CN114732814B - 尿石素a在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了尿石素A在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用，其中，所述尿石素A是通过调节肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白治疗过敏性气道疾病。发明人发现尿石素A可显著改善过敏性气道疾病小鼠的多项炎症指标，与鞣花酸相比，尿石素A在改善疾病模型组小鼠挠鼻频率，降低BALF中IL‑5、IL‑4、IL‑18水平，缓解肺部嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞增生、降低支气管与血管周围炎症细胞浸润程度病理评分，升高肺组织抗氧化因子GSH水平，降低肺组织TXNIP、ASC以及IL‑1β蛋白表达及NLRP3、TXNIP阳性细胞比例上都具有更好的效果。

Description

尿石素A在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用

技术领域

本发明属于化合物药物用途领域，具体涉及尿石素A在防治过敏性鼻炎及过敏性哮喘中的应用。

背景技术

随着城市化进程的推进，环境污染日趋严重，过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)和哮喘的发病率在过去二十年内大幅度升高，影响着全球10％-20％人口，而高达80％的儿童哮喘和50％以上的成人哮喘病例为过敏性哮喘。AR和过敏性哮喘经常共同存在，同属于过敏性气道疾病，通常均以多种炎症细胞浸润增加，多种炎症因子升高以及异常的气道重塑为特征，并伴随气喘、胸闷和咳嗽等症状。其发病机制较复杂，目前尚未完全研究清楚。其中，以Th2细胞过度分化介导的适应性免疫应答占主导地位，主要特征是大量Th2细胞、嗜酸性粒细胞等免疫炎症细胞在气道的聚集以及Th2细胞因子如IL-4，IL-5和IL-13的释放，进而导致气道过敏反应的发生发展。此外，NOD样受体蛋白3(NOD-Like ReceptorProtein 3,NLRP3)是一种非常重要的模式识别受体，可以识别外界入侵的病原体，启动先天免疫，释放效应分子，诱导和调节适应性免疫。一般情况下，NLRP3蛋白处于静息状态，当受到外界刺激活化后，可与胞内半胱胺酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)的前体及凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-Associated Speck-Like Protein Containing A CARD,ASC)相互作用结合形成NLRP3炎症小体，促进成熟IL-1β和IL-18形成与释放，在过敏性气道疾病中发挥着重要作用。NLRP3炎症小体有多种激活途径，其中活性氧(Reactive OxygenSpecies,ROS)产生可导致胞内硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-InteractingProtein,TXNIP)的解离，然后游离TXNIP与NLRP3结合，促进炎症小体形成和活化，是NLRP3炎症小体一条非常重要的激活途径。抑制NLRP3炎症小体的激活可能是治疗过敏性气道疾病的一个重要靶点。

相关技术中，临床上对于过敏性气道疾病的治疗药物主要是糖皮质激素，但其对于重症患者疗效不佳，且具有依赖性，长期用药可能会产生副作用。

尿石素A(Urolithin A)，化学名称为3,8-二羟基-6H-二苯并[B,D]吡喃-6-酮，是鞣花酸(Ellagic Acid，EA)的一种肠道菌群代谢产物。在相关技术中，尿石素A常用作潜在的神经保护剂、促进维持肠道菌群的平衡、调控雌激素分泌、改善糖尿病、改善动脉粥样硬化、抑制前列腺癌细胞的增殖，但并未发现其在过敏性气道疾病中的应用。

因此，开发一种基于尿石素A的过敏性鼻炎和过敏性哮喘治疗药物对于临床上治疗过敏性气道疾病具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出尿石素A在改善过敏性气道疾病中的应用。在本发明中，发明人发现尿石素A可显著改善过敏性气道疾病模型小鼠的多项炎症指标，而且，尿石素A在改善疾病模型组小鼠挠鼻频率，降低BALF中IL-5、IL-4、IL-18水平，缓解肺部嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞增生、降低支气管与血管周围炎症细胞浸润程度病理评分，升高肺组织抗氧化因子GSH水平，降低肺组织TXNIP、ASC以及IL-1β蛋白表达及NLRP3、TXNIP阳性细胞比例等指标上比鞣花酸具有更好的效果，从而能够说明尿石素A具有极好的过敏性气道疾病治疗作用。

