CN1539022A - 病毒药物敏感性测试 - Google Patents

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Abstract

描述了一种通过测试一种从所述个体的生物样品例如血液或血浆中回收的、包装到有包膜病毒例如HIV中的酶，来测试药物在有包膜病毒感染的哺乳动物个体中的表型敏感性的方法。所述方法包括下述步骤：a)向所述样品中加入一种酶失活剂，以使存在于有包膜病毒体之外的聚合酶活性失活，b)除去所述酶失活剂、酶活性封闭性抗体、内源酶活性抑制剂和抗病毒药物，c)裂解所述病毒颗粒以释放所述酶，d)回收由c)产生的、经浓缩的纯化病毒酶例如HIV逆转录酶(RT)，并且通过用灵敏的酶测定，根据所回收的酶来确定所述个体的药物敏感性分布型。所述药物敏感性分布型可以用于选择药物疗法。包括一种商业成套试剂。

Description

病毒药物敏感性测试
本发明涉及病毒药物敏感性测试，尤其涉及测试经药物治疗的、有包膜病毒感染的哺乳动物个体中的药物表型敏感性的方法，即通过测试包装到从所述个体的生物样品中回收的有包膜病毒中的一种酶，来测试有包膜病毒感染例如逆转录病毒感染的(例如人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的)、经药物治疗的哺乳动物个体中药物表型敏感性的方法。
背景
HIV药物敏感性与新治疗的病毒学反应有关。标准化抗药性试验目前是可利用的，且来自临床试验的数据提示，抗药性试验的应用可能与改进的病毒学结论有关。然而，抗药性就性能、实验结果分析及临床应用而言是复杂的。
表型试验测定HIV分离物在有药物情况下的生长能力，且采用评价在不同药物浓度时的病毒复制抑制程度的测定来进行所述表型试验。结果用来计算对分离物50％或90％抑制的药物浓度。伴随着经典表型分析的一个潜在问题是，在病毒分离期间病毒群体中的遗传漂变效应。在最坏的情况下，所分离的病毒克隆是最适合在体外条件下生长的病毒克隆，而不是患者体内最丰富的病毒克隆。
现在，可通过基于重组DNA技术的自动分析，完成药物表型敏感性的测定。这些方法涉及编码HIV蛋白酶和逆转录酶(RT)的血浆RNA的扩增，以及用来自实验室构建体(盒式病毒)的其它基因产生重组病毒[1]。基因型分析测定由抗逆转录病毒药物靶向的基因中的某些突变的发生。而表型抗性则测量病毒对药物的敏感性，基因分型赋予表型抗性的突变。从每毫升含有500-1000个RNA拷贝的血浆中通过聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1序列是这些分析以及重组病毒表型分析中的第一个步骤。根据所评价的突变和在实验室进行的实验，基因型分析可区分病毒混合物中的含量10-50％的突变体。由序列测定得到的数据的复杂性已导致了解释结果方面的困难。关于由特定突变模式所赋予的表型抗性水平，则可能有各不相同的解释。由于产生新的数据，因而有提供不适当解释乃至错误解释的危险[2]。迄今使用的所有抗逆转录病毒药物的反应机制是干扰病毒蛋白酶或者逆转录酶的酶促反应。根据酶测定的能力和所用的病毒分离技术，药物敏感性测试在理论上可以或者在来自病毒培养繁殖的上清液、原代病毒分离物或者直接从患者中回收的病毒制备物上进行。
与传统的病毒复制抑制实验相比，用来自原代病毒分离物的逆转录酶的药物敏感性测试有两个优点。病毒繁殖的时间被缩短，且更重要的是对病毒群体发生较少的选择。理想的情况是，最终应该表征直接从患者血液中循环的病毒提取的酶。这种方法的好处是样品将反映出在采集血液样品时存在于患者体内的病毒群体。这在实践中迄今还是不可行的，但通过用基于PCR的Amp RT测定进行抗性试验仔细研究了所述构思[3]。
HIV-1逆转录酶以及其它逆转录酶进行三种不同的酶促反应：依赖RNA的DNA聚合、依赖DNA的DNA聚合以及DNA-RNA杂合体中的RNA的降解(RNA酶H)。由pol基因编码的HIV逆转录酶是由一个p66亚基和一个p51亚基组成的异二聚体。靠定位于p66亚基中的同一活性位点进行依赖RNA的DNA聚合和依赖DNA的DNA聚合。通过除去p66中对应于RNA酶H结构域的C末端片段，产生p51[4]。目前已批准供临床使用的所有逆转录酶抑制剂抑制该酶的聚合酶活性。根据这些药物对依赖RNA的DNA聚合反应的作用，大体上已确定了这些药物的反应机制。依赖DNA的DNA聚合反应的作用则研究得比较少。
通过使用一种人工模板-引物构建体以及标记的作为核苷酸底物的脱氧核苷酸三磷酸，来进行常规逆转录酶活性测定。对于测定HIV以及对于其它逆转录病毒逆转录酶，模板/引物对聚(rA)/寡聚(dT)是最有效最常用的组合。当涉及药物敏感性测试时，这类测定的一个缺点是：仅仅能测定非核苷类似物或者与rA能进行碱基配对的类似物。其它核苷酸碱基的类似物将需要一种基于可变聚合物模板的测定。
