EA006161B1 - Тестирование чувствительности вирусов к лекарству - Google Patents
Тестирование чувствительности вирусов к лекарству Download PDFInfo
- Publication number
- EA006161B1 EA006161B1 EA200301244A EA200301244A EA006161B1 EA 006161 B1 EA006161 B1 EA 006161B1 EA 200301244 A EA200301244 A EA 200301244A EA 200301244 A EA200301244 A EA 200301244A EA 006161 B1 EA006161 B1 EA 006161B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- enzyme
- drug
- individual
- hiv
- virus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Описан способ тестирования фенотипической чувствительности к лекарству у инфицированного оболочечным вирусом индивидуума, представляющего собой млекопитающее, путем тестирования по ферменту, упакованному в оболочечный вирус, такой как ВИЧ, выделенный из биологического образца, например крови или плазмы, указанного индивидуума. Способ включает стадии а) к образцу добавляют агент, инактивирующий фермент, для инактивации полимеразной активности, отличной от той, которая присутствует в оболочечном вирионе; б) удаляют агент, инактивирующий фермент, антитела, блокирующие ферментативную активность, эндогенные ингибиторы ферментативной активности и противовирусные лекарства; в) осуществляют лизис вирусных частиц с высвобождением фермента; г) выделяют концентрированный очищенный вирусный фермент, например обратную транскриптазу ВИЧ, полученный на стадии (в), и определяют профиль чувствительности к лекарству у индивидуума на основе выделенного фермента с помощью чувствительных ферментных анализов. Профиль чувствительности к лекарству может быть использован для выбора лекарственной терапии. Включен коммерческий комплект.
Description
Настоящее изобретение относится к тестированию чувствительности вирусов к лекарству, в частности, к способу тестирования фенотипической чувствительности к лекарству подвергающегося лекарственной терапии индивидуума, инфицированного оболочечным вирусом, например индивидуумамлекопитающего, инфицированного ретровирусом, например вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-
1), путем тестирования по ферменту, упакованному в оболочечный вирус, выделенный из биологического образца, полученного от упомянутого выше индивидуума.
Предшествующий уровень техники
Чувствительность ВИЧ к лекарству связана с реакцией вируса на новые способы лечения. Сейчас имеются стандартные тесты на устойчивость к лекарству, и данные клинических испытаний позволяют предполагать, что применение тестирования на устойчивость к лекарствам может быть связано с улучшением исходов вирусной инфекции. Однако устойчивость к лекарствам сложна с точки зрения осуществления, интерпретации и клинического применения.
Фенотипические тесты определяют способность изолята ВИЧ расти в присутствии лекарственного средства и осуществляются с применением анализов, в которых оценивается степень ингибирования репликации вируса при разных концентрациях лекарственного средства. Результаты используют для расчета 50%- или 90%-ной ингибирующей концентрации лекарства для данного изолята. Проблема, которая может возникнуть при проведении классического фенотипического анализа, состоит в наличии генетического дрейфа в вирусной популяции в процессе выделения вируса. В худшем случае выделенный вирусный клон представляет собой клон, который наиболее приспособлен к росту в условиях ίη νίίτο и не является клоном, наиболее распространенным у пациента.
Определение фенотипической чувствительности к лекарству можно в настоящее время осуществлять с помощью автоматизированных анализов, основанных на технологии рекомбинантной ДНК. Эти подходы включают амплификацию плазматической РНК, кодирующей ВИЧ-протеазу и обратную транскриптазу (гс\'СГ5С ШшкепрЫкс. ВТ), и получение рекомбинантного вируса с другими генами из лабораторной конструкции (вирусной кассеты) [1]. Генотипические анализы определяют наличие определенных мутаций в генах, являющихся мишенью для противоретровирусных лекарств. В то время как фенотипическая устойчивость определяет чувствительность вируса к лекарству, генотипирование определяет мутации, которые придают вирусу фенотипическую устойчивость. ПЦР-амплификация (ПЦР - полимеразная цепная реакция) последовательностей ВИЧ-1 из плазмы, содержащей от 500 до 1000 копий РНК на мл, является начальным этапом в обоих этих анализах и в фенотипических анализах рекомбинантных вирусов. В зависимости от предполагаемых мутаций и лабораторных условий осуществления теста, генотипические анализы могут различать мутант на уровне от 10 до 50% в смеси вирусов. Комплексность данных, полученных в результате секвенирования, привела к трудностям в интерпретации результатов. Могут существовать различия в интерпретации, касающиеся уровня фенотипической устойчивости, которая обусловлена специфическим характером мутаций. Когда появляются новые данные, существует риск предоставления неадекватной или даже некорректной их интерпретации [2]. Для всех использовавшихся до сих пор антиретровирусных лекарств механизм реакции состоит во вмешательстве в ферментативную реакцию, осуществляемую либо вирусной протеазой, либо ВТ. В зависимости от производительности ферментных анализов и использующихся методов выделения вирусов, тестирование чувствительности к лекарству теоретически можно проводить либо на супернатантах, полученных при выращивании вируса в культуре, первичного посева вируса, либо на препаратах вируса, полученного непосредственно от пациентов.
Тестирование чувствительности к лекарству по ВТ из первичного посева вируса дает два преимущества по сравнению с традиционными тестами на ингибирование репликации вируса. Уменьшается время размножения вируса, и что более важно, будет иметь место меньшая селекция вирусной популяции. В идеале в конце нужно характеризовать фермент, который был выделен непосредственно из вируса, циркулирующего в крови пациента. Преимущество такого подхода заключается в том, что этот образец отражает вирусную популяцию, которая присутствует у пациента во время отбора образца крови. До сих пор это не было осуществлено на практике, но эту концепцию изучали путем тестирования устойчивости с помощью Атр-ВТ ПЦР-анализа [3].
