CN112538480A - 精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，包括在野生型Fsip2基因的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的步骤。本发明还公开了所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法在筛选用于预防或治疗精子鞭毛多发形态异常的药物中的应用。

Description

精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，特别是涉及精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法和应用。
背景技术
精子鞭毛多发形态异常是弱精症的一种亚型，患者的精子鞭毛出现包括卷曲、弯曲、不规则、短或/和缺失，以及超微结构缺陷在内的一系列形态异常，造成精子活力严重降低，导致患者不育，目前尚无有效药物治疗手段。因此，发现新的致病基因并构建符合表征的动物模型以用于研究其致病机制，对精子鞭毛多发形态异常的预测和诊断，以及开发潜在的治疗药物具有指导意义。
发明内容
基于此，有必要提供一种模拟精子鞭毛多发形态异常的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法和应用。
一种精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，包括在野生型Fsip2基因的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的步骤，所述构建方法中所使用的动物为啮齿类动物。
在其中一些实施例中，插入核苷酸C的方法选自CRISPR-Cas9技术、ZFN技术、TALENs技术和Cre-loxp基因敲入技术中的任意一种。
在其中一些实施例中，包括以下步骤：
将oligo donor DNA、gRNA和Cas9 mRNA的混合物显微注射至受精卵，胚胎移植，产生F0代基因变异动物；
所述gRNA序列如SEQ IDNO.l所示，所述oligo donor DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一些实施例中，所述方法还包括对F0代基因变异动物进行Sanger测序验证的步骤，Sanger测序引物序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示。
在其中一些实施例中，将F0代基因变异动物与野生型动物交配，获得稳定遗传的杂合子F1代动物，将F1代动物自交繁殖获得纯合型基因变异动物。
在其中一些实施例中，包括对所述纯合型基因变异动物进行qRT-PCR验证的步骤，qRT-PCR引物序列如SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6、SEQ IDNO.7和SEQ IDNO.8所示。
在其中一些实施例中，所述构建方法中所使用的动物为小鼠或大鼠；优选的，所述小鼠的品系选自C57BL/6J、C57BL/6N、DBA/2和BALB/c中的任意一种。
在其中一些实施例中，包括对获得的纯合型基因变异动物进行表型验证的步骤，所述表型验证包括精子形态检测、计算机辅助精子分析、精子尾部超微结构检测和精子尾部长度检测中的任意一种或多种。
在其中一些实施例中，包括对获得的纯合型基因变异鼠进行组织层面验证的步骤，所述组织层面验证包括：成年期睾丸组织的曲细精管的HE染色和PAS染色和成年期睾丸组织的曲细精管的组织免疫荧光染色中的任意一种或多种。
在其中一些实施例中，包括对获得的纯合型基因变异动物进行分子层面验证的步骤，所述分子层面验证包括：睾丸组织单细胞RNA-seq测序、睾丸组织蛋白质组测序、精子免疫荧光染色和Western blot验证中的任意一种或多种。
一种所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法在筛选用于预防或治疗精子鞭毛多发形态异常的药物中的应用。
疾病动物经发明人长期临床和实验研究发现，Fsip2基因是精子鞭毛多发形态异常的致病基因之一，编码精子尾部纤维鞘蛋白。本发明通过构建Fsip2基因突变鼠，能够获得精子鞭毛多发形态异常疾病模型，为精子鞭毛多发形态异常的致病机制及潜在药物的开发提供了一种在体实验的新途径。本方法包括在野生型Fsip2基因的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的步骤。通过大量的实验研究得出该位点的核苷酸特异性敲入能够与临床精子鞭毛多发形态异常患者性状完全相同的动物模型。
在该位点特异性插入C导致精子鞭毛形态异常，尚未被现有技术公开。本发明是全世界首次构建Fsip2基因突变模型的课题。
附图说明
图1为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠的Sanger验证结果；
图2为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠的相对mRNA表达量检测结果；
图3为实施例1中Fsip2基因过表达鼠精子的拷贝数和mRNA表达量之间的相关性结果；
