CN102788874A - 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 - Google Patents
一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102788874A CN102788874A CN2011101252650A CN201110125265A CN102788874A CN 102788874 A CN102788874 A CN 102788874A CN 2011101252650 A CN2011101252650 A CN 2011101252650A CN 201110125265 A CN201110125265 A CN 201110125265A CN 102788874 A CN102788874 A CN 102788874A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- test
- tree shrew
- cigarette
- chinese tree
- chinese
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 241000288906 Primates Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000006378 damage Effects 0.000 title abstract description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title abstract description 8
- 241001033908 Tupaia chinensis Species 0.000 claims abstract description 59
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 15
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 241000288667 Tupaia glis Species 0.000 claims description 14
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 241000288754 Scandentia Species 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000011809 primate model Methods 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 4
- -1 biochemistry Substances 0.000 claims description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 4
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 206010013183 Dislocation of vertebra Diseases 0.000 claims description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 3
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 claims description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 claims description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 241001582888 Lobus Species 0.000 claims description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 claims description 2
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 claims description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 2
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003546 flue gas Substances 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 239000003517 fume Substances 0.000 claims description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 claims description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 22
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000779 smoke Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 abstract 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000000862 serotonergic effect Effects 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 4
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 2
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 2
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 2
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000954 anitussive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000386 athletic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000026781 habituation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004007 neuromodulation Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 229940072644 pitressin Drugs 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000013417 toxicology model Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,属于卷烟毒理学评价及相关技术检测领域。本方法选用中国树鼩作为试验动物,采用一种特殊设计的主动吸烟装置,使受试动物处于模拟抽烟的状态,进而观察动物在该状态下的情况,测得真实的试验数据,对卷烟有害程度进行合理的评价。本发明的优点是采用特有的生物学分类较高的中国树鼩进行烟草毒理及减毒机制的评价研究,由于其不仅对于卷烟烟气产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点,同时本方法所采用的评价体系较为完善,评价费用较为低廉,评价结果相对于其他实验动物更具有比较医学价值,适用于卷烟减害功效的评价。
Description
技术领域
本发明属于卷烟毒理学评价及相关技术检测领域,具体涉及一种用灵长目动物构建卷烟减害功效的评价方法。
背景技术
现有技术中,为了减少吸烟给人类带来的危害,世界卫生组织(WHO)已将“反吸烟”列为二十一世纪卫生领域的三大主要行动目标(抗疟疾、反吸烟和助贫困)之一。在评价吸烟对机体损害时,有必要建立一个合适的吸烟动物模型来研究烟雾所含毒物的损伤机制。
目前,用于吸烟染毒试验的动物主要有啮齿目(如小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等)和灵长目动物如猴子等。肺癌动物模型也多选择小鼠、大鼠、地鼠、羊和狗等动物,还没有关于猿猴等灵长类的报道。从与人类的相似性考虑,采用猴子、猩猩等作为动物模型最好,但是猴子和猩猩等大型灵长类动物数量少、价格昂贵、遗传和饲养管理困难。
中国树鼩(Tupaia Belangeri Chinensis)是中国特有的小型灵长目实验动物,为低等灵长目动物。中国树鼩其脑重与体重之比为1∶45,与人的1∶40和猕猴的1∶45极为相似。既往研究表明:中国树鼩的视上核主部出现OT(催产素,Oxytoc in)能神经元的部位在终板血管器头侧,距第三脑室最前壁约90μm处,相对于大鼠的视上核终板血管器更前;中国树鼩的室旁核尾侧部OT能及VP(加压素,Vasopressin)能神经元的分布也比大鼠的要复杂。同时,中国树鼩视上核和室旁核OT能神经元胞体数目比大鼠的要多得多,说明其OT能神经元所接触的神经调控表面积要比大鼠的精细,并复杂得多。而VP能神经元胞体比OT能神经元的大,与人类的相似,这也是中国树鼩属于灵长目的一个可能的佐证。因此,这种小型、廉价的灵长目动物已经广泛用于医学研究,包括病毒、神经、消化、泌尿、生殖、免疫和社会生物学方面。
现有技术中,动物染毒试验的吸入接触途径有两种,一种是静式吸入,一种是动式吸入。静式吸入是将实验动物置于一个称为染毒箱的密闭容器内,加入一定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物,在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境,对动物进行试验。动式吸入是将实验动物置于空气流动的染毒箱中,染毒箱装备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统,在动态环境下对动物进行试验。卷烟行业也需要对烟草的毒性进行动物试验,但现有技术的动式吸入系统不适用于烟草的动物试验。
发明内容
针对现有技术的上述不足,本发明要解决的技术问题是提供一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,本方法选用中国树鼩作为试验动物,采用一种特殊设计的主动吸烟装置,使受试动物处于模拟抽烟的状态,进而观察动物在该状态下的情况,测得真实的试验数据,对卷烟有害程度进行合理的评价。
本发明的技术方案是一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,含有用于动物实验的主动吸烟装置,这种装置是本申请人的另一实用新型专利,专利号为:2008201907603,实用新型名称为“用于动物实验的主动吸烟装置”。本发明的方法按以下步骤依次进行:
[1]将一或数只小型灵长目实验动物中国树鼩,每日定时置于用于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内;
[2]开启所述主动吸烟装置的模拟抽烟系统的真空泵,设置压力为0.03MPa,自控断电重启间隔时间10s,用样品卷烟和对照卷烟分别对中国树鼩进行烟气暴露试验,每天每只中国树鼩在烟气中的暴露剂量为5支烟,中国树鼩在染毒箱内主动吸入烟雾时间为15分钟/只/天,连续暴露时间为12周;
[3]对连续暴露12周的中国树鼩及暴露前的中国树鼩,或以不同的卷烟样品分别对两组不同的中国树鼩连续暴露12周后,进行以下测试:
(1)生物学行为测试:对中国树鼩的饲料摄入率,体重,口腔粘液分泌中的一种或数种进行测试;
(2)血液、生化、抗氧化指标的测试:对中国树鼩的血液学常规指标红细胞,白细胞,血小板,血清生物化学指标天门冬氨酸转换酶,丙氨酸氨基转换酶,碱性磷酸酶,总蛋白,白蛋白,总胆固醇,总胆红素,血糖,尿素氮,肌酐,及球蛋白中的一种或数种进行测试;
(3)生物学标志物表达的测试:包括采用以GAPDH为内参照,对中国树鼩的相关细胞因子mRNA表达相对量进行检测,以中国树鼩GAPDH/CRCX4/MHC-1/TNF-α/MCP mRNA序列设计引物,分别检测外周血,肺组织,心肌组织,支气管组织的相应产物的表达;
(4)组织病理学指标测试:对中国树鼩组织病理组织学变化,及发病例数,肺间质细胞增生的程度,膀胱和前列腺病理组织学检查和测试;
[4]将上述测试数据用统计方法进行计算,将计算结果与对照样的数据进行差异对比,由此对样品卷烟有害程度进行评价。
所述小型灵长目实验动物中国树鼩为中国树鼩云南滇西亚种。
