CN103255196A - 一种检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，包括以下步骤，（1）分别制备不同浓度的肿瘤细胞悬液、黄连生物碱单体药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度肿瘤细胞悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用时，所使用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肿瘤细胞生长指数值，根据细胞生长指数值。判断药液对肿瘤细胞的作用本发明的优点是，该方法可实时反映给药前后的肿瘤细胞经历的生长、伸展、形态变化、死亡生理状态，具有高度的灵敏性和可重复性，无需标记，检测结果稳定、精确。
Description
技术领域
本发明属于生物中检测细胞活性方法的技术领域，具体是一种检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法。
背景技术
黄连（Coptis Chinensis Franch）是一味常用中药，黄连中主要含有的生物碱有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀等。近年来研究表明，小檗碱、黄连碱等具有一定的抗肿瘤作用，可抑制和杀伤多种癌细胞，如肝癌HepG2细胞、肺癌GLC-82细胞、胃癌MGC-803细胞等。寻找具有抗肿瘤活性的中药单体受到越来越多的关注，评价各种中药单体是否具有灭杀肿瘤细胞的作用，则要依靠对其抗肿瘤活性的检测来判断。目前，这种在体外检测中药单体抗肿瘤实验以传统的断点检测方法为主，如MTT法、荧光染色法、3H-Tdr（3H-Thymidine，三氢胸腺嘧啶核苷）掺入法等。这些方法以给药前后细胞增殖和存活能力变化作为评价指标，需要进行特定的标记和处理，操作繁琐，灵敏性较差且只能局限于特定时间点观察，无法得到药物作用的直观动态过程。
发明内容
为解决上述技术缺陷，本发明公开了一种检测黄连生物碱单体抗肿瘤活性的方法，该方法可实时反映给药前后的肿瘤细胞经历的生长、伸展、形态变化、死亡生理状态，具有高度的灵敏性和可重复性，无需标记，检测结果稳定、精确。
实现上述目的技术方案是，本发明设计的检测黄连生物碱单体对肿瘤作用的方法，包括以下步骤，（1）分别制备不同浓度的肿瘤细胞悬液、黄连生物碱单体药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度肿瘤细胞悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用时，所使用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肿瘤细胞生长指数值，根据细胞生长指数值判断药液对肿瘤细胞的作用。
所述步骤（2）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肿瘤细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃；②设置信号采集频率为1次/min,测量实时细胞分析仪未有肿瘤细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；③分别将100μl不同细胞浓度的肿瘤细胞悬液加入每个检测板板孔中的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/5min,测量实时细胞分析仪有肿瘤细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度肿瘤悬液的细胞生长指数曲线，选择肿瘤细胞加入到肿瘤细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测时间到100h时肿瘤细胞仍能处于对数生长期所对应的肿瘤细胞悬液细胞浓度，即为用于确定检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用时，所使用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的肿瘤悬液所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为1的时间点，即为添加黄连生物碱单体药液的最佳给药时间点。
步骤④分析比较不同浓度肿瘤悬液的细胞生长指数曲线时，不同浓度肿瘤悬液的肿瘤细胞浓度为2×104、4×104、5×104、8×104的细胞悬液的细胞生长指数做分析比较，上述肿瘤细胞浓度的单位为个/ml。
步骤④确定的用于检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度为4×104个/ml。
确定用于实时细胞分析仪检测时的细胞悬液浓度依据是细胞添加到培养液中能较快经过潜伏期进入对数生长期，且实时细胞分析仪检测结束时细胞仍处于对数生长期。依据肿瘤细胞的对数生长期作为判断细胞悬浮液浓度指标的原因是，对数生长期是细胞活力最好时期，是进行实验的最佳时期，细胞浓度过小则细胞需要经过较长时间的潜伏期才能进入对数生长期，导致试验周期过长；细胞浓度过大则营养物质消耗快，且细胞易粘连、叠加，则细胞很快经过对数生长期并开始脱落、死亡。在选择用于检测的最佳细胞浓度时，一般选择肿瘤细胞进入对数生长期的 1/3～2/3细胞的生长率显著增高的时段，同时为了方便后续不同浓度黄连生物碱单体药液添加到肿瘤细胞悬液中的细胞生长曲线好拟合对比，综合考察，一般细胞指数为1的时间点，为最佳的给药时间。