迄今所批准的所有抗逆转录病毒药物或者干扰病毒蛋白酶的酶促反应，或者干扰病毒逆转录酶的酶促反应。另外还有影响逆转录病毒整合酶功能通道的候选药物。
所述逆转录酶抑制剂或者是核苷类似物，或者是非核苷类似物。所述非核苷抑制剂与活性部位附近但并不与其相邻的RT酶中的疏水性口袋结合。HIV-1复制由于取代了与聚合酶结合部位相关的催化性天冬氨酸残基而在变构水平上受到抑制。如果以单一疗法的形式给予非核苷药物，或在存在不完全病毒抑制的情况下给予非核苷药物，则抗药性通常快速地出现。目前仅三种非核苷抑制剂：奈韦拉平、依法韦仑和地拉韦啶被FDA批准用于临床。
当前使用的核苷抑制剂由于它们没有3’-羟基因而终止DNA链的延伸。长期用核苷抑制剂治疗则通常导致产生抗性病毒。这个过程与病毒pol基因中不断出现的突变有关，每个突变导致已确定氨基酸的取代[5]。这些取代的结果在酶水平方面是复杂的，且包括增强原始DNA编辑功能。这个反应是核苷酸依赖性的，且产生二核苷多磷酸和一个可延伸的DNA 3’端[6]。
当前的HIV疗法基于多药疗法。其方案基于所有三类可利用的药物—核苷类似物、非核苷类似物和蛋白酶抑制剂的组合。策略是将突变病毒存活的概率减至最小。面对病毒学的不足，当前的治疗指南则建议转到一组完全新的药物方面来。这是使人感到灰心的，因为许多HIV阳性者并没有从所述药物中选出三种或更多种未经试用的药物。另外，除去事实上仍然有效的药物，还可能是一个不经济的决定。如果有改进的抗药性测试，则淘汰给定组合中的一种或多种无效药或许是可能的。
发明的描述
本发明提供一种用直接从患者血浆样品中回收的酶来进行表型抗药性测试的方法。该方法基于一种回收病毒酶即基本上没有其细胞对应物的病毒酶、继之以用灵敏的酶测定对其进行测定的技术组合。对于包装到有包膜病毒中的任何酶，可使用所描述的酶分离技术；但在本说明书中，仅仅为了抗药性测试而通过利用从血浆得到逆转录酶来探测该技术的用途。
因此，本发明的一个方面涉及一种测试药物在有包膜病毒感染的哺乳动物个体中的表型敏感性的方法，即通过测定从所述个体之生物样品中回收的一种包装到有包膜病毒中的酶，来测试药物的所述表型敏感性的一种方法，所述方法包括下述步骤：
a)向所述样品中加入一种酶失活剂，以使存在于有包膜病毒体之外的聚合酶活性失活，
b)除去所述酶失活剂、酶活性封闭性抗体、内源酶活性抑制剂以及抗病毒药物，
c)裂解所述病毒颗粒以释放所述酶，
d)回收由c)产生的、经浓缩的纯化病毒酶，并且通过用灵敏的酶测定，根据所回收的酶来确定所述个体的药物敏感性分布型。
在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物个体是人类。
在本发明的一个优选实施方案中，所述生物样品为血液样品，例如血浆样品。
在另一个优选的实施方案中，所述有包膜病毒为逆转录病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)。在最后提到的情况下，所述酶最好是HIV逆转录酶(RT)。
可使用借助本发明方法得到的个体的药物敏感性分布型，选择用于个体的药物疗法。实际上，有包膜病毒感染的哺乳动物个体将在几个时间点经受药物敏感性分布型的测试，从而监控所述个体中该感染的发展以及病毒药物治疗。
本发明也涉及一种商业成套试剂(package)，该商业成套试剂包括按照本发明而测试有包膜病毒感染的哺乳动物个体中药物表型敏感性的书面说明或资料载体说明，以及一种使聚合酶活性失活的酶失活剂、一种灵敏的酶测定和至少一种参照药物。
现在，通过下面非限制性描述本发明的实施方案和附图，举例说明本发明。
所引用的文献的公开内容通过引用结合到本文中。
附图简述
图1显示所回收的HIV-1逆转录酶与用RNA PCR测定的病毒RNA之间的关系。
图2举例说明药物敏感性测定中所用的逆转录酶量与所得到的IC50值之间的关系。符号说明：(◇)依法韦仑野生型逆转录酶，(◆)依法韦仑L100I逆转录酶，(○)AZT-TP野生型逆转录酶，(●)AZT-TP T215Y逆转录酶。
实施方案的描述
所用的方法包括四个不同的步骤。I)将存在于样品中的宿主聚合酶活性灭活，而不影响存在于有包膜病毒体中的病毒酶。II)除去所述酶失活剂、酶活性封闭性抗体、内源酶活性抑制剂以及抗病毒药物。III)回收经浓缩的纯化病毒酶。IV)确定所回收酶的药物敏感性分布型。
(步骤I-III)基于可溶性细胞酶破坏后由微型柱分离病毒逆转录酶，从 含有逆转录酶封闭性抗体的材料中分离病毒逆转录酶的方案。
1)标记要使用的4.5ml塑料管。将其置于Nalgene盒中。向每支标记管中加入1ml样品(例如来自HIV感染个体的EDTA血浆)。加入100μl 66mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)的缓冲水溶液，涡旋混合，将所述样品在室温下温育1小时。