ВТ ВИЧ-1, а также другие обратные транскриптазы осуществляют три разные ферментативные реакции: РНК-зависимую ДНК-полимеризацию, ДНК-зависимую ДНК-полимеризацию и разрушение РНК в гибриде ДНК-РНК (РНКазаН). ВТ ВИЧ, кодируемая геном ро1, представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединиц р66 и р51. Как РНК-зависимая ДНК-полимеризация, так и ДНК-зависимая ДНКполимеризация осуществляются одним и тем же активным сайтом, находящимся в субъединице р66. Субъединица р51 получается путем удаления С-концевого фрагмента р66, соответствующего домену РНКазы Н [4]. Все ингибиторы ВТ, одобренные в настоящее время для клинического применения, ингибируют полимеразную активность этого фермента. Механизм реакции этих лекарств был определен в основном по их действию на реакцию РНК-зависимой ДНК-полимеризации. Влияние на реакцию ДНКзависимой ДНК-полимеризации является сравнительно менее изученным.
Стандартный анализ ВТ-активности осуществляют с использованием искусственной матричнопраймерной конструкции и меченного дезоксинуклеотидтрифосфата в качестве нуклеотидного субстра- 1 006161 та. Матрично-праймерная пара поли(тА)/олиго(бТ) является наиболее эффективной и чаще всего применяемой комбинацией для определения ЯТ ВИЧ, а также других ретровирусных ЯТ. Недостаток этого вида анализа, когда речь идет о тестировании чувствительности к лекарству, состоит в том, что могут быть протестированы только ненуклеозидные аналоги или аналоги, которые могут спариваться с гА. Аналоги других нуклеотидных оснований требуют анализа на основе вариабельной полимерной матрицы.
Все антиретровирусные лекарства, одобренные до настоящего времени, препятствуют ферментативной реакции, осуществляемой либо вирусной протеазой, либо ЯТ. Кроме того, в разработке находятся кандидаты в лекарственные средства, которые действуют на функцию ретровирусной интегразы.
ЯТ-Ингибиторы представляют собой либо нуклеозидные аналоги, либо ненуклеозидные аналоги. Ненуклеозидные ингибиторы связываются с гидрофобным карманом в ферменте ЯТ, близким к активному сайту, но не соприкасающимся с ним. Репликация ВИЧ-1 ингибируется аллостерически путем смещения каталитических остатков аспартата относительно сайта связывания полимеразы. Устойчивость обычно появляется быстро, если ненуклеозиды применяют в виде монотерапии или при наличии неполной супрессии вируса. В настоящее время только три ненуклеозидных ингибитора: невирапин, ифавиренц и делавирдин одобрены для клинического применения Комитетом США по контролю за продуктами питания и лекарствами (ΕΌΆ).
Нуклеозидные ингибиторы, применяемые сегодня, останавливают элонгацию ДНК-цепи, так как у них отсутствует З'-гидроксильная группа. Длительная терапия нуклеозидными ингибиторами часто приводит к развитию устойчивых вирусов. Этот процесс связан с постепенным появлением мутаций в вирусном гене ро1, каждая из которых приводит к определенным аминокислотным заменам [5]. Эффекты этих замен на ферментативных уровнях являются сложными и включают усиление функции коррекции первичной ДНК. Эта реакция является нуклеотидзависимой и образует динуклеозид полифосфат и З'конец ДНК, допускающий удлинение [6].
ВИЧ-терапия сегодня базируется на мультилекарственной терапии. Схемы лечения основаны на комбинации всех трех имеющихся типов лекарств: нуклеозидных аналогов, ненуклеозидных аналогов и ингибиторов протеазы. Стратегия заключается в сведении к минимуму вероятности выживания мутантного вируса. Сталкиваясь с неудачами вирусологии, современные руководства по терапии рекомендуют переключение на совершенно новую группу лекарств. Эта рекомендация является бесполезной, поскольку для многих ВИЧ-инфицированных людей не имеется трех или более неопробованных лекарств, из которых можно выбирать. Кроме того, может быть также нерациональным решение отменить лекарство, которое фактически еще является эффективным. С помощью усовершенствованного тестирования на лекарственную устойчивость можно исключить неэффективное лекарство или лекарства в заданной комбинации.
Описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен способ осуществления тестирования фенотипической устойчивости к лекарству по ферменту, который выделяют непосредственно из образцов плазмы крови пациента. Этот способ основан на комбинации методов выделения вирусных ферментов в значительной степени свободных от их клеточных эквивалентов, с последующим их определением с помощью чувствительных ферментных анализов.
Описанный метод выделения ферментов может быть использован для любого фермента, упакованного в оболочечный вирус, но в настоящем описании его применение только исследуется путем использования ЯТ из плазмы для тестирования устойчивости к лекарству.
Таким образом, один аспект изобретения относится к способу тестирования фенотипической чувствительности к лекарству у инфицированного оболочечным вирусом индивидуума, представляющего собой млекопитающее, путем тестирования по ферменту, упакованному в оболочечный вирус, выделенный из биологического образца, полученного от указанного индивидуума, включающий следующие стадии:
а) к образцу добавляют агент, инактивирующий фермент, для инактивации полимеразной активности, отличной от той, которая присутствует в оболочечном вирионе,
б) удаляют агент, инактивирующий фермент, антитела, блокирующие активность фермента, эндогенные ингибиторы активности фермента и противовирусные лекарства,
в) осуществляют лизис вирусных частиц с высвобождением фермента,
г) выделяют концентрированный очищенный вирусный фермент, полученный на стадии (в), и определяют профиль чувствительности к лекарству у индивидуума на основе выделенного фермента с использованием чувствительных ферментных анализов.
В реализации изобретения индивидуум представляет собой человека.
В предпочтительном на данный момент воплощении биологический образец представляет собой образец крови, например образец плазмы.
В другом предпочтительном воплощении оболочечный вирус представляет собой ретровирус, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В последнем случае предпочтительным ферментом является обратная транскриптаза (ЯТ) ВИЧ.
- 2 006161
Профиль чувствительности к лекарству у индивидуума, полученный по способу настоящего изобретения, может быть использован для подбора лекарств для лечения этого индивидуума. На практике инфицированный оболочечным вирусом индивидуум, являющийся млекопитающим, будет подвергаться тестированию на профиль чувствительности к лекарству в несколько временных точек для наблюдения за развитием инфекции и противовирусным лечением указанного индивидуума.
