CN108896759A - 受试物致敏性检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及受试物致敏性检测方法及其试剂盒。该检测方法包括：取若干小鼠，随机分组；测量每组各小鼠的双耳厚度；进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；进入第二时间段；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5‑溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5‑溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；按限定标准判断受试物致敏性。本发明能鉴定受试物是否致敏性阳性，不需对动物腹腔注射以减轻动物痛苦；5‑溴脱氧尿嘧啶核苷用量大幅减少，利于降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种受试物致敏性检测方法及其试剂盒，属于医学检测技术领域。
背景技术
据发明人所知，致敏性的外源化学物刺激机体时，机体易产生过敏反应，而判断化学物是否具有致敏性，就需要通过动物试验来检测。
目前常用的检测方法采用向动物腹腔注射受试物的方式，但是这会让动物产生痛苦，不符合动物福利“3R”原则。同时，该检测方法中会用到价格较贵的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)，每只鼠的用量达5mg，而一次检测试验每组最低使用20只小鼠，也即每组需要至少100mg的BrdU，使整个检测成本居高不下。亟待研发减轻动物痛苦以符合动物福利“3R”原则、且降低检测成本的检测方法。
经检索发现，以申请号CN201711285287.7、申请公布号CN107966562A、名称《一种重组柯萨奇病毒B3注射液致敏性的检测评价方法》的中国发明专利申请为代表的现有技术中，并没有给出解决上述技术问题的技术手段或技术教导。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种受试物致敏性检测方法，能鉴定受试物是否致敏性阳性，不需对动物腹腔注射以减轻动物痛苦，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)用量大幅减少，利于降低检测成本。同时，本发明还提供与该检测方法相配的试剂盒。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
受试物致敏性检测方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取若干小鼠，随机分成阴性对照组、阳性对照组、以及至少两个受试组；每组小鼠数量相等，每组小鼠的数量为至少4只；
第二步、测量每组各小鼠的双耳厚度；
第三步、进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；阴性对照组涂抹的试剂为溶剂，阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，各受试组涂抹的试剂为不同浓度的受试物；所述第一时间段为至少3天；
第四步、进入第二时间段，所述第二时间段为至少2天；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；
第五步、针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标和致敏性指标；其中，刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：
致敏性指标为SI3，且SI3按下式计算：
式中，BrdU为5-溴脱氧尿嘧啶核苷；
对于阳性对照组，如果刺激性指标小于或等于25％，且致敏性指标大于或等于1.6并小于14，则本次检测的试验系统可靠；
对于各受试组，只要有一个受试组的致敏性指标大于或等于1.6、且刺激性指标小于或等于25％，则该受试物致敏性为阳性。
该检测方法基于以下原理：致敏性的外源化学物刺激机体时，可引起局部引流淋巴结淋巴细胞增殖，可以通过局部引流淋巴结淋巴细胞增殖情况来判断受试物致敏性。
在该检测方法中，只需在小鼠双耳耳部涂抹试剂，不需要腹腔注射，从而大大减轻动物的痛苦，更加符合动物福利“3R”原则；完成全部检测过程最短仅需1周左右；所需动物数量大为减少，每组最低仅需4只动物；此外，由于仅需向细胞悬液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)，这就能大幅降低BrdU的用量，利于降低成本。
本发明进一步完善的技术方案如下：
优选地，第四步还包括：取小鼠双侧耳后淋巴结后称重并记作淋巴结重量，获得细胞悬液后进行计数并记作淋巴细胞数；第五步还包括：针对阳性对照组和各受试组，计算每组的辅助指标，所述辅助指标为SI1或SI2，且SI1、SI2分别按下式计算：
当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。
采用该优选方案后，可采用辅助指标来印证致敏性指标的判断结果。
