CN107607699B - 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法，属于卷烟危害评价技术领域。本发明的建立方法，包括如下步骤：1)分离气管环；2)体外培养步骤1)得到的气管环；3)将步骤2)培养后的气管环在烟气冷凝物下暴露1‑24h。评价烟草主流烟气诱发炎症反应的方法还包括：选择评价指标，划分评价标准；评价炎症反应的程度。本发明的方法具有以下优点：1)烟气暴露后气管炎症检测方法的效率高；2)烟气暴露后气管炎症检测方法的具有良好的可重复性，体系稳定准确性高；3)使用范围广：该方法可以适用于卷烟主流烟气、侧流烟气、环境烟气等烟气气溶胶的体外暴露模型。

Description

一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建 立方法、评价方法

技术领域

本发明涉及一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法，属于卷烟危害评价技术领域。

背景技术

吸烟能引起气管以及肺部的炎症，是慢性阻塞性肺气肿(COPD)首要的危险因素。通过气管的体外实验可初步理解炎症反应的作用机制及过程。烟气冷凝物(cigarettesmoke， CS)在呼吸道造成组织损伤，这种损伤涉及CS诱导的气道疾病和相关肺部疾病的发展，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)(Murray LA,Dunmore R,Camelo A,Da Silva CA,Gustavsson MJ,Habiel DM,Hackett TL,HogaboamCM,Sleeman MA,Knight DA.Acute cigarette smoke exposure activates apoptoticand inflammatory programs but a second stimulus is required to induceepithelial to mesenchymal transition in COPD epithelium.Respir Res.2017,18(1):82.)、气道上皮细胞是CS的主要靶点(Cui Y,Liu KW, Liang Y,Ip MS,MakJC.Inhibition of monoamine oxidase-B by selegiline reduces cigarette smoke-induced oxidative stress and inflammation in airway epithelial cells.ToxicolLett.2017, 268:44-50.)。动物模型是研究发病机制和临床防治的基础，同时也是研究的一个难点。啮齿类动物是动物模型的最佳选择，一般常用大、小鼠模型是通过暴露在烟雾等方式造模的 (Smith KR1,Uyeminami DL,Kodavanti UP,Crapo JD,Chang LY,PinkertonKE.Inhibition of tobacco smoke-induced lung inflammation by a catalyticantioxidant.Free Radic Biol Med.2002 Oct 15；33(8):1106-14.Stringer KA,FreedBM,Dunn JS,Sayers S,Gustafson DL,Flores SC. Particulate phase cigarette smokeincreases MnSOD,NQO1,and CINC-1in rat lungs.Free Radic Biol Med.2004Nov 15；37(10):1527-33.)。

然而由于动物实验建立COPD模型周期较长，且影响因素众多，各类研究的结果很难精确地进行比较，是因为缺乏标准化的烟雾暴露和标准化的分析，包括香烟的品种不同、香烟的剂量、研究仪器、暴露设计以及广泛的鼠种系等多种影响因素(烟气加气管滴注博莱霉素制备慢性阻塞性肺疾病大鼠模型及白藜芦醇对该疾病的干预作用及机制研究周敏博士论文2008)，因此非常有必要借助体外模型进一步研究CS染毒后气道炎症的机制。

目前大多数研究解决体外快速COPD风险模型评估的方法是二维培养的细胞模型，但由于二维模型限制细胞间反应、破坏细胞组织和极性、无法准确表现细胞体内生长环境、断开细胞体内体外表现的关系等缺陷而对研究造成了一定的影响(Haycock,J.W.3D CellCulture:A Review of Current Approaches and Techniques.MethodsMol.Biol.2011,695,1– 15.)。从细胞培养的种类来看，为了模仿肺细胞对CS的反应，很大一部分研究使用肺泡、支气管和气道上皮细胞系统(Bucchieri F,Pitruzzella A,Fucarino A,GammazzaAM,Bavisotto CC,MarcianòV,Cajozzo M,Lo Iacono G,Marchese R,Zummo G,HolgateST,Davies DE.Functional characterization of a novel 3D model of theepithelial-mesenchymal trophic unit.Exp Lung Res.2017，43(2):82-92.)。例如使用上皮细胞(小鼠肺泡II型上皮细胞、支气管上皮细胞)或细胞转化的细胞系。然而，COPD患者的气道还包括炎性细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞和树突状细胞。例如，巨噬细胞被认为是慢性阻塞性肺病的主要细胞类型之一，它在COPD的病理生理过程中起重要作用。因此细胞培养，包括肺上皮细胞和支气管上皮细胞均不足以被用来评估COPD的炎症过程。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法，可以模拟体内CS暴露后的炎症反应。