图4为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠精子的BASO染色结果；
图5为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠精子的扫描电镜结果；
图6为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠精子的透射电镜结果；
图7为实施例1中Fsip2基因过表达鼠精子尾部的长度和宽度测量结果；
图8为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠睾丸曲细精管的HE和PAS染色结果；
图9为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠睾丸曲细精管的组织免疫荧光染色结果；
图10为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠睾丸组织的单细胞RNA-seq测序和生物信息分析结果；
图11为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠睾丸组织的蛋白质组测序和生物信息分析结果；
图12为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠精子的免疫荧光染色结果；
图13为实施例1中Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠精子的Western blot结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
基因编辑鼠模型一直是研究不孕不育疾病的常用动物模型，能够更真实准确地反映睾丸和精子在生命周期内的生理病理变化，在基因变异引起的精子鞭毛多发形态异常中被广泛应用。本发明实施例提供的Fsip2基因突变敲入和基因过表达鼠可为该基因及其相关通路的研究提供合适的平台。此外，本发明涉及的基因突变鼠也可作为精子鞭毛多发形态异常疾病的药物筛选在体模型。
本发明采用在野生型Fsip2基因(ENSMUSG00000075249)的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的方法构建精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型。经发明人长期临床和实验研究发现，Fsip2基因是精子鞭毛多发形态异常的致病基因，编码精子尾部纤维鞘蛋白。本发明通过构建Fsip2基因突变鼠，能够获得精子鞭毛多发形态异常疾病模型，为精子鞭毛多发形态异常的致病机制及潜在药物的开发提供了一种在体实验的新途径。本方法包括在野生型Fsip2基因的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的步骤。通过大量的实验研究得出该位点的核苷酸特异性敲入能够与临床精子鞭毛多发形态异常患者性状完全相同的鼠模型。
Fsip2基因在各个啮齿类动物中均保守。因此，本发明的动物模型构建不仅适用于大鼠、小鼠，还适用于任何的啮齿类动物。
所述构建方法中所使用的鼠选自现有的鼠品系，在一些实施方式中，上述鼠选自现有的任一鼠品系，包括但不限于C57BL/6J、C57BL/6N、DBA/2、BALB/c。
在一些实施方式中，特异性插入核苷酸C的基因编辑方法可选自：CRISPR-Cas9技术、ZFN技术、TALENs技术和Cre-loxp基因敲入技术中的任意一种。
在一些实施方式中，所述Fsip2基因突变敲入方式包括采用CRISPR-Cas9技术对模型动物的Fsip2基因进行点突变敲入。该构建方法中gRNA以及与之匹配的oligo donor DNA的选择是决定Fsip2基因突变敲入模型能否达到理想结果的关键因素。通过大量的实验研究得出gRNA以及oligo donor DNA配合能够构建得到与临床精子鞭毛多发形态异常患者性状完全相同的动物模型。
具体的，本发明实施例提供一种精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，包括以下步骤：
设计gRNA和oligo donor DNA，所述gRNA序列如SEQ IDNO.l所示，所述oligodonor DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
将oligo donor DNA、gRNA和Cas9 mRNA的混合物显微注射至受精卵，胚胎移植，产生F0代基因变异动物。
gRNA:atcaagaacaagttatctgctgg(SEQ ID NO.1)
oligo donor DNA:agcagtactaagaccaaaatcaagaacaagttaagcgctggagagaaaacctccaagagagagcagaccaaaaccgcccttgggctgccacaaactccac(SEQ ID NO.2)。
在一些实施方式中，精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法包括将F0代基因变异动物与野生型动物交配，获得稳定遗传的杂合子F1代鼠，将F1代动物自交繁殖获得纯合型基因变异动物。
