CN109601472B - 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法，包括如下步骤：将实验小鼠置于吸烟气体染毒仪中，设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，得到评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型。该动物模型的建立有助于认识并系统评价吸烟对动物机体免疫系统的影响与作用特点，也可为烟草降害的判断提供实验数据，进而研制出低毒性卷烟，为无法戒烟者提供减害产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法。
背景技术
吸烟是世界各国家存在的群体现象，近年来有关吸烟对健康影响的研究越来越受到人们的重视。机体免疫系统具有重要的生理功能，是机体健康的捍卫者。鉴于此，人们希望了解有关吸烟对免疫系统是否有影响以及如何影响的机制。国外较早研究烟草对机体免疫影响的研究始于上世纪七十年代末，主要观察了吸烟者呼吸道周围局部免疫如补体蛋白、血清反应蛋白、免疫复合物以及溶菌酶的变化，特别是对肺部肿瘤患者与正常志愿者间一些免疫相关的物质进行了临床的检测；并对一些戒烟的志愿者的免疫机能的可能影响以及戒烟后的恢复进行了研究。
随着免疫学理论和技术的发展，烟草特别是烟草提取成分(粒相)对免疫细胞如吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞的影响进行了一些实验研究，显示烟草对吞噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞可能的影响作用。2001年，波兰免疫学者Moszczyński研究116名男性吸烟者细胞免疫和体液免疫状态的变化进行了较系统的监测。选取116名男性为观察对象，分为3组：第1组为轻度吸烟者，年龄21～37岁，烟龄<10年；第2组为重度吸烟者，年龄29～50岁，烟龄>10年；两组吸烟者每日吸烟数均为15～25支。第3组为对照组，年龄24～47岁，从不吸烟。对所有观察者进行体检，排除各种急慢性疾患，取清晨空腹静脉血进行免疫学检查。结果发现，第1组外周血淋巴细胞绝对计数高于第2组和对照组；第2组血清免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)浓度与对照组相比显著下降，溶菌酶活性与对照和第1组相比也显著下降(P<0.05，P<0.01)；NK细胞(CD16+)的绝对计数，第1组升高而第2组显著下降；与对照组相比，细胞毒性T细胞(CD8+)，第1组升高了15％，第2组升高了23％。研究表明，吸烟可影响人体免疫系统，特别是长期吸烟者可抑制机体免疫功能，提示，吸烟的时间和剂量是影响免疫系统功能的关键因素。
国内学者研究了不同时间吸烟对实验动物淋巴细胞的影响。将大鼠置于吸烟室中3个月、9个月后，检测吸烟组及对照组大鼠淋巴细胞体液和细胞免疫功能，发现吸烟9个月后大鼠对绵羊红细胞的抗体形成细胞反应及抗CD3抗体诱导的增殖反应均较对照组明显降低，而吸烟3个月大鼠上述功能无显著差异。但该研究对吸烟的量没有详细的探讨，对不同吸烟剂量和时间与免疫功能的效应间缺乏系统的评价。
然而，近些年来，关于尼古丁对机体的作用在以往大量负面报道的基础上，逐步开始有了一些相反作用的报道，如抑制中枢神经元凋亡进程、压制细菌毒素引起的机体炎症反应、对缺氧状态下的细胞保护作用、促进血管再生及损伤修复及诱导干扰素(IFN)生成增加粘膜局部抵抗力等。尤其值得注意的是尼古丁在调节机体炎症反应过程时表现出与其它致炎因子不同的特性，提示尼古丁对于气道炎症的发生可能并非只是以往认为的负面效应。研究表明，尼古丁可抑制巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞对细菌内毒素(LPS)的刺激反应，减少白介素的释放，同时诱导IFN-γ的生成。研究也显示尼古丁可有效压制肠道炎症动物模型IL-8、IL-4的表达释放水平，减轻病理损伤程度。因此，吸烟对机体健康的影响仍然有待于进一步的实验研究与评估，也需要动物模型来综合评价吸烟对动物机体免疫系统的影响。但机体的免疫系统组成及功能复杂，目前尚没有有效的动物模型来综合评价吸烟对动物机体免疫系统及功能的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法，构建的动物模型可用于综合评价吸烟对动物机体免疫系统及功能的影响。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
由于吸烟首先影响的是肺脏器官，且机体免疫细胞分布于机体的每个器官和组织包括肺脏器官中，因此，本发明采用吸烟后小鼠肺部病理疾病活动指数(Disease activityindex，DAI)评分的方法研究吸烟的剂量、时间与效应的关系，提出了一套系统的疾病活动指数评分体系。基于该评价体系，本发明设定出一种合理的模拟吸烟条件，即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，进而得到适用于评价吸烟对肌体免疫系统及功能的影响的模拟吸烟条件。
本发明提供的吸烟后小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分体系如下：
肺泡完整性评分值A1(0-3分)：肺泡完整(-)记0分，轻度损伤(+)记1分，中度损伤(++)2分，重度损伤(+++)3分；
肺上皮细胞水肿评分值A2(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分；