游离的血浆酶活性在该步骤中遭到破坏，而病毒体内所含的酶则仍保持完整。然后可以通过几个分离步骤，从5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、酶活性封闭性抗体和其它可能干扰病毒RT定量的物质中纯化所述病毒体。下述方案基于FractogelEMD TMAE Hicap凝胶的应用。
2)小心地悬浮分离胶，并转移1500μl凝胶浆至每支样品预处理管中。
3)将样品与凝胶浆在室温下温育90分钟，其中将所述管以水平方向放在定轨摇床上。
4)标记所需数目的10ml塑料微型柱，以识别要分析的样品。将该柱固定在柱洗涤装置即Supelco Visiprep固相提取真空歧管上。转移结合管中的内容物至其相应的柱中。转移前，将管涡旋一儿会，以使凝胶均匀分布。
5)当所有的柱都填满时，抽真空并将凝胶吸干。关掉真空，并通过将每个柱装入9ml缓冲液A开始洗涤。当所有的柱已装满时，抽真空并将凝胶吸干。
6)重复步骤5三次以上，总共洗涤4次。每次洗涤后都将凝胶吸干。在第4次洗涤后且将凝胶吸干后，关掉真空，进行步骤7。
所述洗涤步骤除去系统中未结合的RT封闭性抗体和5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有干凝胶中加入9ml调节缓冲液(B)。1分钟后，抽真空并将凝胶吸干。
8)重复步骤7，在关掉真空之前，检查是否已从所有凝胶中除去所有调节缓冲液(B)。
9)卸下柱洗涤装置的上层部分。将装有标记管的固定器固定在清洁的容器中。重新装上该装置的上层部分。控制各柱的小管落入其相应管中。
10)向每个柱中加入600μl裂解缓冲液(C)。让所述缓冲液在所述柱中停留5分钟。然后缓慢抽真空并将凝胶吸干。这将在每支管中得到来自相关凝胶的约600μl病毒裂解液。
从步骤10的裂解液中回收的RT活性基本上无RT封闭性抗体、药物和细胞聚合酶活性，并且可以用灵敏的RT活性测定，即基于Ekstrand等人描述的方法的Cavidi HS-kit Lenti RT[7]进行定量。按照所述方法获得的25μl裂解液足以测定所述样品中的RT活性。余下的575μl样品应于-70℃冷冻贮存，以供以后用于药物敏感性试验。
请注意：对半胱氨酸修饰剂不敏感的RT酶例如野生型HIV 1 RT可以任选地在存在高达5mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)的情况下进行测定。另一方面，敏感酶例如MULV RT和来自某些疗法的抗HIV1毒株(含有例如突变Y181C)的RT要求向所述裂解缓冲液中加入巯基还原剂即半胱氨酸或半胱胺。
(步骤IV)裂解液中逆转录酶活性的药物敏感性的测定方案
用改进的比色RT测定(CavidiHS-kit Lenti RT)(可得自CavidiTech，Uppsala，瑞典)，测定RT活性在所研究的病毒制剂中的水平。简而言之，用与96孔微量滴定板各孔共价结合的poly(rA)作为模板，以在逆转录步骤中于33℃掺入5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)。用碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrdU单克隆抗体检测掺入到DNA中的溴脱氧尿苷一磷酸(BrdUMP)量。最后，用Ap底物4-甲基伞形基磷酸酯进行荧光检测。对于核苷类似物，则使用于IC50测定的分离逆转录酶的量对相当于每孔5fg(4.3×10-20mol)参照HIV-1逆转录酶的活性进行标准化；而对于非核苷类似物，则使用1.7fg(1.5×10-20mol)逆转录酶。所述裂解液用“模拟裂解液”即由胎牛血清的模拟分离中获得的裂解液进行稀释。
用HS Lenti RT测定法的两种不同的修饰版本进行逆转录酶抑制研究
非核苷类似物用RT反应混合物分5个步骤进行连续稀释，并将25μl等份样品转移至微量滴定板的各孔中，与125μl RT反应混合物混合，且通过加入25μl裂解物的稀释液而起始所述酶反应。核苷酸底物(BrdUTP)的终浓度为16μM，而引物(odT22)的含量为12ng/孔。dT类似物用链终止反应混合物分5个步骤进行连续稀释，并将25μl等份样品转移至微量滴定板的各孔中，与125μl RT链终止反应混合物混合，且通过加入25μl裂解物的稀释液而起始所述酶反应。核苷酸底物(BrdUTP)的终浓度为1.5μM，而引物(odT22)的含量为12ng/孔。不但对于核苷逆转录酶抑制剂，而且对于非核苷逆转录酶抑制剂，允许所述逆转录酶反应进行过夜(16-24小时，于33℃)。其后，通过洗涤该滴定板而终止所述反应。将IC50值定义为所研究的逆转录酶活性达到50％抑制的药物浓度。
材料