所述步骤（3）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肿瘤细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃，设置信号采集频率为1次/min,实时细胞分析仪检测未有肿瘤细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；②将步骤（2）确定的最佳细胞浓度的肿瘤细胞悬液100μl加入到每个检测板板孔的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/15min，实时细胞分析仪对培养液中肿瘤细胞的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤（2）确定的最佳给药时间点时，吸弃检测板板孔中的肿瘤细胞培养液，再向每个板孔中加入200μl不同浓度的黄连生物碱单体药液，另设置2个板孔，添加200μl肿瘤细胞培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为1次/min，细胞实时分析仪监测黄连生物碱单体药液中肿瘤细胞生长指数。步骤①中基准的测定是为了扣除细胞培养液本身所带电荷可能产生的背景数值，有效保证了结果的准确性及可重复性。
本发明中的黄连生物碱单体药液的配制方法是，黄连生物碱单体用肿瘤细胞培养液超声溶解10～20min，再用孔径为0.2μm的微孔滤膜过滤除菌得到母液，用肿瘤细胞培养液将母液稀释，得到不同浓度的黄连生物碱单体药液。利用培养液作为黄连生物碱单体的溶剂，防止其它化学试剂破坏细胞的黏性、弹性，避免了细胞破裂、聚堆不好观察现象的发生。
上述的黄连生物碱单体为小檗碱、巴马汀或非洲防己碱、黄连碱、药根碱或表小檗碱。
本发明检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用的方法，采用的是DP型实时细胞分析仪。DP型号是罗氏公司推出的最新型号的实时细胞分析仪，新的DP型实时细胞分析仪利用无标记、非侵入性电极阻抗测量得出细胞生长指数值，提供了实时的细胞分析，并对平行进行短期和长期的分析研究者来说具有高度的灵活性，DP型的实时细胞分析仪的检测板共3块16个孔板，可由三个不同的用户同时操作，由于其体积小，检测板可放入标准的培养箱中，轻松实现最优的培养的条件。
本发明检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用的方法，具体的是对肝癌HepG2细胞做进行的检测。
综上，本发明利用实时细胞仪检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法有益效果是，1、在本发明中所使用的方法能够将药物对细胞作用的全过程进行实时在线监测，无需标记、灵敏专属、而且能节约大量的人力物力；
2、通过对不同浓度细胞悬液中肿瘤细胞生长情况进行监测，对比不同浓度下的肿瘤细胞增殖曲线，能够筛选出检测时所使用的肿瘤细胞的最佳浓度和给药时间；
3、对本发明方法所得到的图谱及数据进行分析，能够得到各种生物碱单体、不同浓度的一个生物碱单体灭杀肿瘤细胞数值一半的时间，进而得到各种单体、不同浓度一个生物碱单体的作用强弱顺序；
4、通过对比不同药物的图谱之间的差异也能对其作用机制研究提供支持；
5、本发明的技术方案具有定性定量、简便快捷、易于推广的优点。
附图说明
图1为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数CI值为纵轴；
图2为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数CI值为纵轴；
图3为DP实时细胞分析仪监测的不同浓度巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数值谱图，该谱图以时间横轴，细胞生长指数CI值为纵轴；
其中，曲线1为DP实时细胞分析仪监测小檗碱药液对肝癌细胞HepG2的作用情况时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；
曲线2为质量浓度250ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线3为质量浓度120ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线4为质量浓度85ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线5为质量浓度65ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线6为质量浓度55ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线7为质量浓度45ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线8为质量浓度40ug/ml的小檗碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线9为DP实时细胞分析仪监测黄连碱药液对肝癌细胞HepG2的作用情况时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；