本发明还提供了评价烟草主流烟气诱发炎症反应的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法，包括如下步骤：

1)气管分离：取成年大鼠麻醉后，切口于颈部的中央打开，分离喉至气管部分的皮肤，剪断肋骨，并将肋骨推至两侧暴露喉、气管和肺；自上而下，沿喉至支气管方向剖出气管并分离；将气管周围组织及血管剥离干净后，在喉及气管分叉处将气管剪断，然后冲洗气管管腔；将冲洗好的气管切成2-6段，每段4-12个软骨环；

2)体外培养步骤1)得到切好的气管环；

3)将步骤2)培养后的气管环在含烟气冷凝物的培养基中暴露培养1-24h。

步骤1)中取雄性成年SD大鼠进行麻醉。

步骤1)中采用BEGM培养基冲洗气管。

步骤1)及步骤3)中培养均有三维matrigel包被，为三维培养。

本发明的建立方法是基于大鼠气管的解剖结构特点而研发的体外风险暴露模型。大鼠气管一般由24个C型软骨环构成，切成2-6段后，每段4-12个软骨环。气管的横截面为椭圆形，横径约3.5mm，直径约2mm，壁厚约0.5～1mm。气管壁由粘膜、软骨层和外膜组成。气管粘膜由粘膜上皮、黏液纤毛和固有层组成。固有层位于粘膜深部，含有大量毛细血管、淋巴样组织和浆细胞。气管环可在体外利用Matrigel三维立体培养方式至少培养 24h保持良好增殖的活性。3D培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接或缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构，与体内细胞生长情况更为相似；因此，3D细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。并且把体外三维培养的气管环在CS中暴露数小时后，HE染色显示炎性细胞浸润的单核细胞和淋巴细胞在实验组和对照组之间具有显著性差异。该气管环具有完整的组织结构，可产生与体内暴露于CS相似的炎症。而与二维模型相比，三维模型以其能更好地模拟体内正常细胞生长环境、复制复杂的组织结构和体内形态、反映分化等细胞活动和细胞间反应以及更加真实的细胞生物学和功能，能更好地预测病程和药物反应、更准确建立靶组织模型，拥有更快的生长速度，更节约成本、减少细胞数并可自动化操作等优点而成为建立细胞模型的理想化方式。故寻找一种可以快速建模的模型显得尤为重要，从而在细胞和分子水平认识COPD的本质。因此，该模型可以应用于慢性阻塞性肺疾病的CS暴露的风险评估，也可模拟体内炎症。该模型在体外培养气管环可以阐明CS暴露的分子和细胞反应，并进一步了解空气污染对人体健康的影响，以及特定的COPD的病因。

步骤2)中体外培养为采用三维立体培养方式培养气管环1.5-2.5h。所采用的培养基为 BEGM培养基。

步骤3)中所述含烟气冷凝物的培养基中烟气冷凝物的浓度为50-200μg/mL。

所述含烟气冷凝物的培养基由包括如下步骤的方法制得：采用吸烟机提取待测烟的烟气冷凝物，溶于DMSO溶液后，得烟气冷凝物溶液，然后加入组织培养基中，即可。使用吸烟机(Borgwaldt RM-20H,Borgwaldt KC,Hamburg,Germany)提取烟气冷凝物。将收集好的烟气冷凝物以10mg/ml的浓度在DMSO溶液中充分溶解。