本发明的第一个方面，提供尿石素A或其衍生物在制备过敏性气道疾病治疗药物中的应用。

尿石素A是鞣花酸最主要的肠道菌群代谢物，该化合物的分子式是C₁₃H₈O₄，分子量228.20，CAS登录号：1143-70-0，其化学结构如式(Ⅰ)所示：

发明人发现，尿石素A具有非常强的抗氧化活性，可以通过抗氧化应激对细胞产生保护作用。而且，尿石素A还可以通过调节PI3K/Akt/NF-κB通路发挥抗炎作用，减少炎症反应的发生。

鞣花酸具有抗氧化、抗炎、抗癌及调节肠道菌群等多种生物活性，对癌症、糖尿病、心脑血管疾病和神经性病变等慢性疾病具有潜在的预防或治疗功效。然而，鞣花酸的生物利用度较低，最终分布于组织及血液中的鞣花酸浓度往往低于其发挥生物学功效的有效浓度，因此，将尿石素类物质——尿石素A取代鞣花酸用作制药原料，能有效的克服鞣花酸的生物利用度低的问题，同时，发明人还发现，尿石素A在治疗过敏性气道疾病方面的有效性要高于鞣花酸，其主要原因在于尿石素A能通过调节NLRP3炎症小体活化有效调控更多过敏性气道疾病相关物质的表达或分泌。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述过敏性气道疾病包括过敏性哮喘和过敏性鼻炎。

在本发明的一些优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物通过调节肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白治疗过敏性气道疾病。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白包括NLRP3、TXNIP、Caspase-1、ASC和IL-1β。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于100mg/kg体重。

在本发明的一些优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于20mg/kg体重。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为10～20mg/kg体重。

本发明的第二个方面，提供尿石素A或其衍生物在制备炎症因子表达抑制剂中的应用。

发明人发现，尿石素A可以通过调节PI3K/Akt/NF-κB通路发挥抗炎作用，减少炎症反应的发生。同时，其相比于鞣花酸，可调控的炎症因子更多，调控程度更高。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述炎症因子包括IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、IL-1β、IL-18。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于100mg/kg体重。

在本发明的一些优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于20mg/kg体重。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为10～20mg/kg体重。

本发明的第三个方面，提供尿石素A或其衍生物在制备抗氧化制剂中的应用。

尿石素A具有非常强的抗氧化活性，可以通过抗氧化应激对细胞产生保护作用。相比于鞣花酸，尿石素A不仅具有同样有效的ROS抑制效果、SOD提高效果，还能够显著增加肺组织内GSH水平，其抗氧化应激效果远超鞣花酸。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于100mg/kg体重。

在本发明的一些优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为小于等于20mg/kg体重。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述尿石素A或其衍生物的使用剂量为10～20mg/kg体重。

本发明的第四个方面，提供一种治疗过敏性气道疾病的组合物，该组合物中含有尿石素A或其衍生物。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述过敏性气道疾病包括过敏性哮喘和过敏性鼻炎。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述组合物中还含有其他辅剂。

在本发明的一些优选实施方式中，所述辅剂包括药学上可接受的载体、防腐剂或抗菌剂中的一种或多种。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他辅剂。

在本发明的一些优选实施方式中，所述组合物的剂型包括片剂、散剂、溶液剂、胶囊。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他剂型以提高组合物的利用率。