分离胶：FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAE Hicap，例如在314mM(2-(N-吗啉代)乙磺酸)(MES)pH 5.1、413mM碘化钾及0.5mg/ml肝素中。
微型柱，例如Biorad Poly-Prep(7311553)。
微型柱洗涤装置，即Supelco Visiprep固相提取真空歧管。
塑料管，例如Nunc的4.5ml低温管。
具有固定化prA的微量滴定板即Nalge Nunc NucleoLink。
半胱氨酸修饰剂，例如在用0.87M三羟甲基氨基甲烷(PH 8.3)缓冲的66mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)水溶液。
温和巯基还原剂，例如33mM半胱胺水溶液。
抗病毒药物：
3′-叠氮-2′，3′-脱氧胸苷三磷酸(AZT-TP)和(2′，3′-二脱氢-3′-脱氧胸苷三磷酸(d4T-TP)购自加利福尼亚州的Moravek Biochemicals。奈韦拉平(11-环丙基-5，11-二氢-4-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b：2’，3’-f][1，4]二氮杂-6-酮)(NVP)、地拉韦啶即1-(5-甲磺酰胺-1H-吲哚-2-基-羰基)-4-[3-(1-甲基乙基-氨基)吡啶基]哌嗪一甲磺酸酯(DLV)以及依法韦仑即(-)6-氯-4-环丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4-二氢-2H-3，1-苯并噁嗪-2-酮)(EFV)，购自瑞典乌普萨拉(Uppsala)的Apoteksbolaget。
来自HIV感染个体的血浆样品
追溯既往地选择来自首次处理的患者的血浆样品或来自用常规联合疗法的患者的血浆样品。以两个不同组的，冷冻递送已编号的样品，所述两个不同组分别代表对NNRTI具有抗性的患者以及对T-类似物具有抗性的患者。通过标准HIV 1 RNA PCR(Cobas，RocheDiagnostica)，测定每个样品中HIV-1 RNA的量，而用TRUGENETMHIV-1 Genotyping试剂盒(Visible Genetics)，来分析所存在的病毒基因型。
重组逆转录酶：
产生逆转录酶的NNRTI抗性突变体形式(L100I，K103N，L100I/K103N，Y181C)。用由BH10分离物构建的pETRT表达载体作为突变的模板。运用市售定点诱变试剂盒QuikChange(Stratagene)，产生突变。所述突变通过DNA序列分析加以证实。如同先前所描述的[8]，分离逆转录酶的突变形式和天然形式。
通过把突变引入克隆到表达载体pKK233-2(Amersham Biotech)中的野生型HXB2-DEcoRI-Ndel限制性酶片段的逆转录酶编码区中，产生具有AZT特异性突变的重组逆转录酶。运用市售定点诱变试剂盒QuikChange(Stratagene)，产生突变。将突变型克隆表达载体转化到大肠杆菌菌株XL1-B1ue中，且其基因型通过DNA序列分析加以证实。
所用的缓冲液：
A)洗涤缓冲液：20mM MES pH 5.4，500mM醋酸钾(KAc)。
B)调节缓冲液：适合于逆转录酶测定的缓冲液，例如50mM的(N-(2-羟乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(Hepes)pH 7.6，25mM KAc，20mM氯化镁(MgCl2)，0.2mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，2mM精胺以及0.5mg/ml热灭活牛血清白蛋白(BSA)。
C)裂解缓冲液：适合于逆转录酶测定的缓冲液，该缓冲液包括去污剂例如1.25％的聚氧乙烯4十二烷基醚(Brij 30)、13ng/ml的odT22以及与调节缓冲液(B)中一样的组分。当处理用对SH氧化/修饰敏感的逆转录酶处理病毒时，可任择地加入巯基还原剂即0.2mM半胱胺。
D)逆转录酶反应混合物：例如10mM Hepes pH 7.6，19μMBrdUTP，80ng/ml odT22，4mM MgCl2，0.5g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA以及0.5mg/ml BSA。
E)链终止反应混合物：10mM Hepes pH 7.0，BrdUTP 1.75μM，80ng/ml odT22，10mM MgCl2，7mMATP，0.05g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA以及0.5mg/ml BSA。
实施例