优选地，获得Fsip2基因过表达动物包括：将包含完整Fsip2基因序列及其侧翼序列的BAC克隆(CloneDB,ID：RP23-221K3)注射到动物的受精卵中，使Fsip2基因随机整合到动物基因组中，从而获得Fsip2基因过表达动物。
在一些实施方式中，包括对F0代基因变异动物进行Sanger测序验证的步骤。优选地，Sanger验证所需引物对包括序列如SEQ ID NO.3～4所示。
在一些实施方式中，包括对获得的纯合型基因变异动物进行qRT-PCR验证的步骤。优选地，纯合型基因变异动物的qRT-PCR引物序列如SEQ ID NO.5～8所示。
引物对1的序列：
Fsip2-F1：aactcagcccaaagaacagccc(SEQ ID NO.3)
Fsip2-R1：tccgtaggataacctgcaccca(SEQ ID NO.4)
引物对2的序列：
Fsip2-F1：tcacacgattccaaaactgg(SEQ ID NO.5)
Fsip2-R1：aagcgttgttcctctgctgt(SEQ ID NO.6)
Fsip2-F2：tgatgaggaggaggttgtcc(SEQ ID NO.7)
Fsip2-R2：tttcaggttgcttgtgcttg(SEQ ID NO.8)。
在一些实施方式中，包括对获得的纯合型基因变异鼠进行表型验证的步骤，所述表型验证包括精子形态检测、计算机辅助精子分析(Computer-aided sperm analysis,CASA)、精子尾部超微结构检测和精子尾部长度检测中的任意一种或多种。
优选地，精子形态检测包括精子长度和外观检测包括：通过BASO法对鼠精子进行染色，在光学显微镜下检验精子的形态结构，以及通过扫描电子显微镜(ScanningElectron Microscopy,SEM)检验精子的形态结构。
优选地，计算机辅助精子分析包括精子浓度、精子活力和精子运动速度等参数分析。
优选地，精子尾部超微结构检测包括对精子线粒体鞘、纤维鞘、外层致密纤维、9+2微管等的检测。
优选地，精子尾部长度检测包括对精子尾部中段和主段的长度进行检测。
在一些实施方式中，对鼠精子形态检测可采用任何现有的显微成像方式，只要能实现验证鼠的精子形态，则属于本申请的保护范围。
在一些实施方式中，包括对获得的纯合型基因变异鼠进行组织层面验证的步骤，所述组织层面验证包括：成年期睾丸组织曲细精管的HE(hematoxylin and eosin)和PAS(Periodic acid–Schiff)染色和成年期睾丸组织的曲细精管的组织免疫荧光染色中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，对所述成年期睾丸组织的曲细精管的观测包括但不限于HE染色和PAS染色，以及组织免疫荧光染色，可采用任何现有的检测方式，只要能实现检测动物组织层面曲细精管内精子生成过程的变化，则属于本申请的保护范围。
优选地，所述成年期睾丸组织的曲细精管HE染色和PAS染色方法为：手术切除12-16周的睾丸组织，固定后脱水，包埋在石蜡中，分别用HE和PAS进行染色。
优选地，所述成年期睾丸组织的曲细精管的组织免疫荧光染色方法为：手术切除12-16周的睾丸组织，脱水后封闭，先后加入一抗和二抗，用荧光显微镜成像。
在一些实施方式中，包括对获得的纯合型基因变异动物进行分子层面验证的步骤，所述分子层面验证包括：睾丸组织单细胞RNA-seq测序、睾丸组织蛋白质组测序、精子免疫荧光染色和Western blot验证中的任意一种或多种，只要能实现检测动物在敲入突变或过表达之后睾丸和精子相关基因和蛋白的表达情况变化，则属于本申请的保护范围。
优选地，所述睾丸组织单细胞RNA-seq测序包括：制备单细胞悬液，通过10xgenomics构建单细胞文库，进行高通量测序，继而对数据进行生物信息学分析。
优选地，所述睾丸组织蛋白质组测序包括：提取睾丸组织中的蛋白并酶解成多肽，通过TMT(Tandem Mass Tag)定量蛋白质组学技术进行标记，进行液相色谱-质谱联用分析，并对数据进行生物信息学分析。
优选地，所述成年期精子尾部相关蛋白免疫荧光染色方法为：提取成年期附睾尾精子，制备涂片并固定，封闭后先后加入一抗和二抗，用荧光显微镜成像。
本发明实施例还提供上述任一实施例的Fsip2基因突变动物模型的构建方法得到的Fsip2基因突变动物模型在筛选用于预防或治疗精子鞭毛多发形态异常的药物中的应用。
本发明实施例还提供一种获得Fsip2基因过表达动物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括对Fsip2基因过表达方式的选择不作限制，只要能实现Fsip2基因过表达，以用于制备基因过表达动物模型即可。
在一些实施方式中，所述Fsip2基因过表达方式包括采用BAC转基因技术对动物的Fsip2基因进行过表达。包括：将包含完整Fsip2基因序列及其侧翼序列的BAC克隆(CloneDB,ID：RP23-221K3)注射到动物的受精卵中，使Fsip2基因随机整合到鼠基因组中，从而获得Fsip2基因过表达动物。
在一些实施方式中，包括对获得的Fsip2基因过表达动物纯合型基因变异动物进行BAC克隆成功整合验证的步骤。
在一些实施方式中，包括对获得的Fsip2基因过表达动物纯合型基因变异动物进行Fsip2基因拷贝数检测的步骤。
优选地，Fsip2基因过表达动物的BAC克隆成功整合验证引物序列如SEQ ID NO.9～12所示；