所述的血液、生化、抗氧化指标的测试还包括研究分析烟草暴露对于中国树鼩的造血系统的评价。所述的测试采用全自动血气分析仪和全自动生物化学分析仪进行。
所述生物学标志物表达按以下方法进行:自中国树鼩股静脉采集血液1.2ml置于经肝素抗凝的EP管中;取0.3ml外周血,用红细胞裂解液分离有核细胞,用Trizol溶液处理,提取总RNA;以总RNA为模板,逆转录合成cDNA;PCR反应加入2μl cDNA,50μl反应体系包含10mMTris-HCl,1.5mM MgCl2,50mM KCl,pH 8.3,200μM each dNTP,2μl SYBR Green I荧光染料and 1U TaqDNA polymerase(promega)和0.4μM引物;反应条件:预变性94℃,5min,变性94℃,30s,退火57℃,30s,延伸72℃,30s,共45循环;最后72℃,延伸10min;在退火的过程中搜集荧光信号;用GAPDH作内参照;反应条件:预变性94℃,5min,变性94℃,30s,退火50℃,1min,延伸72℃,2min,共45个循环;最后72℃,延伸10min;在退火的过程中搜集荧光信号,于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照;反应结束后做PCR产物熔解曲线验证PCR产物的特异性;用2-ΔΔCt法计算mRNA的表达量;经颈椎脱臼法处死股动脉放血致死中国树鼩后,取中国树鼩的左肺叶、支气管、心脏组织100mg,加入Trizol 1ml溶液处理,于匀浆器研磨成混悬液,提取总RNA,以总RNA为模板,逆转录合成cDNA;其他步骤同前。
所述组织病理学指标测试按以下方法进行:采用HE染色、图像采集系统来进行;对连续暴露12周的中国树鼩用颈椎脱臼法处死股动脉放血致死后,将其心脏、肺脏、脾脏、肺脏(左叶)、肾脏、脑、胰腺、睾丸、子宫、前列腺组织,置10%中性福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋切片,用HE染色,图像采集系统来进行光镜下观察各器官组织病理学变化。
本发明的优点是采用特有的生物学分类较高的中国树鼩进行烟草毒理及减毒机制的评价研究,由于其不仅对于卷烟烟气产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点,同时本方法所采用的评价体系较为完善,评价费用较为低廉,评价结果相对于其他实验动物更具有比较医学价值,适用于卷烟减害功效的评价。
附图说明
附图1是中国树鼩在动物主动吸烟装置中吸入浓烟的现象示意;
附图2是动物主动吸烟装置结构示意图;
附图3是被试中国树鼩在吸烟后的流涎现象示意;
附图4是被试中国树鼩在吸烟后的咳嗽现象示意;
附图5是被试中国树鼩在吸烟后的咳痰现象示意。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式及有关技术问题作进一步详细的描述。
实施例1
本实施例是对烟草暴露的中国树鼩,以未进行烟草暴露的中国树鼩为对照组,进行本发明方法中的各项测试,结果如下:与未进行暴露的中国树鼩比较,烟草暴露后的中国树鼩呼吸频率明显低于对照组,每分钟咳嗽次数41次到69次之间,其饲料利用率呈出现一过性减少现象;烟雾暴露时,暴露组中国树鼩表现出抑制到兴奋的明显反应,8W后出现对烟雾一定程度的成瘾性;同时发现暴露12W后,暴露组中国树鼩有一例出现明显的神经症状,其运动姿态发生明显改变;烟草暴露12W中国树鼩血清SOD含量明显下降、血清CREA含量明显升高,血清MDA的含量未见明显升高;暴露对于中国树鼩外周血CXCR4及TNF-αmRNA的表达有明显的影响;同时,其支气管CXCR4表达量亦有显著变化;肺脏组织病理组织学变化较对照组严重,从发病例数、肺间质细胞增生的程度都较对照组有明显的区别;膀胱和前列腺:暴露组膀胱内均出现颗粒状凝胶分泌物,前列腺病理组织学检查证实该分泌物来自前列腺,对照组均未见明显的颗粒状凝胶分泌物存在,可见,受试物的刺激作用可能导致前列腺分泌增加,造成膀胱堵塞,进一步导致排尿困难其一系列临床表现。如果试验时间延长,可能刺激前列腺增生等情况发生。出现上述结果可以判定该高等级烟草毒理及减毒研究模型构建成功。
本发明的特点是采用特有的生物学分类较高的中国树鼩进行烟草毒理及减毒机制的评价研究,由于其不仅具有对于香烟烟雾产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点,同时本模型所采用的评级体系较为完善,评价费用较为低廉,评价结果相对于其他实验动物更为具有比较医学价值,适用于烟草减毒作用的评价以及可望作为替代猴子等濒危灵长目实验动物的新型药理、毒理学模型。下表为几种烟草毒理评价方法的比较。
表1、几种烟草毒理评价方法的比较
实施例2
本实施例研究日期为2010年2月到2010年8月。本实施例以灵长目实验动物中国树鼩为研究对象,对比分析中国树鼩置于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内,分别以卷烟样品10号、11号进行烟雾暴露后,对于实验动物中国树鼩的减害作用及其机制。【试验方法】本研究采用由SHZ-D(III)循环水多用真空泵(中国巩义予华仪器有限责任公司生产)、电磁流量计、自动合闭装置组成的动物主动吸烟装置以0.05Mpa的真空压、按照燃烧5支样品烟/只/天的烟气量作为暴露剂量,将中国树鼩于密闭主动吸烟装置内,其净吸入烟雾时间为15mins/d/只。暴露周期为12W。【试验结果】实验结果表明:与10号样品比较,11号样品在暴露过程中的中国树鼩的生物学反应具有明显的变化。其特征表现如下:(1)相对于10号样品,11号样品暴露期中国树鼩的咳嗽次数明显少于10号样品组。暴露4W后,10号样品中国树鼩的咳嗽次数为53±8次,而11号样品中国树鼩的咳嗽次数为15±13次/min;暴露8W后,10号样品中国树鼩的咳嗽次数为53±9次/min,而11号样品中国树鼩的咳嗽次数为18±10次/min;暴露12W后,10号样品中国树鼩的咳嗽次数为59±9次/min,而11号样品中国树鼩的咳嗽次数为21±10次/min。可见11号样品中添加的天然植物提取成分对于中国树鼩具有较明显的镇咳作用。(2)相对于10号样品,11号样品暴露期中国树鼩的兴奋性持续时间明显长,兴奋性起始时间明显快。(3)结果表明:烟雾暴露12W的10号样品组和11号样品组中国树鼩血常规指标仅EOS和EOS%有明显差异(p<0.05)。(4)烟雾暴露4W,10号样暴露组和11号样暴露组BUN指标出现显著区别(P<0.05),10号样暴露组指标明显高于11号样暴露组,反映出10号样暴露组动物肾脏功能障碍较突出;烟雾暴露8W,10号样暴露组和11号样暴露组生化指标无明显差异;烟雾暴露12WS,10号样暴露组和11号样暴露组生化指标无明显差异。