炎症细胞浸润评分值A3(0-3分)：无浸润(-)记0分，少量浸润(+)记1分，中度浸润(++)记2分，大量浸润(+++)记3分；
支气管上皮完整性评分值A4(0-3分)：完整(-)记0分，轻度缺损(+)记1分，中度缺损(++)记2分，重度缺损(+++)记3分；
支气管水肿评分值A5(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分。
以肺泡完整性评分值A1+肺上皮细胞水肿评分值A2+炎症细胞浸润评分值A3+支气管上皮完整性评分值A4+支气管水肿评分值A5之和为肺部DAI值。
本发明经实验研究验证，当0分≤DAI值<8.5分，分值过低，不能很好反映出吸烟损伤。
当8.5分≤DAI值≤12.5分，为较好的评价吸烟对小鼠肺脏器官出现病理效应疾病活动的区间，可从损伤的器官局部及整体反映肺脏器官局部免疫病理的变化及全身免疫系统和功能的改变。
当12.5分<DAI值≤15分，该区间内会引起肺部COPD等严重并发症，与生理条件相差较大，不能完整地反应吸烟对肺部的影响。
经过大量实验验证及创造性分析，本发明将吸烟条件设定为卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，实验小鼠的DAI值介于8.5-12.5分之间，在上述吸烟的剂量、时间与效应条件下，肺脏器官病理疾病活动指数(DAI)评分出现的病理效应可反映肺脏器官局部免疫病理的变化，并探讨全身免疫系统和功能的改变关系，为较佳的吸烟模拟条件，可用于建立适用于评价吸烟对动物机体免疫系统及功能影响的动物模型。
本发明提供的一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法，包括如下步骤：将实验小鼠置于吸烟气体染毒仪附带的密封染毒舱室中，设定染毒舱室空间内卷烟烟气体积浓度为60％，1次/日，吸烟10～40min/次/日，连续吸烟30天，得到评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型。
优选的，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，分别设定鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟10min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟40min/次/日，连续吸烟30天，得到3组动物模型。
更优选的，所述评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型的构建方法中，设定卷烟烟气浓度为60％，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天，得到动物模型。
另外，本发明构建出的动物模型可在评价卷烟烟气对动物免疫系统损伤中的应用。通过该动物模型提供的一种合理的模拟吸烟条件即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，应用于评价不同组成的卷烟燃烧后动物在该卷烟烟气条件下吸烟对其机体免疫系统及功能的影响。
本发明构建出的动物模型可在研制低毒性卷烟中的应用。通过该动物模型提供的一种合理的模拟吸烟条件，即60％吸烟烟雾浓度、1次/日、10～40min/次/日、连续吸烟30天，应用于评价不同组成的卷烟燃烧后动物在该卷烟烟气条件下吸烟对机体免疫系统及功能的影响；以动物在该卷烟烟气条件下吸烟对机体免疫系统及功能的结果调整卷烟的组方，进而研制低毒性卷烟。
本发明还提供一种卷烟烟气对动物机体免疫系统功能影响的评价方法，其包括如下步骤：
1)将实验动物置于密封空间中，设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60％、10～40min/次/日、1次/日，连续吸烟30天；
2)通过对步骤1)处理后的实验动物进行机体免疫系统损伤检测，评价卷烟燃烧后的烟气对动物机体免疫系统的影响。
进一步，步骤2)中，所述对步骤1)处理后的实验动物进行机体免疫系统损伤检测包括：检测实验动物吸烟前后肺脏局部肺泡灌洗液中细胞量及分泌细胞因子量变化；检测实验动物吸烟前后肺脏组织细胞因子变化；检测实验动物吸烟前后肺脏免疫相关基因及分子的表达变化；检测实验动物吸烟前后免疫系统中CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例的变化及T淋巴细胞中CD69、CD25、MHC II的表达情况；检测实验动物吸烟前后脾脏中B细胞各亚群比例变化及血清中IgM、IgG、IgA、IgD、IgE的表达情况评估吸烟对动物获得性免疫功能的影响。
再，所述检测实验动物肺泡灌洗液中细胞量及分泌细胞因子量变化中所述细胞量为巨噬细胞含量、NK细胞含量、中性粒细胞含量，所述分泌细胞因子量为炎症因子表达量，所述炎症因子包括IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶。
本发明所述免疫相关基因及分子包括巨噬细胞表达的CD40、CD80、CD86、Ia及炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α。所述B细胞亚群包括FoB(滤泡B细胞)和MZB(边缘区B细胞)。
本发明以动物机体天然免疫为研究内容的主线，结合机体特异性免疫，通过整体动物的研究方法，考察出烟草烟气对动物机体免疫系统影响的剂量和时间，并在上述模拟吸烟条件下建立动物模型，从而方便、准确地从免疫细胞、免疫分子水平得到不同烟草烟气对机体免疫系统的影响，评价出卷烟烟气对动物机体免疫系统功能影响，得到烟草对机体免疫系统的损伤情况。
本发明的有益效果：