在本发明的一些优选实施方式中，按照质量比计，所述组合物中尿石素A或其衍生物的占比为1～99％。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理调整组合物中尿石素A或其衍生物的占比以得到相似的药效。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了尿石素A或其衍生物在制备过敏性气道疾病治疗药物中的应用，发现尿石素A可显著改善过敏性气道疾病模型小鼠的多项炎症指标，且与鞣花酸相比，尿石素A在改善疾病模型组小鼠挠鼻频率，降低BALF中IL-5、IL-4、IL-18水平，缓解肺部嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞增生、降低支气管与血管周围炎症细胞浸润程度病理评分，升高肺组织抗氧化因子GSH水平，降低肺组织TXNIP、ASC以及IL-1β蛋白表达及NLRP3、TXNIP阳性细胞比例上都具有更好的效果，从而能够说明尿石素A具有极好的过敏性气道疾病治疗作用，可作为极佳的制药原料。

2.本发明提供了尿石素A或其衍生物在制备炎症因子表达抑制剂中的应用，发现尿石素A可以显著抑制IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、IL-1β、IL-18等炎症因子的表达，减轻或减缓炎症反应。

3.本发明提供了尿石素A或其衍生物在制备抗氧化制剂中的应用，发现尿石素A具有非常强的抗氧化活性，相比于鞣花酸，不仅具有同样有效的ROS抑制效果、SOD提高效果，还能够显著增加肺组织内GSH水平，能够有效的保护细胞免受氧化应激的伤害。

4.发明人发现了尿石素A或其衍生物通过对肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白的调节作用实现了对过敏性气道疾病的治疗效果，为后续药物的研发及过敏性气道疾病治疗靶位提供了理论参考。

附图说明

图1为本发明实施例中的OVA致敏和激发造模流程图。

图2(A)为本发明实施例中各组小鼠摄食量，(B)为各组小鼠体重监测趋势图，以及(C)为激发前后体重差值统计分析条形图；其中，Control代表正常对照组，OVA代表疾病模型组，OVA+EA代表鞣花酸干预组，OVA+UroA代表尿石素A干预组，OVA+Dex代表地塞米松阳性对照组；数据表示为均数±标准误，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001versus control；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(下同)。

图3为本发明实施例中各组小鼠挠鼻频率的统计分析条形图。

图4为本发明实施例中各组小鼠全血中各类血细胞的百分比对比图，其中，(A)为总白细胞数量，(B)为淋巴细胞比例，(C)为单核细胞比例，(D)为嗜酸性粒细胞比例，(E)为中性粒细胞比例，(F)为嗜碱性粒细胞比例。

图5为本发明实施例中各组小鼠肺部病理HE染色和PAS染色的代表性图片，其中，(a)是HE染色，放大倍数×400，拍摄部位为支气管及其周围炎症细胞；(b)是(a)中框线部分的放大图，其中，小箭头指示嗜酸性粒细胞，放大倍数×1000；(c)是PAS染色，放大倍数×400，拍摄部位为支气管及其周围炎症细胞；(d)是HE染色，放大倍数×400，拍摄部位为血管及其周围炎症细胞。

图6为本发明实施例中各组小鼠肺组织病理相关统计图，其中，(A)是嗜酸性粒细胞浸润数的统计图，(B)是小鼠肺组织杯状细胞黏液生成(PAS阳性)的统计图，(C)是支气管周围炎症细胞浸润程度病理评分的统计图，(D)是血管周围炎症细胞浸润程度病理评分的统计图。

图7为本发明实施例中各组小鼠肺组织各类型T细胞的统计图，其中，(A)是Th1细胞比例，(B)是Th2细胞比例，(C)是Th2与Th1细胞比值，(D)是Th17细胞比例，(E)是Treg细胞比例，(F)是Th17与Treg细胞比值。

图8为本发明实施例中各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)或肺组织匀浆中各类细胞因子的统计图，(A)是BALF中的IL-4水平，(B)是BALF中的IL-5水平，(C)是BALF中的IL-13水平，(D)是BALF中的IFN-γ水平，(E)是BALF中的IL-17水平，(F)是BALF中的IL-10水平，(G)是BALF中的IL-1β水平，(H)是肺匀浆中的IL-1β水平以及(I)是BALF中的IL-18水平。