本发明的评价烟草主流烟气诱发炎症反应用的动物体外气管模型的建立方法，包括如下步骤：1)分离气管环；2)体外培养步骤1)得到的气管环；3)将步骤2)培养后的气管环在烟气冷凝物下暴露培养1-24h。本发明制定了一套气管分离、培养以及暴露的实验过程，本实验的烟气冷凝物为主流烟气香烟烟雾，本发明被描述为分离大鼠气管环组织和气管环组织培养系统的建立，以及在本研究中评价在CS暴露下气管环组织的分子和细胞反应。CS暴露下气管的炎症反应机制也是环境污染对人类健康影响的一种体现，研究发现这个模型能用来研究COPD的病因，本发明的方法也适用于其它与香烟相关的威胁人类健康的疾病。

一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应的方法，包括以下步骤：

A.建立动物体外气管模型：

1)气管分离：取成年大鼠麻醉后，切口于颈部的中央打开，分离喉至气管部分的皮肤，剪断肋骨，并将肋骨推至两侧暴露喉、气管和肺；自上而下，沿喉至支气管方向剖出气管并分离；将气管周围组织及血管剥离干净后，在喉及气管分叉处将气管剪断，然后冲洗气管管腔；将冲洗好的气管切成2-6段，每段4-12个软骨环；

2)体外培养步骤1)得到切好的气管环；

3)将步骤2)培养后的气管环在含烟气冷凝物的培养基中暴露培养1-24h。

B.选择评价指标，划分评价标准；

C.评价烟草主流烟气诱发炎症反应的程度。

步骤B中在细胞水平、转录水平、蛋白水平选择评价指标。

在步骤3)气管环暴露培养后，在细胞水平、转录水平、蛋白水平评价烟气诱发炎症反应的程度。

所述选择评价指标为在检测炎症细胞浸润生长情况、IL6基因表达量、ICAM-1基因表达量、炎症因子蛋白含量及细胞增殖活性中选择一种或几种评价指标。

采用HE染色，并通过显微镜观察所述炎症细胞浸润生长情况。取暴露后的气管环组织用4％多聚甲醛固定，脱水，包蜡块，然后以3μm厚度切片，进行HE染色。

采用qRT-PCR检测所述IL6及ICAM-1基因的表达量。提取暴露后气管组织的RNA，检测OD260/OD280，计算浓度与纯度后，进行逆转录合成cDNA，然后进行Real Time qPCR。

采用IL6及ICAM-1的ELISA试剂盒检测所述炎症因子蛋白表达量。根据用IL6及ICAM-1ELISA试剂盒产品说明书配制标准品，设置不同的标准品浓度梯度(8000pg/mL、4000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、0pg/mL)。按 100μl/孔加标准品至标准品孔，按照试剂盒步骤操作，通过酶标仪用450nm的波长读值。

采用含CCK-8的培养基检测所述细胞增殖活性。在96孔细胞培养板中接种细胞悬液 (100μl/孔)。向每孔加入10μl的CCK-8水溶液中；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

本发明评价方法通过SD大鼠气管环体外培养，于培养基中加入烟气冷凝物实现气管环的暴露培养，利用细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)检测组织体外培养和染毒暴露后的细胞增殖情况，气管环石蜡包埋组织切片苏木素伊红(HE)染色，实时荧光定量PCR 和酶联免疫吸附实验(ELISA)三种方法检测染毒暴露后气管炎症的发生变化情况，从而评价烟气冷凝物暴露前后体外培养的气管环组织炎症反应的变化特征。