本发明提供的构建方法建立了卷烟烟气对免疫系统功能毒性作用的实验动物模型，该动物模型从肺脏局部、免疫器官及整体免疫方面较系统、全面地反映吸烟对动物免疫系统的影响。该动物模型的建立有助于认识并系统评价吸烟对动物机体免疫系统的影响与作用特点，也可为烟草降害的判断提供实验数据，进而研制出低毒性卷烟，为无法戒烟者提供减害产品。
附图说明
图1为本发明实施例1小鼠吸烟30天后肺部典型病理表现照片。
图2为本发明实施例2烟气染毒后，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞Ly6G变化典型图。
图3为本发明实施例2烟气染毒后，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞CD3变化典型图。
图4为本发明实施例2为吸烟对小鼠肺泡灌洗液上清中炎症因子和溶菌酶产生的影响。
图5为本发明实施例4吸烟小鼠肺部表达谱的Heatmap分析。
图6为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD40表达的影响。
图7为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD80表达的影响。
图8为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子CD86表达的影响。
图9为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞表面分子la表达的影响。
图10为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞细胞炎性因子产生的影响。
图11为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD40针对LPS的反应性的影响。
图12为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD80针对LPS的反应性的影响。
图13为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞CD60针对LPS的反应性的影响。
图14为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞la针对LPS的反应性的影响。
图15为本发明实施例5吸烟对小鼠巨噬细胞针对LPS的反应性产生炎性因子的影响。
图16为本发明实施例6吸烟对小鼠胸腺淋巴细胞比例的影响。
图17为本发明实施例6吸烟对脾脏淋巴细胞比例的影响。
图18为本发明实施例6小鼠吸烟后T细胞对conA刺激后CD25、CD69及Ia分子的表达。
图19为本发明实施例6小鼠吸烟30天后对脾脏T细胞增殖能力与细胞因子分泌能力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1小鼠吸烟浓度、时间的生物学效应模式与免疫损伤实验模型的建立
如何评价吸烟的生物学效应是关乎后续开展的吸烟对机体免疫系统即功能影响的首先面临的问题。由于吸烟首先影响的是肺脏器官，且机体免疫系统分布于机体的每个器官和组织包括肺脏中，因此，本实施例采用对吸烟后小鼠肺部病理疾病活动指数(DAI)评分的方法研究吸烟的剂量和时间与效应的关系，用于免疫系统及功能的影响评价。
吸烟后小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分方法及标准如下：
肺泡完整性评分值A1(0-3分)：肺泡完整(-)记0分，轻度损伤(+)记1分，中度损伤(++)2分，重度损伤(+++)3分；
肺上皮细胞水肿评分值A2(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分；
炎症细胞浸润评分值A3(0-3分)：无浸润(-)记0分，少量浸润(+)记1分，中度浸润(++)记2分，大量浸润(+++)记3分；
支气管上皮完整性评分值A4(0-3分)：完整(-)记0分，轻度缺损(+)记1分，中度缺损(++)记2分，重度缺损(+++)记3分；
支气管水肿评分值A5(0-3分)：无水肿(-)记0分，轻度水肿(+)记1分，中度水肿(++)记2分，重度水肿(+++)记3分。
以肺泡完整性评分值A1+肺上皮细胞水肿评分值A2+炎症细胞浸润评分值A3+支气管上皮完整性评分值A4+支气管水肿评分值A5之和为肺部DAI值。
本发明经实验研究验证，当0分≤DAI值<8.5分，分值过低，不能很好反映出吸烟损伤。
当8.5分≤DAI值≤12.5分，为较好的评价吸烟对小鼠肺脏器官出现病理效应疾病活动的区间，可完整地、显著地出现反映肺脏器官局部免疫病理的变化及全身免疫系统和功能的改变。
当12.5分<DAI值≤15分，该区间内会引起肺部COPD等严重并发症，与生理条件相差较大，不能完整地反应吸烟对肺部的影响。
将实验小鼠(C57BL/6小鼠)随机分组(分5组，每组20只)，将动物置于动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)中，设定小鼠染毒烟雾浓度为20％、40％、60％、80％，分别吸烟10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日，连续吸烟30天；正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验。
本实施例中烟雾来源于江西中烟工业有限责任公司提供的对照卷烟(生产批号为20150225-0)，经过智能吸烟机(HRH-SM120)将烟雾输入动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)的密封染毒舱室中，并设定染毒舱室空间内所需的卷烟烟气浓度。