实施例1.所回收的HIV-1逆转录酶与用RNA PCR测定的病毒RNA之间的关系
按照“ 基于可溶性细胞酶破坏后由微型柱分离病毒逆转录酶，从 含有逆转录酶封闭性抗体的材料中分离病毒逆转录酶的方案”，处理1ml来自HIV感染个体的EDTA血浆样品，且用CavidiHS-kit LentiRT，在一种过夜RT测定中测定从每个样品中回收的逆转录酶活性的量。根据内标曲线，将所得到的逆转录酶活性换算成fg HIV 1 RT/ml血浆。通过标准HIV 1 RNA PCR(Roche Amplicor)，测定每个样品中HIV 1 RNA的量。该图只限于PCR值＞500拷贝/ml的样品。在所回收的血浆逆转录酶量与用PCR测定的HIV RNA量之间发现了强相关性(r＝0.93，n＝33，p＜＜0.001)。参见图1。
根据该实例可推断出：处理1ml来自每毫升血浆具有50 000个HIV RNA拷贝之个体的血浆，将导致回收大约200fg逆转录酶活性。每次测定用1.7fg逆转录酶，该量对应于118个试验，可使用所述试验测定所分离的逆转录酶的药物敏感性分布型。
实施例2.用于药物敏感性试验的逆转录酶量的影响
按照“ 裂解液中逆转录酶活性的药物敏感性的测定方案”，用指定逆转录酶浓度，测定NNRTI、AZT-TP和d4T-TP对指定重组HIV 1逆转录酶的影响。图2举例说明用于药物敏感性测定中逆转录酶量与所得出的IC50值之间的关系。在所研究的范围内，像依法韦仑那样的NNRTI的IC50值，则根本不受逆转录酶量变化的影响。在所研究的NRTI中，相对于所述测定中包括的逆转录酶量，AZT-TP显示出最大变化。对于野生型逆转录酶，该变化最大，如果逆转录酶量从2fg/孔增加至162fg/孔，则所述IC50从0.13μM增加到0.22μM(图2)。
血浆样品中可获得的逆转录酶活性量决定当前测定的限度。需要至少5倍于本底的信号，来获得所测定药物的可再现IC50值。如果在试验中加入逐渐增加的逆转录酶量的IC50值变化范围小使得药物敏感性测定成为可能，而不用将每个测定中所用的逆转录酶量预先标准化。
实施例3.非核苷抑制剂对具有已确定突变的重组HIV 1逆转录酶的影响的比较
按照“ 裂解液中逆转录酶活性的药物敏感性的测定方案”，测定三种非核苷抑制剂对所指定重组HIV 1逆转录酶的影响。将各逆转录酶的量标准化至相当于我们的标准逆转录酶的1.7fg/孔的活性。逆转录酶反应的持续时间为19小时，并将所获得的活性换算成占在没有抑制剂的情况下温育同一逆转录酶所获得到的活性的百分比(％)。
所述表型数据摘自文献(国际抗病毒新闻以及http：//stanford.edu/hiv数据库)(表1)。
在来自逆转录酶抑制测定的IC50值与根据所述文献的表型数据之间总的来讲有强相关性。鉴别高抗性病毒或中等抗性病毒逆转录酶总是可能的(表1)。
实施例4.dT类似物对具有已确定突变的重组HIV 1逆转录酶的影响的比较
按照“ 裂解液中逆转录酶活性的药物敏感性的测定方案”，测定AZT-TP与d4T对指定重组HIV 1逆转录酶的影响。将各逆转录酶的量标准化至相当于与我们的标准逆转录酶的5fg/孔的活性。逆转录酶反应的持续时间为19小时，并将所获得的活性换算成占在没有抑制剂的情况下温育同一逆转录酶所获得到的活性的百分比(％)。
所述表型数据摘自文献(国际抗病毒新闻以及http：//stanford.edu/hiv数据库)(表2)。
为测定对T-类似物药物的敏感性而使用的链终止反应混合物，应该能够支持能量依赖性磷酸解反应。可惜由于聚合反应速度的下降以及检测灵敏度也因此下降，迅速地反映出有效磷酸解反应。因此，与NNRTI的相应测定相比，该测定需要更高的逆转录酶活性。另一个结果是，在抗性逆转录酶和敏感逆转录酶之间的间距小于NNRTI测定中的间距。然而，在来自逆转录酶抑制测定的IC50值与根据所述文献的表型数据之间总的来讲有强相关性。鉴别高抗性病毒或中等抗性病毒逆转录酶则总是可能的(表2)。
实施例5.用从血浆得到的逆转录酶来测定对NNRTI的敏感性
按照“ 基于可溶性细胞酶破坏后由微型柱分离病毒逆转录酶，从 含有逆转录酶封闭性抗体的材料中分离病毒逆转录酶的方案”，处理17位来自瑞典斯德哥尔摩的HIV感染个体的各1ml血浆样品。这些样品中的15个样品含有足够逆转录酶，从而允许进行药物敏感性测试。这些样品的PCR值为17 000个拷贝/ml或更大些。按照“ 裂解液中逆转 录酶活性的药物敏感性的测定方案”，使每种血浆逆转录酶和两种对照之酶对一组连续稀释的奈韦拉平、地拉韦啶和依法韦仑进行滴定。
使用来自每种逆转录酶提取物的、相当于1.7fg/孔标准逆转录酶HIV-1 RT的活性，我们发现15个样品中的7个含有对所有三种NNRTI具有高抗性的逆转录酶(表3)。在它们的逆转录酶基因中，全部都有取代即K103N或者在一个病例(样品656)中有A98G取代和Y181C取代的组合。8个样品对所有三种NNRTI敏感。所述敏感样品中的六个在其逆转录酶基因中没有相关突变，而剩余的二个却或者有V179I突变，或者有V179T/A/I突变；影响对NNRTI的敏感性的这些突变尚不了解。
