BR0210361B1 - Método para testar a suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado com vírus envelopado, e, embalagem comercial. - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA TESTAR A SUSCETIBILIDADE FENOTÍPICA A MEDICAMENTO EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO INFECTADO COM VÍRUS ENVELOPADO, E, EMBALAGEM COMERCIAL” A presente invenção diz respeito a teste de suscetibilidade viral ao medicamento, em particular a um método para testar a suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado por vírus envelopado tratado com medicamento, tal como infectado por retrovírus, por exemplo o vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), mediante o teste de uma enzima contida em um vírus envelopado recuperado de uma amostra biológica do referido indivíduo.

Fundamentos A suscetibilidade ao medicamento do HIV é associada com a resposta virológica aos novos tratamentos. Os testes padronizados de resistência aos medicamentos acham-se agora disponíveis, e os dados de provas clínicas sugerem que o uso dos testes de resistência ao medicamento pode estar associado com o resultado virológico melhorado. Entretanto, a resistência ao medicamento é complexa em termos de desempenho, interpretação e aplicação clínica.

Os testes fenotípicos medem a capacidade de um isolado do HIV desenvolver-se na presença de medicamento e são realizados usando-se ensaios em que o grau de inibição da replicação viral em diferentes concentrações do medicamento é avaliado. Os resultados são usados para calcular a concentração inibidora de 50% ou 90% de um medicamento quanto a um isolado. Um problema potencial com o ensaio clássico do fenótipo é o efeito da deriva genética na população viral durante o isolamento do vírus. Nos casos piores, o clone viral isolado é aquele mais adaptado a desenvolver-se durante as condições in vitro, não aquele mais abundante no paciente. A medição da suscetibilidade fenotípica a medicamento pode agora ser feita através de ensaios automáticos com base na tecnologia do DNA recombinante. Estas abordagens envolvem a amplificação do RNA plasmático codificando para a HIV protease e a transcriptase reversa (RT) e a geração de um vírus recombinante com os outros genes de uma construção de laboratório (vírus cassete) [1]. Os ensaios de genótipos medem a ocorrência de certas mutações nos genes alvejados por medicamentos anti-retrovirais. Enquanto a resistência genotípica mede a suscetibilidade ao medicamento do vírus, a genotipação detecta as mutações que conferem resistência fenotípica. A amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) das seqüências de HIV-1 de plasma contendo de 500 a 1000 cópias de RNA por mililitro, é a etapa inicial tanto nestes ensaios quanto nos ensaios fenotípicos de vírus recombinante. Dependendo das mutações avaliadas e do laboratório que realiza o teste, os ensaios de genótipos podem diferenciar um mutante em um nível de 10 a 50% em uma mistura de vírus. A complexidade dos dados gerados da seqüenciação tem conduzido a dificuldades na interpretação dos resultados. Pode haver interpretações variáveis com respeito ao nível de resistência fenotípica por um padrão mutacional específico. À medida em que novos dados são gerados, existe um risco de se fornecer interpretações inadequadas ou mesmo incorretas [2]. O mecanismo de reação quanto a todos os medicamentos anti-retrovirais até agora usados está na interferência com a reação enzimática ou da protease viral ou da RT. Dependendo da capacidade dos ensaios enzimáticos e das técnicas de isolamento viral usadas, os testes de sensibilidade ao medicamento podem teoricamente ser feitos ou nos sobrenadantes da propagação da cultura viral, no isolamento do vírus primário ou nas preparações virais recuperadas diretamente dos pacientes. O teste de suscetibilidade ao medicamento na RT do isolamento viral primário oferece duas vantagens em comparação com os testes tradicionais de inibição da replicação viral. O tempo para a propagação viral é reduzido e o mais importante, menos seleção na população viral ocorrerá. A situação ideal é finalmente caracterizar a enzima que tenha sido extraída diretamente do vírus circulante no sangue do paciente. A vantagem de uma tal abordagem é que a amostra espelhará a população viral presente no paciente no momento da colheita da amostra de sangue. Isto não tem sido até aqui exeqüível na prática, mas o conceito tem sido explorado por testes de resistência com o ensaio de Amp RT com base na PCR [3]. A RT do HIV-1, bem como outras transcríptases reversas, desempenham três diferentes reações enzimáticas: polimerização do DNA dependente do RNA, polimerização do DNA dependente do DNA, e degradação do RNA no híbrido de DNA-RNA (RNAse Η). A RT do HIV, codificada pelo gene pol, é um heterodímero consistindo de uma subunidade p66 e uma p51. Tanto a polimerização do DNA dependente do RNA quanto a polimerização do DNA dependente do DNA são realizadas pelo mesmo sítio ativo na subunidade p66. A p51 é produzida pela remoção do fragmento C-terminal do p66 correspondente ao domínio H de RNAse [4]. Todos os inibidores da RT correntemente aprovados para uso clínico inibem a atividade de polimerase da enzima. O mecanismo da reação destes medicamentos tem sido definido principalmente de acordo com sua ação na reação de polimerização do DNA dependente do RNA. O efeito sobre a reação de polimerização do DNA dependente do DNA é comparativamente menos estudado. O ensaio convencional da atividade da RT é realizado pela utilização de uma construção de um padrão-iniciador artificial e desoxinucleotídeo trifosfato rotulado como substrato de nucleotídeo. O par padrão/iniciador poli(rA)/oligo(dT) é o mais eficiente e a combinação mais usada para determinação do HIV, bem como para outras RTs retrovirais. Um inconveniente deste tipo de ensaio quando o teste de sensibilidade ao medicamento está envolvido, é que apenas análogos não nucleosídeos ou análogos que podem ter pareamento de base com rA podem ser testados. Análogos às outras bases de nucleotídeos necessitarão de um ensaio com base em um padrão polimérico variável.

