合物巴洛沙韦酯促进了VISTA蛋白的抑制作用，是VISTA蛋白的激动剂。
如图16A、B和C所示。巴洛沙韦酸能减少anti-human-CD-3抗体和anti-human-CD28抗体诱导的PBMC细胞IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌并且具有剂量依赖性，表明化合物巴洛沙韦酸促进了VISTA蛋白的抑制作用，是VISTA蛋白的激动剂。
表5化合物细胞活性实验组别设置
Figure BDA0004109301140000092
Figure BDA0004109301140000101
实施例5
CFSE实验建立human VISTA蛋白的PBMC激动模型，用于鉴定化合物对PBMC细胞增殖的影响
荧光染料CFSE，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。CFSE进入活细胞后，可与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。
CFSE随着细胞分裂而平均分配至子代细胞中，而导致荧光强度逐级递减，依据这一特性，可通过流式细胞仪被用于检测细胞增殖活力。
①CFSE实验建立human VISTA蛋白的PBMC激动模型
第一天：在96孔板中用PBS包被空白组，激动组使用PBS将抗anti-human-CD-3抗体(Biolegend,Cat#317326)稀释至1μg/ml，抑制组保持anti-human-CD-3抗体浓度不变，设置human VISTA蛋白浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。蛋白均用PBS稀释，包被时每孔加入100μl蛋白混合溶液，4℃包被18小时(组别设置如表6所示)。
第二天：首先进行CFSE染料母液配制，取一支CFSE固体染料(5mM,Biolegend,Cat#423801)加入36μl的无水DMSO，配制母液浓度为5mM，溶解后混匀，进行分装，每管2μl，-20℃避光干燥保存，备用；接着进行细胞染色，取1μl的CFSE染料母液，加入PBS至1ml，配成终浓度为5μM的CFSE染料工作液。再取已复苏的PBMC,室温200x g，离心15分钟，弃上清。细胞中加入0.2ml的CFSE染料工作液，37℃避光孵育10分钟，室温200x g，离心15分钟，弃上清。沉淀用2ml新鲜的1640完全培养基重悬，室温避光孵育10分钟，计数后将细胞密度调整为1x106个/ml备用。弃去前一天板中的溶液，PBS洗两遍，然后每孔加入100μL CFSE染色的PBMC，再加入100μL的培养基，然后将其放入细胞培养箱中培养120小时。培养120小时后将样品收集于1.5mL离心管中，室温下800x g离心5分钟，弃上清；细胞用200μL流式细胞染色液重悬，室温800x g，离心5分钟，弃上清，重复洗涤两次。加入200μL流式染色液(PBS+2％FBS)重悬细胞后，使用BD C6流式细胞仪进行流式检测，FlowJo-v10进行数据处理。实验结果如图8所示，在2.5μg/mL、5μg/mL或10μg/mL的人VISTA蛋白都会对PBMC的增殖产生抑制作用
表6CFSE建立human VISTA蛋白的PBMC的激活实验组别设置
Figure BDA0004109301140000102
②化合物活性检测实验
第一天：在96孔板中用PBS包被空白组，激动组使用PBS将抗
anti-human-CD-3抗体(Biolegend,Cat#317326)稀释至1μg/ml，抑制组保持
anti-human-CD-3抗体浓度不变，设置human VISTA蛋白浓度为2.5μg/ml、5
μg/ml、10μg/ml。蛋白均用PBS稀释，包被时每孔加入100μl蛋白混合溶液，4℃包被18小时。
第二天：首先进行CFSE染料母液配制，取一支CFSE固体染料加入36μl的无水DMSO，配制母液浓度为5mM,溶解后混匀，进行分装，每管2μl，-20℃
