CN101693915A - 卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及卷烟烟气毒理学研究领域，尤其是一种卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法。卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，该方法包括以下的步骤：①卷烟烟气粒相物提取液制取；②HMy2.CIR人B淋巴母细胞系培养；③染毒；④显色；⑤计算细胞存活率；⑥然后绘制成图计算IC50。本发明具有的优点：1、不存在个体差异，可排除个体差异对实验的影响。2、取材方便，细胞数量不受限制，可满足大样本量实验需要。3、不涉及伦理问题。4、与CCK-8作用时间短，可以缩短显色时间并减少因显色时间长而产生的实验误差，实验过程更为快速。
Description
技术领域
本发明涉及卷烟烟气毒理学研究领域，尤其是一种卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法。
背景技术
细胞毒性在探究化学物对细胞和或组织的作用机制中起重要作用，它可影响包括致癌作用和炎症反应等多个病理学过程。细胞毒性也可调节自由基、刺激剂和遗传毒性物质等其它物质的作用(Bombick，DW et al.，chemical andbiological studies of a new cigarette that primarily heats tobacco，Food and ChemicalToxicology，1998，36，191-197.)。卷烟烟气是一种复杂的混合物，它含有6000多种化学物质，其中有多种或多类化学物具有细胞毒性。细胞毒性试验可对这些化学物进行筛选，以发现具有潜在危害的毒性效应，并可及时为化学物毒作用机制的研究提供信息，这类试验的另一优点是比较经济。细胞毒性评价在研究卷烟烟气这样的复杂混合物的毒作用机制中起重要作用。对卷烟烟气冷凝物的细胞毒性评价对新型卷烟的设计具有重要意义，它有助于降低卷烟产品的化学及生物学活性(Putnam，KP et al.，evaluation of eight in vitro assays for assessing thecytotoxicity of cigarette smoke condensate，Toxicology in Vitro，2002，16，599-607)。体外细胞毒性试验的运用可节省时间、研究资金并可减少实验动物的使用。
检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，不同的细胞可能有相同的机制，也可能有细胞特异性机制。在选择细胞毒性试验时必须考虑两点：试验所需的时间以及该试验所检测的生物学终点。细胞毒性的可通过测定酸性磷酸酶或其它蛋白活性而计算细胞数量、测定细胞代谢活性以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价，这些终点的测定分别可用不同的试验进行。目前已有部分学者用不同的方法对卷烟烟气以及其中的化学物的细胞毒性进行研究。Babich和Borenfreund用中性红试验研究了包括尼古丁在内的一些烟气中的化学物的细胞毒性(Babich，H.，Borenfreund，E.，Cytotoxic and morphological effectsof phenyl-propanolamine，caffeine，nicotine and some of their metabolites studied invitro.Toxicology in Vitro，1992，6，493-502)。Yang和Acosta用LDH试验和MTT试验同时评价表面活性剂混合物的细胞毒性，并将其结果与整体动物眼刺激试验的结果进行比较，虽然这些试验所检测的生物学终点不同，但它们所测得的细胞毒性结果类似(Yang，W.，Acosta，D.，Cytotoxicity potential of surfactantmixtures evaluated by primary cultures of rabbit corneal epithelial cells，ToxicologyLetters，1994，70，309-318)。Grant等也在对多种表面活性剂的细胞毒性的研究中发现LDH试验、MTT试验以及中性红试验所得到的结果类似(Grant，RL)。中性红试验已被较多的用于不同焦油含量或不同类型那个卷烟烟气所致的细胞毒性的比较研究，在卷烟烟气中分析出的一些化学物的细胞毒性也由中性红试验测定(Bombick，DW et al.，The contribution of hudroxy-and dihydroxybenzenesfound in cigarette smoke to the overall cytotoxicity of the cigarette smoke mixture，Toxicological Sciences，1999，48，306)。该试验还被CORESTA体外毒理学工作组推荐为卷烟烟气细胞毒性的测定方法(DeMarini，DM.，et al.，Genotoxicity of 10cigarette smoke condensates in four test systems：Comparisons between assays andcondensates，Mutation Research，2008)。
CCK-8试验可用于简便而准确的细胞毒性分析。其基本原理为：该试剂中所含化学物WST-8[其化学名为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(-4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲脂(1-Methoxy PMS)的作用下可被细胞中的脱氢酶还原为黄色甲臜染料(Formanzan dye)，这种染料具有高度水溶性。甲臜物的数量与所检测细胞中活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞毒性分析。该方法具有操作简便、安全以及重现性好等特点。