Изобретение также относится к коммерческому комплекту, включающему письменные инструкции или инструкции на носителе информации для тестирования фенотипической чувствительности к лекарству у инфицированного оболочечным вирусом индивидуума, представляющего собой млекопитающее, в соответствии с настоящим изобретением, агент, инактивирующий фермент, для инактивации полимеразной активности, чувствительный ферментный анализ и по меньшей мере одно рассматриваемое лекарство.
Изобретение далее проиллюстрировано следующими описанием воплощений и графическими материалами, не ограничивающими изобретение.
Содержание ссылочных материалов включено сюда посредством ссылки.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 демонстрирует корреляцию между выделенной КТ ВИЧ-1 и вирусной РНК, определенной с помощью РНК-ПЦР;
фиг. 2 дает примеры зависимости между количеством КТ, использованным в анализах чувствительности к лекарству, и найденными значениями 1С5о. Символы: (◊) Ифавиренц - КТ дикого типа, (♦) Ифавиренц -КТ Ь1001, (о) ΑΖΤ-ΤΡ - КТ дикого типа, (·) ΑΖΤ-ΤΡ-ΚΤ Τ215Υ.
Описание воплощений
Используемая процедура состоит из четырех разных стадий. I). Инактивация полимеразной активности хозяина, которая присутствует в образце, без воздействия на вирусные ферменты, присутствующие в оболочечном вирионе. II). Удаление агента, инактивирующего фермент, антител, блокирующих ферментативную активность, эндогенных ингибиторов ферментативной активности и противовирусных лекарственных средств. III). Выделение концентрированного очищенного вирусного фермента. IV). Определение профиля чувствительности к лекарству выделенного фермента.
(Стадии ^Ш). Протокол выделения вирусной КТ из материала, который содержит антитела, блокирующие КТ, основанного на деструкции растворимых клеточных ферментов с последующим выделением вирусной КТ из миниколонок.
1) . Пометьте пластиковые пробирки объемом 4,5 мл, которые будут использованы. Поместите их в контейнер Nа1деηе. Добавьте 1 мл образца (например, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)плазмы от ВИЧ-инфицированных индивидуумов) в каждую помеченную пробирку. Добавьте 100 мкл 66 мМ раствора 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) в забуференной воде, интенсивно перемешайте и инкубируйте образцы 1 ч при комнатной температуре.
Во время этой процедуры свободные ферменты плазмы разрушаются, тогда как ферменты, находящиеся внутри вирионов, остаются интактными. Вирионы затем могут быть очищены от 5,5'-дитиобис-(2нитробензойной кислоты), антител, блокирующих ферментативную активность, и других веществ, которые могут мешать количественному определению вирусной КТ, с использованием нескольких процедур выделения. Приведенный ниже протокол основан на применении геля Ргае1оде1® ΕΜΌ ΤΜΑΕ Н1сар.
2) . Осторожно суспендируйте гель для разделения и перенесите по 1500 мкл суспензии геля в каждую пробирку с предварительно обработанным образцом.
3) . Инкубируйте образцы с суспензией геля в течение 90 мин при комнатной температуре, причем пробирки лежат горизонтально на орбитальном шейкере.
4) . Пометьте необходимое количество пластиковых миниколонок объемом 10 мл для идентификации анализируемых образцов. Установите колонки в устройство для промывки колонок, т.е. в вакуумный коллектор для твердофазной экстракции 8ире1со Каргер. Перенесите содержимое пробирок, предназначенных для связывания, в соответствующие колонки. До переноса в течение короткого периода времени интенсивно перемешайте содержимое пробирок для равномерного распределения геля.
5) . Когда все колонки будут заполнены, подсоедините вакуум и высушите гели. Отключите вакуум и начните промывку, заполняя каждую колонку 9 мл буфера А. Когда все колонки будут заполнены, подсоедините вакуум и высушите гели.
6) . Повторите стадию 5 еще три раза, сделав в целом четыре промывки. Высушивайте гели после каждой промывки. После вакуумного высушивания гелей после четвертой промывки отключите вакуум и переходите к стадии 7.
На стадии промывки из системы удаляются несвязанные антитела, блокирующие КТ, и 5,5'дитиобис-(2-нитробензойная кислота).
7) . Добавьте ко всем высушенным гелям по 9 мл кондиционирующего буфера (В). Через 1 мин подсоедините вакуум и высушите гели.
8) . Повторите стадию 7. До отключения вакуума проверьте, чтобы кондиционирующий буфер (В) был полностью удален из всех гелей.
- 3 006161
9) . Снимите верхнюю часть устройства для промывки колонок. Установите держатель с помеченными пробирками в чистый контейнер. Установите верхнюю часть этого устройства на прежнее место. Проследите, чтобы маленькие трубки от каждой колонки опустились в соответствующие им пробирки.
10) . Добавьте 600 мкл лизирующего буфера (С) в каждую колонку. Оставьте колонку стоять с буфером 5 мин. Затем подсоедините медленный вакуум и высушите гели. В каждой пробирке эта процедура даст приблизительно по 600 мкл вирусного лизата из соответствующего геля.
ЯТ-активность, полученная в лизатах на стадии 10, по существу, свободна от антител, блокирующих ЯТ, лекарственных средств и клеточной полимеразной активности, и она может быть количественно определена с помощью чувствительного анализа ЯТ-активности, т.е. с помощью ί,'ανίάί Н8-кй Ьеий ЯТ, который основан на методе, описанном ЕкЦтапб е( а1. [7]. Для определения ЯТ-активности в образце достаточно 25 мкл лизата, полученного согласно настоящему протоколу. Оставшиеся 575 мкл образца следует заморозить при температуре -70°С или ниже для последующего использования в тесте на чувствительность к лекарству.