避光干燥保存，备用；接着进行细胞染色，取1μl的CFSE染料母液，加入PBS至1ml，配成终浓度为5μM的CFSE染料工作液。再取已复苏的PBMC，室温200x g，离心15分钟，弃上清。细胞中加入0.2ml的CFSE染料工作液，37℃避光孵育10分钟，室温200xg，离心15分钟，弃上清。沉淀用2mL新鲜的1640完全培养基重悬，室温避光孵育10分钟，计数后将细胞密度调整为1x 106个/ml备用。弃去前一天板中的溶液，PBS洗两遍，每孔加入100μl指定浓度的化合物巴洛沙韦酯，同时控制化合物的终浓度为20μM和50μM，37℃孵育30分钟(组别设置如表7所示)。然后每孔加入100μl CFSE染色的PBMC,将其放入37℃细胞培养箱中培养120小时。培养120小时后将样品收集于1.5mL离心管中，室温下800x g离心5分钟，弃上清；细胞用200μl流式细胞染色液重悬，室温800x g，离心5分钟，弃上清，重复洗涤两次。加入200μL流式染色液重悬细胞后，使用BD C6流式细胞仪进行流式检测，FlowJo-v10进行数据处理。实验结果如图9和图16所示，巴洛沙韦酯和巴洛沙韦酸会加重2.5μg/mL的human VISTA蛋白对PBMC的增殖产生的抑制作用。表明巴洛沙韦酯和巴洛沙韦酸是VISTA的激动剂。
表7化合物细胞活性实验组别设置
Figure BDA0004109301140000111
实施例6
过表达VISTA全长的Jurkat细胞激动模型的建立，用于鉴定化合物的靶向性
首先通过慢病毒转染构建了Jurkart过表达VISTA全长(Jurkat-VISTA-FL)以及空载体(Jurkat-EV)细胞(Br J Pharmacol,2021,178:1445-1458)。首先将两种细胞密度调整为2x 10 5个/ml，并以100μl/孔接种于96孔板中，化合物检测组加入100μl含有待测化合物的PMA与PHA的混合液，同时控制巴洛沙韦酯的终浓度为10μM、25μM和50μM。巴洛沙韦酸的终浓度为1.5625μM，3.125μM和6.25μM。对照组加入100μl PMA与PHA的混合液。空白组加入100μl的完全培养基。组间控制PMA的终浓度为1ng/ml，PHA的终浓度为6μg/ml(组别设置如表8所示)。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48h后收集细胞上清检测化合物对Jurkat-VISTA-FL以及Jurkat-EV细胞IL-2的抑制率。实验结果如图10和图17所示，表明化合物巴洛沙韦酯和巴洛沙韦酸是靶向VISTA的激动剂。
表8化合物细胞靶向性实验组别设置
Figure BDA0004109301140000112
实施例7
化合物对BALB/c野生型(wild type,WT)和BALB/c VISTA敲除(knockout，KO)小鼠CD4+T细胞IL-2的抑制率的影响，用于鉴定化合物的靶向性
第一天：在96孔板中分别包被anti-mouse-CD-3抗体，激动组与化合物实验组anti-mouse-CD-3抗体浓度为2.5μg/ml，对照组不加anti-mouse-CD-3抗体，只加入等体积的PBS(组别设置如表9所示)。抗体用PBS稀释，包被时每孔加入100μl anti-mouse-CD-3溶液，4℃包被过夜。
第二天：首先使用EasySep小鼠CD4+T细胞分离试剂盒从BALB/C野生型(wildtype,WT，上海南方模式生物科技股份有有限公司)和BALB/C VISTA敲除(knockout，KO，上海南方模式生物科技股份有限公司)小鼠的脾脏中分离出总的小鼠CD4+T细胞。要求CD4+T细胞纯度达到90％以上时才可以用于实验，细胞纯度结果如图11所示。接着吸去孔中的包被anti-mouse-CD-3抗体，用PBS清洗2次，每孔200μl。再将提取出来的CD4+T细胞的密度调整为1x 106个/ml，并以100μl/孔接种于96孔板中，然后再将细胞放入37℃细胞培养箱内孵育30min后再加入化合物,控制化合物的终浓度为10μM,加入化合物后，再将96孔板放入37℃细胞培养箱内，72h后收取上清检测化合物对WT CD4+T以及VISTA KO的CD4+T细胞IL-2的抑制率，结果如图12和图18所示，表明化合物巴洛沙韦酯和巴洛沙韦酸是靶向VISTA的激动剂。
表9化合物细胞靶向性实验组别设置
Figure BDA0004109301140000121
实施例8
巴洛沙韦酯对cGVHD样系统性红斑狼疮的小鼠的治疗效应
①试验动物：选择购买自北京维通利华公司CB6F1小鼠以及BALA/c小鼠，雌性，日龄48-56天；于普通环境下饲养，自由摄食饮水。
②药物制备：巴洛沙韦酯给药剂量均为50mg/kg，溶解于0.5％羧甲基纤维素钠的水溶液中，并用环磷酰胺(CTX)作为阳性对照组，将CTX溶解于生理盐水中配制成25mg/kg的浓度。