本发明的方法具有以下优点：

1)法烟气暴露后气管炎症检测方法的效率高；

2)烟气暴露后气管炎症检测方法的具有良好的可重复性，体系稳定准确性高；

3)使用范围广：该方法可以适用于卷烟主流烟气、侧流烟气、环境烟气等烟气气溶胶的体外暴露模型。

附图说明

图1为实施例1中评价烟草主流烟气诱发炎症反应用的动物体外气管模型的建立方法步骤示意图；

图2为实施例1中剪切的气管环的过程图；

图3为实施例1中气管环体外三维培养电镜下的超微结构图；

图4为实施例1中CS染毒后气管环炎症的HE形态学变化图；

图5为实施例1中CS染毒后气管环炎症基因IL6、ICAM-1基因水平的表达差异图；

图6为实施例1中CS染毒后气管环炎症基因IL6、ICAM-1蛋白水平的表达差异图；

图7为实施例1中CCK8气管环细胞增殖活性检测对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明涉及的实验动物的研究，以及各类动物实验的设计、实施过程都符合动物福利和伦理原则，即遵从动物保护原则，动物福利原则以及伦理原则。以下实施例中所使用的实验材料为：于北京维通利华中心公司采购的SPF级成年雄性SD大鼠，10周龄，体重 230±20g；采用独立饲养笼具饲养，自由进水，标准颗粒进食。使用的主要实验器材：转盘式吸烟机、气体麻醉机、体式显微镜、苏州净化超净工作台、CO₂培养箱、24孔板、移液器、Leica切片机、实时荧光定量PCR仪、酶标仪。

实施例1

本发明的评价烟草主流烟气诱发炎症反应用的动物体外气管模型的建立方法(流程如图1所示)，包括如下步骤：

(1)气管分离：Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(SPF级别)由北京实验动物平台(SCXK) 提供。在对动物进行手术操作前，大鼠在麻醉机上使用异氟醚进行深度麻醉。于北京维通利华中心公司采购的SPF级成年雄性SD大鼠,体重230±20g。所有的实验动物给予充分的水和食物，使其能够自由饮水和进食，房间温度维持在23±2℃，定期给房间进行消毒。

①当用手术钳夹大鼠的脚趾大鼠依然没有反应时，说明大鼠已经进入了深度麻醉状态，此时，立即对大鼠进行颈部的解剖。

②切口于颈部的中央打开，钝性分离喉至气管部分的皮肤，剪断肋骨，并将肋骨推至两侧暴露喉、气管和肺。

③自上而下，延喉至支气管方向剖出气管并分离，将取出的气管置于盛有含青链霉素的冷的PBS(pH 7.2-7.4)的3001皿中。

④在立体显微镜下利用眼科剪仔细剥离血管及气管周围组织，剥离的过程需要避免损坏气管，尤其是气管内膜，以便得到完整的气管环，另外，用眼科镊剥离由咽至气管分叉处的气管外膜。

⑤将气管周围组织剥离干净后，在喉及气管分叉处将气管剪断，然后使用BEGM冲洗气管管腔3次。

剪切的气管环的过程如图2所示，分别代表从图2-A老鼠体内取出气管环，所有操作均在显微镜图2-B下进行，图2-C为切好的气管环，然后放在图2-D所示的24孔板中培养，并染毒。

⑥将处理好的气管放置在盛有2ml BEGM培养基的3001皿中，使用另一个洁净的眼科剪将气管切成6段，每段4个软骨环。也可以平均切成2-6段。

⑦使用BGEM培养基体外三维培养⑥中切好的气管环，气管环体外三维培养2h。三维培养的主要步骤如下：实验前把-20℃保存的matrigel胶取出放在4℃解冻，在超净台中进行铺板操作，matrigel胶和培养基按1:9稀释，打开24孔板，每孔50μl的matrigel 胶包被液，37℃CO₂培养箱孵育2-3h，吸出包被液，超净台中自然吹干三维培养备用。

培养后制备气管粘膜透射电镜样品，具体为：

取气管粘膜组织块小于1立方毫米，2.5％戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2h，然后更换新的固定液。用0.1M磷酸漂洗液漂洗15min，重复三次；1％锇酸固定液固定2-3h，用0.1M磷酸漂洗液漂洗15min，重复三次；脱水：50％乙醇，15-20min，70％乙醇，15-20min，90％乙醇，15-20min，三次；90％乙醇：90％丙酮(1：1)15-20min，90％丙酮15-20min，以上在4度冰箱内进行。100％丙酮，室温，15-20min,三次。纯丙酮+包埋液(2：1)室温3-4h，纯丙酮+包埋液(1：2)室温过夜，纯包埋液37度，2-3h。固化：37度烘箱内，过夜，45 度烘箱内，12h，60度烘箱内，48h。超薄切片机切片70nm。3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色。透射电镜JEOL JEM观察并拍片，其电镜下的超微结构如图3所示。