Todos os medicamentos anti-retrovirais até aqui aprovados interferem com a reação enzimática ou da protease viral ou da RT. Existem, além disso, medicamentos candidatos nas fontes de informação, que afetam a função da integrase retroviral.

Os inibidores da RT são ou análogos de nucleosídeos ou análogos não nucleosídeos. Os inibidores de não nucleosídeos se ligam a uma bolsa hidrofóbica na enzima da RT perto, mas não contígua, ao sítio ativo. A replicação do HTV-1 é inibida alostericamente pelo deslocamento dos resíduos catalíticos de aspartato em relação ao sítio de ligação da polimerase. A resistência usualmente emerge rapidamente quando os não nucleosídeos são administrados como monoterapia ou na presença de supressão incompleta do vírus. Presentemente, apenas três inibidores de não nucleosídeos, Nevirapine, Efavirenz e Delavirdine, são aprovados para uso clínico pela FDA.

Os inibidores de nucleosídeos usados hoje terminam o alongamento da cadeia de DNA à medida em que eles careçam de um grupo 3’-hidroxila. A terapia prolongada com os inibidores de nucleosídeos comumente conduz ao desenvolvimento de vírus resistentes. Este processo é associado com a aparência gradual de mutações no gene pol viral, cada um conduzindo a substituições definidas de aminoácidos [5]. Os efeitos destas substituições nos níveis enzimáticos são complicados e incluem a intensificação de uma função primitiva de edição do DNA. Esta reação é dependente do nucleotídeo e produz polifosfato de dinucleosídeo e uma extremidade 3’ de DNA extensível [6]. A terapia do HIV hoje se baseia na terapia de medicamentos múltiplos. Os regimes se baseiam nas combinações de todos os três tipos de medicamentos disponíveis: análogos nucleosídeos, análogos não nucleosídeos e nos inibidores da protease. A estratégia é minimizar a probabilidade para que um vírus mutante sobreviva. Encarando a falha virológica, as diretrizes da terapia corrente recomendam a mudança para uma batelada de medicamentos inteiramente nova. Isto é frustrante, tendo em vista que muitas pessoas de HIV positivo não têm três ou mais medicamentos não experimentados, dentre os quais escolher. Além disso, também pode ser uma decisão imprevidente eliminar um medicamento que de fato ainda seja eficaz. Com os testes de resistência melhorada do medicamento pode ser possível eliminar o medicamento ou medicamentos ineficazes em uma dada combinação. Descrição da Invenção A presente invenção provê um procedimento para realizar testes de resistência a medicamento fenotípico em enzima que seja recuperada diretamente de amostras de plasma do paciente. Baseia-se em uma combinação de técnicas para recuperar enzimas virais essencialmente livres de suas contrapartes celulares, seguida por sua medição com o uso de ensaios de enzimas sensíveis. A técnica de isolamento de enzimas descrita pode ser usada para qualquer enzima contida em um vírus envelopado, porém seu uso é, no presente relatório descritivo, apenas explorado pela utilização de plasma derivado de RT para testes de resistência ao medicamento.

Assim, um aspecto da invenção é dirigido a um método de testar a suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado com o vírus envelopado, mediante o teste em uma enzima contida em um vírus envelopado recuperado de uma amostra biológica do referido indivíduo, compreendendo as etapas de a) adicionar um agente inativador da enzima à amostra para inativar a atividade de polimerase outra que não aquela presente no vírion envelopado, b) remover o agente inativador da enzima, os anticorpos bloqueadores da atividade da enzima, os inibidores endógenos da atividade da enzima e os medicamentos antivirais, c) lisar a partícula viral para liberar a enzima, d) recuperar a enzima viral purificada concentrada resultante de c) e determinar o perfil de sensibilidade do indivíduo ao medicamento a partir da enzima recuperada mediante o uso de ensaios de enzimas sensíveis.

Em uma forma de realização da invenção, o indivíduo mamífero é um ser humano.

Em uma forma de realização presentemente preferida, a amostra biológica é uma amostra de sangue, tal como uma amostra de plasma.