优选地，第五步还包括：针对5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量做统计分析，观察各受试组是否与阴性对照组存在显著差异；
对于各受试组，当该受试组与阴性对照组存在显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于或等于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有刺激性，若该受试组的致敏性指标大于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为既有刺激性也有致敏性；
当该受试组与阴性对照组无显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于1.6，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为非刺激非致敏，若该受试组的致敏性指标大于或等于1.6时，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有致敏性。
当受试物的各分级评价中含有致敏性时，按下式计算受试物的EC1.6：
上式中，a为致敏性指数高于1.6的受试物最低浓度，b为与a对应的致敏性指数，c为致敏性指数低于1.6的受试物最高浓度，d为与c对应的致敏性指数；
若EC1.6大于10，则受试物的致敏强度等级为弱致敏物，若EC1.6大于或等于1、且小于或等于10，则受试物的致敏强度等级为中强致敏物，若EC1.6大于或等于0.1、且小于或等于1，则受试物的致敏强度等级为强致敏物，若EC1.6小于0.1，则受试物的致敏强度等级为极强致敏物。
采用以上优选方案后，可对受试物进行更为细致地鉴别。
优选地，第四步中，将小鼠双侧耳后淋巴结制成细胞悬液的具体过程为：U1、先将小鼠双侧耳后淋巴结经200目筛网研磨，再用PBS溶液清洗细胞，将所得细胞混合液转移到预设体积的培养液中，混匀，即得细胞悬液；
第四步中，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养的具体过程为：U2、将细胞悬液加入孔板，每只小鼠至少3个平行孔，每孔加入的细胞悬液体积相等；向各孔细胞悬液中分别加入等体积的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，培养18-36小时；
第四步中，采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量的具体过程为：U3、将孔板离心后弃上清，并吹干孔板各孔；每孔加入固定液进行固定，然后离心弃液体；每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液并孵育，然后离心弃液体；每孔加入洗涤液进行清洗，然后离心弃液体；每孔加入TMB底物溶液并避光孵育，然后以酶标仪测定吸光度值后计算5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量。
更优选地，U2中，每孔加入的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液体积为25μl，5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液的浓度为150μg/ml。
更优选地，U1中，所述培养液为含胎牛血清的1640培养液，所述预设体积为15ml；U2中，所述孔板为平底96孔板，每孔加入的细胞悬液体积为100μl，培养条件为置37℃5％CO2细胞培养箱中培养；U3中，离心条件分别为300g×10min，吹干时间为15min，每孔加入固定液的体积为200μl、固定温度为15℃-35℃、且固定时间为30min，固定液为甲醇-冰乙酸混合液，每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液的体积为200μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为1小时，每孔加入洗涤液体积为200μl、且清洗次数为3次，洗涤液为磷酸盐缓冲液，每孔加入TMB底物溶液的体积为100μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为15min，测定吸光度值时的参考波长为450nm。
采用以上优选方案后，可以更好地实施检测过程。
优选地，第二步还包括记录每组各小鼠的体重；在第三步的第一时间段内、以及第四步的第二时间段内，每天记录每组各小鼠的体重；第四步还包括在第二时间段结束时记录每组各小鼠的体重；第五步还包括针对小鼠体重做统计分析，观察在各时间点阳性对照组、各受试组的小鼠体重与阴性对照组小鼠体重是否存在显著差异。
采用以上优选方案后，可同时判断受试物对小鼠体重的影响。
优选地，第四步还包括：在处死小鼠后，取小鼠直径9mm耳组织称重，记作耳重；第五步还包括：针对小鼠耳重做统计分析，观察阳性对照组、各受试组的小鼠耳重与阴性对照组小鼠耳重是否存在显著差异。
采用以上优选方案后，可通过小鼠耳重的变化来印证耳厚试验结果。
本发明还提供：
用于检测受试物致敏性的试剂盒，其特征是，由以下试剂组成：