Замечание: Ферменты ЯТ, которые нечувствительны к цистеин-модифицирующим агентам, например ЯТ ВИЧ-1 дикого типа, можно по выбору анализировать в присутствии вплоть до 5 мМ 5,5'дитиобис-(2-нитробензойной кислоты). С другой стороны, чувствительные ферменты, такие как ЯТ вируса МиЬУ (вируса лейкоза мышей Молони) и ЯТ из определенных устойчивых к терапии штаммов ВИЧ-1 (содержащих, например, мутацию У181С), требуют добавления в лизирующий буфер сульфгидрильного восстановителя, т. е. цистеина или цистеамина.
(Стадия IV). Протокол определения чувствительности к лекарству ЯТ-активности в лизатах.
Модифицированный колориметрический анализ ЯТ (Сау1б1® Н8-кй Ьеий ЯТ), доступный от фирмы Сау1б1 Теей (Ирр8а1а, Елтебеп). использовали для определения уровня ЯТ-активности в исследуемых вирусных препаратах. Кратко, поли(гА), ковалентно связанный с лунками 96-луночного микропланшета для титрования, служит в качестве матрицы для включения 5-бромдезоксиуридин-5'-трифосфата (ВгбиТР) во время стадии обратной транскрипции, осуществляемой при 33°С. Количество бромдезоксиуридин-монофосфата (ВтбИМР), включенного в ДНК, определяют с помощью щелочной фосфатазы (а1кайпе рйо8рйа1а8е, АР), конъюгированной с анти-Вгби-моноклональными антителами. И наконец, для флуориметрического определения используют 4-метилумбеллиферилфосфат - субстрат для АР. Количество ЯТ в изоляте, использованное для определения 1С50, было стандартизировано для нуклеозидных аналогов относительно активности, соответствующей 5 фг (4,3 х 10-20 моль) контрольной ЯТ ВИЧ-1 на лунку, тогда как для ненуклеозидных аналогов использовали 1,7 фг (1,5 х 10-20 моль) ЯТ. Лизаты разводили в «ложных лизатах», т.е. лизатах, полученных после «ложного» разделения фетальной телячьей сыворотки.
Исследования ингибирования ЯТ проводили с помощью двух разных модифицированных версий Н8 Ьепй ЯТ-анализа.
Делали серийные разведения ненуклеозидных аналогов в стадиях пятикратного разведения в реакционной смеси для ЯТ, и аликвоты по 25 мкл переносили в каждую лунку микропланшета для титрования, смешивая с 125 мкл реакционной смеси для ЯТ, и ферментативную реакцию инициировали добавлением 25 мкл разведенного лизата. Конечная концентрация нуклеотидного субстрата (ВгбиТР) составляла 16 мкМ, а количество праймера (обТ22) - 12 нг на лунку. Делали серийные разведения аналогов бТ в стадиях пятикратного разведения в реакционной смеси для обрыва цепи, и аликвоты по 25 мкл переносили в каждую лунку микропланшета для титрования, смешивая с 125 мкл реакционной смеси для обрыва цепи ЯТ, и ферментативную реакцию инициировали добавлением 25 мкл разведенного лизата. Конечная концентрация нуклеотидного субстрата (ВгбиТР) составляла 1,5 мкМ, а количество праймера (обТ22) - 12 нг на лунку. Как для нуклеозидных, так и для ненуклеозидных ЯТ-ингибиторов ЯТ-реакции давали идти в течение ночи (16-24 ч при 33°С). После этого реакцию прекращали, промывая планшет. Значение 1С50 определяли как концентрацию лекарственного средства, которая дает 50%-ное ингибирование исследуемой ЯТ-активности.
Материалы.
Гель для разделения: например, Етас!оде1® ΕΜΌ ТМАЕ или Етас!оде1® ΕΜΌ ТМАЕ Н1сар в 314 мМ 2-(Ы-морфолино)этансульфоновой кислоты (МЕ8), рН 5.1, 413 мМ иодида калия и с 0,5 мг/мл гепарина.
Миниколонки, например, Вютаб Ро1у-Ргер® (7311553).
Устройство для промывки миниколонок, т.е. вакуумный коллектор для твердофазной экстракции 8цре1со бартер.
Пластиковые пробирки, например, криогенные пробирки Ыипс объемом 4,5 мл.
Микропланшеты для титрования с иммобилизованным ргА, т.е. №11де Ыипс ЫискоЕшск®.
Цистеин-модифицирующий агент, например, 66 мМ 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) в воде, забуференной 0,87 М ТЙ8(гидроксиметил)аминометана (рН 8,3).
Мягкий сульфгидрильный восстановитель, например, 33 мМ цистеамина в воде.
- 4 006161
Противовирусные лекарственные препараты.
3'-Азидо-2',3'-дезокситимидинтрифосфат (ΑΖΤ-ΤΡ) и (2',3'-дидегидро-3'-дезокситимидинтрифосфат (64Τ-ΤΡ) были закуплены у фирмы Могауек В1оскет1са1к (СакГогша). Невирапин: (11-циклопропил-5,11дигидро-4-метил-6Н-дипиридо[3,2-Ь:2',3'-Г][1,4]диазепин-6-он) (КУР, №у1гарше); делавиридин: 1-(5метансульфонамидо-1Н-индол-2-илкарбонил)-4-[3-(1-метилэтиламино)пиридинил]пиперазинмонометана сульфонат (ПЬУ, Иехаушбте); и ифавиренц: (-)6-хлор-4-циклопропилэтинил-4-трифторметил-1,4дигидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он) (ЕРУ, Е Гауке их) были закуплены у фирмы Аро1еккЬо1аде1 (Иррка1а, 8^ебеи).
Образцы плазмы от ВИЧ-инфицированных индивидуумов.
Образцы плазмы получали, соответственно, от пациентов, не подвергавшихся лечению, или от пациентов, подвергающихся обычной комбинированной терапии. Закодированные образцы доставляли замороженными в виде двух различных панелей, представляющих пациентов с устойчивостью, соответственно, к ΝΝΒΤΙ (иои-иис1еок1бе ΒΤ 1иЫЬйогк - ненуклеозидные ΒΤ-ингибиторы) и к Т-аналогам. Количество РНК ВИЧ-1 в каждом образце определяли с помощью стандартного ПЦР-анализа РНК ВИЧ-1 (СоЬак, Воске О1адиоккса), и присутствующий вирусный генотип анализировали с помощью набора для генотипирования ВИЧ-1 ΤΒυΟΕΝΕ™ (У1К1Ь1е Оеиекск).