Em outra forma de realização preferida, o vírus envelopado é um retrovírus, tal como um vírus da imunodeficiência humana (HIV). A enzima é, no último caso mencionado, preferivelmente uma transcriptase reversa (RT) do HIV. O perfil de sensibilidade ao medicamento de um indivíduo, obtido com o método da invenção, pode ser usado para selecionar a terapia de tratamento do medicamento para o indivíduo. Na prática, o indivíduo mamífero infectado com o vírus envelopado será submetido a testes do perfil de sensibilidade ao medicamento em vários pontos do tempo para monitorar o desenvolvimento da infecção e o tratamento viral do medicamento no referido indivíduo. A invenção também é direcionada a uma embalagem comercial compreendendo instruções escritas ou portadoras de dados para o teste de suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado com o vírus envelopado em conformidade com a invenção, e um agente inativador da enzima para inativar a atividade de polimerase, um ensaio de enzima sensível, e pelo menos um medicamento de referência. A invenção será agora ilustrada pela seguinte descrição não limitativa das formas de realização e desenhos da invenção.

As instruções da literatura citada ficam aqui incorporadas como referência.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a correlação entre a RT do HIV-1 recuperada e o RNA viral medido com PCR de RNA. A Figura 2 exemplifica o relacionamento entre a quantidade de RT usada nos ensaios de suscetibilidade ao medicamento e os valores de IC50 encontrados. Símbolos (0) RT tipo selvagem de Efavirenz, (♦) RT L100I de Efavirenz, (O) RT do tipo selvagem de AZT-TP, (·) RT T215Y de AZT-TP. Descrição das Formas de Realização O procedimento usado consiste de quatro diferentes etapas. I) Inativação da atividade da polimerase hospedeira que esteja presente na amostra, sem afetar as enzimas virais presentes no vírion envelopado. II) Remoção do agente inativador da enzima, dos anticorpos bloqueadores da atividade enzimática, inibidores da atividade enzimática endógena e medicamentos antivirais. III) Recuperação da enzima viral purificada concentrada. IV) Determinação do perfil de sensibilidade ao medicamento da enzima recuperada. (Etapas I a ΙΙΓ) Protocolo para isolamento da RT viral do material que contêm os anticorpos bloqueadores da RT, com base na destruição de enzimas celulares solúveis, seguido pelo isolamento da RT viral de mini-colunas. 1) Rotular os tubos plásticos de 4,5 ml a serem usados. Colocá-los em uma caixa Nalgene. Adicionar 1 ml de amostra (por exemplo, plasma de EDTA dos indivíduos infectados com o HIV) a cada tubo rotulado. Adicionar 100 μΐ de uma solução a 66 mM de 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) em água tamponada, turbilhonar e incubar as amostras por uma hora em temperatura ambiente. A atividade das enzimas livres do plasma é destruída durante este procedimento, enquanto as enzimas contidas dentro dos vírions permanecem intactas. Os vírions podem, então, ser purificados de 5,5’- ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), dos anticorpos bloqueadores da atividade enzimática e de outras substâncias que possam interferir com a quantificação da RT viral por vários procedimentos de separação. O protocolo abaixo se baseia no uso do gel Fractogel® EMD TMAE Hicap. 2) Suspender o gel de separação cuidadosamente e transferir 1500 μΐ de lama de gel para cada tubo de pré-tratamento da amostra. 3) Incubar as amostras com a lama de gel por 90 minutos em temperatura ambiente, com os tubos repousando horizontalmente sobre uma batedeira orbital. 4) Rotular a quantidade desejada de mini-colunas plásticas de 10 ml para identificar as amostras que estão sendo analisadas. Montar as colunas em um dispositivo de lavagem de colunas, isto é, uma tubulação de vácuo de extração de fase sólida Supelco Visiprep. Transferir os conteúdos nos tubos de ligação para suas colunas correspondentes. Antes de transferir, turbilhonar o tubo brevemente para distribuir uniformemente o gel. 5) Quando todas as colunas estiverem cheias, aplicar o vácuo e aspirar os géis secos. Desligar o vácuo e iniciar a lavagem pelo enchimento de cada coluna com 9 ml de tampão A. Quando todas as colunas tiverem sido enchidas, aplicar o vácuo e aspirar os géis secos. 6) Repetir a etapa 5 por três vezes mais, dando um total de quatro lavagens. Aspirar os géis secos após cada lavagem. Após aspirar os géis secos depois da quarta lavagem, desligar o vácuo e prosseguir para a etapa 7. A etapa de lavagem remove os anticorpos bloqueadores da RT não ligados e o 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) do sistema. 7) Adicionar a todos os géis secos 9 ml de tampão condicionador (B). Após um minuto, aplicar vácuo e aspirar os géis secos. 8) Repetir a etapa 7. Antes de desligar o vácuo, verificar que todo o tampão condicionador (B) tenha sido removido de todos os géis. 9) Erguer a parte superior do dispositivo de lavagem da coluna. Montar a alça dos tubos com os tubos rotulados dentro de um recipiente limpo. Reajustar a parte superior do dispositivo. Controlar para que as pequenas tubulações de cada coluna desçam em. seus tubos correspondentes. 10) Adicionar 600 μΙ de tampão de li se (C) a cada coluna. Deixar o tampão repousar na coluna por cinco minutos. Depois aplicar o vácuo lentamente e aspirar os géis secos. Isto dará em cada tubo aproximadamente 600 μΐ de lisado vira! do gel ligado. A atividade da RT recuperada nos lisados da etapa 10 é essencial mente livre de anticorpos bloqueadores da RT, medicamentos e atividade de polimerase celular, e pode ser quantificada com um ensaio da atividade de RT sensível, isto é, o Cavidi HS-kit Lenti RT, que se baseia no método descrito por Ekstrand et ai. [7], 25 μΙ do lisado obtido de acordo com o protocolo corrente são suficientes para a determinação da atividade da RT na amostra. Os remanescentes 575 μΐ de amostra podem ser congelados a -70 °C ou abaixo, para uso posterior no teste de sensibilidade ao medicamento.