图9为本发明实施例中各组小鼠肺组织氧化应激各指标水平的统计图，(A)是肺组织细胞内ROS水平，(B)是肺组织细胞内MDA水平，(C)是肺匀浆中SOD水平及(D)是肺匀浆中GSH水平。

图10为本发明实施例中各组小鼠血浆总IgE浓度(A)和OVA sIgE浓度(B)的统计图。

图11为本发明实施例中各组小鼠肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达水平的代表性条带。

图12为本发明实施例中各组小鼠肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达水平的统计图，(A)是NLRP3蛋白的相对表达量，(B)是TXNIP蛋白的相对表达量，(C)是Caspase-1蛋白的相对表达量，(D)是ASC蛋白的相对表达量以及(E)是IL-1β蛋白的相对表达量。

图13为本发明实施例中各组小鼠肺组织免疫组化代表性图片，放大倍数×400，(a)为NLRP3，(b)为TXNIP，(c)为Caspase-1。

图14为本发明实施例中TXNIP/NLRP3通路相关蛋白阳性细胞比例统计图，(A)是支气管周围NLRP3阳性细胞比例，(B)是支气管周围TXNIP阳性细胞比例及(C)是支气管周围Caspase-1阳性细胞比例。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

试验材料

试验药物：

地塞米松(美国Sigma)，溶于DMSO中加PBS溶液稀释制成溶液。

鞣花酸(美国Sigma)，溶于DMSO中加PBS溶液稀释制成悬浊液。

尿石素A(美国Sigma)，溶于DMSO中加PBS溶液稀释制成悬浊液。

卵清蛋白(OVA)购自美国Sigma，货号A5503。

构建过敏性鼻炎/过敏性哮喘小鼠模型

本实施例中的小鼠均采用4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，该BALB/c小鼠由广东省医学实验动物中心提供，饲养于中山大学公共卫生学院SPF级动物房内。饲养小鼠所用器皿笼具均严格消毒，自由采食和饮用纯净水，饲料为常规实验鼠维持饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，不含任何药物。

在实验开始前，所有实验小鼠在检疫室内检疫一周，观察有无异常症状。

过敏性鼻炎/过敏性哮喘小鼠模型构建步骤为：

取40μg的OVA、4mg的氢氧化铝混合，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)定容至终体积200μL。将OVA-氢氧化铝-PBS混合液分别于实验第0天、第7天和第14天在小鼠左下腹进行腹腔注射致敏。激发可在腹腔注射致敏后，间隔1周，即从实验第21天开始，配置5％(v/v，PBS稀释)的OVA溶液，对小鼠进行雾化吸入30min，然后用40μg/μL的OVA溶液(PBS稀释)滴入小鼠鼻腔，每只小鼠滴加20μL。每天激发一次，连续激发5天(即实验第21、22、23、24、25天)，即得过敏性鼻炎/过敏性哮喘小鼠模型。

所造模型兼有过敏性鼻炎及过敏性哮喘症状及病理特征。

正常对照组小鼠采用PBS溶液作为安慰剂代替OVA进行致敏和激发实验。

造模示意图如图1所示。

尿石素A对过敏性鼻炎/过敏性哮喘小鼠的治疗作用

取实验小鼠40只，随机分为5组，每组8只。

分组情况如下所示：

A.正常对照组：使用PBS致敏和激发，普通饲料(即上述实施例中的常规实验鼠维持饲料)喂养；

B.疾病模型组：OVA致敏和激发造模，普通饲料喂养；

C.鞣花酸干预组：OVA致敏和激发造模，普通饲料喂养，每天加鞣花酸灌胃(20mg/kg体重，时间为实验第0～25天)；

D.尿石素A干预组：OVA致敏和激发造模，普通饲料喂养，每天加尿石素A灌胃(20mg/kg体重，时间为实验第0～25天)；

E.地塞米松阳性对照组：OVA致敏和激发造模，普通饲料喂养，于每次OVA激发前半小时腹腔注射地塞米松(2.5mg/kg体重，时间为实验第21～25天)。

各组具体情况如表1所示。

表1实验小鼠分组情况

在实验期间，小鼠定期称量体重和记录食量，每周更换两次干净的垫料，定期更换饮水。最后一次激发24h后处死小鼠，收集样本。实验结束后的小鼠尸体集中送至中山大学北校区动物中心进行无害化处理。动物实验符合中山大学动物伦理委员会规定。