Рекомбинантные ферменты ΒΤ.
Были получены устойчивые к ΝΝΒΤΙ мутантные формы ΒΤ (Ь1001, Κ103Ν, Ε100Ι/Κ103Ν, У181С). В качестве матрицы для мутаций использовали вектор экспрессии ρΕΤΒΤ, который был сконструирован из изолята ВН10. Мутации осуществляли с использованием имеющихся в продаже наборов для сайтнаправленного мутагенеза ОшкСкаиде (81га!адеие). Наличие мутаций подтверждали с помощью анализа последовательности ДНК. Мутантные и нативные формы ΒΤ выделяли как описано ранее [8].
Рекомбинантные ΒΤ с мутациями, специфичными в отношении ΑΖΤ, получали путем введения мутации в участок, кодирующий ΒΤ, в ΕсоΒI-NбеI-рестрицированного фрагмента штамма НХВ2-Э дикого типа, клонированного в векторе экспрессии рКК233-2 (Атегккат Вю(еск). Мутации производили с использованием имеющихся в продаже наборов для осуществления сайт-направленного мутагенеза ОшкСкаиде (81га1адеие). Клонированные мутантные векторы экспрессии вводили путем трансформации в клетки штамма Е.сок ХЬ1-В1ие и генотипы подтверждали с помощью анализа последовательности ДНК.
Используемые буферы.
A) . Буфер для промывки: 20 мМ МЕ8, рН 5.4, 500 мМ ацетата калия (КАс).
Б). Кондиционирующий буфер. Буфер, совместимый с ΒΤ-анализом, например, 50 мМ Ν-2гидроксиэтилпиперазин-Ы'-(2-этансульфоновой кислоты) (Нерек), рН 7.6, 25 мМ ацетата калия, 20 мМ хлорида магния (МдС12), 0,2 мМ этиленгликоль-бис-в-аминоэтилового эфира Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 2 мМ спермина и 0,5 мг/мл термоинактивированного бычьего сывороточного альбумина (БСА).
B) . Лизирующий буфер. Буфер, совместимый с ΒΤ-анализом, включающий детергент, например, 1,25% полиоксиэтилен-4-лаурилового эфира (Вгу 30), 13 нг/мл оДГ22 и те же компоненты, что и в кондиционирующем буфере (В). Сульфгидрильный восстановитель, т.е. 0,2 мМ цистеамина, добавляют по выбору при осуществлении процедур с вирусами с ΒΤ, которая чувствительна к 8Нокислению/модификации.
Г). Реакционная смесь для ΒΤ, например, 10 мМ Нерек, рН 7.6, 19 мкМ Вгби'ГР, 80 нг/мл оДГ22, 4мМ МдС12, 0,5 г/л декстрансульфата, 2 мМ спермина, 0,5% (об./об.) Τη®!! Х100, 0,2 мМ ЭГТА и 0,5 мг/мл БСА.
Д). Реакционная смесь для обрыва цепи: 10 мМ Нерек, рН 7.0, 1,75 мкМ ВрбиБР, 80 нг/мл об^, 10 мМ МдС12, 7 мМ АТР, 0,05 г/л декстрансульфата, 2 мМ спермина, 0,5% (об./об.) ЧиФи Х100, 0,2 мМ ЭГТА и 0,5 мг/мл БСА.
Примеры
Пример 1. Корреляция между выделенной ΒΤ ВИЧ-1 и вирусной РНК, определенной с помощью РНК-ПЦР.
Образцы ЭДТА-плазмы объемом 1 мл от ВИЧ-инфицированных индивидуумов обрабатывали в соответствии с Протоколом выделения вирусной ΒΤ из материала, который содержит антитела, блокирующие ΒΤ, основанного на разрушении растворимых клеточных ферментов с последующим выделением вирусной ΒΤ из миниколонок и количество ΒΤ-активности, выделенной из каждого образца, определяли в течение ночи в ΒΤ-анализе с использованием набора Сау1б1® Ηδ-Κίΐ Ьеик ΒΤ. Полученные ΒΤактивности были пересчитаны в фемтограммы (фг) ΒΤ ВИЧ-1 на мл плазмы в соответствии с внутренней стандартной кривой. Количество РНК ВИЧ-1 в каждом образце определяли с помощью стандартного ПЦР-анализа РНК ВИЧ-1 (Лоске Атрксог). Наблюдение ограничивается образцами с выходами ПЦР >500 копий/мл. Была обнаружена строгая корреляция между количеством выделенной ΒΤ плазмы и количеством РНК ВИЧ, определенным с помощью ПЦР (г = 0.93, и = 33, р<< 0,001). См. фиг. 1.
Из этого примера можно сделать вывод, что обработка 1 мл плазмы индивидуума, содержащего
50000 копий РНК ВИЧ на мл плазмы, приведет к выделению примерно 200 фг ΒΤ-активности. При ис- 5 006161 пользовании 1,7 фг ВТ на тест, указанное количество соответствует 118 тестам, которые можно использовать для определения профиля чувствительности выделенной ВТ к лекарству.
Пример 2. Влияние количества ВТ, используемой в тестах на чувствительность к лекарству.
Действие ΝΝΒΤΙ, ΑΖΤ-ΤΡ и Й4Т-ТР на указанную рекомбинантную ВТ ВИЧ-1 определяли в соответствии с Протоколом определения чувствительности к лекарству ВТ-активности в лизатах с использованием указанных концентраций ВТ. На фиг. 2 приведены примеры зависимости между количеством ВТ, используемой в анализах чувствительности к лекарству, и найденными значениями 1С50. Значения 1С50 для NNВΤI, таких как ифавиренц, совсем не подвергались влиянию изменения количества ВТ в пределах исследуемого диапазона. Среди исследуемых NВΤI, ΑΖΤ-ΤΡ демонстрирует наибольшее варьирование в зависимости от количества ВТ, включенного в анализ. Это варьирование было максимальным для ВТ дикого типа, и 1С50 увеличилась от 0,13 до 0,22 мкМ при увеличении количества ВТ от 2 до 162 фг/лунка (фиг. 2).