Nota: As enzimas da RT que não sejam sensíveis aos agentes modificadores da cisterna, por exemplo a RT do HIV-I tipo selvagem podem ser opcionalmente ensaiadas na presença de até 5 mM de 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico). Enzimas sensíveis, tais como as MULV RT e RT de certas cepas de HTV-l resistentes à terapia (contendo, por exemplo, a mutação Y181C), por outro lado necessitam da adição de um agente redutor da sulfidrila, isto é, cisterna ou cisteamina, ao tampão de lise. (Etapa IV) Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade da RT nos lisados.

Uma modificação do ensaio colorimétrico da RT (Cavidi® HS-kit Lenti RT), disponível da Cavidi Tech, Uppsala, Suécia, foi usada para a determinação do nível de atividade da RT nas preparações virais estudadas. Em resumo, a poli(rA) covalentemente ligada aos reservatórios de uma placa microtituladora de 96 reservatórios serve como padrão para a incorporação de 5’-trifosfato de 5-bromo-deoxiuridina (BrdUTP) durante a etapa de transcrição reversa em 33 °C. A quantidade de monofosfato de bromodeoxiuridina (BrdUMP) incorporada no DNA, é detectada com um anticorpo monoclonal anti-BrdU conjugado à fosfatase alcalina (Ap). Um substrato de Ap, o fosfato de 4-metilumbeliferila, é finalmente usado para detecção fluorimétrica. A quantidade de RT isolada usada nas determinações de IC50 foi para os análogos de nucleosídeos padronizados a uma atividade correspondente a referência de RT de HIV-1 de 5 fg (4,3 x 10‘20 mol) por reservatório, enquanto a RT de 1,7 fg (1,5 x 10‘20 mol) foi usada para os análogos não nucleosídeos. Os lisados foram diluídos em “lisados simulados”, isto é, lisados obtidos da separação simulada do soro de bezerro fetal.

Os estudos da inibição da RT foram realizados em duas diferentes versões modificadas do ensaio de RT HS Lenti.

Os análogos não nucleosídeos foram serialmente diluídos em etapas quíntuplas na mistura de reação da RT e alíquotas de 25 μΐ foram transferidas para cada reservatório na placa microtituladora, misturadas com 125 μΐ da mistura de reação da RT, e a reação enzimática foi iniciada pela adição de 25 μΐ de diluição de lisado. A concentração final do substrato de nucleotídeo (BrdUTP) foi de 16 μΜ e a quantidade de iniciador (odT22) foi de 12 ng por reservatório. Os análogos dT foram serialmente diluídos em etapas quíntuplas na mistura de reação de terminação de cadeia e alíquotas de 25 μΐ foram transferidas para cada reservatório na placa microtituladora, misturadas com 125 μΐ da mistura de reação de terminação da cadeia de RT, e a reação enzimática foi iniciada pela adição de 25 μΐ da diluição do lisado. A concentração final do substrato de nucleotídeo (BrdUTP) foi de 1,5 μΜ e a quantidade de iniciador (odT22) de 12 ng por reservatório. Tanto para os inibidores da RT de nucleosídeos quanto de não nucleosídeos, a reação da RT foi deixada prosseguir durante a noite (16 a 24 horas em 33 °C). Depois disso, a reação foi terminada por uma lavagem da placa. O valor de IC50 foi definido como a concentração de medicamento que dá a inibição de 50% da atividade da RT estudada.

Materiais Gel de separação: por exemplo, Fractogel® EMD TMAE ou Fractogel® EMD TMAE Hicap em 314 mM [ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico] (MES) pH 5,1, iodeto de potássio 413 mM e 0,5 mg/ml de heparina.

Mini-colunas, por exemplo Biorad Poly-Prep® (7311553) Dispositivo de lavagem das mini-colunas, isto é, tubo múltiplo de vácuo de extração de fase sólida Supelco Visiprep.

Tubos plásticos, por exemplo tubos criogênicos de 4,5 ml Nunc.

Placas microtituladoras com prA imobilizado, isto é, Nalge Nunc NucleoLinck® Agente modificador da cisteína, por exemplo 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) 66 mM em água tamponada com Tris(hidroximetil)amino-metano 0,87 M (pH 8,3).