所有数据均采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以mean±SEM的形式表示，使用GraphPad Prism 5软件进行统计图的制作。当数据符合正态分布，且方差齐时，多组计量资料采用单因素方差分析(ANOVA)。多组比较具有统计学差异后，采用LSD检验进行两两比较，当数据不满足方差齐时，多组比较采用Welch's anova检验，随后的两两比较采用Games-Howell检验。当P<0.05时，认为差异有统计学意义。所有数据均表示为均数±标准误(mean±SEM)。

其中，下述附图中，与正常组相比，#为P<0.05，##为P<0.01，###为P<0.001。与其他组相比，*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001。·

实验结果如图2～14所示。

1.尿石素A改善疾病模型组小鼠过敏激发前后体重下降：

如图2所示，各组小鼠摄食量差异无统计学意义(P>0.05)。通过对各组小鼠体重进行监测(第0、7、14、21、26天)，可以发现，与正常组小鼠相比，模型组小鼠激发后体重显著下降(P<0.01)，鞣花酸和尿石素A均有减轻疾病模型组小鼠体重丢失的趋势，且尿石素A更为明显，而地塞米松有加重疾病模型组小鼠激发后体重下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.尿石素A减轻疾病模型组小鼠的挠鼻症状：

在最后一次激发后，记录小鼠10min内的挠鼻的次数用于评估过敏症状，结果如图3所示。

与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠挠鼻症状显著加重(P<0.001)，鞣花酸、尿石素A均能显著减轻疾病模型组小鼠的挠鼻症状(P<0.001)，但通过结果也可以发现，尿石素A比鞣花酸更能明显降低挠鼻频率，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示尿石素A具有比鞣花酸更好的减轻鼻部过敏瘙痒症状的作用。

3.尿石素A对疾病模型组小鼠全血各类血细胞的影响：

从每只实验小鼠中提取血液，制备得到20μL的ACD抗凝全血，使用迈瑞兽用五分类血球试剂包，通过血液细胞分析仪BC-5000V(深圳迈瑞)对获得的ACD抗凝全血进行血细胞检测。

结果如图4所示。

可以发现，与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠全血中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞比例显著增加(P<0.01)，鞣花酸、尿石素A均可显著降低血中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞比例(P<0.05)。

4.尿石素A改善疾病模型组小鼠肺部病理变化：

取实验小鼠左上肺，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色。在光学显微镜下进行观察，分析气道炎症的变化情况，同时，使用PAS染色，观察杯状细胞增生情况和气道黏液分泌情况。

结果如图5和6所示。

结果发现，与正常对照组(Control)小鼠相比，疾病模型组小鼠肺部具有明显的嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞黏液生成、支气管与血管周围炎症细胞浸润明显增加等现象(P<0.01)，鞣花酸、尿石素A干预后疾病模型组小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞黏液生成、支气管与血管周围炎症细胞浸润等现象明显减轻(P<0.05)，且通过对比鞣花酸干预组，可以发现尿石素A比鞣花酸改善上述病理现象效果更好，差异具有统计学意义(P<0.05)。

5.尿石素A对疾病模型组小鼠肺组织各类T细胞的影响：

流式细胞术检测各类T细胞比例。取实验小鼠的肺组织，剪碎，用DNA酶和胶原酶消化1h后研磨得到单细胞悬液，加入细胞刺激剂培养5h。随后使用相应抗体[单克隆抗体CD3e(PE-efluor 610)、CD4(APC-efluor 780)、CD8a(FITC)、IFN-gamma(APC)、IL-17A(PE)、IL-4(PE-cyanine7)、CD25(PE-cyanine7)、IL-10(APC)、Foxp3(PE)]进行表面染色和胞内染色，洗涤后重悬上机检测，用CytExpert软件分析各类T细胞亚型结果。