Количество ВТ-активности, имеющейся в образцах плазмы, устанавливает ограничения для данных тестов. Для получения воспроизводимых значений 1С50 для исследуемых лекарств требуется сигнал, превышающий фоновый сигнал по меньшей мере в пять раз. Низкая вариабельность значений 1С50 при увеличении количества ВТ делает возможным определение чувствительности к лекарству без предварительной калибровки количества ВТ, используемого в каждом анализе.
Пример 3. Сравнение действия ненуклеозидных ингибиторов на рекомбинантную ВТ ВИЧ-1 с определенными мутациями.
Действие трех ненуклеозидных ингибиторов на указанную рекомбинантную ВТ ВИЧ-1 определяли в соответствии с Протоколом определения чувствительности к лекарству ВТ-активности в лизатах. Количество каждой ВТ было стандартизовано для того, чтобы их активность соответствовала активности 1,7 фг/лунку нашей контрольной ВТ. Длительность ВТ-реакции составляла 19 ч, и полученные активности были пересчитаны в % от активности той же самой ВТ, инкубированной в отсутствие ингибитора.
Фенотипические данные были взяты из литературы (базы данных 1п1егпайоиа1 ап1п'йа1 пе\\ъ и 1Шр://51апГогй.ейи/1и\') (табл. 1).
В основном имела место строгая корреляция между значениями 1С50 из анализа ингибирования ВТ и фенотипическими данными из литературы. Всегда можно было различить ВТ от вирусов с высокой или средней устойчивостью (табл. 1).
Пример 4. Сравнение действия аналогов ЙТ на рекомбинантную ВТ ВИЧ-1 с определенными мутациями.
Действие ΑΖΠΈΡ и Й4Т на указанную рекомбинантную ВТ ВИЧ-1 определяли в соответствии с Протоколом определения чувствительности к лекарству ВТ-активности в лизатах. Количество каждой ВТ было стандартизировано для того, чтобы их активность соответствовала активности 5 фг/лунка контрольной ВТ. Длительность ВТ-реакции составляла 19 ч, и полученные активности были пересчитаны в % от активности той же самой ВТ, инкубированной в отсутствие ингибитора.
Фенотипические данные были взяты из литературы (базы данных 1и1егиайоиа1 αηΙίνίΓαΙ пе\\ъ и 1Шр://51апГогй.ейи/1иу) (табл. 2).
Реакционная смесь для обрыва цепи, используемая для определения чувствительности к Таналоговым лекарствам, должна обладать способностью поддерживать энергозависимую реакцию фосфоролиза. К сожалению, эффективность реакции фосфоролиза сразу же проявляется в уменьшении скорости полимеризации и, как следствие, также в уменьшении чувствительности определения. Поэтому данный анализ требует большей ВТ-активности по сравнению с соответствующим анализом для NNВΤI. Другим следствием является то, что диапазон между устойчивыми и чувствительными ВТ меньше, чем в NNВΤI-анализе. Однако в целом имела место строгая корреляция между значениями 1С50 из анализа ингибирования ВТ и фенотипическими данными из литературы. Всегда можно было различить ВТ от вирусов с высокой или промежуточной устойчивостью (табл. 2).
Пример 5. Определение чувствительности к NNВΤI с использованием выделенных из плазмы ВТ.
Образцы плазмы объемом 1 мл от 17 ВИЧ-инфицированных индивидуумов из Стокгольма (Швеция) обрабатывали в соответствии с Протоколом выделения вирусной ВТ из материала, который содержит антитела, блокирующие ВТ, основанного на деструкции растворимых клеточных ферментов с последующим выделением вирусной ВТ из миниколонок. 15 из них содержали достаточное количество ВТ для осуществления тестирования на чувствительность к лекарству. Выходы ПЦР для этих образцов составляли 17000 копий/мл или больше. Каждую ВТ плазмы и два контрольных фермента титровали относительно ряда серийных разведений невирапина, ифавиренца и делавирдина в соответствии с Протоколом определения чувствительности к лекарству ВТ-активности в лизатах.
Используя ВТ-активность из каждого выделения ВТ, соответствующую 1,7 фг/лунку контрольной
ВТ ВИЧ-1, авторы изобретения обнаружили, что 7 образцов из 15 содержали ВТ, которые были высоко устойчивы ко всем трем NNВΤI (табл. 3). Все имели замену Κ103Ν или, в одном случае, (образец 656) комбинацию замен Α98Ο и У181С в их генах, кодирующих ВТ. Восемь образцов были чувствительны ко всем трем ΝΝΡΠ. Шесть из них не имели релевантных мутаций в их генах ВТ, тогда как оставшиеся два
- 6 006161 имели либо У1791, либо νΐ79Τ/Α/Ι мутации, про которые не известно, что они влияют на чувствительность к ΝΝΒΤΙ.
Пример 6. Определение чувствительности к ΑΖΤ-ΤΡ и 64Τ-ΤΡ с использованием выделенных из плазмы ВГ.
Образцы плазмы объемом 1 мл от 27 ВИЧ-инфицированных индивидуумов из Стокгольма (Швеция) обрабатывали в соответствии с Протоколом выделения вирусной ΒΤ из материала, который содержит антитела, блокирующие ΒΤ, основанного на деструкции растворимых клеточных ферментов с последующим выделением вирусной ΒΤ из миниколонкок. Только 13 из них содержали достаточное количество ΒΤ для осуществления тестирования на чувствительность к лекарству. Выходы ПЦР для этих образцов составляли 43000 копий/мл или больше. Каждую ΒΤ плазмы и два контрольных фермента титровали относительно ряда серийных разведений ΑΖΤ-ΤΡ и 44Τ-ΤΡ в соответствии с Протоколом определения чувствительности к лекарству ΒΤ-активности в лизатах. См. табл. 4.