Agente brando redutor da sulfidrila, por exemplo cisteamina 33 mM em água. Medicamentos antivirais: Trifosfato de 3,-azido-2’,3’-deoxitimidina (AZT-TP) e trífosfato de 2’,3’-dideídro-3’-deoxitimidina (d4T-TP) foram trazidos da Moravek Biochemicals, Califórnia. Nevirapine, (ll-ciclopropil-5,ll-diidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2’ ,3’-f][l ,4]diazepin-6-ona) (NVP), Delaviridine, sulfonato monometano de l-(5-metanossulfonamido-lH-indol-2-il-carbonil)-4-[3-(l-metiletil-amino)-piridinil]piperadina (DLV) e Efavirenz, (-)6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-diidro-2H-3,1 -benzoxazin -2-ona) (EFV) foram trazidos da Apoteksbolaget, Uppsala, Suécia.

Amostras de plasma de indivíduos infectados com HIV

Amostras de plasma de pacientes de tratamento ingênuo ou de pacientes tratados com terapia de combinação comum, foram selecionadas retrospectivamente. As amostras codificadas foram liberadas congeladas como dois painéis diferentes, representando pacientes com resistência a NNRTIs e aos análogos T, respectivamente. A quantidade de RNA de HIV-1 em cada amostra foi medida por PCR padrão de RNA do HTV-1 (Cobas, Roche Diagnostica) e o genótipo viral foi analisado com o kit TRUGENE® HTV-1 Genotyping (Visible Genetics).

Enzimas recombinantes de RT: Formas mutantes de RT resistentes a NNRTI foram produzidas (L100I, K103N, L100I/K103N, Y181C). Como padrão para as mutações foi usado o vetor de expressão pETRT, que foi construído do isolado BH10. As mutações foram geradas usando-se os kits comerciais de mutagênese locodirigida, QuikChange (Stratagene). As mutações foram verificadas pela análise de seqüências de DNA. As formas transformadas e nativas da RT foram isoladas como descrito anteriormente [8].

As RTs recombinantes com as mutações específicas AZT foram produzidas pela introdução da mutação na região codificadora de RT de um fragmento de enzima de restrição HXB2-D EcoRI-Ndel clonado no vetor de expressão pKK233-2 (Amersham Biotech). As mutações foram geradas usando-se os kits comerciais de mutagênese locodirigida, QuikChange (Stratagene). Os vetores de expressão clonados transformados foram transformados na cepa de E. coli XLl-Blue e os genótipos foram verificados por análise de seqüências de DNA.

Tampões usados: A) Tampão de lavagem: MES 20 mM pH 5,4, acetato de potássio 500 mM (KAc) B) Tampão condicionador. Um tampão compatível com o ensaio da RT, por exemplo N-2-hidroxietilpiperazina-N’-(ácido 2- etanossulfônico) (Hepes) pH 7,6, KAc 25 mM, cloreto de magnésio (MgCl2) 20 mM, Ácido Etileno Glicol-bis(éter β-aminoetílico) Ν,Ν,Ν’,Ν’-Tetraacético (EGTA) 0,2 mM, espermina 2 mM e 0,5 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA) inativada pelo calor. C) Tampão de lise: um tampão compatível com o ensaio da RT que inclui um detergente, por exemplo 1,25% do Lauril Éter de polioxietileno 4 (Brij 30), 13 ng/ml de odT22 e os mesmos componentes do tampão condicionador (B). Um agente redutor de sulfidrila, isto é, cisteamina 0,2 mM, é opcionalmente adicionado quando do processamento de vírus com RT que sejam sensíveis à oxidação/modificação de SH. D) Mistura de reação da RT, por exemplo Hepes 10 mM, pH 7,6, BrdUTP 19 μΜ, 80 ng/ml de odT22, MgCl2 4 mM, 0,5 g/litro de sulfato de dextrano, espermina 1 mM, Triton-X 100 0,5% (v/v), EGTA 0,2 mM e 0,5 mg/ml de BS A. E) Mistura de reação de terminação de cadeia: Hepes 10 mM pH 7,0, BrdUTP 1,75 μΜ, odT22 80 ng/ml, MgCl2 10 mM, ATP 7 mM, 0,05 g/litro de sulfato de dextrano, espermina 2 mM, Triton-X 100 0,5% (v/v), EGTA 0,2 mM e 0,5 mg/ml de BSA.

Exemplos Exemplo 1 Correlação entre a RT de HIV-1 e o RNA viral medida com PCR de RNA.

Amostras de 1 ml plasma de EDTA de indivíduos infectados com o HTV, foi processado de acordo com o “Protocolo para isolamento da RT viral de material que contém anticorpos bloqueadores de RT, com base na destruição de enzimas celulares solúveis seguida pelo isolamento da RT viral de mini-colunas” e a quantidade de atividade de RT recuperada de cada amostra foi determinada em um ensaio de RT durante a noite, usando-se Cavidi® HS-kit Lenti RT. As atividades da RT obtidas foram recalculadas em fg HIV 1 RT/ml de plasma, de acordo com uma curva padrão interna. A quantidade de RN A de HIV-1 em cada amostra foi medida por PCR padrão de RNA do HIV-1 (Roche Amplicor). O gráfico é restrito a amostras com valores de PCR > 500 eópias/ml. Uma forte correlação foi encontrada entre a quantidade de RT do plasma recuperada e a quantidade de RNA do HIV medida com PCR (r = 0,93, n = 33, p « 0,001). Ver Figura 1.