对不同吸烟条件下小鼠肺部病理切片进行了DAI评分，评分结果参见表1。
由表1可知，第15-18组、第19-21组、第22-23组、第25组的DAI评分在8.5分≤DAI值≤12.5分范围内，但是相对应第19-21组，第15组的每天每次吸烟时间过长，第16-18组、第22-23组的连续吸烟天数过长，第25组的烟雾浓度过高，因此，综合考虑实验时间及成本与DAI分数，较佳的吸烟评价模拟条件是：60％吸烟浓度、1次/日、10-40min/次/日、连续吸烟30天；最佳评价条件是60％吸烟浓度、1次/日、20min/次/日、连续吸烟30天。
表1小鼠肺部病理进行疾病活动指数(DAI)评分表
图1为第19-21组小鼠吸烟30天后肺部典型病理表现照片及对照组小鼠肺部照片，发现未吸烟的对照组肺泡结构明显，结构清晰，肺泡腔中及间质无出血水肿情况(参见图1A)；吸烟10min/日组与吸烟20min/日组小鼠的部分肺泡可见水肿，少部分区域出现免疫细胞浸润(参见图1B、图1C)；吸烟40min/日组小鼠可见显著的肺泡充血，可见灶性淤血或出血(参见图1D)。因此，以60％对照卷烟的烟雾浓度连续30天吸烟可导致肺脏的炎症病理，以40min/次/日尤为明显。
实施例2利用动物模型评价吸烟对小鼠肺部区域性免疫功能的影响
本实施例中烟雾的来源于江西中烟工业有限责任公司提供的对照卷烟(生产批号为20150225-0)，经过智能吸烟机(HRH-SM120)将烟雾输入动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)的密封染毒舱室中，并设定染毒舱室空间内所需的卷烟烟气浓度
将动物置于动物吸烟气体染毒仪(HRH-CSED-K)中，设定小鼠染毒烟雾浓度为60％，吸烟1次/日，分别吸烟10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日；正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验。本实施例检测了该模式烟雾下吸烟对小鼠肺泡灌洗液中细胞含量的变化及细胞因子表达的情况。
首先，对小鼠支气管进行灌洗，利用流式细胞仪(FACS)对支气管进行灌洗液(BALF)中免疫细胞亚群进行了测定，肺泡灌洗液中细胞量测定结果参见表2，小鼠支气管灌洗液中固有免疫细胞变化典型图参见图2-图3。
由表2可知，小鼠在60％烟雾下吸烟20min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞含量均增加(P<0.05)，但吸烟10min/日30天组的肺泡灌洗液细胞含量与对照细胞相比增加不明显，而在吸烟40min/次/日的卷烟烟气吸烟30天后，与对照细胞相比，肺泡灌洗液细胞含量显著增加(P<0.01)。
同时，由表2及图2-3可知，FACS检测免疫细胞亚群比例发现，吸烟后小鼠BALF中巨噬细胞(CD11b+Ly6G-)、NK细胞(NK1.1+CD3-)差异并不明显，但中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)、和NKT(NK1.1+CD3+)细胞的比例均有所上调，吸烟20min组小鼠上调最为显著，40min组小鼠发生下调。
表2.不同模式吸烟对小鼠肺泡灌洗液中细胞量的影响
| 组别 | 巨噬细胞(％) | 中性粒细胞(％) | NK细胞(％) | NKT细胞(％) |
| 0min | 3.3±0.3 | 46.1±3.1 | 6.0±0.8 | 27.9±5.2 |
| 10min | 2.9±0.2* | 58.2±4.8** | 8.5±1.1** | 48.4±6.3** |
| 20min | 0.7±0.2** | 83.3±4.9** | 4.8±1.3 | 73.4±8.4** |
| 40min | 1.9±0.2** | 57.7±4.2** | 6.5±1.2 | 39.9±5.7** |
与0min组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝5。
本实施例还检测了吸烟对小鼠肺泡灌洗液上清中炎症因子及溶菌酶表达情况的影响，上清中IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶含量采用检测试剂盒检测。检测方法包括：将100微升待测上清加入包被好IL-1等抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，在吸水纸上控干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上控干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟，每孔加入50微升终止液混匀30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，以690nm的波长矫正，制作标准曲线测定待测样品的含量。
检测结果参见图4，由图4可知，在吸烟10min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液上清中IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP、溶菌酶含量均增加(P<0.05)；在吸烟20min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞表达IL-1、IL-6、TNF、溶菌酶(LYZ)含量均增加(P<0.01)；而在吸烟40min/次/日、30天后，小鼠肺泡灌洗液中细胞表达IL-1、IL-6、TNF、hs-CRP含量也增加(P<0.05)，但溶菌酶含量降低，提示烟雾浓度为60％、吸烟1次/日、40min/次/日、连续吸烟30天可抑制溶菌酶的产生。