用于清洗细胞的PBS溶液，含胎牛血清的1640培养液，5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，固定液，抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液，洗涤液，TMB底物溶液；5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液的浓度为150μg/mL。
该试剂盒是前述检测方法的配套试剂盒，采用该试剂盒结合前述检测方法，即能鉴定受试物是否致敏性阳性。
本发明的检测方法能鉴定受试物是否致敏性阳性，不需对动物腹腔注射以减轻动物痛苦；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)用量大幅减少，利于降低检测成本。
附图说明
图1为本发明实施例的主体流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例、检测2,4-二硝基氯代苯(DNCB)的致敏性
1-材料及试剂
1.1-动物选择及准备
成年BALB/c小鼠，雌性，8-12周龄，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0007。动物饲养于南京医科大学卫生分析检测中心屏障系统，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2015-0009，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。
1.2-仪器与试剂
电子天平(T1000型，常熟市双杰测试仪器厂)、电子天平(AL104型，Mettler)、酶标仪(SpectraMax M2e，Molecular Devices)、CO2细胞培养箱(HERACELL-150，Heraeus)、游标卡尺(0-150mm，上海美耐特实业有限公司)、超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司)、倒置显微镜(CK41，OLYMPUS)、低温离心机(300g转速，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。
AOO(丙酮：橄榄油＝4:1，上海凌峰化学试剂有限公司、益海嘉里食品营销有限公司)、超纯水(美国Millipo公司密理博纯水仪自制)、BrdU(Sigma公司)、BrdU-ELISA试剂盒(abcam，包括BrdU溶液、固定液、auti-BrdU-POD溶液、洗涤液、TMB底物溶液)、pH7.0无钙镁磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone)、2,4-二硝基氯代苯(和光纯药工业柱式会社)。注：在BrdU-ELISA试剂盒中，BrdU溶液即5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，auti-BrdU-POD溶液即抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液，固定液采用甲醇-冰乙酸混合液(如甲醇:冰乙酸＝体积比3:l)，洗涤液采用磷酸盐缓冲液(如pH7.2的磷酸盐缓冲液)。
2-方法
2.1-操作步骤(主体流程如图1所示)
小鼠适应性喂养3天后，随机分为6组，包括阴性对照组(AOO)，阳性对照组(25％乙基肉桂醛)，以及4个受试组：0.05％DNCB组、0.25％DNCB组、0.50％DNCB组和1.00％DNCB组；每组5只小鼠。阳性对照组的25％乙基肉桂醛溶液以AOO为溶剂，浓度单位为g/ml；各受试组的2,4-二硝基氯代苯溶液以AOO为溶剂，浓度单位为g/ml。
(1)第1天：实验前记录临床表现和每只动物体重并进行编号，随机分组后测量小鼠双耳的厚度，并对小鼠双耳耳部涂抹25μl试剂：受试组涂抹的试剂为受试物、阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，阴性对照组涂抹的试剂为溶剂AOO。观察各受试组中，小鼠耳部皮肤对受试物的反应。
(2)第2天和第3天：重复第1天的涂抹，并记录体重。第1天至第3天即第一时间段。
(3)第4、5天：不处理，记录体重。第4天至第5天即第二时间段。
(4)第6天：记录各小鼠的体重并测量双耳厚度；处死小鼠，取小鼠直径9mm耳组织称重记作耳重，无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结，先200目筛网研磨再用PBS溶液清洗细胞，将所得细胞混合液转移到15ml含胎牛血清的1640培养液中，混匀即得细胞悬液；吸取100μl细胞悬液加入到平底96孔板，每只小鼠3个平行孔；向各孔细胞悬液中分别加入25μl150μg/ml的BrdU溶液，置37℃5％CO2细胞培养箱中培养24小时，然后采用测定BrdU含量的ELISA法进行检测。
(5)ELISA法检测：将含有细胞悬液的96孔板，离心(300g×10min)，弃上清；吹干孔板各孔15min；每孔加入200μl固定液，15℃-35℃固定30min后离心弃固定液；每孔加入100μl auti-BrdU-POD溶液，15℃-35℃孵育1小时后离心弃抗体溶液；每孔加入200μl洗涤液进行清洗，离心弃洗涤液，清洗3次；每孔加入100μl TMB底物溶液，15℃-35℃避光孵育15min；酶标仪测定吸光度值，参考波长450nm。根据吸光度值计算BrdU含量。