Do exemplo pode ser deduzido que o processamento de 1 ml de plasma de um indivíduo com 50.000 cópias de RNA do HIV por mililitro de plasma, resultará na recuperação de aproximadamente 200 fg de atividade da RT. Usando-se 1,7 fg de RT por teste, esta quantidade corresponde a 118 testes, que podem ser usados para determinação do perfil de sensibilidade ao medicamento da RT isolada.

Exemplo 2 Influência da quantidade de RT usada nos testes de suscetibilidade ao medicamento.

Os efeitos de NNRTIs, AZT-TP e d4T-TP na RT do HIV-1 recombinante indicada foram determinados de acordo com o “Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade da rí nos Usados" usando-se as concentrações de RT indicadas. A Figura 2 exemplifica a relação entre a quantidade de RT usada nos ensaios de suscetibilidade ao medicamento e os valores de IC50 encontrados. Os valores de IC50 para as NNRTIs como o Efavirenz não foram de modo algum influenciados pelas variações na quantidade de RT dentro da faixa pesquisada. Entre as NRTIs estudadas A.ZT-TP apresentou a maior variação em relação à quantidade de RT incluída no ensaio. Esta variação foi máxima quanto à RT do tipo selvagem e a IQo aumentou de 0,13 para 0,22 μΜ quando do aumento da quantidade de RT de 2 para 162 fg/reservatório (Figura 2). A quantidade de atividade da RT disponível nas amostras de plasma estabelece os limites dos testes presentes. Um sinal de pelo menos cinco vezes o fundo é necessário para se obter valores reprodutíveis de 1C5U para os medicamentos testados. A baixa variabilidade dos valores de IC5U quando o aumento das quantidades de RT são adicionados ao teste, toma exeqüível a determinação da sensibilidade ao medicamento sem padronização prévia da quantidade de RT usada em cada ensaio.

Exemplo 3 Comparação dos efeitos de inibidores de não nucleosídeos na RT do HIV 1 recombinante com mutações definidas Os efeitos de três inibidores de não nucleosídeos na RT indicada do HIV-1 recombinante foram determinados de acordo com o “Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade da RT nos Usados". A quantidade de cada RT foi padronizada para corresponder à atividade de 1,7 fg/reservatório da RT de nossa referência. A duração da reação da RT foi de 19 horas e as atividades obtidas foram recalculadas em % da atividade com a mesma RT incubada na ausência de inibidor.

Os dados feno típicos foram extraídos da literatura (notícias antivirais internacionais e banco de dados http://stanford.edu/hiv) (Tabela 1).

Havia em geral lima forte correlação entre os valores de IC5t> do ensaio de inibição da RT e os dados fenotípicos de acordo com a literatura. Sempre foi possível distinguir as RTs dos vírus alta ou medianamente resistente (Tabela 1).

Exemplo 4 Comparação do efeito de análogos DT na RT de HIV-1 com mutações definidas.

Os efeitos de AZT-TP e d4T na RT indicada do HIV-1 recombinante foram determinados de acordo com o “Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade da RT nos Usados”. A quantidade de cada RT foi padronizada para corresponder à atividade de 5 fg/reservatório da RT de nossa referência. A duração da reação da RT foi de 19 horas e as atividades obtidas foram recalculadas em % da atividade com a mesma RT incubada na ausência de inibidor.

Os dados fenotípicos foram extraídos da literatura (notícias antivirais internacionais e banco de dados http://stanford.edu/hivΐ (Tabela 2). A mistura da reação de terminação de cadeia usada para a determinação da suscetibilidade aos medicamentos do análogo T deve ser capaz de suportar uma reação de fosforólise dependente da energia. Lamentavelmente, uma reação eficiente de fosforólise é prontamente refletida por um decréscimo na velocidade de polimerização e como consequência também um decréscimo na sensibilidade de detecção. Portanto, este ensaio requer mais atividade da RT, em comparação com o ensaio correspondente para as NNRTIs. Outra consequência é que a distância entre as RTs resistentes e sensíveis é menor do que no ensaio de NNRTL Entretanto, havia em geral uma forte correlação entre os valores de IC50 do ensaio de inibição da RT e os dados fenotípicos de acordo com a literatura. Sempre foi possível distinguir as RTs dos vírus alta ou medianamente resistentes. (Tabela 2). Exemplo 5 Determinação da suscetibilidade às NNRTIs usando RTs derivadas do plasma Amostras de um ml de plasma de 17 indivíduos infectados com HIV de Estocolmo, Suécia, foram processadas em conformidade com o “Protocolo para isolamento da RT vira! de material que contém anticorpos bhqueadores da RT, com base na destruição de enzimas celulares solúveis seguida por isolamento da RT viral das mini-colunas”. 15 destas continham RT suficiente para permitir os testes de suscetibilidade ao medicamento. O valor da PCR para estas amostras foi de 17.000 cópias/ml ou mais. Cada RT do plasma e duas enzimas de controle foram tituladas quanto a um conjunto de diluições seriais de Nevirapine, Efavirenz e Delavirdine, de acordo com o Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade de RT nos Usados.