曲线10为质量浓度60ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线11为质量浓度50ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线12为质量浓度40ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线13为质量浓度30ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线14为质量浓度20ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线15为质量浓度10ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线16为质量浓度5ug/ml的黄连碱药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线17为DP实时细胞分析仪监测巴马汀药液对肝癌细胞HepG2的作用情况时，设置的空白对照组的细胞生长指数曲线；
曲线18为质量浓度500ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线19为质量浓度450ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线20为质量浓度400ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线21为质量浓度350ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线22为质量浓度300ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数；
曲线24为质量浓度200ug/ml的巴马汀药液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明发明内容。
实施例一：本发明利用实时细胞仪检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，肿瘤细胞具体的为肝癌细胞HepG2；黄连生物单碱体常见的有小檗碱、巴马汀、非洲防己碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱，本发明方法可同时对不同浓度、各种生物碱单体对肝癌细胞HepG2的作用进行监测，实施例一列举的是对于不同浓度的小檗碱药液对肝癌细胞HepG2的作用情况，本实施例中用到的实时细胞分析仪均是DP型实施细胞分析仪。
1、试验中所用到的仪器：RTCA DP (德国Roche公司)；E-Plate 16检测板 (6x6 plates，德国Roche公司)；恒温培养箱（5410型，美国Napco公司）；冷冻离心机（HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；电子天平（AL-204型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；吉尔森移液器（P100型、P1000型，法国GILSON公司）；微孔滤膜（0.20 μm，美国Millipore公司）；培养瓶（25cm、75cm，美国Corning公司）；离心管（2mL、5mL、10mL、50mL，美国Corning公司）。
2、供试药液：小檗碱（纯度均大于98%）由中国药品生物制品检定所提供；
3、检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法步骤为，（1）分别制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液、小檗碱药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度肝癌细胞HepG2悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测小檗碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肝癌细胞HepG2生长指数值，根据细胞生长指数值判断药液对肿瘤细胞的作用。
步骤（1）中制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液时，利用现有的方法对肝癌HepG2细胞培养，肝癌细胞株HepG2用的培养液是含10%胎牛血清的DMEM培养液，用体积浓度为5%CO2，温度为37℃的恒温培养箱中培养，制备肿瘤细胞悬液的具体步骤为选取在HepG2细胞培养液中生长状态良好的HepG2细胞，用质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2细胞培养液终止消化、吹打初步得到细胞悬液，再转移至离心管离心5min，离心后加入HepG2细胞培养液并吹匀，此时得到的HepG2细胞悬液中的细胞呈分散的单个细胞状态。根据加入的HepG2细胞培养液的量，分别制备肝癌细胞HepG2浓度为5×10---3、5×10---4、2×10---4、4×10---4、8×10---4、1.6×10---5、3.2×10---5、6.4×10---5个/ml的肝癌细胞HepG2悬液。