实施例6.用从血浆得到的逆转录酶测定对AZT-TP和d4T-TP的敏感性
按照“ 基于可溶性细胞酶破坏后由微型柱分离病毒逆转录酶，从 含有逆转录酶封闭性抗体的材料中分离病毒逆转录酶的方案”，处理27位来自瑞典斯德哥尔摩的HIV感染个体的各1ml血浆样品。这些样品中仅13个样品含有足够逆转录酶，从而允许进行药物敏感性测试。这些样品的PCR值为43 000个拷贝/ml或更大些。按照“ 裂解液中逆转 录酶活性的药物敏感性的测定方案”，使每种血浆逆转录酶和两种对照之酶对一组连续稀释的AZT-TP和d4T-TP进行滴定。参见表4。
使用来自每种逆转录酶提取物的、相当于5fg/孔标准逆转录酶HIV-1 RT的活性和链终止反应混合物，我们发现这两种药物的IC50值随着与对NRTI抗性有关的已知突变的积聚而平行地增大(表4)。正如所料到的，单独的突变D69N或突变M184V并不导致IC50值增加。样品656和样品1320含有既对AZTT-TP、又对d4T-TP显示出中等IC50值的逆转录酶，尽管所述逆转录酶中存在几个已知影响对NRTI抗性的氨基酸取代。发现这些分离物也含有Y181C取代或M184V取代，它们这些取代导致对T-类似物药物重新敏感是已知的。与野生型对照逆转录酶相比，在当前之组中的两种逆转录酶显示出升高至少20倍的IC50值(表4)。这些逆转录酶中的一种具有表现Q151M复合体[8]的一组氨基酸(aa)插入，而另一种含有典型的K70R取代且另外还含有L210S取代。可分别用IC50值1μM和0.1μM作为AZT-TP、d4T-TP之值的等级，将所述提取物分为含有9种敏感逆转录酶和4种抗性逆转录酶的类型，这和由基因型测定得出的结果相一致。
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表1.非核苷抑制剂对具有已确定突变的重组HIV 1 RT的影响的比较。
所分析的RT           RT测定中指定抑制剂的IC50(μM)          相应病毒的敏感性 *
中的修饰          奈韦拉平    地拉韦啶    依法韦仑    奈韦拉平    地拉韦啶    依法韦仑
L100I             32          9.5         ＞4         L           I           I
K103N             ＞100       3.0         ＞4         H           H           H
L100I/K103N       ＞100       ＞100       ＞4         H           H           H
Y181C             ＞100       3.0         0.5         H           H           L
野生型BH10        0.2         0.5         0.04        S           S           S
野生型HxB2        1.7         1.6         0.12        S           S           S
*表型数据：S＝敏感，L＝低水平抗性(抑制剂量增加2-10倍)，I＝中等抗性(增加10-100倍)，H＝高水平抗性(增加＞100倍)。and未测定。
表2.AZT-TP和d4T对具有已确定突变的重组HIV 1 RT的影响的比较。
所分析RT                 RT测定中AZT-TP       RT测定中                 相应病毒的敏感性*
中的修饰*                的IC50(μM)          d4T-TP的IC50(μM)        AZT         d4T
T215Y                    0.69                 0.15                     I           L
M41L/T69S-SS/L210W/
R211K/L214F/T215Y        4.0                  0.49                     H           H
野生型HXB2               0.19                 0.050                    S           S