③动物分组、造模和给药：将小鼠随机分为空白对照组(Control)、模型组(Model)以及化合物组。再将模型组以及化合物组的小鼠构建成cGVHD样狼疮小鼠模型。取6至8周BALB/c雌性小鼠和(C57BL/6J×BALB/c)F1杂交雌性鼠，在无菌条件下，取出BALB/c鼠脾脏、淋巴结(肠系膜、腹股沟、颈部)和胸腺，制备淋巴细胞悬液。调整细胞密度为1x108个/ml，每次200μl通过尾静脉注射到Fl代鼠体内，注射时间分别为1、4、7、10天。对照组注入生理盐水，诱导红斑狼疮模型。6周后，对照组以及模型组给予0.05％羧甲基纤维素钠的水溶液，化合物组给予化合物巴洛沙韦酯每日两次灌胃给药(50mg/kg)，给药周期为四周。
④血清anti-dsDNA抗体、尿素氮以及肌酐含量测定：用ELISA试剂盒测定各组小鼠血清中anti-dsDNA抗体；用尿素氮以及肌酐检测试剂盒(南京建成)去测量小鼠血清中尿素氮以及肌酐含量。结果如图19所示，模型组anti-dsDNA抗体、尿素氮以及肌酐水平均高于对照组，巴洛沙韦酯组anti-dsDNA抗体、尿素氮以及肌酐水平相对于模型组显著降低。
⑤尿蛋白含量测定：用尿蛋白检测试剂盒测定各组小鼠尿液中尿蛋白含量结果如图20所示，模型组尿蛋白高于对照组，巴洛沙韦酯组尿蛋白水平相对于模型组显著降低。
⑥脾脏重量测量：给药结束后，取小鼠脾脏并称重，如图所示21，模型组小鼠脾脏重量高于对照组，巴洛沙韦酯组脾脏重量水平相对于模型组均显著降低。
⑦RT-PCR：总RNA用TRIZOL试剂提取，mRNA用Prime Scrip RT Master Mix转录成cDNA。RT-PCR分析测量IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β以及KIM-1mRNA水平，结果如图22所示，模型组IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β以及KIM-1水平高于对照组，巴洛沙韦酯组IL-6、MCP-1、TNF-α、TGF-β以及KIM-1水平显著低于模型组。
⑧HE染色：小鼠给药结束后，取小鼠的肾脏并将其浸泡于4％多聚甲醛中，石蜡包埋；用苏木精和伊红染色(HE)，HE染色流程如下：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。脱水封片：切片依次放入无水乙醇I5min-无水乙醇II5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。HE结果如图23所示，结果表明模型组的肾脏损伤程度以及炎性细胞浸润程度大于对照组，且有显著性差异，巴洛沙韦酯组肾脏损伤程度以及炎性细胞浸润程度相对于模型组有显著改善。
⑨免疫荧光法检测肾脏免疫复合物的沉积情况：小鼠给药结束后，取小鼠的肾脏，将其制作冰冻切片,厚度为5-7μm，丙酮固定。用直接免疫荧光法检测肾脏组织IgG的沉积情况。首先取出冰冻切片，在室温下干燥30min，然后再用5％的BSA封闭1小时，接着再用PBST冲洗3次，每次5min；将切片与Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠IgG(1:1000)在4℃下孵育过夜，然后第二天用PBST冲洗3次，每次5min洗去未结合的山羊抗小鼠IgG，将切片用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10min，再用PBST冲洗，封片后在荧光倒置显微镜下观察。免疫荧光结果如图24所示，结果表明模型组肾脏肾小球以及系膜中具有大量的免疫复合物IgG的沉积，而巴洛沙韦酯组显著减轻了免疫复合物IgG的沉积。
⑩统计学处理：体重、尿蛋白等均采用graphpad prism软件进行数据处理，采用多样本均数比较的方差分析(One-WayANOVA)处理。
综上所述，化合物巴洛沙韦酯处理后，狼疮小鼠尿蛋白水平明显下降，外周血中尿素氮、肌酐以及抗dsDNA抗体水平液显著性降低，同时狼疮小鼠肾脏病理损害明显减轻、肾脏中炎症因子IL-6/MCP-1/TNF-α/TGF-β/KIM-1以及免疫复合物IgG沉积也同样减少。表明化合物巴洛沙韦酯在治疗狼疮性肾炎这类系统性红斑狼疮中具有显著效果。
实施例9
巴洛沙韦酯对OVA所诱导的小鼠哮喘模型的影响
①试验动物：选择购买自北京维通利华公司BALA/c小鼠，雌性，日龄48-56天；于普通环境下饲养，自由摄食饮水。
②药物制备：巴洛沙韦酯给药剂量均为50mg/kg，溶解于0.5％羧甲基纤维素钠的水溶液中，并用地塞米松(Dexamethasone)作为阳性对照组，将地塞米松溶解于生理盐水中配制成1mg/kg的浓度。