上述步骤（1）中制备不同浓度的小檗碱药液的具体操作步骤是：精密称取小檗碱粉末，加入肿瘤细胞培养液中，超声溶解15 min，用0.20 μm微孔滤膜过滤除菌得到含250 μg/ml小檗碱母液，取母液，用肿瘤细胞培养液依次稀释成以下6个浓度：120、85、65、55、45、40 μg/ml，本步骤所用的肿瘤细胞培养液就是肝癌细胞株HepG2的培养液。
所述步骤（2）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃；②设置信号采集频率为1次/min,测量实时细胞分析仪未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；③分别将100μl不同细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液加入每个检测板板孔中的肝癌细胞HepG2培养液中，设定信号采集频率为1次/5min,测量实时细胞分析仪有肝癌细胞HepG2时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度肝癌细胞HepG2悬液的细胞生长指数曲线，选择肝癌细胞HepG2加入到肝癌细胞HepG2培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测时间到100h时肿瘤细胞仍能处于对数生长期所对应的肝癌细胞HepG2悬液细胞浓度，即为用于确定检测小檗碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为1的时间点，即为添加小檗碱药液的最佳给药时间点。
根据步骤（2）的方法，经过大量的试验表明，用于确定检测小檗碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度一般在2×10---4～8×10---4个/ml范围内选取，最佳的细胞浓度为4×10---4个/ml，最佳给药时间点为细胞在肝癌细胞HepG2培养液生长24h时。
所述步骤（3）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃，设置信号采集频率为1次/min,实时细胞分析仪检测未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；②将步骤（2）确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液100μl加入到每个检测板板孔的肝癌细胞HepG2培养液中，设定信号采集频率为1次/15min，实时细胞分析仪对培养液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤（2）确定的最佳给药时间点时，吸弃检测板板孔中的肝癌细胞HepG2培养液，再向每个板孔中加入200μl不同浓度的小檗碱，另设置2个板孔，添加200μl肝癌细胞HepG2培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为1次/min，细胞实时分析仪监测肿瘤细胞在小檗碱药液中的细胞生长指数。
本发明选用的实时细胞分析仪，实际上就是一种细胞实时在线监测技术，是近年研制成功的一种建立在阻抗基础上的瞬时细胞电感应连续记录系统，这种分析仪器的核心是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部。微电子芯片测定的电阻抗反映了细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度等一系列生理状态。通过检测板板孔底下的微阵列的电极设计，该技术能全面实时的监控细胞群落的变化，并具有高度的灵敏性性和可重复性，无需标记，其检测结果被证明与其他传统分析得到结果一致。
向检测板的板孔中加入黄连生物碱单体药液和肿瘤细胞悬液，检测板底部的微阵列电极会检测细胞生长时的电极阻抗，根据电极阻抗机器内部通过计算公式计算细胞生长指数值，直接在生成的细胞生长图谱上显示出来，所用到的计算公式如下：
其中，i为信号采样频率数，Rcell(fi) 的检测板板孔中肿瘤细胞接种到药液后的电极阻抗， Rb(fi)是检测板板孔中未有肿瘤细胞时培养液的电极阻抗，也作为基准阻抗，CI是细胞生长指数值。
在没有肿瘤细胞的培养液中，检测板孔底部排列的微电极阵列的阻抗分布近似均匀，我们所检测到的基准电极阻抗为零，CI值为零。当检测板板孔中是肿瘤细胞接种到药液中时，细胞接触板孔的电极表面开始贴附、生长，电极阻抗值升高，DP实时细胞分析仪系统所响应的CI值开始增加；当细胞生长覆盖度达到100％后，由于板孔面积的局限、细胞生长所需的营养物质等有限及细胞间的相互接触抑制，或者对细胞给予一定药物刺激后，细胞开始死亡，电极阻抗开始减小，DP实时细胞分析仪系统所响应的CI值也开始减小，如果时间足够长，细胞将全部死亡，阻抗值不断减小直至为零，DP实时细胞分析仪所响应的CI值也将减小至零，所以，细胞生长指数值判断黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞的作用情况时，细胞生长指数值越小，说明作用越强。
如图1所示的在250、120、86、65、55、45、40 μg/ml六个浓度下小檗碱药液对HepG2细胞作用的情况，可以看出前期未用药时细胞迅速生长，用药后药液的浓度越高，肿瘤细胞生长指数值越小，因此对肿瘤细胞的作用越强。
实施例二：本实施例列举的是不同浓度下黄连碱药液对肝癌细胞HepG2的作用情况，所用的试验仪器同实施例一，黄连碱对照品（纯度大于98%），购于成都曼斯特生物科技有限公司。