引物对3的序列：
Fsip2-F1：cagcaaggaaacaatggttacac(SEQ ID NO.9)
Fsip2-R1：tccgcacccgacatagataataac(SEQ ID NO.10)
Fsip2-F2：tccgcacccgacatagataataac(SEQ ID NO.11)
Fsip2-R2：catgactgctctgacaacacac(SEQ ID NO.12)
优选地，Fsip2基因过表达动物的Fsip2基因拷贝数验证引物序列如SEQ ID NO.13～16所示。
引物对4的序列：
Fsip2-F1：aaatgagcaaaagccagggg(SEQ ID NO.13)
Fsip2-R1：ctgttcgggtgttttctgca(SEQ ID NO.14)
Dicer-1-F1：ctggtggcttgaggacaagac(SEQ ID NO.15)
Dicer-1-R1：agtgtagccttagccatttgc(SEQ ID NO.16)。
本发明实施例提供了分别用于构建模拟精子鞭毛多发形态异常的基因突变鼠模型和基因过表达的鼠模型的方法，采用CRISPR-Cas9技术在鼠的Fsip2基因中敲入模拟人的Fsip2基因的突变，以及通过BAC转基因技术过表达Fsip2基因。
下面结合实施例对本发明的特征和性能做进一步详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于构建精子鞭毛多发形态异常疾病模型和基因过表达模型的方法，其包括敲入鼠Fsip2基因突变和对基因进行过表达，并对鼠表型等进行验证。其中，WT表示野生型鼠，Fsip2-KI表示Fsip2基因突变鼠，Fsip2-OE表示Fsip2基因过表达鼠。
(1)基因突变敲入
采用CRISPR-Cas9技术对C57BL/6J鼠进行基因编辑以获得Fsip2基因突变鼠。对目的基因设计gRNA，并合成oligo donor DNA，将gRNA，Cas9 mRNA和donor DNA显微注射到受精卵中培养至双细胞期，将其转入假孕雌鼠输卵管中，产生F0代基因变异鼠后对DNA序列进行Sanger验证，将基因变异的F0代鼠与野生型鼠交配，获得稳定遗传的杂合子鼠F1，将F1自交繁殖获得纯合型基因突变敲入子代，通过Sanger测序验证突变(如图1)，并对RNA表达水平进行qRT-PCR验证(如图2)，用于后续实验。图2说明Fsip2基因突变鼠的Fsip2基因的mRNA表达量显著低于野生型鼠。
(2)基因过表达
将包含完整Fsip2基因序列及其侧翼序列的BAC克隆(CloneDB，ID：RP23-221K3)注射到鼠的受精卵中，使Fsip2基因随机整合到鼠基因组中，从而获得Fsip2基因过表达鼠。对RNA表达水平进行qRT-PCR验证(如图2)，对Fsip2基因的拷贝数进行qPCR验证(如图3)，用于后续实验。图3说明所有的Fsip2基因过表达鼠的Fsip2基因拷贝数都高于野生型鼠，且大部分基因过表达鼠的Fsip2基因的mRNA表达量高于野生型鼠。
对获得的Fsip2基因突变鼠的精子鞭毛多发形态异常相关表型和基因过表达鼠的相关表型进行检测。具体如下：
(3)鼠精子形态检测
精子鞭毛多发形态异常的主要表现为精子卷曲、弯曲、不规则、短或/和缺失，故检测的重要指标为精子的形态。从12-16周龄的雄性鼠的附睾尾中采集精子，在37℃下，在SpermRinse培养基中培养10分钟，通过BASO染色法对精子进行染色，在相差显微镜下(分辨率400X)观察精子尾部的长度，厚度，是否卷曲成团，是否分岔或打结等(如图4)。图4说明与野生型鼠和基因过表达鼠相比，Fsip2基因突变鼠的精子尾部特别短，且出现了分岔现象，表现出精子鞭毛多发形态异常的特征。为了进一步检测精子的形态，将分离出的附睾尾精子在PBS中洗涤，并在2.5％戊二醛和2％多聚甲醛的0.15M磷酸钠缓冲液中固定，在4℃下过夜，将精子在缓冲液中洗净，收集在玻璃盖玻片上进行干燥和包被，通过HITACHI S-3000N扫描电子显微镜(20KV，分辨率1000X和5000X)进一步观察精子尾部各个节段(中段，主段和尾段)是否存在异常，如中段的线粒体鞘是否发育不良，主段的纤维鞘是否缺失，尾段的鞭毛轴丝是否暴露等等(如图5)。图5说明Fsip2基因突变鼠的精子尾部短，主段纤维鞘缺失，鞭毛轴丝外露。
(4)计算机辅助精子分析
精子鞭毛多发形态异常还会导致精子活力显著降低，故检测的重要指标为精子浓度、活力和运动能力。在计算机辅助精子分析中，将检测精子悬液滴加在载物台的专用底板上，并盖上盖玻片，通过CASA分析系统采集和记录精子各项指标，包括精子浓度、精子活力和精子运动速度等(如表1，表2)。表1为野生型鼠和Fsip2基因突变敲入鼠的CASA分析结果；表2为野生型鼠和Fsip2基因过表达鼠的CASA分析结果；
表1说明Fsip2基因突变敲入鼠精子的浓度，活力和运动能力显著低于野生型鼠精子；表2说明Fsip2基因过表达鼠精子的活力略微弱于野生型鼠精子，但在精子浓度和运动能力方面无显著差异。
表1
参数 WT<sup>a</sup> KI<sup>b</sup> P-value
浓度(mill/ml) 47.62±10.98 25.64±8.37 1.89e-2
活力(％) 48.50±2.05 14.66±2.78 1.15e-6
A-level motility(％) 7.12±0.83 0.60±0.19 6.14e-4