③动物分组、造模和给药：将小鼠随机分为正常对照组(Control)、模型组(Model)、巴洛沙韦酯(Baloxavir marboxil)组，地塞米松组(Dexamethasone)。除正常组外，其余各组制作小鼠哮喘模型，在实验的第0和5天,小鼠通过腹腔内注射0.2mL致敏液(包含20μg OVA和4mg氢氧化铝佐剂)进行致敏，正常组小鼠用生理盐水代替致敏液，注射方式、注射部位和剂量相同。第12～18天，将小鼠放入封闭的喷雾仪中用5％卵清蛋白溶液进行激发，激发时间为30min，正常组激发时以生理盐水代替激发溶液。第12天开始，连续7天，雾化前60min巴洛沙韦酯组小鼠灌胃给予0.2mL药物50mg/kg，雾化6小时后再次给予巴洛沙韦酯。地塞米松组小鼠腹腔注射给予0.2mL药物1mg/kg。正常组与模型组灌胃给予同剂量的0.5％CMC-Na。最后一次激发24小时后处死小鼠，研究巴洛沙韦酯的治疗哮喘作用。
④收集血液和肺泡灌洗液
激发后24小时后，小鼠称重，眼球取血处死小鼠，室温静置2h后于4度3000转离心15分钟，提取血清，分装放入-80℃保存。用于测定IgE。用75％酒精棉球对胸腹腔进行消毒，暴露胸腔，从小鼠腹部中间剪开，沿着中间一直剪剪到颈部，用细线将右肺结扎管道，小心分离颈部组织，分离气管周围组织，用镊子穿过气管下面，用1ml注射器缓慢注入预冷生理盐水溶液轻灌洗肺共3次，静置30s反复回抽3次,缓慢回抽，将灌洗液收集于1.5mlEP管内。收集肺泡灌洗液。灌洗液置冰上。将灌洗液置于4℃离心机离心，样品以4℃,1200r/min,离心7分钟。离心后上清液分装后置-80℃冰箱保存，用于测定细胞因子IL-4,IL-10和IFN-γ。
⑤肺组织病理切片制作
肺泡灌洗后，剪取右肺上叶放入多聚甲醛固定液中，行HE与PAS染色。HE染色流程如下：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。脱水封片：切片依次放入无水乙醇I5min-无水乙醇II5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
PAS染色流程如下：石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗；切片入PAS染色液B中染色10-15min，自来水洗，蒸馏水洗两遍；切片入PAS染色液A浸染25-30min，避光，流水冲洗5min；切片入PAS染色液C染30S，自来水洗，盐酸水溶液分化，自来水洗，氨水返蓝，流水冲洗；脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲苯5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。由图25可知，肺组织HE染色结果显示，对照组表现为支气管、肺泡结构清晰，支气管壁无增厚水肿，支气管周围无炎症浸润情况；哮喘模型组表现为肺泡结构破损，支气管壁增厚明显，出现水肿，支气管狭窄，周围大量炎症细胞浸润,以嗜酸性粒细胞为主；地塞米松组组表现为支气管、肺泡偶有破损空洞现象，支气管壁增厚水肿的状况和炎症浸润情况较模型组减轻；巴洛沙韦酯组表现为支气管、肺泡破损现象减轻，支气管壁增厚水肿状况较模型组显著减轻，气道狭窄、炎症浸润情况得到有效改善。由图26可知，肺组织PAS染色结果显示，对照组表现为无杯状细胞增生与粘液产生，模型组表现为有大量杯状细胞增生与粘液产生，地塞米松组有较少杯状细胞增生与粘液产生，巴洛沙韦酯组有少量杯状细胞增生与粘液产生。
⑥酶联免疫吸附实验检测IgE、IL-4、IFN-γ和IL-10
根据Biolegend公司ELISA试剂盒说明书检测各组小鼠血清中免疫球蛋白Ig-E和支气管肺泡灌洗液中的IL-4、IFN-γ和IL-10表达。具体实验步骤如下：第一天100μL稀释捕获抗体4℃包被板孵育过夜；第二天洗涤4次后加入200μL封闭液孵化1小时，洗板4次后加入100μL待测样品或者不同浓度的标准品，37℃条件下孵育120min。洗板4次，加入100μL生物素化抗体工作液，37℃条件下孵育60min。洗板5次，加入100μL酶结合物工作液，37℃条件下避光孵育30min。洗板5次，加入100μL显色底物，37℃条件下避光孵育15-20min。最后加入100μL终止液，然后立即测定各孔在450nm和570波长处的吸光度值。利用绘制的标准曲线计算出各细胞因子的浓度。IgE是免疫球蛋白的一种，主要与过敏性疾病有关，由图27可知模型组的IgE显著高于对照组，而地塞米松组和巴洛沙韦酯组可以显著降低小鼠血清中IgE的含量。IL-4可驱动IgE合成。T辅助细胞1(Th1)细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)对IgE的产生具有抑制作用。由图28可知，模型组的IL-4显著高于对照组，而地塞米松组和巴洛沙韦酯组可以显著降低小鼠血清中IL-4的含量。模型组的IFN-γ,IL-10显著低于对照组，而地塞米松组和巴洛沙韦酯组可以显著升高小鼠血清中IFN-γ,IL-10的含量。综上，巴洛沙韦酯在50mg/kg时可以显著降低IL-4的水平，升高IFN-γ,IL-10的水平。