(2)CS的制备和收集：使用吸烟机提取待测烟(3R4F标准烟)的烟气冷凝物，将收集好的烟气冷凝物用溶媒烟气冷凝物补集到滤片上，根据滤片补集前后质量差得到烟气质量，将收集好的烟气冷凝物以10mg/ml的浓度在DMSO中充分溶解，得到10mg/ml 的烟气冷凝物溶液，冻存在-80℃保存备用。

(3)CS的暴露和检测：用BEGM培养基配置成使用浓度的烟气冷凝物培养基，用不同浓度(0、50、100、200μg/ml)的烟气冷凝物培养基暴露培养气管环6h。暴露2-10h均可达到效果。

(4)HE染色：取暴露培养后，染毒的气管环组织用4％多聚甲醛固定，脱水，包蜡块，然后以3μm厚度切片，60℃烤片1～2h后进行HE染色。首先脱蜡致水，通过两次二甲苯每次10min将蜡脱掉，然后通过梯度酒精(100％，95％，90％，75％)使细胞间隙充水，每个梯度3min，水洗后用苏木精染色5min中，水洗2-3次后用盐酸酒精分色20s，水洗后用1％的伊红染色10min，梯度酒精(90％，95％，100％)脱水后，两次二甲苯中各透明10min后，中性树胶封片。

用尼康显微镜观察气管黏膜炎性细胞浸润生长情况。染色结果如图4所示，其中A为 0浓度对照组，B为50μg/ml处理组，C为100μg/ml处理组，D为200μg/ml处理组；从图中可以看出烟气冷凝物暴露期间，气道炎症细胞浸润，HE结果表明炎性细胞浸润(包括单核细胞和淋巴细胞)，实验组和对照组(0μg/ml的烟气冷凝物暴露)之间出现差异，随着浓度的提高炎性细胞在实验组中增加。在用高浓度染毒物200μg/ml简单处理的样品中，在光学显微镜下可看局灶性坏死和溶解。

(5)q RT-PCR：气管总RNA提取，取200mg气管组织，放到1.5ml EP管中，加入 1mlTrizol剪碎；震荡30s；加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min；12000×g，4℃离心， 15min；吸上层无色水相约0.5ml，移入另一EP管中，加等体积异丙醇，-20℃，30min； 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀；弃上清，加75％乙醇1ml，振荡；7500×g，4℃离心，10min；弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min；沉淀溶于20μl DEPC H₂O，取1μl加入79μl DEPC H₂O测OD260/OD280计算浓度与纯度后，进行逆转录合成cDNA。逆转录合成cDNA：RT反应体系10μL。反应程序：16℃30min； 42℃1h；95℃5min；4℃(1stStrand cDNA Synthesis Kit(Vazyme biotech co.,ltd. Nanjing,China).)。

Real Time qPCR：SYBR Green反应体系总体积为20μL，所用引物为：

rICAM1-sp：ACCTACATACATTCCTACC，rICAM1-asp：ATGAGACTCCATTGTTG，产物长度91bp；

rIL6-sp：TAGTGTGCTATGCCTAAG，rIL6-asp：TATTGCCAGTTCTTCGTA，产物长度113bp；

rGAPDH-sp：CATTCTTCCACCTTTGAT，rGAPDH-asp：CTGTAGCCATATTCATTGT，产物长度92bp。该引物为内参基因引物。

定量PCR实验步骤如下：

1)将All-in-One^TM qPCR Mix在室温下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2)冰上配制PCR Reaction Mix，体系如表1所示；

表1PCR Reaction Mix配制体系

试剂	加入量	终浓度
			2×All-in-One<sup>TM</sup> qPCR Mix	10μL	1×
All-in-One<sup>TM</sup> qPCR Primer(2μM)	2μL	0.2μM
			cDNA Template	2μL
ddH<sub>2</sub>O	to 20μL