Usando uma atividade correspondente à RT do HIV-1 da RT de referência de 1,7 fg/reservatório, de cada extrato de RT, nós observamos que 7 das 15 amostras continha RTs que eram altamente resistentes a todas as três NNRTls (Tabela 3). Todas tinham a substituição K103N ou em um caso (amostra 656), a combinação das substituições A98G e Y181C em seus genes de RT. Oito amostras foram sensíveis a todas as três NNRTls. Seis das quais não tiveram mutação relevante em seus genes de RT, enquanto as duas remanescentes tiveram as mutações ou V179I ou V179T/A/I, as quais não se sabe se afetam a sensibilidade às NNRTls.

Exemplo 6 Determinação da suscetibilidade a AZT-TP e d4T-TP usando RTs derivadas do plasma.

Amostras de um ml de plasma de 27 indivíduos infectados com HIV de Estocolmo, Suécia, foram processadas de acordo com o “Protocolo para isolamento da RT viral de material que contém anticorpos bloqueadores da RT, com base na destruição de enzimas celulares solúveis seguida por isolamento da RT viral das mini-colunas”. Apenas 13 destas continham RT suficiente para permitir os testes de suscetibilidade ao medicamento. O valor da PCR para estas amostras foi de 43.000 cópias/ml ou mais. Cada RT do plasma e duas enzimas de controle foram tituladas quanto a um conjunto de diluições seriais de AZT-TP e d4T-TP, de acordo com o Protocolo para determinação da suscetibilidade ao medicamento da atividade de RT nos Usados. Ver Tabela 4.

Usando uma atividade correspondente à RT do HIV-1 da RT de referência de 5 fg/reservatório, de cada extrato de RT e a mistura de reação de terminação da cadeia, nós observamos que os valores de IC50 para ambos os medicamentos aumentaram em paralelo com o acúmulo de mutações conhecidos como estando envolvidos na resistência às NRTIs (Tabela 4). As mutações D69N ou M184V sozinhas, como esperado, não resultaram em valores aumentados de IC50. As amostras 656 e 1320 continham RTs que, a despeito da presença de várias substituições de aminoácidos conhecidas como afetando a resistência às NRTIs, apresentaram valores de IC50 intermediários tanto para AZTT-TP quanto para d4T-TP. Estes isolados foram observados conterem também as substituições Y181C ou M184V, as quais são conhecidas como causadoras da re-sensibilização quanto aos medicamentos de análogo T. Duas RTs no painel presente apresentaram valores de IC50 que eram elevados de pelo menos 20 vezes em comparação com a RT de controle do tipo selvagem (Tabela 4). Uma destas tinha um conjunto de inserções de aminoácidos (aa) representativas quanto ao complexo Q151M [8] e a outra continha a substituição clássica K70R e, além disso, uma substituição L210S. Usando os valores de IC50 de 1 μΜ e de 0,1 μΜ como corte dos valores para AZT-TP e d4T-TP respectivamente, os extratos podem ser classificados como contendo 9 RTs sensíveis e 4 resistentes, o que está em concordância com os resultados do ensaio genotípico.