检测不同浓度下黄连碱药液对肝癌细胞HepG2作用的方法步骤为，（1）分别制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液、黄连碱药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度肝癌细胞HepG2悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测黄连碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肝癌细胞HepG2生长指数值，根据细胞生长指数值判断药液对肝癌细胞HepG2的作用。
步骤（1）中制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液时，利用现有的方法对肝癌HepG2细胞培养，肝癌细胞株HepG2用的培养液是含10%胎牛血清的MEM培养液，用体积浓度为5%CO2，温度为37℃的恒温培养箱中培养，制备肿瘤细胞悬液的具体步骤为选取在HepG2细胞培养液中生长状态良好的HepG2细胞，用质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2细胞培养液终止消化、吹打初步得到细胞悬液，再转移至离心管离心5min，离心后加入HepG2细胞培养液并吹匀，此时得到的HepG2细胞悬液中的细胞呈分散的单个细胞状态。根据加入的HepG2细胞培养液的量，分别制备肿瘤细胞浓度为5×10---3、5×10---4、2×10---4、4×10---4、8×10---4、1.6×10---5、3.2×10---5、6.4×10---5个/ml的肿瘤细胞悬液。
上述步骤（1）中制备不同浓度的黄连碱药液的具体操作步骤是：精密称取黄连碱粉末，加入肝癌HepG2细胞培养液中，超声溶解15 min，用0.20 μm微孔滤膜过滤除菌得到含100 μg/ml黄连碱母液，取母液，用肝癌HepG2细胞培培养液依次稀释成以下7个浓度：60、50、40、30、20、10、5μg/ml。
所述步骤（2）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃；②设置信号采集频率为1次/min,测量实时细胞分析仪未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；③分别将100μl不同细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液加入每个检测板板孔中的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/5min,测量实时细胞分析仪有肝癌细胞HepG2时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度肝癌细胞HepG2悬液的细胞生长指数曲线，选择肝癌细胞HepG2加入到肝癌细胞HepG2培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测时间到100h时肝癌细胞HepG2仍能处于对数生长期所对应的肝癌细胞HepG2悬液细胞浓度，即为用于确定检测黄连碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为1的时间点，即为添加黄连碱药液的最佳给药时间点。
根据步骤（2）的方法，经过大量的试验表明，用于确定检测黄连碱药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的细胞浓度一般在2×10---4～8×10---4个/ml均可，最佳的细胞浓度为4×10---4个/ml，最佳给药时间点为细胞在肝癌细胞HepG2培养液生长24h时。
所述步骤（3）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃，设置信号采集频率为1次/min,实时细胞分析仪检测未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；②将步骤（2）确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液100μl加入到每个检测板板孔的肝癌细胞HepG2培养液中，设定信号采集频率为1次/15min，实时细胞分析仪对培养液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤（2）确定的最佳给药时间点时，吸弃检测板板孔中的肝癌细胞HepG2培养液，再向每个板孔中加入200μl不同浓度的黄连碱药液，另设置2个板孔，添加200μl肝癌细胞HepG2培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为1次/min，细胞实时分析仪监测黄连碱药液中肿瘤细胞生长指数。
监测结束后，将结果倒入到实时细胞分析仪Software1.2.1中进行分析，数据用Origin8.5作图，得到黄连碱药液对肝癌HepG2细胞作用的实时在线图谱，见图2。由图中可知，前期细胞迅速生长时期为未用药的阶段，曲线9～16为用药后的细胞生长曲线。
实施例三：本实施例列举的是不同浓度下巴马汀药液对肝癌细胞HepG2的作用情况，所用的试验仪器同实施例一，巴马汀对照品（纯度大于98%），购于成都曼斯特生物科技有限公司。