3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4)采用标准的三步法程序进行反应，程序如表2所示：

表2PCR反应程序

q RT-PCR数据分析用prism5.0统计分析并作图。横坐标为染毒浓度，纵坐标为基因的表达量。结果如图5所示，横坐标为不同浓度的烟气冷凝物：0到200μg/ml，从图中可以看出随着CS暴露的浓度增高，炎症因子ICAM-1和IL6的表达水平上调，同时蛋白的表达水平也上调。

(6)ELISA：使用IL-6试剂盒检测IL-6蛋白的含量；使用ICAM-1试剂盒检测ICAM-1蛋白的含量。

按100μl/孔加入样品至样品孔，设置空白孔，同时制作标准曲线，封板膜封板，37℃温育90min。300μl/孔洗板三次后，100μl/孔加入稀释后的生物素化的抗体，盖上封板膜，37℃温育90min。洗板三次后100μl/孔加入稀释后的Streptavidin-HRP，盖上封板膜，放在湿盒中，37℃温育30min，洗板三次后，100μl/孔加入TMB，显色15min后，迅速100μl/ 孔加入终止液，通过酶标仪用450nm的波长读值。

ELISA数据分析用prism5.0统计分析并作图。横坐标为染毒浓度，纵坐标为蛋白的浓度。

ELISA试剂盒检测的结果如图6所示：从图中可以看出随着CS暴露的浓度增高，炎症因子ICAM-1和IL6蛋白的表达浓度水平也上调。

(7)CCK8气管环细胞增殖活性检测：在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5％二氧化碳的条件下)；向每孔加入10μl的CCK-8 溶液；将培养板在培养箱内孵育1～4h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

检测结果如图7所示，从图中可以看出随着CS暴露的浓度增高，气管环组织细胞的增殖能力降低。

本发明的方法还可以适用于卷烟主流烟气、侧流烟气、环境烟气等烟气气溶胶的体外暴露模型。

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院、郑州大学

<120> 一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应用动物体外气管模型建立方法、评价方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rICAM1-sp

<400> 1

acctacatac attcctacc 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rICAM1-asp

<400> 2

atgagactcc attgttga 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rIL6-sp

<400> 3

tagtgtgcta tgcctaag 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rIL6-asp

<400> 4

tattgccagt tcttcgta 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rGAPDH-sp

<400> 5

cattcttcca cctttgat 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> rGAPDH-asp

<400> 6

ctgtagccat attcattgt 19

Claims (5)

1.一种评价烟草主流烟气诱发炎症反应的评价方法，其特征在于：包括以下步骤：

A. 建立动物体外气管模型：

1）将冲洗好的成年雄性大鼠气管切成2-6段，每段4-12个软骨环；

2）使用BGEM培养基采用三维立体培养方式培养步骤1）得到切好的气管环1.5-2.5h；

3）将步骤2）培养后的气管环在含烟气冷凝物的培养基中暴露培养2-10h；

所述含烟气冷凝物的培养基由包括如下步骤的方法制得：采用吸烟机提取待测烟的烟气冷凝物，溶于DMSO溶液后，得烟气冷凝物溶液，然后加入组织培养基中，即可；所述含烟气冷凝物的培养基中烟气冷凝物的浓度为50-200μg/mL；

B. 选择检测炎症细胞浸润生长情况、IL6基因表达量、ICAM-1基因表达量、炎症因子蛋白含量及细胞增殖活性作为评价指标，划分评价标准；

C. 评价烟草主流烟气诱发炎症反应的程度。

2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：采用HE染色，并通过显微镜观察所述炎症细胞浸润生长情况。

3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：采用qRT-PCR检测所述IL6及ICAM-1基因的表达量。

4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：采用IL6和ICAM-1的ELISA试剂盒检测所述炎症因子蛋白表达量。

5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于：采用含CCK-8的培养基检测所述细胞增殖活性。