野生型BH10               0.16                 0.033                    S           S
Y181C                    0.15                 0.033                    RS          RS
*表型数据：RS＝所述突变引起抗性病毒的再敏感。S＝敏感，L＝低水平抗性，I＝中等抗性，H＝高水平抗性。and未测定。
表3.NNRTI对从患者血浆中回收的HIVRT的影响
患者      PCR         fgRT/ml    IC50NVP    IC50EPV      IC50DLV                         氨基酸的突变
编号      值          血浆       (μM)      (μM)        (μM)           98   101   103   106   108   179   181
                                                                         A    L     K     V     V     V     Y
3980      542 000     1056       0.65       0.09         7.51                                         *
1177      73 000      83         0.81       0.17         4.54
1412      17 000      40         0.80       0.21         3.60
1784      17 000      69         0.97       0.15         8.22                                         I
1885      465 000     1032       0.97       0.17         8.97
1572      105 000     146        2.16       0.21         9.54
1424      245 000     375        2.92       0.42         8.21
1639      431 000     71         3.14       0.33         12.7
494       18 000      39         ＞100      ＞4          ＞100           S    I     N
622       529 000     400        ＞100      ＞4          ＞100                I     N
2098      ＞750 000   5533       ＞100      ＞4          ＞100                      N     H
2883      71 000      517        ＞100      ＞4          ＞100                I     N
3807      764 000     683        ＞100      ＞4          ＞100                I     N
656       ＞75 000    1921       ＞100      ＞4          ＞100           G                                  C
1517      353 000     268        ＞100      ＞4          ＞100                      N
重组RT对照
L100I                            32         ＞4          9.5                  I
野生型RT                         1.7        0.12         1.6
*序列V179T/A/I中的异质性(Hetrogenicity)。
表4.AZT-TP和d4T-TP对从患者血浆回收的HIV RT的影响
患者   PCR        fgRT     AZT-TP      d4T-TP                             氨基酸的突变
编号   值         /ml血浆  IC50(μM)/  IC50(μM)/    41  44  67  69  70  210  215  219  75  116  118  151  181  184