检测不同浓度下巴马汀药液对肝癌细胞HepG2作用的方法步骤为，（1）分别制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液、巴马汀药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓巴马汀悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测巴马汀药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肿瘤细胞生长指数值，根据细胞生长指数值判断药液对肿瘤细胞的作用。
步骤（1）中制备不同浓度的肝癌细胞HepG2悬液时，利用现有的方法对肝癌HepG2细胞培养，肝癌细胞株HepG2用的培养液是含10%胎牛血清的MEM培养液，用体积浓度为5%CO2，温度为37℃的恒温培养箱中培养，制备肿瘤细胞悬液的具体步骤为选取在HepG2细胞培养液中生长状态良好的HepG2细胞，用质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA消化，加入HepG2细胞培养液终止消化、吹打初步得到细胞悬液，再转移至离心管离心5min，离心后加入HepG2细胞培养液并吹匀，此时得到的HepG2细胞悬液中的细胞呈分散的单个细胞状态。根据加入的HepG2细胞培养液的量，分别制备肿瘤细胞浓度为5×10---3、5×10---4、2×10---4、4×10---4、8×10---4、1.6×10---5、3.2×10---5、6.4×10---5个/ml的肿瘤细胞悬液。
上述步骤（1）中制备不同浓度的巴马汀药液的具体操作步骤是：精密称取巴马汀粉末，加入肝癌HepG2细胞培养液中，超声溶解15 min，用0.20 μm微孔滤膜过滤除菌得到含500 μg/ml巴马汀母液，取母液，用肝癌HepG2细胞培养液依次稀释成以下6个浓度：450、400、350、300、250、200μg/ml。
所述步骤（2）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃；②设置信号采集频率为1次/min,测量实时细胞分析仪未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；③分别将100μl不同细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液加入每个检测板板孔中的肝癌细胞HepG2培养液中，设定信号采集频率为1次/5min,测量实时细胞分析仪有肝癌细胞HepG2时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度肝癌细胞HepG2悬液的细胞生长指数曲线，选择肝癌细胞HepG2加入到肝癌细胞HepG2培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测时间到100h时肿瘤细胞仍能处于对数生长期所对应的肝癌细胞HepG2悬液细胞浓度，即为用于确定检测巴马汀药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为1的时间点，即为添加巴马汀药液的最佳给药时间点。
根据步骤（2）的方法，经过大量的试验表明，用于确定检测巴马汀药液对肝癌细胞HepG2作用时，所使用的肝癌细胞HepG2悬液的细胞浓度一般在2×10---4～8×10---4个/ml均可，最佳的细胞浓度为4×10---4个/ml，最佳给药时间点为细胞在肝癌细胞HepG2培养液生长24h时。
所述步骤（3）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肝癌细胞HepG2培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃，设置信号采集频率为1次/min,实时细胞分析仪检测未有肝癌细胞HepG2时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；②将步骤（2）确定的最佳细胞浓度的肝癌细胞HepG2悬液100μl加入到每个检测板板孔的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/15min，实时细胞分析仪对培养液中肝癌细胞HepG2的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤（2）确定的最佳给药时间点时，吸弃检测板板孔中的肝癌细胞HepG2培养液，再向每个板孔中加入200μl不同浓度的巴马汀药液，另设置2个板孔，添加200μl肝癌细胞HepG2培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为1次/min，细胞实时分析仪监测巴马汀药液中的肝癌细胞HepG2生长指数。
监测结束后，将结果倒入到实时细胞分析仪Software1.2.1中进行分析，数据用Origin8.5作图，得到巴马汀药液对肝癌HepG2细胞作用的实时在线图谱，见图3。由图中可知，肝癌细胞HepG2不断生长期时是未用药的情况，曲线17～24为用药后细胞受到药的作用后的细胞生长指数曲线。
