CN103018431A - 一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于卷烟烟气凝集物毒性细胞效应检测技术领域，具体涉及一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法。现有技术不能充分的反映其烟气凝集物的生物学毒性。为解决现有技术存在的问题，本发明提供的技术方案是：本发明在常规细胞培养技术下，以哺乳动物气管上皮细胞或肺上皮细胞为靶细胞，以烟气凝集物为待测样品，两者共育一定时间，以MTT法检测受试靶细胞增殖状态，反映待测样品是否刺激靶细胞增殖，以细胞增殖的多少反映待测样品的生物学活性，即“毒性”，本发明对细胞毒试验是一个有用的补充，即检测烟气凝集物对靶细胞增殖的刺激作用。这种细胞增殖刺激作用比直接的细胞毒作用更灵敏。

Description

一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法

技术领域

本发明属于卷烟烟气凝集物毒性细胞效应检测技术领域，具体涉及一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法。

背景技术

目前卷烟烟气凝集物（cigarette smoke condensate CSC）的毒理学评价指标包括，卷烟烟气的细胞毒性（中性红细胞毒性试验）， 细菌回复突变试验（AMES试验），诱发小鼠微核形成率（微核试验）等三种检测方法，主要目的是检测其对细菌,哺乳动物细胞的致突变作用，中性红细胞毒试验检测的是卷烟烟气凝集物杀伤细胞的直接细胞毒性，细菌回复突变试验和微核形成试验反映的是烟气凝集物的基因毒作用，进而与肿瘤发生相关联。过去对于肿瘤的发生主要归结于基因毒，即其致突变性。 目前认为肿瘤发生过程中除了基因损伤的积累外，细胞活跃的增殖是其癌变的前提。如果在烟气凝集物的作用下细胞被完全破坏， 细胞的癌变即无从说起。因此，中性红试验的确可以反映烟气凝集物的细胞毒性，但从致癌这一目前所认为的吸烟最主要的危害来说，中性红细胞毒试验结合细菌回复突变和微核形成两种基因毒检测还不能充分的反映其烟气凝集物的生物学毒性。直接杀伤细胞所需的烟气凝集物剂量明显高于刺激细胞增殖所需的剂量，因此， 细胞的增殖试验对细胞毒试验将是一个有用的补充。即检测烟气凝集物对靶细胞增殖的刺激作用。这种细胞增殖刺激作用比直接的细胞毒作用更灵敏。事实上，通常吸烟者每次所暴露于烟气凝集物的量是很微弱的，这一检测结果更切合实际。

发明内容

本发明的目的是提供一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法，以解决现有技术不能充分的反映其烟气凝集物的生物学毒性的问题。

为解决现有技术存在的问题，本发明提供的技术方案是：

一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1，烟气粒相物的获得：确定所要选用及需处理的样品，在恒温恒湿，即：20℃和60%相对湿度条件下平衡48h，通过德国Borgwaldt公司生产的 RM- 20型转盘式20孔道吸烟机，在维持20℃和60%相对湿度条件下，在标准抽吸条件下，即：1 puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff抽吸，烟气通过 85 mm直径的剑桥滤片收集 

2，烟气粒相物的提取：将获得的滤纸片取下密封保存，处理时，用剪刀剪碎，放入50 mL离心管中，加入二甲基亚砜以使其完全浸没滤纸碎片。30℃下振荡4hrs后,  30℃，5000rpm条件下离心，取上清液体，收集入离心管中4℃密封保存备用。

3，细胞增殖/细胞毒试验：

细胞株：CCL-64 貂肺上皮细胞，细胞培养于DMEM完全培养基中，经时添加培养基并传代，维持细胞在对数生长期，待用；

取培养至对数期的细胞株，调细胞浓度至1x105 /ml, 接种于96孔板，104/孔细胞，添加待试的TPM 20% 起始，对倍稀释，37℃ 培养48小时，加MTT，即储存液2mg/ml，20μl/孔，继续孵育4小时， 弃上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm 读取光密度，分析结果，一般结果显示，高浓度烟气凝集物表现为直接的细胞毒效应，即OD值低于阴性对照，当待测样品浓度降低时则表现为刺激细胞增殖，OD值高于阴性对照，以明显刺激细胞增殖的最高稀释度为观察终点。