实施例3利用动物模型评价吸烟对小鼠体重、免疫器官的影响
本实施例评价了小鼠染毒烟雾浓度为60％条件下，吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日，吸烟1个月后小鼠体重及免疫器官的影响。正常对照组不吸烟。1个月后中止吸烟，进行相应的实验秤取小鼠体重的变化；处死小鼠后去脾脏、胸腺。分析天平称重，计算免疫器官系数。
小鼠吸烟后，各组小鼠免疫器官胸腺、脾脏重量及其系数结果如表3-5所示。由表3-5可见，在烟雾浓度60％条件下，吸烟20min/次/日、40min/次/日，吸烟30天后均可导致小鼠体重的减轻；与未吸烟组比较，实验组小鼠胸腺、脾脏系数均明显降低，表明在烟雾浓度60％条件下，吸烟20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后对小鼠免疫器官产生了效应。
表3.小鼠吸烟10min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.6±3.3 | 25.1±3.2 | 24.7±3.4 | 24.1±4.2 | 24.5±5.1 |
| 脾系数[％] | 0.41±0.03 | 0.40±0.02 | 0.39±0.02 | 0.385±0.02 | 0.38±0.02* |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.02 | 0.25±0.02 | 0.23±0.02 | 0.23±0.04 | 0.22±0.05 |
与0min组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝10
表4.小鼠吸烟20min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.5±3.7 | 24.9±3.6 | 23.7±3.4 | 22.9±4.6 | 21.8±5.4** |
| 脾系数[％] | 0.42±0.02 | 0.40±0.04 | 0.39±0.03* | 0.35±0.03** | 0.32±0.02** |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.01 | 0.24±0.02 | 0.23±0.03 | 0.19±0.03* | 0.17±0.04** |
与0min组比较，**p<0.01；n＝10
表5.小鼠吸烟40min/次/日1个月后免疫器官重量及系数结果
| 染毒浓度 | 0％ | 20％ | 40％ | 60％ | 80％ |
| 体重(g) | 25.4±3.5 | 24.9±3.7 | 23.7±4.4 | 20.1±4.6** | 19.5±5.4** |
| 脾系数[％] | 0.41±0.03 | 0.37±0.02* | 0.33±0.02* | 0.31±0.01** | 0.27±0.02** |
| 胸腺系数[％] | 0.25±0.03 | 0.24±0.04 | 0.22±0.06* | 0.16±0.04** | 0.16±0.05** |
与0min组比较，**p<0.01；n＝10
实施例4利用动物模型评价吸烟对小鼠肺脏免疫相关基因表达的影响
随机选取以60％对照卷烟的烟雾浓度连续30天的10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日组各一小鼠的右侧肺叶，采用mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Cat#AM1560,Ambion,Austin,TX,US)，根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)电泳质检合格后备用。之后实验样品RNA采用Agilent表达谱芯片配套的试剂盒，按照标准操作流程的标记部分对样品中的mRNA分子进行荧光标记。按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，mRNA Complete Labeling and Hyb Ki的杂交部分，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization Oven，55℃，20rpm，滚动杂交20小时。杂交完成后在洗缸staining dishes中洗片，洗片所用的试剂为Gene ExpressionWash Buffer Kit。芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用FeatureExtraction software 10.7读取数据，软件设置Scan resolution＝5μm,PMT 100％，5％最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Quantile，使用Illumina高通量测序平台检测其基因表达差异，将测序结果进行比对，筛选Log2(countingnumber)>3的结果进行分析，heatmap分析结果如图5所示。
由图5结果显示，IL-6与溶菌酶(LYZ)在吸烟10min/日与20min/日、30天后中出现上调，在40min/日组出现显著的下调，免疫抑制因子SOCS2在所有吸烟组中出现下调。上述结果表明，小剂量吸入香烟后会导致肺部区域免疫相关基因的活化，介导肺部炎症反应性的增强；而大剂量吸入香烟烟气后可介导肺部炎症损害，并导致肺部区域免疫相关基因表达的显著抑制。