⑦RT-qPCR实验检测检测IL-6，MCP-1，Arg-1和Ym-1
总RNA的提取:取冰冻肺组织样品于冰盒上进行切割，肺组织取15mg，用小刀剪碎放在2mL离心管中，所取出的样品加入1ml TotalI RNA Extractor，2粒小磁珠，1粒大磁珠，冰上放置，用匀浆器处理60Hz，60s,2次。使其粉粹裂解。将裂解的样品冰上放置10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，冰上放置10min，12000rpm 4℃离心10min。吸取上层水相300uL转移至干净的1.5mL离心管中，加入等体积预冷异丙醇，用机器震荡混匀，冰上放置10min。12,000rpm 4℃离心10min,弃上清，可看到白色沉淀。加入1ml75％乙醇(无水乙醇：DEPC水＝3：1)洗涤沉淀。12,000rpm 4℃离心10min.弃上清。短暂离心后用移液枪吸走上清，倒扣EP管于吸水纸上晾干5-10min。加入20uL RNase-free ddH2O(DEPC水)，充分溶解RNA，用nona测定RNA样品的浓度与A260/A280。
逆转录：测完RNA样品的浓度后，以制成2μg的上样量来进行稀释，首先加入RNA，DEPC水和4×gDNA wiper Mix微升,短暂离心混匀，置于逆转录仪中42℃2min，取出无酶8联管再加入5×HiScript II qRT SuperMix IIa溶液，短暂离心后用移液枪混匀置于逆转录仪中，选择50℃15min,再85℃反应5s即可得到cDNA。可立即使用，也可-20℃保存，长期应再-80℃分装保存。
实时定量PCR：在96孔孔管中配制如下混合液，封口膜密封，反应体系是10uL。
表7反应体系
Figure BDA0004109301140000151
图29可知，巴洛沙韦酯可以显著降低IL-6，MCP-1，Arg-1和Ym-1的mRNA的表达。
⑧蛋白质印迹法测定pSTAT3与STAT3蛋白表达情况
提取总蛋白：称15mg肺组织于2mL离心管中,加2个小钢珠和1个大钢珠、再加入300μL RIPA裂解液研磨2次(60HZ,60s)，冰上裂解20min，4℃离心12000rpm 15min，吸取上清于1.5mL离心管中，取2.4μL样品用于蛋白定量，剩余样品与loading buffer混匀放入95℃金属浴煮10min使其变性。12000rpm离心1min。根据浓度计算上样体积，每样本含40μg蛋白。
Western Blot：配制相应浓度分离胶与浓缩胶，加足够的Running Buffer后加入蛋白样品，在上层胶时使用低电压恒压电泳(60V，30min)，而在loading Buffer进入下层胶时使用高电压恒压电泳(120V左右，1h)。电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，进行转膜。设定转膜电流为200mA，转膜时间为120分钟。转膜完毕后，立即把膜放置到预先准备好的TBST中，以洗去膜上的转膜液，在玻璃板加入TBST，切割需要的蛋白的条带，将切好的条带放入封闭盒里，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，加入TBST洗膜后用BSA稀释液稀释二抗。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入TBST，洗膜。取条带置于曝光机上，用移液枪取曝光液滴加在条带上，等待1min后进行曝光。图30可知，模型组的p-STAT3蛋白的表达显著高于对照组，巴洛沙韦酯可以显著降低p-STAT3蛋白的表达。表明巴洛沙韦酯可能通过影响STAT3蛋白的表达来调节小鼠哮喘
综上所述，化合物巴洛沙韦酯处理后，显著改善哮喘小鼠的肺部的病理情况,显著降低小鼠血清中IgE以及IL-4的水平，升高IFN-γ和IL-10的水平的含量，可以显著降低肺部IL-6，MCP-1，Arg-1和Ym-1的mRNA的表达以及显著降低p-STAT3蛋白的表达从而减轻小鼠哮喘的症状。
实施例10
化合物巴洛沙韦酯对小鼠银屑病模型的治疗效应
①选择试验动物：选择购买自北京维通利华公司的BALB/C小鼠，雌性，日龄48-56天；于普通环境下饲养，自由摄食饮水。