(5)烟雾暴露12WS,10号暴露组和11号暴露组动物在气管的CXCR4和TNF-α表达量上有差异,其中第11号样品组中国树鼩的上述两项因子表达量明显高于第10号样品组;与此同时,第11号样品组中国树鼩心脏MCP表达量亦明显高于第10号样品组的表达。(6)11号样品和10号样品暴露12WS后中国树鼩均出现不同程度支气管肺炎,并可见支气管周围肺泡坏死灶,从坏死波及的范围、坏死灶的大小来看,10号样品的病变程度明显比11号样品要高。【结论】试验结果表明:相对于无添加天然植物有效成分的10号卷烟样品,第11号卷烟样品中添加天然植物有效成分能降低对于灵长目实验动物中国树鼩因卷烟烟雾暴露所产生的咳嗽频率,能降低因烟雾暴露所产生的流涎持续时间,表明有效成分具有显著的保护作用,同时,第11号样品中天然植物有效成分能加速烟雾成分引起中国树鼩的起始性兴奋性时间,能有效延长中国树鼩的兴奋性维持时间;第11号样品中天然植物有效成分能显著性地刺激炎性因子CXCR4以及抗肿瘤因子如TNF-α在外周血以及靶向组织中的表达。天然植物有效成分对于延缓和减轻卷烟有害物质对于肺组织的病理性损害具有一定的保护作用。
Claims (6)
1.一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,含有用于动物实验的主动吸烟装置,其特征在于所述的方法按以下步骤依次进行:
[1]将一或数只小型灵长目实验动物中国树鼩,每日定时置于用于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内;
[2]开启所述主动吸烟装置的模拟抽烟系统的真空泵,设置压力为0.03MPa,自控断电重启间隔时间10s,用样品卷烟和对照卷烟分别对中国树鼩进行烟气暴露试验,每天每只中国树鼩在烟气中的暴露剂量为5支烟,中国树鼩在染毒箱内主动吸入烟雾时间为15分钟/只/天,连续暴露时间为12周;
[3]对连续暴露12周的中国树鼩及暴露前的中国树鼩,或对不同的卷烟样品分别对两组不同的中国树鼩连续暴露12周后,进行以下测试:
(1)生物学行为测试:对中国树鼩的饲料摄入率,体重,口腔粘液分泌中的一种或数种进行测试;
(2)血液、生化、抗氧化指标的测试:对中国树鼩的血液学常规指标红细胞,白细胞,血小板,血清生物化学指标天门冬氨酸转换酶,丙氨酸氨基转换酶,碱性磷酸酶,总蛋白,白蛋白,总胆固醇,总胆红素,血糖,尿素氮,肌酐,及球蛋白中的一种或数种进行测试;
(3)生物学标志物表达的测试:包括采用以GAPDH为内参照,对中国树鼩的相关细胞因子mRNA表达相对量进行检测,以中国树鼩GAPDH/CRCX4/MHC-1/TNF-α/MCP mRNA序列设计引物,分别检测外周血,肺组织,心肌组织,支气管组织的相应产物的表达;
(4)组织病理学指标测试:对中国树鼩组织病理组织学变化,及发病例数,肺间质细胞增生的程度,膀胱和前列腺病理组织学检查和测试;
[4]将上述测试数据用统计方法进行计算,将计算结果与对照样的数据进行差异对比,由此对样品卷烟有害程度进行评价。
2.根据权利要求1所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,其特征在于:所述小型灵长目实验动物中国树鼩为中国树鼩云南滇西亚种。
3.根据权利要求1所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,其特征在于:所述的血液、生化、抗氧化指标的测试还包括研究分析烟草暴露对于中国树鼩的造血系统的评价。
4.根据权利要求3所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,其特征在于:所述的测试采用全自动血气分析仪和全自动生物化学分析仪进行。
5.根据权利要求1所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,其特征在于所述生物学标志物表达按以下方法进行:自中国树鼩股静脉采集血液1.2ml置于经肝素抗凝的EP管中;取0.3ml外周血,用红细胞裂解液分离有核细胞,用Trizol溶液处理,提取总RNA;以总RNA为模板,逆转录合成cDNA;PCR反应加入2μl cDNA,50μl反应体系包含10mMTris-HCl,1.5mMMgCl2,50mM KCl,pH 8.3,200μM each dNTP,2μl SYBR Green I荧光染料and1U Taq DNApolymerase(promega)和0.4μM引物;反应条件:预变性94℃,5min,变性94℃,30s,退火57℃,30s,延伸72℃,30s,共45循环;最后72℃,延伸10min;在退火的过程中搜集荧光信号;用GAPDH作内参照;反应条件:预变性94℃,5min,变性94℃,30s,退火50℃,1min,延伸72℃,2min,共45个循环;最后72℃,延伸10min;在退火的过程中搜集荧光信号,于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照;反应结束后做PCR产物熔解曲线验证PCR产物的特异性;用2-ΔΔCt法计算mRNA的表达量;经颈椎脱臼法处死股动脉放血致死中国树鼩后,取中国树鼩的左肺叶、支气管、心脏组织100mg,加入Trizol 1ml溶液处理,于匀浆器研磨成混悬液,提取总RNA,以总RNA为模板,逆转录合成cDNA;其他步骤同前。
6.根据权利要求1所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法,其特征在于所述组织病理学指标测试按以下方法进行:采用HE染色、图像采集系统来进行;对连续暴露12周的中国树鼩致死后,将其心脏、肺脏、脾脏、肺脏(左叶)、肾脏、脑、胰腺、睾丸、子宫、前列腺组织,置10%中性福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋切片,用HE染色,图像采集系统,进行光镜下观察各器官组织病理学变化。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011101252650A CN102788874A (zh) | 2011-05-16 | 2011-05-16 | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011101252650A CN102788874A (zh) | 2011-05-16 | 2011-05-16 | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102788874A true CN102788874A (zh) | 2012-11-21 |