实施例5利用动物模型评价吸烟对小鼠巨噬细胞细胞功能的影响
机体免疫系统中的巨噬细胞作为专职的抗原提呈细胞，具有吞噬和杀伤病原体细胞等可以物质的能力，在介导天然免疫应答的过程中起着重要的作用。为了探究烟草烟气对小鼠巨噬细胞的免疫功能的影响，本实施例研究小鼠以60％的吸烟烟雾浓度、吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日、共计30天后，机体腹腔巨噬细胞的功能变化。
取上述吸烟及对照组小鼠，收集腹腔巨噬细胞至15ml离心管中，1000转离心10分钟，弃上清；加入10ml Tris-NH4CL室温破红约10分钟，1000转离心10分钟，弃上清；PBS洗涤一遍，加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)500微升重悬，分管；每管分别加入0.3微升CD40-FITC、CD80-PE、CD86-PERCP、Ia-APC流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，1000转离心10分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，通过FACS检测巨噬细胞表面各类免疫分子的表达，检测结果分别参见图6-图9。由图6-图9可知，吸烟可导致巨噬细胞CD40、CD80、CD86及Ia的上调表达，吸烟20min/次/日组小鼠上调尤为明显，40min/次/日组发生下调。
本发明检测了小鼠以60％的吸烟烟雾浓度、吸烟时间分为10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日、共计30天后，收集机体腹腔巨噬细胞培养上清，将100微升待测上清加入包被好IL-1、IL-6、TNF-α抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，在吸水纸上控干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上控干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟，每孔加入50微升终止液混匀30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，以690nm的波长矫正。IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表达结果参见图10。由图10可知，显示吸烟20min/次/日组小鼠上调尤为明显，40min/次/日组发生下调。上述结果提示，吸烟可活化小鼠巨噬细胞，激活天然免疫应答。但吸烟40min/次/日则可造成小鼠巨噬细胞活化抑制，导致天然免疫应答被抑制。
进一步采用内毒素(LPS)再刺激各组小鼠腹腔巨噬细胞，以检测巨噬细胞对危险刺激的反应性，结果分别参见图11-图14。由图11-图14发现，相比对照组，各组巨噬细胞CD40、CD80、CD86、Ia表面分子均发生不同程度下调，40minn/次/日组下调最为显著。
进一步采用内毒素(LPS)再刺激各组小鼠腹腔巨噬细胞，以检测巨噬细胞对危险刺激的反应性及其产生免疫物质的影响，结果参见图15。由图15发现，相比对照组，各组巨噬细胞IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子的表达也发生了不同程度的下调，同样以吸烟40min/次/日组下调最为显著。提示吸烟40min/次/日组可显著抑制巨噬细胞对抗原的反应性。
实施例6利用动物模型评价吸烟对小鼠获得性免疫功能的影响
烟草烟气对获得性免疫系统的作用机制尚不明确，可能有以下几种作用途径：首先，对细胞免疫的影响。①烟草中的尼古丁在被肺部吸收后，随着血液进入血脑，刺激交感肾上腺系统，能显著加快促肾上腺皮质激素的分泌，并瞬时快速诱导某些蛋白的表达，从而增加血浆中儿茶酚胺以及肾上腺皮质激素的浓度，而儿茶酚胺、肾上腺皮质激素都对细胞免疫有一定的抑制作用。②T淋巴细胞的增殖和生长都需要白介素2(IL-2)，而IL-2只有与膜白介素2受体(mIL-2R)结合才能发挥免疫调节作用。烟雾中的众多有害物质，如苯并芘、丙烯醛等会刺激免疫活性细胞，引起血清中可溶性白介素2受体(sIL-2R)浓度升高，sIL-2R是一种免疫抑制物质，会与mIL-2R竞争结合IL-2，抑制IL-2的免疫调节作用。
其次，对体液免疫的影响。目前国内外针对吸烟对体液免疫的作用机制研究较少，大部分学者都从吸烟影响B淋巴细胞的生长、增殖等角度探讨吸烟对免疫球蛋白的影响，但具体的影响机制不明。同时，烟草中的有些危害物质会对B淋巴细胞的DNA造成损害，从而影响B细胞的增殖；有学者认为高浓度烟雾会抑制细胞信号转导系统的功能，从而干扰B淋巴细胞的增殖。
本实施例从居住特异性(获得性)免疫功能的细胞即T淋巴细胞、B淋巴细胞的主要免疫器官脾脏及淋巴结入手，分析吸烟对其重量、T淋巴细胞、B淋巴细胞的组成及功能探讨吸烟的可能作用。
本实施例探讨了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后脾脏组织的变化。取吸烟30天的各组小鼠的脾脏，称重后，研磨制备成为单个细胞悬液。应用流式细胞仪计数并分析CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例的改变。小鼠胸腺中T淋巴细胞含量结果参见表6，小鼠脾脏中T淋巴细胞含量结果参见表7，图16-图17为吸烟对小鼠脾脏淋巴结胸腺及淋巴细胞比例的影响结果。
由表6-7及图16-图17可知，在吸烟后小鼠胸腺中及脾脏中CD8+T细胞比例在吸烟20min/次/日组小鼠时发生显著上调，而在40min/次/日剂量组时有所下降。