Referências 1. Petropoulos, C. J., Parkin, N. T., Limoli, K. L., Lie, Y. S., Wrín, T., Huang, W., Tian, H., Smith, D., Winslow, G. A., Capon, D. J., Whitcomb, J.M. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency vírus type 1. Antimicrob. Agents Chemother. Abril de 2000; 44(4): 920-928. 2. The Euroguidelines Group for HIV resistance. Clinicai and laboratory guidelines for the use of HIV-1 drug resistance testing as part of treatment Management: recommendations for the European setting. AIDS. 16 de fevereiro de 2001; 15(3): 309-320. 3. Vasquez-Rosales, G., Garcia Lerma, J. G., Yamamoto, S., Switzer, W. M., Havlir, D., Folks, T. M., Richman, D. D., Heneine, W. Rapid screening of phenotypic resistance to nevirapine by direct analysis of HIV type 1 reverse transcriptase activity in plasma. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1 de setembro de 1999; 15(13): 1191-1200. 4. Goff, S. P. (1990) Retrovirus reverse transcriptase: Synthesis, Structure, and Function. Review. J. Acquir. Imm. Defic. Syndr. 3: 817-831. 5. Vandamme, A. M., Van Vaerenbergh, K., De Clercq, E. Anti-human immunodeficiency virus drug combination strategies. Antivir. Chem. Chemother. maio de 1998; 9(3): 187-203. 6. Meyer, P. R., Matsuura, S. E., Mian, A. M., So, A. G., Scott, W. A. Related Articles. A mechanism ofAZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HTV-1 reverse transcriptase. Mol. Cell. julho de 1999; 4(1): 35-43. 7. Ekstrand, D. H., Awad, R. J., Kãllander, C. F., Gronowitz, J. S. A sensitive assay for the quantification of reverse transcriptase activity based on the use of carrier-bound template and non-radioactive-product detection, with special reference to human-immunodeficiency-virus isolation. Biotechnol. Appl. Biochem. abril de 1996; 23 (Pt 2): 95-105. 8. Lindberg, J., Sigurethsson, S., Lowgren, S., O Andersson, H., Sahlberg, C., Noreen, R., Fridborg, K., Zhang, H., Unge, T. Structural basis for the inhibitory efftcacy of efavirenz (DMP-266), MSC194 and PNU142721 towards the HIV-1 RT K103N mutant. Eur. J. Biochem. março de 2002; 269(6): 1670-1677. 9. Shirasaka, T., Kavlick, M. F., Ueno, T., Gao, W.-Y., Kojima, E., Alcaide, M. L., Chokekijchai, S., Roy, B. M., Amold, E., Yarchoan, R. e Mitsuya, H. Emergence of human immunodeficiency virus type 1 variants with resistance to multiple dideoxynucleosides in patients receiving therapy with dideoxynucleosides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, 92: 2398-2402. 10. Larder, B. A. 3,-Azido-3,-deoxythymÍdine resistance suppressed by a mutation conferring human immunodeficiency virus type 1 resistance to nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrob. Agents Chemother. dezembro de 1992; 36(12): 2664-2669. 11. Larder, B. A. Interactions between drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J. Gen. Virol. maio de 1994; 75 (Pt 5): 951-957. 12. Boucher, C. A., Cammack, N., Schipper, P., Schuurman, R., Rouse, P., Wainberg, Μ. A., Cameron, J. M. High-level resistance to (-) enantioméric 2 ’-deoxy-3 ’-thiacytidine in vitro is due to one amino acid substitution in the catalytic site of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents Chemother. outubro de 1993; 37(10): 2231-2234.

Tabela I, Comparação do Efeito de Inibidores de não nucieosídeos sobre a RT do HIV-1 Recombinante com Mutações Definidas. * Dados fenolípicos: S = sensível, L = resistência de baixo nível (aumento de 2 a 10 vezes na dose inibidora), I = resistência intermediária (aumento de 10 a 100 vezes), H = resistência de alto nível (aumento > 100 vezes). Jnd não feito.

Tabela 2, Comparação do Efeito de AZT-TPe d4T sobre a RT do HIV-1 Recombinante com Mutações Definidas. * Dados fenotípicos: RS = as mutações são a re-sensibilização do vírus resistente. S = sensível, L = resistência de baixo nível, 1 = resistência intermediária, H = resistência de alto nível. and não feito.

Tabela 3: Efeito das NRTIs sobre a RT do HIV Recuperada do Plasma do Paciente * Heterogenicidade na sequência V179T/A/I.

Tabela 4. Efeito de AZT-TP e D4t-Tp sobre a RT do HIV Recuperada de Plasma de Paciente #Não determinado por causa de irregularidades no perfil. *A RT na amostra 656 tanto tinha uma substituição L100I quanto uma M184V que é conhecida por dar a re-sensibilização (Ver ref. 12). a'Esta RT contém uma inserção T69S—>SS. a'Esta RT contém uma inserção T69S—>SS.

Claims (8)

1. Método para testar a suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado com vírus envelopado, mediante teste em uma polimerase contida em um vírus envelopado, recuperado de uma amostra biológica do referido indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar, à amostra, um agente de inativação cnzimáticaselccionado a partir de agentes modifícadores de cisteína, para inativar a atividade de polimerase outra que não aquela presente no vírion envelopado, b) purificar e concentrar o vírus envelopado através da remoção de anticorpos bloqueadores de atividade enzimática, inibidores da atividade enzimática endógenos, medicamentos antivirais presentes e o agente inativador de enzima, c) lísar a partícula viral para liberar a polimerase contida no interior do referido vírus envelopado, d) recuperar a polimerase viral purificada concentrada resultante de c) e determinar o perfil de sensibilidade ao medicamento do indivíduo a partir da enzima recuperada mediante o uso de ensaios sensíveis de polimerase.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um ser humano.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra de plasma.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vírus envelopado é um retrovírus.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o retrovírus é um vírus da imunodeficiência humana (HIV), e a enzima é uma transcriptase reversa (RT) de HIV.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o perfil de sensibilidade ao medicamento do indivíduo é usado para selecionar a terapia de tratamento do medicamento para o indivíduo.

8. Embalagem comercial para testar a suscetibilidade fenotípica a medicamento em um indivíduo mamífero infectado com um vírus envelopado conforme método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende , e um agente inativador de enzima, selecionado a partir de agentes modificadores de cisteína, para inativar a atividade de polimerase, um ensaio de atividade de polimerase, e pelo menos um medicamento anti-viral de referência.