结果如图7所示。

结果发现，与正常对照组(Control)小鼠相比，疾病模型组小鼠Th2细胞比例、Th17细胞比例、Th2与Th1细胞比值及Th17与Treg细胞比值均显著升高(P<0.01)，其中鞣花酸、尿石素A均可显著抑制OVA诱导的肺部Th2细胞比例和Th17与Treg细胞比值的升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

6.尿石素A对疾病模型组小鼠肺泡灌洗液中各类细胞因子的影响：

使用本领域常规方法，对实验小鼠进行肺泡灌洗(灌洗溶剂为1mL PBS)，得到支气管肺灌洗液(BALF)。使用ELISA试剂盒(Mouse IFN-γELISA Kit，购自eBioscience；MouseIL-4ELISA Kit，购自安迪(R&D)；Mouse IL-5ELISA Kit，购自eBioscience；Mouse IL-13ELISA Kit，购自eBioscience；Mouse IL-17A ELISA Kit，购自安迪(R&D)；Mouse IL-10ELISA Kit，购自安迪(R&D)；Mouse IL-1βELISA Kit，购自eBioscience；Mouse IL-18ELISA Kit，购自eBioscience，使用方法均参照使用说明书进行)检测小鼠肺泡灌洗后溶液中各类细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-18、IFN-γ)水平。

结果如图8所示。

可以发现，与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠肺泡灌洗液中Th2的标志性细胞因子IL-4、IL-5、IL-13与IL-10以及Th17的标志性细胞因子IL-17水平均明显升高(P<0.001)，其中鞣花酸、尿石素A干预均可显著降低疾病模型组小鼠IL-5、IL-13和IL-17水平，且尿石素A降低IL-15的效果明显优于鞣花酸，差异具有统计学意义(P<0.05)；而且，实验组中仅有尿石素A可以显著降低IL-4水平(P<0.01)；此外，疾病模型组小鼠BALF中的NLRP3炎症小体下游因子IL-1β和IL-18，肺匀浆中的IL-1β水平较正常组小鼠均显著升高(P<0.01)，其中鞣花酸、尿石素A干预均可显著降低疾病模型组小鼠BALF和肺匀浆中IL-1β水平(P<0.05)，而仅有尿石素A可以显著降低IL-18的水平(P<0.01)。总体而言，尿石素A比鞣花酸调节气道细胞因子的效果更好。

7.尿石素A改善疾病模型组小鼠肺部氧化应激水平：

使用流式细胞术对实验小鼠肺组织进行检测，检测常规的氧化指标——活性氧(ROS)、细胞丙二醛(MDA)，抗氧化指标还原型谷胱甘肽(GSH)以及超氧化物歧化酶(SOD)。通过相应的试剂盒(活性氧检测试剂盒，购自碧云天；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，购自南京建成；还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒，购自南京建成；细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒，购自南京建成，使用方法均参照使用说明书进行)进行检测。

结果如图9所示。

与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠肺部氧化因子ROS与MDA水平显著增加(P<0.001)，而抗氧化因子GSH与SOD水平显著降低(P<0.05)，鞣花酸、尿石素A均可显著降低肺组织内ROS和MDA水平，增加SOD水平(P<0.01)，而仅有尿石素A可显著增加肺组织内GSH水平(P<0.01)。说明尿石素A在改善哮喘小鼠肺部氧化应激水平上具有比鞣花酸更加优异的效果。

8.尿石素A降低疾病模型组小鼠血浆IgE水平：

使用ELISA试剂盒(Mouse OVA Specific IgE ELISA Kit，购自Biolegend；DeluxeSet Mouse IgE，购自Biolegend，使用方法均参照使用说明书进行)对实验小鼠血浆总IgE、OVA特异性IgE(OVA specific IgE,OVA sIgE)浓度进行检测。