                           增加倍数    增加倍数      M   E   D   T   K   L    T    K    V   F    V    Q    Y    M
3507*  54 000     83       0.13  0,8   0.020  0.6
622    529 000    400      0.23  1,4   0.028  0.8                N
160    363 000    350      0.27  1.7   0.043  1.3
2098   ＞750 000  5533     0.35  2.2   0.048  1.5
48     189 000    30.8     0.47  2.9   0.085  2.6
181    550 000    831      0.50  3.1   0.049  1.5
807    420 000    294      0.50  3.1   0.070  2.7
662    750 000    4567     0.50  3.1   0.065  2.0
1144   110 000    76.7     0.56  3.5   ND#                                                                     V
656*   ＞75 000   1921     1.25  7.8   0.17  5.2     L   D   N           W    Y                  I         C
1320*  43 000     420      1.32  8.3   0.59  19.6                        W    Y                  I             V
393    750 000    388      3.2   20    0.42  12.7                                       X   Y         M
1030   207 000    173      3.2   20    1.1   33                      R   S
重组RT对照
野生型RT                   0.16  1.0   0.033 1.0
T69S→SSa                  4.00  25    0.49  15      L          S-SS     W    Y
#由于分布型方面的不规则而未测定。*样品656中的RT既有L100I取代、又有181C取代，已知这些取代引起再敏感(参见参考文献10和11)。样品1320中的RT具有已知引起再敏感的M184V取代(参见参考文献12)。a这种RT含有一种T69S→SS插入。
a这种RT含有一种T69S→SS插入。

Claims (8)

1.一种测试药物表型敏感性的方法，所述方法通过测试一种从所述个体的生物样品中回收的、包装到有包膜病毒中的酶，来测试药物在有包膜病毒感染的哺乳动物个体中的表型敏感性，所述方法包括下述步骤：
a)向所述样品中加入一种酶失活剂，以使存在于有包膜病毒体之外的聚合酶活性失活，
b)除去所述酶失活剂、酶活性封闭性抗体、内源酶活性抑制剂以及抗病毒药物，
c)裂解所述病毒颗粒以释放所述酶，
d)回收由c)产生的、经浓缩的纯化病毒酶，并且通过用灵敏的酶测定，根据所回收的酶来确定所述个体的药物敏感性分布型。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物个体是人类。
3.权利要求1或2的方法，其中所述生物样品为血液样品。
4.权利要求3的方法，其中所述血液样品为血浆样品。
5.权利要求4的方法，其中所述有包膜病毒为逆转录病毒。
6.权利要求5的方法，其中所述逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，而所述酶是HIV逆转录酶(RT)。
7.权利要求1的方法，其中所述个体的药物敏感性分布型用来选择所述个体的药物疗法。
8.一种商业成套试剂，所述商业成套试剂包括依照权利要求1-7中任一项用于测试药物在有包膜病毒感染的哺乳动物个体中的表型敏感性的书面说明或资料载体说明，和
一种使聚合酶活性失活的酶灭活剂，
一种灵敏的酶测定，和
至少一种参照药物。
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