②药物制备：巴洛沙韦酯给药剂量均为50mg/kg，溶解于0.5％羧甲基纤维素钠的水溶液中。
③动物分组、造模和给药：小鼠按体重随机分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、化合物组。用剃毛器去除背部毛发，露出2cm×3cm的皮肤区域。5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏(局部剂量62.5mg)每天对右耳及背部给药，Toll样受体在银屑病发生和发展进程中起重要作用，咪喹莫特是Toll样受体激动剂，可用于银屑病造模。上午造模，下午给药，实验周期为7天。每天对小鼠进行称重、拍照、测量每只小鼠的右耳厚度以及观察小鼠右耳以及背部情况，为了对小鼠皮肤炎症的严重情况进行评分，基于临床牛皮癣面积和严重程度指数开发了客观评分系统(Psoriasis Area and Severity Index；PASI)，红肿和鳞屑从0到4独立评分(0：无症状；1：轻度；2：中度；3重度；4：极其严重)。结果如图31所示，与模型组耳厚度以及红肿程度相比，对照组以及给药组小鼠耳厚度以及红肿程度显著性降低。
④HE染色：从咪喹莫特乳膏涂抹造模开始，每天对小鼠进行拍照并观察小鼠右耳及背部情况，每天测量每只小鼠的右耳厚度，耳厚度测量结果如图21所示。取小鼠背部及右耳皮肤标本浸泡于4％多聚甲醛中，石蜡包埋；用苏木精和伊红染色(HE)；HE定量结果如图32所示，结果表明模型组的棘皮厚度大于对照组，且有显著性差异(P<0.05)，化合物组棘皮厚度相对于模型组有显著降低。
⑤统计学处理：HE染色情况、右耳厚度等均采用graphpadprism软件进行数据处理，多组间采用单因素方差分析(One-WayANOVA)处理。
综上所述，巴洛沙韦酯处理后银屑病小鼠耳厚度、皮肤以及耳朵损伤程度均具有显著降低。表明化合物巴洛沙韦酯对银屑病具有显著的治疗效果。

Claims (10)

1.巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐在制备VISTA激动剂中的用途。
2.巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐作为VISTA激动剂在制备预防或治疗由VISTA介导的疾病的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述由VISTA介导的疾病为自身免疫性疾病。
4.巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐在制备预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求3或者4所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括红斑狼疮、哮喘、银屑病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎或类风湿性关节炎。
6.根据权利要求3或者4所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病为红斑狼疮、哮喘或者银屑病。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述红斑狼疮包括：皮肤型红斑狼疮、系统性红斑狼疮或者药物诱导性红斑狼疮；所述哮喘包括：过敏性哮喘、非过敏性哮喘、晚发性哮喘、有固定气流限制的哮喘、重症哮喘、难治性哮喘或者肥胖哮喘；所述银屑病为斑块状银屑病、泛发性脓疱型银屑病、红皮病型牛皮癣或者银屑病关节炎。
8.一种药物组合物在制备预防或治疗自身免疫性疾病中的用途，所述药物组合物其优选含有权利要求1所述的巴洛沙韦酯或巴洛沙韦酸或其二者药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括红斑狼疮、哮喘、银屑病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎或类风湿性关节炎。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的剂型是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
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