结果如10所示。

可以发现，与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠的血浆总IgE和OVA sIgE水平均显著升高(P<0.001)，鞣花酸、尿石素A干预均可显著降低疾病模型组小鼠总IgE和OVA sIgE水平(P<0.05)。

9.尿石素A对疾病模型组小鼠肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白的调节作用：

取实验小鼠肺组织，提取肺组织蛋白，经加样、电泳、转膜、封闭等步骤后，与一抗NLRP3(NLRP3(D4D8T)Rabbit mAb，购自CST)、ASC(ASC(D2W8U)Rabbit mAb，购自CST)、Caspase-1(anti-Caspase-1(p20)mouse mAb购自Adipogen)、TXNIP(Recombinant Anti-TXNIP antibody购自Abcam)、IL-1β(IL-1β(3A6)Mouse mAb购自CST)在4℃孵育一夜，随后与HRP标记的二抗(Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody)在室温孵育1小时。蛋白质条带通过Tanon 5200自动化学发光图像分析系统(Tanon)进行可视化分析。

对肺组织中的NLRP3、TXNIP及Caspase-1蛋白进一步进行免疫组化分析检测其分布。制备肺组织石蜡切片，经脱蜡，抗原修复，浸泡洗涤，干燥切片，封闭后滴加一抗，4℃孵育过夜。随后滴加HRP标记的二抗孵育后加DAB显色剂显色，经复染、脱水、透明和封片后于显微镜下观察。图像用Image J软件进行分析。结果如图11～14所示。

Western blot结果显示，与正常组相比，疾病模型组小鼠肺组织内NLRP3、TXNIP、Caspase-1、ASC以及IL-1β蛋白表达均显著增加(P<0.001)，鞣花酸、尿石素A均可显著降低疾病模型组小鼠肺组织内NLRP3、TXNIP以及Caspase-1蛋白表达(P<0.01)，且尿石素A降低TXNIP蛋白量的效果优于鞣花酸(P<0.05)，仅尿石素A可以显著降低疾病模型组小鼠肺组织内ASC以及IL-1β蛋白表达(P<0.001)。

免疫组化结果显示，与正常组小鼠相比，疾病模型组小鼠肺组织内NLRP3、TXNIP以及Caspase-1阳性细胞比例均明显升高(P<0.001)，鞣花酸、尿石素A干预均可显著降低疾病模型组小鼠肺组织内NLRP3、TXNIP以及Caspase-1阳性细胞的比例(P<0.01)，但尿石素A降低肺组织NLRP3及TXNIP阳性细胞比例的效果比鞣花酸更明显(P<0.05)。

综上所述，尿石素A可显著改善过敏性气道疾病小鼠(过敏性鼻炎及过敏性哮喘)的多项炎症指标。其中，尿石素A在改善疾病模型组小鼠挠鼻频率，BALF中IL-5水平，肺部嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞增生、降低支气管与血管周围炎症细胞浸润程度病理评分，降低肺组织TXNIP蛋白表达及NLRP3、TXNIP阳性细胞比例等指标上比鞣花酸具有更好的效果(P<0.05)；且仅尿石素A可以显著降低疾病模型组BALF中的IL-4、IL-18水平，降低肺组织内ASC以及IL-1β蛋白表达，升高肺组织GSH水平(P<0.05)。从而能够说明尿石素A具有极好的过敏性气道疾病治疗作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.尿石素A作为唯一活性成分在制备治疗过敏性气道疾病的药物中的应用；所述过敏性气道疾病为过敏性哮喘和过敏性鼻炎。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿石素A通过调节肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白治疗过敏性气道疾病，所述肺组织TXNIP/NLRP3通路相关蛋白包括NLRP3、TXNIP、Caspase-1、ASC和IL-1β。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿石素A的使用剂量为小于或等于100mg/kg体重。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有防腐剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，按照质量比计，所述药物中尿石素A的占比为1~99%。