Используя ΒΤ-активность из каждого выделения ΒΤ, соответствующую 5 фг/лунку контрольной ΒΤ ВИЧ-1, и реакционную смесь для обрыва цепи, авторы обнаружили, что значения 1С50 для обоих лекарств увеличивались параллельно с накоплением мутаций, про который известно, что они вовлечены в устойчивость к ΝΒΤΙ (табл. 4). Мутации Ό69Ν или Μ184ν сами по себе, как и ожидалось, не приводили к увеличению значений 1С50. Образцы 656 и 1320 содержали ΒΤ, которые, несмотря на наличие нескольких аминокислотных замен, про которые известно, что они влияют на устойчивость к ΝΒΤΙ, проявляли промежуточные значения 1С50 как для ΑΖΤΤ-ΤΡ, так и для 44Τ-ΤΡ. Было обнаружено, что эти изоляты также содержат замены У181С или Μ184ν, которые, как известно, вызывают повторную сенсибилизацию в отношении Т-аналоговых лекарств. Две ΒΤ в этой панели проявляли значения 1С50, которые превышали по меньшей мере в 20 раз контрольную ΒΤ дикого типа (табл. 4). Одна из них имела набор аминокислотных (а.к.) вставок, характерных для комплекса Ο151Μ [8], а другая содержала классическую замену Κ70Β и, кроме того, замену Ь2108. Применяя значения 1С50 1 мкМ и 0,1 мкМ границы для ΑΖΤ-ΤΡ и 44Τ-ΤΡ. соответственно, можно классифицировать указанные экстракты как содержащие 9 чувствительных и 4 устойчивых ΒΤ, что согласуется с результатами генотипического анализа.
Список литературы
1. Ρеΐ^οροи1οк С.Ц йаткт Ν.Τ. Ышо11 К.Ь., Ые Υ.8., \Упп Τ., Ниапд V., Пап Н., 8тйй И., МпкЕ»· Ο.Α., Сароп Ό.Τ, ^Ы1еошЬ Ι.Μ. Α поуе1 рйепо1урю бгид киксербЬййу аккау Тог йитап 1ттипо4ейс1епсу у1Ш8 1уре 1. ЛпНписгоЬ ЛдепЦ СйетоШег. 2000 Αρτ; 44(4): 920-8.
2. П1е ЕитодшбеНпек Отоир Тот Ηΐν тек1к1апсе. С11шса1 апб 1аЬога!огу дшбейпек Тот 1Не ике о! Ηΐν-1 бгид тек181апсе 1екбпд ак рай оТ 1геа1теп1 тападетеп!: гесоттепбайопк Тог !йе Еигореап кейтд. ΑΙΌ8. 2001 ГеЬ 16; 15(3): 309-20.
3. Уа/с.|ие/-Ро8а1ек О., Оагша Ьетта 1.С., Υататοΐο 8., 8\\йхег ν.Μ., Науйг И., Го1кк Τ.Μ., ИюНтам И.И., Непеше V. Рар|б ксгеешпд оТ рйепо1ур1с тек1к1апсе !о пеуйарте Ьу бйес! апа1ук1к оТ Ηΐν 1уре 1 геуетке ЧапкспрРке асбуйу ш р1акта. ΑΙΌ8 Βек Нит РеЧоуйикек. 1999 8ер 1; 15(13): 1191-200.
4. СоГГ, 8.Ρ. (1990) РеЧоубик геуегке ЧапкспрШке: 8уп1йек1к, 81гис1иге, апб Гипсйоп. Ре\зе\\·. 1 Αс^и^^ Ιιηιη Иейс 8упбг 3: 817-831.
5. Vаηбатте Α.Μ., Vаη УаегепЬещй К., Ие С1егсс| Е. Αηί^-йишаη 1ттипобейс1епсу У1гик бгид сотЬ1пабоп к(га(ед1ек. Αηйν^^Сйеш Сйето!йег. 1998 Μау; 9(3): 187-203.
6. Μеуе^ Ρ.Β., Μаΐкии^а 8.Е., Μίηι·ι Α.Μ., 8о Α.Ο., 8сой ν.Α. Βе1аΐеб ΑτΙκ^. Α тесйашкт оТ ΑΖΤ гекМапсе: ап тсгеаке т пис1еойбе-берепбеп! рптег ипЫоскшд Ьу ти1ап1 НI ν-1 геуегке ЧапкспрШке. Μο1 Се11. 1999 1и1; 4(1): 35-43.
7. ЕккЧапб И.Н., Α^ι6 Β.Γ, Ка11апбег С.Е., Сгопо\\й/ 1.8. Α кепкйтуе аккау Тог !йе циапййсабоп оТ геуегке ЧапкспрШке асйуйу Ьакеб оп !йе ике оТ сатег-Ьоипб 1етр1а1е апб поп-габюасйуе-ргобис! бе!есйоп, χνίΐΐι крес1а1 ге Тетенсе !о йитап-1ттипобейс1епсу-У1гик 1ко1абоп. Вю1есйпо1 ΑρρI Вюсйет. 1996 Αι^·; 23 (Ρ!2): 95-105.
8. ЫпбЬегд 1., 81диге1йккоп 8., йотедгеп 8., О Αηбе^ккοη Н., 8ай1Ьегд С., №гееп Β., ГпбЬотд К., Ζйаηд Н., Ипде Τ. 81гис1ига1 Ьак1к Тог !йе 1пй1Ьйоту еЕйсасу оТ еТауйепх (ΌΜΡ-266), Μ8Ο194 апб ΡΝυ142721 !отеатбк !йе НГУ-1 ΒΤ Κ103Ν шШап!. Еиг 1 Вюсйет. 2002 Унг; 269(6): 1670-1677.