2.2-数据处理
2.2.1-刺激性指标
针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标。
刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：
2.2.2-致敏性指标
针对阳性对照组和各受试组，计算每组的致敏性指标。
致敏性指标为SI3，且SI3按下式计算：
2.2.3-辅助指标
针对阳性对照组和各受试组，计算每组的辅助指标，所述辅助指标为SI1或SI2，且SI1、SI2分别按下式计算：
2.3-结果评价
2.3.1-对于阳性对照组，如果刺激性指标小于或等于25％，且致敏性指标大于或等于1.6并小于14(数值14代表引起明显的系统毒性或局部刺激)，则本次检测的试验系统可靠。
2.3.2-对于各受试组，只要有一个受试组的致敏性指标大于或等于1.6、且刺激性指标小于或等于25％，则该受试物致敏性为阳性。当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。
2.3.3-受试物的分级评价
针对5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量做统计分析，观察各受试组是否与阴性对照组存在显著差异；
对于各受试组，当该受试组与阴性对照组存在显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于或等于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有刺激性，若该受试组的致敏性指标大于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为既有刺激性也有致敏性；
当该受试组与阴性对照组无显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于1.6，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为非刺激非致敏，若该受试组的致敏性指标大于或等于1.6时，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有致敏性。
详见下表：
2.3.4-受试物的致敏强度等级
当受试物的各分级评价中含有致敏性(即S)时，按下式计算受试物的EC1.6：
上式中，a为致敏性指数高于1.6的受试物最低浓度，b为与a对应的致敏性指数，c为致敏性指数低于1.6的受试物最高浓度，d为与c对应的致敏性指数；
若EC1.6大于10，则受试物的致敏强度等级为弱致敏物，若EC1.6大于或等于1、且小于或等于10，则受试物的致敏强度等级为中强致敏物，若EC1.6大于或等于0.1、且小于或等于1，则受试物的致敏强度等级为强致敏物，若EC1.6小于0.1，则受试物的致敏强度等级为极强致敏物。
详见下表：
2.3.5-当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。
2.3.6-针对小鼠体重做统计分析，观察在各时间点阳性对照组、各受试组的小鼠体重与阴性对照组小鼠体重是否存在显著差异。以此判断受试物对小鼠体重的影响。
2.3.7-针对小鼠耳重做统计分析，观察阳性对照组、各受试组的小鼠耳重与阴性对照组小鼠耳重是否存在显著差异。以此印证耳厚试验结果。
3-试验结果
3.1-小鼠耳厚结果
小鼠各剂量组各观察点耳厚结果见下表：
注：*表示与阴性对照组比较，P<0.05。
由以上结果可知，阳性对照组、各受试组的耳厚差百分比均未超过25％。
此外，1.00％DNCB组雌性小鼠耳厚与阴性对照组比较有统计学差异，P<0.05。
3.2-BrdU含量测定结果
BrdU含量测定结果及SI3值见下表：
注：*表示与阴性对照组比较，P<0.05。
由该结果可知，阳性对照组的SI3>1.6，同时该组的耳厚差百分比未超过25％，因此本次检测的试验系统可靠。
0.25％DNCB、0.50％DNCB、1.00％DNCB的SI3>1.6，并有剂量反应关系。且这三组的BrdU含量与阴性对照组比较均有统计学差异，P<0.05。因此，受试物DNCB的致敏性为阳性。
根据2.3.3的评价标准，受试物DNCB的分级评价为既为刺激物I也为致敏物S。进而，根据2.3.4的标准，受试物DNCB的EC1.6＝0.1738，因此，受试物DNCB的致敏强度等级为强致敏物。
3.3-小鼠淋巴结重量结果
小鼠淋巴结重量结果及SI1值见下表：
注：*表示与阴性对照组比较，P<0.05。
由该结果可知，阳性对照组的SI1>1.6，印证了3.2中阳性对照组的结果。
0.25％DNCB、0.50％DNCB、1.00％DNCB的SI1>1.6，并有剂量反应关系。且这三组的小鼠淋巴结重量与阴性对照组比较均有统计学差异，P<0.05。这也印证了3.2中相应受试组的结果。
3.4-小鼠体重结果
经统计，小鼠各剂量组各观察点的体重与对照组比较，差异均无统计学意义(P﹥0.05)。这表明，受试物DNCB对小鼠体重没有显著影响。
主要体重数据如下表所示：
3.5-小鼠耳重结果
小鼠各剂量组各耳重结果见下表：
注：*表示与阴性对照组比较，P<0.05。
以上结果与3.1的耳厚试验结果趋势基本一致。