本发明相对于现有技术，具有如下优点和效果：

本发明在常规细胞培养技术下，以哺乳动物气管上皮细胞或肺上皮细胞为靶细胞，以烟气凝集物为待测样品，两者共育一定时间， 以MTT 法检测受试靶细胞增殖状态，反映待测样品是否刺激靶细胞增殖， 以细胞增殖的多少反映待测样品的生物学活性，即“毒性”， 本发明对细胞毒试验是一个有用的补充，即检测烟气凝集物对靶细胞增殖的刺激作用。这种细胞增殖刺激作用比直接的细胞毒作用更灵敏。

附图说明

图1为烟气凝聚物对CCL-64细胞增殖的刺激效应检测结果图；

图2为图1检测结果的条形图；

具体实施方式

申请人给出以下实施例， 但不局限于这些实施例：

实施例1，一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法，包括以下步骤：1、烟气粒相物的获得。确定所要选用及需处理的样品，在恒温恒湿 (20℃和60%相对湿度)条件下平衡48h，通过德国Borgwaldt公司生产的 RM- 20型转盘式20孔道吸烟机（需维持恒温恒湿，20℃和60%相对湿度的条件），在标准抽吸条件下(1 puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff) 抽吸，烟气通过 85 mm直径的剑桥滤片收集。滤纸在收集烟气之前和收集完烟气之后分别称重，最后得出所收的烟气的重量。（具体参见陕西中烟中心实验室）

2、烟气粒相物的提取。将获得的滤纸片取下密封拿回（须密封保存，维持恒定的条件），处理时，用剪刀剪碎（一般对折之后剪成3-4小块/片）放入50 mL离心管中，加入20 mL二甲基亚砜以使其完全浸没滤纸碎片。常温放置60min，置于摇床中于220r/min、30℃下振荡4hrs后, 再在超声仪上超声40min，然后离心（30℃，5000rpm）30min，最后将获得的液体吸出，滤纸片取出并挤压完全。收集入离心管中4℃密封保存，使用时需融化并10000rpm,27℃(温度过低会导致凝固，过高会导致挥发)离心10分钟，然后取出上清直接实验。注意整个过程要密封。温度不可以过低（<20℃）或者过高（>45℃）。

3、细胞增殖/细胞毒试验

  细胞株：CCL-64 貂肺上皮细胞，  细胞培养于含10% 谈牛血清得DMEM完全培养基中，经时添加培养基并传代，维持细胞在对数生长期。检测时，取培养至对数期的细胞株，以含2% 胎牛血清的DMEM培养基（随后检测过程均以此培养基）调细胞浓度至1x10⁵ /ml, 接种于96孔板，10⁴/孔细胞。 添加待试的TPM 20% 起始，对倍稀释。37℃ 培养48小时， 加MTT（储存液2mg/ml）20μl/孔， 继续孵育4小时， 弃上清， 加DMSO 150ul/孔， 570nm/630nm 读取光密度。分析结果。

Claims (1)

1.一种卷烟烟气凝集物毒理学生物测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）烟气粒相物的获得：确定所要选用及需处理的样品，在恒温恒湿，即：20℃和60%相对湿度条件下平衡48h，通过德国Borgwaldt公司生产的 RM- 20型转盘式20孔道吸烟机，在维持20℃和60%相对湿度条件下，在标准抽吸条件下，即：1 puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff抽吸，烟气通过 85 mm直径的剑桥滤片收集；

2）烟气粒相物的提取：将获得的滤纸片取下密封保存，处理时，用剪刀剪碎，放入50 mL离心管中，加入二甲基亚砜以使其完全浸没滤纸碎片，30℃下振荡4hrs后,  30℃，5000rpm条件下离心，取上清液体，收集入离心管中4℃密封保存备用；

3）细胞增殖/细胞毒试验：

细胞株：CCL-64 貂肺上皮细胞，细胞培养于DMEM完全培养基中，经时添加培养基并传代，维持细胞在对数生长期，待用；

取培养至对数期的细胞株，调细胞浓度至1x105 /ml, 接种于96孔板，104/孔细胞，添加待试的TPM 20% 起始，对倍稀释，37℃ 培养48小时，加MTT，即储存液2mg/ml，20μl/孔，继续孵育4小时， 弃上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm 读取光密度，分析结果，一般结果显示，高浓度烟气凝集物表现为直接的细胞毒效应，即OD值低于阴性对照，当待测样品浓度降低时则表现为刺激细胞增殖，OD值高于阴性对照，以明显刺激细胞增殖的最高稀释度为观察终点。

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