发明人在《中华劳动卫生职业病杂志》2009年3月20日出版第27卷第3期140-144页公开了建立卷烟烟气细胞毒性快速敏感的测定评价方法，其采用肝素抗凝外周血分离淋巴细胞。肝素抗凝外周血采集具有个体差异，取材不方便，而且实验时间较长等缺陷。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明的目的是建立卷烟烟气细胞毒性快速敏感的测定评价方法，为研制低危害卷烟提供方法学支持。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，该方法包括以下的步骤：①卷烟样品采用吸烟机抽吸卷烟，连续抽吸多支卷烟后将剑桥滤片取出，置于DMSO溶液中，振荡均匀制成卷烟烟气粒相物提取液；②采用HMy2.CIR人B淋巴母细胞系，用含胎牛血清的IMDM培养液于细胞培养箱中培养，2～3天传代一次；③于微孔板中每孔接种2×104～5×104个B淋巴细胞，各受试物分别采用0.001～0.01支烟/ml浓度区间内选择多个浓度的卷烟烟气粒相物提取液进行染毒；④染毒结束后向每孔中加入适量的CCK-8，置培养箱中显色；⑤显色结束后用酶标仪测定吸光度，按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％，其中
As为含处理细胞的培养基
Ac为含未处理细胞的培养基
Ab不含细胞的培养基；
⑥然后绘制成图，细胞存活率为50％的受试物浓度值即为IC50。
作为优选，所述的培养基由含4Mm L-谷氨酰胺和1.5g/L碳酸氢钠的IMDM和胎牛血清组成，IMDM的体积百分比为90％，胎牛血清的体积百分比为10％。
作为优选，各受试物分别采用2.5×10-3、5.0×10-3、7.5×10-3、10.0×10-3和12.5×10-3支烟/ml浓度的卷烟烟气粒相物提取液进行染毒。
作为优选，上述的CCK-8的加入量为5～15μL。
作为优选，上述步骤①卷烟烟气粒相物提取液的制备方法如下：卷烟样品于温度22℃±1℃和相对湿度60％±2％下平衡48h，然后在温度为22℃±2℃，湿度为60％±5％恒温恒湿下用SM400吸烟机抽吸卷烟，抽吸条件为：每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s；连续抽吸5支卷烟后将剑桥滤片取出，置10mlDMSO溶液中，以145转/分钟振荡30分钟，分装后置-70℃冰箱中待用。
本发明采用HMy2.CIR人B淋巴母细胞系，与外周血淋巴细胞比较的优点：1、不存在个体差异，可排除个体差异对实验的影响。2、取材方便，细胞数量不受限制，可满足大样本量实验需要。3、不涉及伦理问题。4、与CCK-8作用时间短，可以缩短显色时间并减少因显色时间长而产生的实验误差，实验过程更为快速。与《中华劳动卫生职业病杂志》已发表文章比较的优势：本发明操作过程更为简便，染毒结束后直接加入CCK-8试剂显色，不需要先离心收获细胞再用PBS液清洗，然后再加显色剂。
本发明由于采用了上述的技术方案，可以检测卷烟烟气的细胞毒性，并研究了细胞毒性与卷烟烟气量的关系。该方法可以用来比较研究不同卷烟烟气的细胞毒性作用，为研制低危害卷烟提供方法学支持。
附图说明
图1为本发明实施例1的烟气细胞毒性剂量效应图。
图2为本发明实施例2的烟气细胞毒性剂量效应图。
图3为本发明实施例3的烟气细胞毒性剂量效应图。
具体实施方式
实施例1对国内某一烤烟型卷烟烟气细胞毒性进行评价
按照ISO 3308抽吸条件(每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s)连续抽吸5支卷烟后将剑桥滤片取出，置10mlDMSO溶液中，以145转/分钟振荡30分钟，分装后置-70℃冰箱中待用。
HMy2.CIR人B淋巴母细胞系购自中国科学院细胞库，用IMDM培养液(含10％胎牛血清)于37℃和5％CO2细胞培养箱中培养，2-3天传代一次。取指数生长期细胞进行染毒，于96孔板中每孔接种5×104个B淋巴细胞，各受试物分别采用2.5×10-3、5.0×10-3、7.5×10-3、10.0×10-3和12.5×10-3支烟/ml浓度进行测试，每种浓度分别接种3个孔，染毒时间为24小时。染毒结束后向每孔中加入10μlCCK-8，置37℃培养箱中显色1小时。显色结束后用酶标仪于450nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含处理细胞的培养基、CCK-8)
Ac：对照孔(含未处理细胞的培养基、CCK-8)
Ab：空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8)。
然后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制成图(如图1所示)，采用直线回归分别拟合方程，计算50％细胞存活率剂量(IC50)。
细胞半数死亡剂量计算结果为：6.69×10-3支/ml。
实施例2对国内某一混合型卷烟烟气细胞毒性进行评价
按照ISO 3308抽吸条件(每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s)连续抽吸5支卷烟后将剑桥滤片取出，置10mlDMSO溶液中，以145转/分钟振荡30分钟，分装后置-70℃冰箱中待用。
HMy2.CIR人B淋巴母细胞系购自中国科学院细胞库，用IMDM培养液(含10％胎牛血清)于37℃和5％CO2细胞培养箱中培养，2-3天传代一次。取指数生长期细胞进行染毒，于96孔板中每孔接种5×104B淋巴细胞，各受试物分别采用2.5×10-3、5.0×10-3、7.5×10-3、10.0×10-3和12.5×10-3支烟/ml浓度进行测试，每种浓度分别接种3个孔，染毒时间为24小时。染毒结束后向每孔中加入10μlCCK-8，置37℃培养箱中显色1小时。显色结束后用酶标仪于450nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含处理细胞的培养基、CCK-8)