4-结论
2,4-二硝基氯代苯(DNCB)的致敏性为阳性。
2,4-二硝基氯代苯(DNCB)在浓度大于或等于0.25％时，既有刺激性也有致敏性；在浓度为0.05％时，则表现为非刺激非致敏。
2,4-二硝基氯代苯(DNCB)的致敏强度等级为强致敏物。
由本实施例可知，(1)在检测时只需在小鼠双耳耳部涂抹试剂，不需要腹腔注射，从而大大减轻动物的痛苦，更加符合动物福利“3R”原则。
(2)完成全部检测过程最短仅需1周左右，且所需动物数量大为减少。
(3)BrdU溶液配制浓度为150μg/ml，BrdU溶液使用量为25μl/孔，即每孔BrdU使用量为3.75μg；本次试验每组5只小鼠共15孔，每组所需的BrdU使用量为56.25μg；当每组4只小鼠共12孔时，每组所需的BrdU使用量低至45μg。这就大幅度节约了BrdU使用量，从而大幅度降低检测成本。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.受试物致敏性检测方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、取若干小鼠，随机分成阴性对照组、阳性对照组、以及至少两个受试组；每组小鼠数量相等，每组小鼠的数量为至少4只；
第二步、测量每组各小鼠的双耳厚度；
第三步、进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；阴性对照组涂抹的试剂为溶剂，阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，各受试组涂抹的试剂为不同浓度的受试物；所述第一时间段为至少3天；
第四步、进入第二时间段，所述第二时间段为至少2天；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；
第五步、针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标和致敏性指标；其中，刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：
致敏性指标为SI3，且SI3按下式计算：
式中，BrdU为5-溴脱氧尿嘧啶核苷；
对于阳性对照组，如果刺激性指标小于或等于25％，且致敏性指标大于或等于1.6并小于14，则本次检测的试验系统可靠；
对于各受试组，只要有一个受试组的致敏性指标大于或等于1.6、且刺激性指标小于或等于25％，则该受试物致敏性为阳性。
2.根据权利要求1所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第四步还包括：取小鼠双侧耳后淋巴结后称重并记作淋巴结重量，获得细胞悬液后进行计数并记作淋巴细胞数；第五步还包括：针对阳性对照组和各受试组，计算每组的辅助指标，所述辅助指标为SI1或SI2，且SI1、SI2分别按下式计算：
当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。
3.根据权利要求1所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第五步还包括：针对5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量做统计分析，观察各受试组是否与阴性对照组存在显著差异；
对于各受试组，当该受试组与阴性对照组存在显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于或等于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有刺激性，若该受试组的致敏性指标大于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为既有刺激性也有致敏性；
当该受试组与阴性对照组无显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于1.6，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为非刺激非致敏，若该受试组的致敏性指标大于或等于1.6时，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有致敏性。
4.根据权利要求3所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，当受试物的各分级评价中含有致敏性时，按下式计算受试物的EC1.6：
上式中，a为致敏性指数高于1.6的受试物最低浓度，b为与a对应的致敏性指数，c为致敏性指数低于1.6的受试物最高浓度，d为与c对应的致敏性指数；
若EC1.6大于10，则受试物的致敏强度等级为弱致敏物，若EC1.6大于或等于1、且小于或等于10，则受试物的致敏强度等级为中强致敏物，若EC1.6大于或等于0.1、且小于或等于1，则受试物的致敏强度等级为强致敏物，若EC1.6小于0.1，则受试物的致敏强度等级为极强致敏物。
5.根据权利要求1至4任一项所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第四步中，将小鼠双侧耳后淋巴结制成细胞悬液的具体过程为：U1、先将小鼠双侧耳后淋巴结经200目筛网研磨，再用PBS溶液清洗细胞，将所得细胞混合液转移到预设体积的培养液中，混匀，即得细胞悬液；