表6.吸烟对小鼠胸腺中T淋巴细胞比例的影响
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| CD4+(％) | 9.8±1.8 | 13.4±4.2** | 14.2±3.1** | 8.1±1.5 |
| CD8+(％) | 2.1±0.3 | 2.2±0.4 | 4.8±0.8** | 1.6±0.6 |
表7.吸烟对小鼠脾脏中T淋巴细胞比例的影响
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| CD4+(％) | 12.5±3.4 | 14.4±2.1* | 16.7±3.2** | 16.6±1.4** |
| CD8+(％) | 7.3±0.4 | 11.3±0.6** | 10.4±0.3** | 10.6±0.3** |
B2即通常指的B细胞，为CD5-B细胞，主要识别蛋白质抗原。在Th细胞的辅助下，B2细胞才能被完全激活并介导对T细胞依赖抗原的免疫应答，产生特异性抗体。B2细胞介导的免疫应答特点为：可发生体细胞突变，有亲和力成熟，产生高亲和力抗体，可产生免疫记忆细胞。B2细胞按照分布位置不同分为FoB(滤泡B细胞)和MZB(边缘区B细胞)，表型分别为B220+CD23hiCD21low和B220+CD23lowCD21hi。
本实施例检测了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后脾脏组织中B2细胞各亚群含量，检测方法如下：处死小鼠后，无菌取脾，200目钢网研磨，3000转离心5min，弃上清，以15ml Tris-NH4CL室温破红10min，3000转离心5min；PBS洗一遍后加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)500微升重悬，分管；每管分别加入0.3微升CD23-FITC、、CD23-PE、B220-PERCP流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，3000转离心10分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，通过FACS检测B2细胞亚群，结果参见表8。
由表8可知，吸烟20min/次/日时，脾脏中FoB与MZB比例均增加，但40min/次/日时，这一现象存在被逆转趋势。
表8.小鼠吸烟后脾脏中B2细胞各亚群变化
T淋巴细胞在活化过程中会表达一些特殊的分子，如CD69(较早期)、CD71(早期)、CD25(晚期)、HLA-DR(较晚期)以及黏附分子CD62L和CD44等。本实施例采用磁珠分选染毒小鼠脾脏CD4+CD62+naive T细胞，conA刺激，并流式检测CD69、CD25以及MHC II的表达情况，以评估染毒后小鼠T细胞活化能力变化，具体操作如下：
磁珠分选CD4+CD62+naive T细胞：无菌取小鼠脾脏，200目钢网研磨，吸入15ml离心管，1200rmp离心5min。弃除上清，加入8-10ml/管Tris-NH4Cl，破红，1200rmp离心5min，弃上清获取单个核细胞悬液，计数后取1×108个细胞用于分选。离心后用分选缓冲液重悬至200μl，加入20μl磁珠混匀，4℃继续避光孵育15min，加10ml分选缓冲液后离心弃上清并用500μl分选缓冲液重悬。离心期间安装MACS LD分选柱，2ml分选缓冲液润柱3次，将重悬细胞混匀加至LD柱，液体留空后加分选缓冲液1ml×3次洗柱，无菌离心管收集流出的未标记细胞悬液即为CD4+T细胞，将收集到的CD4+T细胞离心后用分选缓冲液重悬至400μl，加结合磁珠的CD62L分选抗体20μl，4℃避光孵育10min，10ml分选缓冲液重悬并离心，弃上清后用分选缓冲液500μl重悬。安装MS柱并用500μl缓冲液润柱3次，将500μl细胞悬液混匀后加至MS柱，待悬液流空加500μl×3次洗柱，洗柱完成后加1ml分选缓冲液至MS柱，将MS柱取下放至新的无菌离心管，取配套栓塞用力挤压液体，栓塞挤压后冲出分选柱部分细胞悬液即为CD4+CD62L+naive T细胞；
体外培养并以conA刺激培养24小时后收集至1ml离心管中，3000转离心5分钟，弃上清；PBS洗涤一遍，加入1x流式Buffer(PBS+2％BSA)100微升重悬；每管加入0.3微升CD69-FITC、CD25-PE以及MHC II-APC流式抗体，轻轻混匀，避光孵育15-30分钟；PBS洗涤两遍，3000转离心5分钟，弃上清；每管加入200微升流式Buffer重悬，立即上样检测，以评估染毒后小鼠T细胞活化能力变化。
小鼠吸烟后T细胞对conA刺激后CD25、CD69及Ia分子的表达结果参见图18，结果显示，染毒小鼠脾脏
T细胞的活化能力与染毒剂量成剂量递增关系，20min/次/日时到达顶峰，40min/次/日时这一趋势消失。
使用磁珠分选法调取CD3+T细胞(H-2b)，采用ConA刺激，5％CO2培养箱孵育50小时后吸取上清液100ul，用于检测IL-2、IFN-gmma的表达水平；加入CCK8试剂继续培养20小时后，检测T细胞的增殖，结果参见图19。具体操作如下：