Ac：对照孔(含未处理细胞的培养基、CCK-8)
Ab：空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8)。
然后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制成图(如图2所示)，采用直线回归分别拟合方程，计算50％细胞存活率剂量(IC50)。
细胞半数死亡剂量计算结果为：14.78×10-3支/ml。
实施例3对国外某一烤烟型卷烟烟气细胞毒性进行评价
按照ISO 3308抽吸条件(每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s)连续抽吸5支卷烟后将剑桥滤片取出，置10mlDMSO溶液中，以145转/分钟振荡30分钟，分装后置-70℃冰箱中待用。
HMy2.CIR人B淋巴母细胞系购自中国科学院细胞库，用IMDM培养液(含10％胎牛血清)于37℃和5％CO2细胞培养箱中培养，2-3天传代一次。取指数生长期细胞进行染毒，于96孔板中每孔接种5×104B淋巴细胞，各受试物分别采用2.5×10-3、5.0×10-3、7.5×10-3、10.0×10-3和12.5×10-3支烟/ml浓度进行测试，每种浓度分别接种3个孔，染毒时间为24小时。染毒结束后向每孔中加入10μlCCK-8，置37℃培养箱中显色1小时。显色结束后用酶标仪于450nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含处理细胞的培养基、CCK-8)
Ac：对照孔(含未处理细胞的培养基、CCK-8)
Ab：空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8)。
然后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制成图(如图3所示)，采用直线回归分别拟合方程，计算50％细胞存活率剂量(IC50)。
细胞半数死亡剂量计算结果为：9.44×10-3支/ml。
Claims (5)
1.卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
①卷烟样品采用吸烟机抽吸卷烟，连续抽吸多支卷烟后将剑桥滤片取出，置于DMSO溶液中，振荡均匀制成卷烟烟气粒相物提取液；
②采用HMy2.CIR人B淋巴母细胞系，用含胎牛血清的IMDM培养液于细胞培养箱中培养，2～3天传代一次；
③于微孔板中每孔接种2×104～5×104个B淋巴细胞，各受试物分别采用0.001～0.015支烟/ml浓度区间内选择多个浓度的卷烟烟气粒相物提取液进行染毒；
④染毒结束后向每孔中加入适量的CCK-8，置培养箱中显色；
⑤显色结束后用酶标仪测定吸光度，按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％，其中
As为含处理细胞的培养基
Ac为含未处理细胞的培养基
Ab不含细胞的培养基；
⑥然后绘制成图，细胞存活率为50％的受试物浓度值即为IC50。
2.根据权利要求1所述的卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，其特征在于：培养基由含4Mm L-谷氨酰胺和1.5g/L碳酸氢钠的IMDM和胎牛血清组成，IMDM的体积百分比为90％，胎牛血清的体积百分比为10％。
3.根据权利要求1所述的卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，其特征在于：各受试物分别采用2.5×10-3、5.0×10-3、7.5×10-3、10.0×10-3和12.5×10-3支烟/ml浓度的卷烟烟气粒相物提取液进行染毒。
4.根据权利要求1所述的卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，其特征在于：CCK-8的加入量为5～15μL。
5.根据权利要求1所述的卷烟烟气致细胞毒性的测定评价方法，其特征在于：其特征在于步骤①卷烟烟气粒相物提取液的制备方法如下：卷烟样品于温度22℃±1℃和相对湿度60％±2％下平衡48h，然后在温度为22℃±2℃，湿度为60％±5％恒温恒湿下用SM400吸烟机抽吸卷烟，抽吸条件为：每次抽吸容积为35ml，抽吸2s，间隔60s；连续抽吸5支卷烟后将剑桥滤片取出，置10ml DMSO溶液中，以145转/分钟振荡30分钟，分装后置-70℃冰箱中待用。
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Cited By (5)
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| CN103604917A (zh) * | 2013-11-28 | 2014-02-26 | 云南烟草科学研究院 | 热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法 |
| CN103604917B (zh) * | 2013-11-28 | 2015-10-28 | 云南烟草科学研究院 | 热裂解产物捕集物细胞毒性试验阳性物筛选方法 |
| CN104730019A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-06-24 | 安徽中烟工业有限责任公司 | 一种体外评价卷烟及烟草安全性的方法 |
| CN106191198A (zh) * | 2016-09-18 | 2016-12-07 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法 |
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