第四步中，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养的具体过程为：U2、将细胞悬液加入孔板，每只小鼠至少3个平行孔，每孔加入的细胞悬液体积相等；向各孔细胞悬液中分别加入等体积的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，培养18-36小时；
第四步中，采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量的具体过程为：U3、将孔板离心后弃上清，并吹干孔板各孔；每孔加入固定液进行固定，然后离心弃液体；每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液并孵育，然后离心弃液体；每孔加入洗涤液进行清洗，然后离心弃液体；每孔加入TMB底物溶液并避光孵育，然后以酶标仪测定吸光度值后计算5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量。
6.根据权利要求5所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，U2中，每孔加入的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液体积为25μl，5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液的浓度为150μg/ml。
7.根据权利要求6所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，U1中，所述培养液为含胎牛血清的1640培养液，所述预设体积为15ml；U2中，所述孔板为平底96孔板，每孔加入的细胞悬液体积为100μl，培养条件为置37℃5％CO2细胞培养箱中培养；U3中，离心条件分别为300g×10min，吹干时间为15min，每孔加入固定液的体积为200μl、固定温度为15℃-35℃、且固定时间为30min，固定液为甲醇-冰乙酸混合液，每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液的体积为200μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为1小时，每孔加入洗涤液体积为200μl、且清洗次数为3次，洗涤液为磷酸盐缓冲液，每孔加入TMB底物溶液的体积为100μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为15min，测定吸光度值时的参考波长为450nm。
8.根据权利要求1至4任一项所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第二步还包括记录每组各小鼠的体重；在第三步的第一时间段内、以及第四步的第二时间段内，每天记录每组各小鼠的体重；第四步还包括在第二时间段结束时记录每组各小鼠的体重；第五步还包括针对小鼠体重做统计分析，观察在各时间点阳性对照组、各受试组的小鼠体重与阴性对照组小鼠体重是否存在显著差异。
9.根据权利要求1至4任一项所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第四步还包括：在处死小鼠后，取小鼠直径9mm耳组织称重，记作耳重；第五步还包括：针对小鼠耳重做统计分析，观察阳性对照组、各受试组的小鼠耳重与阴性对照组小鼠耳重是否存在显著差异。
10.用于检测受试物致敏性的试剂盒，其特征是，由以下试剂组成：
用于清洗细胞的PBS溶液，含胎牛血清的1640培养液，5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，固定液，抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液，洗涤液，TMB底物溶液；5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液的浓度为150μg/mL。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110332917A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-10-15 | 山东大学 | 一种基于酶标仪分析方法快速测量微丸包衣膜厚度的方法 |
| CN110332917B (zh) * | 2019-07-08 | 2020-04-21 | 山东大学 | 一种基于酶标仪分析方法快速测量微丸包衣膜厚度的方法 |
| CN112143564A (zh) * | 2020-10-19 | 2020-12-29 | 广东芬豪生物科技有限公司 | 具有水果香味的日化香精及其制备方法 |
| CN112143564B (zh) * | 2020-10-19 | 2023-04-28 | 广东芬豪生物科技有限公司 | 具有水果香味的日化香精及其制备方法 |
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