Family
ID=47154333
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011101252650A Pending CN102788874A (zh) | 2011-05-16 | 2011-05-16 | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102788874A (zh) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107006422A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 华南农业大学 | 一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法 |
CN107607699A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-19 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 |
CN109470539A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-03-15 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种卷烟烟气颗粒物数量浓度与小鼠肺灌洗液中TNF-α表达的相关性分析方法 |
CN109601471A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-04-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用 |
CN109601472A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-04-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法 |
CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
CN114432461A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-05-06 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种评估尼古丁成瘾程度或评估待测药物对于尼古丁成瘾程度的影响的方法 |
CN114717178A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-08 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20030045472A (ko) * | 2001-12-04 | 2003-06-11 | 조명행 | 담배연기의 유해성 실험장치 |
CN201267532Y (zh) * | 2008-09-12 | 2009-07-08 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 用于动物实验的主动吸烟装置 |
-
2011
- 2011-05-16 CN CN2011101252650A patent/CN102788874A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20030045472A (ko) * | 2001-12-04 | 2003-06-11 | 조명행 | 담배연기의 유해성 실험장치 |
CN201267532Y (zh) * | 2008-09-12 | 2009-07-08 | 湖北中烟工业有限责任公司 | 用于动物实验的主动吸烟装置 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
《中国烟草学报》 20080831 刘永等 亚慢性和长期主流烟气暴露小鼠血清乳酸脱氢酶和alpha-羟丁酸脱氢酶活力的变化研究 55-57 1-6 第14卷, 第4期 * |
刘永等: "亚慢性和长期主流烟气暴露小鼠血清乳酸脱氢酶和α-羟丁酸脱氢酶活力的变化研究", 《中国烟草学报》, vol. 14, no. 4, 31 August 2008 (2008-08-31), pages 55 - 57 * |
宋琦如等: "《生产性毒物的检测与毒性鉴定》", 31 December 2004, article "第四章生产毒物亚慢性、慢性毒性鉴定" * |
常秀丽: "应答蛋白基因表达在镉接触中作为生物标志物的研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, no. 7, 15 November 2005 (2005-11-15), pages 66 - 72 * |
梁晓俐: "《病理学基础与实验技术》", 31 March 2003, article "组织病理学制片技术" * |
王晓娟等: "树鼩在医学实验研究中的新进展", 《中国比较医学杂志》, vol. 20, no. 2, 28 February 2010 (2010-02-28), pages 67 - 70 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107006422A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 华南农业大学 | 一种吸烟引起树鼩多器官纤维化模型的建立方法 |
CN107607699A (zh) * | 2017-09-06 | 2018-01-19 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 |
CN107607699B (zh) * | 2017-09-06 | 2019-12-27 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 |
CN109601471A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-04-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤的动物模型及其应用 |