B-level motility(％) 21.18±1.28 3.26±1.25 1.02e-6
C-level motility(％) 20.18±2.43 10.80±2.31 1.40e-3
D-level motility(％) 51.50±2.05 85.34±2.78 1.15e-6
VCL(μm/s) 127.95±2.61 94.98±2.36 1.51e-6
VSL(μm/s) 38.48±3.24 20.60±1.68 6.54e-5
VAP(μm/s) 57.00±4.14 36.01±2.03 9.90e-5
LIN(％) 30.08±2.27 21.67±1.31 6.79e-4
STR(％) 67.53±1.24 57.15±1.65 5.67e-5
WOB(％) 44.50±2.73 37.90±1.40 5.11e-3
A-level motility sperm:快速向前运动的精子
B-level motility sperm:慢速向前运动的精子
C-level motility sperm:非向前运动精子
D-level motility sperm:极慢速或保持静止的精子
VCL:curvilinear velocity(曲线速度)；VSL:straight-line velocity(直线速度)；VAP:average path velocity(平均路径速度)
LIN:linearity(线性)；STR:straightness(直度)；WOB:wobbling(摆动)。
an＝4只15周左右的鼠。
bn＝4只15周左右的鼠。
表2
参数 WT<sup>a</sup> OE<sup>b</sup> P-value
浓度(mill/ml) 27.79±6.23 30.24±5.76 0.46
活力(％) 96.24±1.93 93.52±2.17 0.03
A-level motility(％) 5.77±1.25 5.55±1.04 0.72
B-level motility(％) 71.67±8.29 62.14±7.19 0.04
C-level motility(％) 18.80±6.01 25.84±5.37 0.04
D-level motility(％) 3.76±1.93 6.48±2.17 0.03
VCL(μm/s) 72.34±8.08 61.98±7.25 0.03
VSL(μm/s) 14.75±1.37 13.26±1.01 0.04
VAP(μm/s) 31.47±2.98 27.50±2.45 0.02
LIN(％) 20.52±2.28 21.53±1.90 0.38
STR(％) 46.96±3.24 48.31±2.54 0.40
WOB(％) 43.60±1.93 44.51±1.70 0.37
an＝6只25周左右的鼠。
bn＝8只25周左右的鼠。
(5)精子尾部超微结构检测
精子鞭毛多发形态异常还表现为精子尾部超微结构异常。本实施例采用透射电子显微镜观察精子尾部超微结构。精子样本分别用3％戊二醛和2％四氧化锇固定液固定，通过梯度浓度的丙酮溶液脱水，包埋在Lowicryl树脂中，用透射电子显微镜(HITACHI H-7500，80KV)观察鼠精子尾部超微结构，评估由于Fsip2基因突变敲入和基因过表达对线粒体鞘、纤维鞘、外层致密纤维(outer dense fibers,ODF)、9+2微管和微管中心对的形态、数目和排列方式造成的影响(如图6)。图6说明Fsip2基因突变敲入鼠的精子尾部线粒体鞘发育不良，纤维鞘横肋缺失；基因过表达鼠精子的尾部超微结构没有表现出明显异常。
(6)精子尾部长度检测
Fsip2基因过表达可能导致精子尾部变长。本实施例采用免疫染色法结合相差显微镜检测精子尾部长度。将附睾尾精子分离、固定，用新鲜制备的0.3％X-100在PBS中破膜，用10％山羊血清在37℃下封闭1小时，然后用兔抗Akap4抗体在4℃下孵育过夜。玻片洗净后用MitoTracker探针和二抗(Alexa Fluor 488羊抗兔IgG)在37℃孵育45分钟。清洗玻片，用DAPI染细胞核，通过带有相差通道的荧光显微镜成像。主段的长度通过Akap4绿色通道测量，中段的长度通过MitoTrack红色信号测量(如图7)。图7说明与野生型鼠相比，Fsip2基因过表达鼠的精子尾部主段(图7A)和中段(图7B)均更长。
对获得的Fsip2基因突变敲入型和基因过表达鼠的睾丸组织的变化进行观察。具体如下：
(7)睾丸组织HE染色和PAS染色
手术切除12-16周的雄鼠睾丸组织，固定在改良的Davidson's液(mDF)中，在梯度浓度的乙醇中脱水，包埋在石蜡中，然后制备3-4μm厚的组织学切片。切片分别用苏木精-伊红(hematoxylin-eosi，HE)和过碘酸雪夫氏试剂(periodic acid solution and Schiff’sreagents)染色，然后通过光学显微镜观察曲细精管形态(如图8)。图8说明与野生型鼠相比，Fsip2基因过表达鼠的睾丸曲细精管中精子细胞的密度更高，而Fsip2基因突变敲入鼠的精子细胞密度更低。
(8)睾丸组织免疫荧光