利用DP型实时细胞分析仪监测非洲防己碱、药根碱、表小檗碱对肝癌HepG2细胞作用的方法同上述实施例，本发明的方法还可用于监测同一浓度下、不同种类的黄连生物碱单体对肝癌HepG2细胞作用，还可用于不同浓度、不同种类的黄连生物碱单体对肝癌HepG2细胞作用，以上仅为说明发明内容所列举出的几个实施例而已，一切基于本发明实质内容所做出成份、数量等简单的变化，均应落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，（1）分别制备不同浓度的肿瘤细胞悬液、黄连生物碱单体药液；（2）利用实时细胞分析仪对不同细胞浓度肿瘤细胞悬液中的细胞生长指数进行监测，确定检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用时，所使用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度及添加药液的最佳给药时间点；（3）利用实时细胞分析仪检测给药前后的肿瘤细胞生长指数值，根据细胞生长指数值判断药液对肿瘤细胞的作用。
2.根据权利要求1所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肿瘤细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃；②设置信号采集频率为1次/min,测量实时细胞分析仪未有肿瘤细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；③分别将100μl不同细胞浓度的肿瘤细胞悬液加入每个检测板板孔中的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/5min,测量实时细胞分析仪有肿瘤细胞时培养液中的细胞生长指数；④分析比较不同浓度肿瘤悬液的细胞生长指数曲线，选择肿瘤细胞加入到肿瘤细胞培养液后最快经过潜伏期进入对数生长期，且当实时细胞分析仪检测时间到100h时肿瘤细胞仍能处于对数生长期所对应的肿瘤细胞悬液细胞浓度，即为用于确定检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用时，所使用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度；⑤分析④步确定的最佳细胞浓度的肿瘤悬液所对应的细胞生长指数曲线，当细胞生长指数为1的时间点，即为添加黄连生物碱单体药液的最佳给药时间点。
3.根据权利要求2所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，步骤④分析比较不同浓度肿瘤悬液的细胞生长指数曲线时，不同浓度肿瘤细胞悬液的肿瘤细胞浓度为2×104、4×104、5×104、8×104的细胞悬液的细胞生长指数做分析比较，上述肿瘤细胞浓度的单位为个/ml。
4.根据权利要求2或3所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，步骤④确定的用于检测黄连生物碱单体药液对肿瘤细胞作用的肿瘤细胞悬液的最佳细胞浓度为4×104个/ml。
5.根据权利要求1所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体操作步骤是，①在实时细胞分析仪的检测板每个板孔中分别加入100μl的肿瘤细胞培养液，再将检测板置入培养箱中的细胞分析仪上，培养箱中CO2的体积浓度为5%，温度为37℃，设置信号采集频率为1次/min,实时细胞分析仪检测未有肿瘤细胞时培养液的细胞生长指数，将此时的细胞生长指数定位基准；②将步骤（2）确定的最佳细胞浓度的肿瘤细胞悬液100μl加入到每个检测板板孔的肿瘤细胞培养液中，设定信号采集频率为1次/15min，实时细胞分析仪对培养液中肿瘤细胞的细胞生长指数进行监测；③待细胞生长到步骤（2）确定的最佳给药时间点时，吸弃检测板板孔中的肿瘤细胞培养液，再向每个板孔中加入200μl不同浓度的黄连生物碱单体药液，另设置2个板孔，添加200μl肿瘤细胞培养液，即为空白对照板孔；④设定信号采集频率为1次/min，细胞实时分析仪监测黄连生物碱单体药液中肿瘤细胞生长指数。
6.根据权利要求1、2、5中任意一项所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述黄连生物碱单体药液的配制方法是，黄连生物碱单体用肿瘤细胞培养液超声溶解10～20min，再用孔径为0.2μm的微孔滤膜过滤除菌得到母液，用肿瘤细胞培养液将母液稀释，得到不同浓度的黄连生物碱单体药液。
7.根据权利要求1、2、5中任意一项所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述的实时细胞分析仪为DP型实时细胞分析仪。
8.根据权利要求1所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为肝癌HepG2细胞。
9.根据权利要求1所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞培养液为质量浓度10%胎牛血清的DMEM培养液或质量浓度10%胎牛血清的MEM培养液。
10.根据权利要求6所述的检测黄连生物碱单体对肿瘤细胞作用的方法，其特征在于，所述黄连生物碱单体为小檗碱、巴马汀或非洲防己碱、黄连碱、药根碱或表小檗碱。
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Legal Events
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Granted publication date: 20141126 |
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