CN109601472A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-04-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法 |
CN109601472B (zh) * | 2018-10-26 | 2021-07-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种评价卷烟烟气对小鼠免疫损伤动物模型的构建方法 |
CN109470539A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-03-15 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种卷烟烟气颗粒物数量浓度与小鼠肺灌洗液中TNF-α表达的相关性分析方法 |
CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
CN114432461A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-05-06 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种评估尼古丁成瘾程度或评估待测药物对于尼古丁成瘾程度的影响的方法 |
CN114717178A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-08 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102788874A (zh) | 一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法 | |
Osterholzer et al. | Chemokine receptor 2-mediated accumulation of fungicidal exudate macrophages in mice that clear cryptococcal lung infection | |
CN105994254A (zh) | 一种dc细胞的冻存液及冻存方法 | |
CN1970751B (zh) | 一种从罗布麻属植物叶片中提取完整基因组dna的方法 | |
CN109414456A (zh) | 脂肪及其医疗用途 | |
CN107613997A (zh) | 食用真菌的富含维生素d的提取物、和其组合物、和它们在治疗免疫相关失调中的应用 | |
CN105176844A (zh) | 一种桦褐孔菌的中药材或中药渣的双向固体发酵方法 | |
CN110448617A (zh) | 一种总酸浆苦素提取物的制备方法及其应用 | |
Koriem et al. | Role of some Egyptian medicinal plants against liver and kidney toxicity induced by cadmium chloride | |
CN107607699A (zh) | 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 | |
CN107361399A (zh) | 一种富硒烟及其制备方法 | |
CN106520805A (zh) | 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法 | |
CN110729022B (zh) | 一种被动吸烟大鼠早期肝损伤模型建立方法及相关基因筛选方法 | |
CN104142384A (zh) | 一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法 | |
Essien et al. | Evaluation of Acute Effects of Cadmium Toxicity on Serum Total Protein, Albumin and Globulin in Male Albino Wistar Rats Treated with Ethanol leaf Extracts of Tapinanthus | |
Aydemir | The effect of myasthenia gravis as a prognostic factor in thymoma treatment | |
Njoku et al. | Hepatoprotective Potential of Alkaloid Extracts from Vitex doniana and Ficus thonningii Leaves in Alloxan-induced Diabetic Rats | |
CN103330733A (zh) | 一种水黄皮提取物的提取工艺及其在肝损伤过程中的应用 | |
Shimada Borges et al. | Effects of trophic levels (chlorophyll and phosphorous content) in three different water bodies (urban lake, reservoir and aquaculture facility) on gill morphology of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
CN107708728A (zh) | 一种用于治疗胃癌的肿瘤疫苗及其制备方法 | |
CN101796937A (zh) | 建立无气道高反应性嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型的方法 | |
CN107375950B (zh) | 一种重组Gal-1过敏环境免疫耐受诱导模型及建立方法 | |
CN112151173A (zh) | 乙肝肝脏疾病t细胞免疫状态应用性评估模型构建方法 | |
Al-Samawi et al. | Esophageal cancer in Yemen | |
CN102600376B (zh) | 天麻及天麻提取物在制备治疗外周神经损伤再修复药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121121 |