手术切除12-16周的雄鼠睾丸组织，固定后在乙醇中水化，分别用0.3％的TritonX-100和10％山羊血清进行破膜和封闭。玻片先用一级抗体(分别靶向Akap4、Akap3、Cabyr、Gapdhs和Odf2的抗体)孵育，用PBS洗涤2次，然后用二级抗体(羊抗兔Alexa Fluor 488或568)孵育，用DAPI染细胞核，通过荧光显微镜(Leica)拍摄图像(如图9)。图9说明与野生型鼠相比，Akap4和Akap3这两个已知的精子尾部纤维鞘蛋白在Fsip2基因过表达鼠的睾丸组织中荧光信号更强，而在Fsip2基因突变敲入鼠的睾丸组织中信号更弱。
对获得的Fsip2基因突变敲入型和基因过表达鼠睾丸组织和精子的分子层面的变化进行观察。具体如下：
(9)睾丸组织单细胞RNA-seq测序和生物信息学分析
分离野生型鼠(WT)、Fsip2基因突变鼠(KI)和基因过表达鼠(OE)的睾丸组织，去除白膜，用胶原酶IV、胰蛋白酶和DNA酶I进行消化，随后进行冻干、过滤和重悬。用10XGenomics Chromium平台构建单细胞测序文库，通过Illumina HiseqX10测序仪进行高通量测序。测序得到的Reads用Cell Ranger软件进行处理，并比对到鼠的参考基因组上。将比对后得到的UMI矩阵导入R包Seurat中进行过滤和标准化，并挑选出其中的高变基因(highlyvariable genes)，将三种处理情况下的数据合并起来。进行主成分分析后，选出前30个主成分对数据进行TSNE(t分布的随机相邻嵌入)降维，并将细胞分为数个亚群。通过分析亚群的标记基因，将细胞亚群鉴定为精原细胞、精母细胞、圆型精子、延长期精子、Sertoli细胞和Leydig细胞。通过分析不同处理情况下同类型细胞的基因变化情况，阐明Fsip2基因突变敲入和过表达对睾丸组织表达谱造成的影响(如图10)。图10说明小鼠睾丸组织主要包含六种细胞类型(图10A)，其中Fsip2在圆型精子(round spermatid)中富集(图10B)；与野生型鼠相比，Fsip2基因过表达鼠的圆型精子的大量上调基因显著富集在精子鞭毛、精子发育和精子分化等GO条目中(图10C)；与野生型鼠相比，Fsip2基因突变敲入鼠的圆型精子的差异基因相对较少；下调最明显的前7个基因在各个细胞类型的表达情况如图10D所示。
(10)鼠睾丸组织蛋白质组测序和生物信息学分析
将野生型鼠(WT)、Fsip2基因突变鼠(KI)和基因过表达鼠(OE)的睾丸研磨成粉末，加入裂解缓冲液后进行超声裂解，离心去除细胞碎片。取上清液加入二硫苏糖醇进行还原，加入碘代乙酰胺孵育，加入胰酶酶解肽段。裂解后的肽段除盐后真空冷冻干燥，用TMT10-plex试剂标记肽段，用高效液相色谱法(HPLC)进行分级，合并为18个组分。后续用EASY-nLC1000超高效液相系统进行分离，注入NSI离子源中进行电离然后进Orbitrap FusionLumosTM质谱进行分析。一级质谱扫描范围设置为350-1550m/z，扫描分辨率设置为60,000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为15,000。二级质谱数据使用Maxquant进行检索。通过基因集富集分析(Gene set enrichment analysis)方法分析与纤维鞘和线粒体鞘相关的蛋白在数据中的富集情况(如图11)。图11说明与野生型鼠相比，Fsip2基因突变敲入鼠睾丸的显著差异蛋白较多(图11A)，而Fsip2基因过表达鼠睾丸的显著差异蛋白较少(图11B)；已知的22个精子纤维鞘相关蛋白分别富集在Fsip2基因突变敲入鼠和基因过表达鼠的下调蛋白和上调蛋白中(图11C)；已知的15个精子线粒体鞘相关蛋白也有类似的富集现象(图11D)。
(11)精子尾部相关蛋白的免疫荧光
从12-16周龄的雄性鼠的附睾尾中收集精子，制备涂片并固定。用抗原回收缓冲液激活涂片，分别用0.3％的Triton X-100和10％山羊血清进行破膜和封闭，在4℃下用稀释的一级抗体(分别靶向Akap4、Akap3、Cabyr和Gapdhs的抗体)孵育过夜，经PBS洗涤后，用二级抗体(羊抗兔Alexa Fluor 488或568)孵育，用DAPI染细胞核，通过荧光显微镜(Leica)拍摄图像(如图12)。图12说明与野生型鼠相比，Akap4、Akap3、Gapdhs和Cabyr这4个精子尾部纤维鞘蛋白在Fsip2基因过表达鼠的成熟精子中荧光信号更强，而在Fsip2基因突变敲入鼠的成熟精子中没有信号；此外，精子尾部蛋白Odf2的荧光信号在Fsip2基因过表达鼠和野生型鼠的精子之间没有明显差异，在Fsip2基因突变敲入鼠精子中信号略弱。
(12)精子尾部相关蛋白的Western blot验证
使用含有10mM鸡尾酒(Roche)和PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从鼠睾丸组织中提取总蛋白，将变性后的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析，用Actin作为对照(如图13)。图13说明与野生型鼠相比，Akap4、Akap3、Gapdhs和Cabyr这4个精子尾部纤维鞘蛋白在Fsip2基因过表达鼠的睾丸中表达量更高，而在Fsip2基因突变敲入鼠的睾丸中表达量更低；另一方面，精子尾部蛋白Odf2的表达量在Fsip2基因过表达鼠和野生型鼠的睾丸之间没有明显差异，在Fsip2基因突变敲入鼠的睾丸中表达较低。