使用磁珠分选法调取CD3+T细胞(H-2b)：采用美天妮CD3分选磁珠。处死小鼠，无菌取脾脏，200目钢网研磨。吸入15ml离心管，1200rmp离心5min。弃除上清，加入8-10ml/管Tris-NH4Cl,破红，1200rmp离心5min，弃上清。加入120微升/管PBSE，混匀。加入10微升/管磁珠，混匀后4℃15min,中间混一次。加入15毫升/管PBSE，混匀，1500rmp离心10min后弃上清，2ml PBSE重悬。取无菌阳选柱，2mlPBSE洗3次。重悬好的细胞过柱子，再过2mlPBSE，洗两遍。取下柱子，加入2ml PBSE，迅速打出磁铁吸附的细胞，冲洗两次。收集细胞至离心管，1200rmp离心5min后弃上清，采用ConA刺激，5％CO2培养箱孵育50小时后吸取上清液100ul，用于检测IL-2、IFN-gmma的表达水平(将100微升待测培养上清加入包被好IL-2、IFN-gmma抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，印干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，印干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟；每孔加入50微升终止液混匀；30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值)；加入CCK8试剂继续培养20小时后，检测T细胞的增殖(细胞增殖实验采用CCK8检测，按照操作说明取对数生长期的细胞，以每孔100μL体积，5×103个/孔细胞铺于96孔板，每组设置6个复孔，96孔板四周的孔分别加入等量PBS，防止边缘效应。细胞培养72小时后，加入10μL CCK8试剂，37℃，孵育2小时，于450nm波长处测定OD值，结果参见图19。
由图19结果发现，10min/次/日与20min/次/日吸烟30天后对脾脏的质量、脾脏T细胞产生IL-2、IFN-γ的水平均无显著影响，40min/次/日吸烟30天后对脾脏质量、脾脏T细胞产生IL-2、IFN-γ有降低，同时对T细胞的增殖有一定的抑制作用(P<0.05。上述结果提示，10min/日、20min/日吸烟30天后对脾脏免疫功能无显著影响。
体液免疫中，主要是通过B淋巴细胞合成并分泌的免疫球蛋白发挥作用，包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE五类。IgM是免疫应答出现较早抗体，IgG是免疫应答中最主要的免疫球蛋白，而IgA可在黏膜表面发挥作用，选择这3个指标，能较完整且较准确地观察体液免疫的功能和状态。
本实施例检测了60％烟雾下小鼠10min/次/日、20min/次/日、40min/次/日吸烟30天后小鼠血清中免疫球蛋白水平，具体操作方法为：在使用之前，所有的试剂盒组分都恢复到18-26摄氏度，试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。取出已包被的反应板，并在记录表上标记好每个样本位置。根据检测需要取出所需要的数量反应条，将未使用的反应条放回密封袋于2-8摄氏度保存。将100微升待测BALF加入包被好IgA、IgM、IgG抗体的孔板中；分别加入第一抗体工作液200微升，反应板充分混匀后室温下放置2小时，洗涤反应板3次，印干；每孔加酶标抗体工作液200微升，室温下孵育2小时；用洗涤液将反应板充分洗涤3次，印干；每孔加底物工作液100微升，室温处反应30分钟；每孔加入50微升终止液混匀；30分钟内在96孔板微量分光光度仪上，在490nm波长处测OD值，结果参见表9。
由表9结果显示，与对照组相比，实验组血清中IgM、IgG、IgA均增高，且以20min/次/日组最为明显，但40min/次/日组则略有下降，其可能是免疫系统受损的结果。
表9.小鼠吸烟30天小鼠血清中免疫球蛋白水平
| 染毒浓度 | 0min/次/日 | 10min/次/日 | 20min/次/日 | 40min/次/日 |
| IgA(μg/ml) | 2.16±0.31 | 3.23±0.62 | 4.38±0.54 | 3.33±0.45 |
| IgG(μg/ml) | 14.20±1.36 | 14.83±0.86 | 17.95±0.77 | 14.37±1.52 |
| IgM(μg/ml) | 1.35±0.23 | 1.45±0.29 | 1.41±0.63 | 1.17±0.63 |
Claims (1)
1.一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将实验小鼠置于密封室中，分别设定小鼠染毒的卷烟烟气浓度为60%，1次/日，吸烟10min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60%，1次/日，吸烟20min/次/日，连续吸烟30天；卷烟烟气浓度为60%，1次/日，吸烟40min/次/日，连续吸烟30天；且8.5分≤肺部DAI值≤12.5分，得到3组动物模型；
所述肺部DAI值是通过吸烟后小鼠肺部病理DAI评分体系得到的，所述吸烟后小鼠肺部病理DAI评分体系为：
肺泡完整性评分值A1，所述肺泡完整性评分值A1的范围为0-3分：肺泡完整记0分，轻度损伤记1分，中度损伤2分，重度损伤3分；
肺上皮细胞水肿评分值A2，所述肺上皮细胞水肿评分值A2的范围为0-3分：无水肿记0分，轻度水肿记1分，中度水肿记2分，重度水肿记3分；
炎症细胞浸润评分值A3，所述炎症细胞浸润评分值A3的范围为0-3分：无浸润记0分，少量浸润记1分，中度浸润记2分，大量浸润记3分；
支气管上皮完整性评分值A4，所述支气管上皮完整性评分值A4的范围为0-3分：完整记0分，轻度缺损记1分，中度缺损记2分，重度缺损记3分；
支气管水肿评分值A5，所述支气管水肿评分值A5的范围为0-3分：无水肿记0分，轻度水肿记1分，中度水肿记2分，重度水肿记3分；
以肺泡完整性评分值A1、肺上皮细胞水肿评分值A2、炎症细胞浸润评分值A3、支气管上皮完整性评分值A4与支气管水肿评分值A5之和作为肺部DAI值。
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