另外，该方法得到的Fsip2-KI，即该Fsip2基因突变鼠仅形成了存在精子鞭毛多发形态异常的形状，与临床的精子鞭毛多发形态异常疾病性状相同，该鼠的精子在其他方面的性状不发生改变，例如巴氏染色显示精子头部和颈部的外观正常。
实施例2鼠模型在精子鞭毛多发形态异常药物筛选中的应用
在药物筛选过程中，须经过动物实验在体观察药物的作用。依据Fsip2导致精子鞭毛多发形态异常的潜在机制，使用药物A对胚胎期或新生鼠进行干预，观察鼠脑组织发育的变化。实验设置野生组，Fsip2突变敲入组，Fsip2突变敲入加药物干预组。可进行以下表征来判断药物A精子鞭毛多发形态异常的预防或治疗效果。
比较鼠精子形态的改变：鼠精子形态检测，包括但不限于BASO染色和扫描电镜检测。
比较精子运动能力的改变：精子运动能力检测，包括但不限于计算机辅助精子分析。
比较鼠超微结构的改变：精子超微结构检测，包括但不限于透射电子显微镜检测。
比较鼠睾丸曲细精管的改变：在生精阶段VII-VIII，观察曲细精管内精子密度和精子尾部长度的改变。
比较鼠睾丸基因表达谱和蛋白质组的变化。
比较鼠精子尾部相关蛋白的表达变化。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市妇女儿童医疗中心(广州市妇幼保健院、广州市儿童医院、广州市妇婴医院、广州市妇幼保健计划生育服务中心)
<120> 精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atcaagaaca agttatctgc tgg 23
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agcagtacta agaccaaaat caagaacaag ttaagcgctg gagagaaaac ctccaagaga 60
gagcagacca aaaccgccct tgggctgcca caaactccac 100
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aactcagccc aaagaacagc cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tccgtaggat aacctgcacc ca 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcacacgatt ccaaaactgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aagcgttgtt cctctgctgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgatgaggag gaggttgtcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tttcaggttg cttgtgcttg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cagcaaggaa acaatggtta cac 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tccgcacccg acatagataa taac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tccgcacccg acatagataa taac 24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
catgactgct ctgacaacac ac 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aaatgagcaa aagccagggg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctgttcgggt gttttctgca 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ctggtggctt gaggacaaga c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
agtgtagcct tagccatttg c 21

Claims (10)

1.一种精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括在野生型Fsip2基因的第8136位核苷酸C和第8138位核苷酸T之间插入核苷酸C的步骤，所述构建方法中所使用的动物为啮齿类动物。
2.根据权利要求1所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，插入核苷酸C的方法选自CRISPR-Cas9技术、ZFN技术、TALENs技术和Cre-loxp基因敲入技术中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将oligo donor DNA、gRNA和Cas9 mRNA的混合物显微注射至受精卵，胚胎移植，产生F0代基因变异动物；
所述gRNA序列如SEQ IDNO.l所示，所述oligo donor DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法还包括对F0代基因变异动物进行Sanger测序验证的步骤，Sanger测序引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求3所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，将F0代基因变异动物与野生型动物交配，获得稳定遗传的杂合子F1代动物，将F1代动物自交繁殖获得纯合型基因变异动物。
6.根据权利要求5所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括对所述纯合型基因变异动物进行qRT-PCR验证的步骤，qRT-PCR引物序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求5所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法中所使用的动物为小鼠或大鼠；优选的，所述小鼠的品系选自C57BL/6J、C57BL/6N、DBA/2和BALB/c中的任意一种。
8.根据权利要求5所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括对获得的纯合型基因变异动物进行表型验证的步骤，所述表型验证包括精子形态检测、计算机辅助精子分析、精子尾部超微结构检测和精子尾部长度检测中的任意一种或多种。
9.根据权利要求5所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法，其特征在于，包括对获得的纯合型基因变异鼠进行组织层面验证的步骤，所述组织层面验证包括：成年期睾丸组织的曲细精管的HE染色和PAS染色和成年期睾丸组织的曲细精管的组织免疫荧光染色中的任意一种或多种；和/或，
包括对获得的纯合型基因变异动物进行分子层面验证的步骤，所述分子层面验证包括：睾丸组织单细胞RNA-seq测序、睾丸组织蛋白质组测序、精子免疫荧光染色和Westernblot验证中的任意一种或多种。
10.如权利要求1～9任一项所述的精子鞭毛多发形态异常疾病动物模型的构建方法在筛选用于预防或治疗精子鞭毛多发形态异常的药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113450354A (zh) * 2021-08-30 2021-09-28 山东仕达思生物产业有限公司 基于卷积神经网络和摇摆活动特征的滴虫检测方法
CN115472219A (zh) * 2022-10-19 2022-12-13 温州医科大学 一种阿尔兹海默病数据的处理方法及其系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018129341A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Alpine Biotherapeutics Corporation Nucleic acids and methods for genome editing
CN110582578A (zh) * 2017-02-10 2019-12-17 洛克菲勒大学 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018129341A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Alpine Biotherapeutics Corporation Nucleic acids and methods for genome editing
CN110769835A (zh) * 2017-01-06 2020-02-07 皮勒戈有限公司 用于基因组编辑的核酸和方法
CN110582578A (zh) * 2017-02-10 2019-12-17 洛克菲勒大学 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUILLAUME MARTINEZ ET AL.: "Whole-exome sequencing identifies mutations in FSIP2 as a recurrent cause of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella", 《HUMAN REPRODUCTION》 *
方肇勤: "《分子生物学技术在中医药研究中的应用》", 30 April 2018, 上海科学技术出版社 *
钟亚楠等: "精子尾部发育相关蛋白研究进展", 《遗传》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113450354A (zh) * 2021-08-30 2021-09-28 山东仕达思生物产业有限公司 基于卷积神经网络和摇摆活动特征的滴虫检测方法
CN115472219A (zh) * 2022-10-19 2022-12-13 温州医科大学 一种阿尔兹海默病数据的处理方法及其系统

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