9. 8й1гакака, Τ., Кауйск, Μ.Γ., иепо, Τ., Сао, ν.-Υ., Корта, Е., Α1са^бе, ΜΕ, Сйокекусйац 8., Βοу, Β.Μ., ΑτμΗ, Е., Υа^сйοаη, Β., апб Μйκиуа, Н. Етегдепсе оТ йитап тшшпобеПаепсу У1тик !уре 1 уапап!к \\йй текШапсе !о ншШр1е б1беохупис1еок1бек ш рабеп1к тесе1утд (йегару \\йй б1беохупис1еок1бек. йтос №111 Αсаб 8с1 υ8Α 1995, 92: 2398-2402.
10. Еатбет Β.Α. 3'-Αζ^бο-3'-беοxуΐйут^б^ηе теыйапсе кирргеккеб Ьу а ншИРоп сопТеп-тд йитап 1шшипобейаепсу уиик !уре 1 гек1к1апсе !о поппис1еок1бе геуегке ЧапкспрРке шЫЬйотк. Αηί^т^с^οЬ Αдеηΐк Сйето!йег. 1992 Иес; 36(12): 2664-9.
11. Еатбет Β.Α. 1п1етасбопк ЬеЧтееп бгид текЩапсе ншЮРопк ш йитап 1Н1ншпобеПс1епсу уиик !уре 1 геуегке Чапкспр1аке. 1 Сеп Уйо1. 1994 Μау; 75 (Ρ(5): 951-7.
12. Воисйег ΟΑ., Саттаск Ν., 8сй1ррег Ρ., 8сйии^шаη Β., Βοике Ρ., ’№ашЬетд Μ.Α., Сатегоп Ι.Μ. Н1дй-1еуе1 тек1к1апсе !о (-)еηаηйοше^^с 2'-беоху-3'-11насуРбте т уйго 1к бие !о опе атшо ас1б киЬкШибоп т
- 7 006161 !йе са!а1уйс зйе оГ Китап 1шшипобейс1епсу νΐΓΠ8 !уре 1 геуегзе !гап8спр!азе. Апйш1сгоЬ АцегЖ СйешоШег. 1993 Ос1; 37(10): 2231-4.
Таблица 1 Сравнение действия ненуклеозидных ингибиторов на рекомбинантную КТ ВИЧ-1 с определенными мутациями
| Модификация в анализируемой КТ | Юбп указанного ингибитора в КТ-анализе (мкМ) | Чувствительность соответствующего вируса* | ||||
| Невирапин | Делавиридин | Ифавиренц | Невирапин | Делавиридин | Ифавиренц | |
| И001 | 32 | 9.5 | >4 | 1_ | I | I |
| Κ103Ν | >100 | 3.0 | >4 | н | н | Н |
| Ι-100Ι/Κ103Ν | >100 | >100 | >4 | н | н | Н |
| У181С | >100 | 3.0 | 0.5 | н | н | ί . |
| дикий тип ВН10 | 0.2 | 0.5 | 0.04 | 8 | 8 | 8 |
| дикий тип НхВ2 | 1.7 | 1.6 | 0.12 | 8 | 8 | 8 |
‘Фенотипические данные: 8 = чувствительный, 1_ = Низкий уровень устойчивости (увеличение ингибирующей дозы в 2-10 раз), I = Промежуточная устойчивость (увеличение в 10-100 раз), Н = Высокий уровень устойчивости (увеличение в >100 раз ). апё не делали.
Таблица 2
Сравнение действия ΑΖΤ-ΤΡ и Т4Т на рекомбинантную КТ ВИЧ-1 с определенными мутациями
| Модификация в анализируемой КТ* | Юм ΑΖΤ-ΤΡ в КТ-анализе (мкМ) | 1СМ С14Т-ТР в КТ-анализе (мкМ) | Чувствительность соответствующего вируса | |
| ΑΖΤ | с!4Т | |||
| Τ215Υ | 0.69 | 0.15 | I | ί |
| Μ4ΐυΤ698-88/Ι_210νν/ | ||||
| Κ211Κ/Ι-214Ε/Τ215Υ | 4.0 | 0.49 | н | Η |
| дикий тип НХВ2 | 0.19 | 0.050 | 8 | 8 |
| дикий тип ВН10 | 0.16 | 0.033 | 8 | 8 |
| У181С | 0.15 | 0.033 | КЗ | КЗ |
* Фенотипические данные: КЗ = мутации дают повторную сенсибилизацию устойчивых вирусов. 8 = чувствительный, 1_ = Низкий уровень устойчивости, I = Промежуточная устойчивость, Н = Высокий уровень устойчивости, апс1 не делали.
- 8 006161
Таблица 3 Действие ΝΝΚΤΙ на КТ ВИЧ, выделенную из плазмы пациента
| Код | Выход | фг КТ/мл | 1С» | 1С50 | 1Сбо | Мутации по аминокислоте | |
| паци- | ПЦР | плазмы | ΝνΡ | ЕРУ | ϋΙ.ν | 98 101 103 106 108 179 | 181 |
| ента | |||||||
| (мкМ) | (мкМ) | (мкМ) | А Ь К V V V | Υ |
| 3980 | 542000 | 1056 | 0.65 | 0.09 | 7.51 | * | ||
| 1177 | 73000 | 83 | 0.81 | 0.17 | 4.54 | |||
| 1412 | 17000 | 40 | 0.80 | 0.21 | 3.60 | |||
| 1784 | 17000 | 69 | 0.97 | 0.15 | 8.22 | I | ||
| 1885 | 465000 | 1032 | 0.97 | 0.17 | 8.97 | |||
| 1572 | 105000 | 146 | 2.16 | 0.21 | 9.54 | |||
| 1424 | 245000 | 375 | 2.92 | 0.42 | 8.21 | |||
| 1639 | 431000 | 71 | 3.14 | 0.33 | 12.7 | |||
| 494 | 18000 | 39 | >100 | >4 | >100 | 8 I | N | |
| 622 | 529000 | 400 | >100 | >4 | >100 | I | N | |
| 2098 | >750000 | 5533 | >100 | >4 | >100 | N | н | |
| 2883 | 71000 | 517 | >100 | >4 | >100 | I | N | |
| 3807 | 764000 | 683 | >100 | >4 | >100 | I | N | |
| 656 | >75000 | 1921 | >100 | >4 | >100 | е | с | |
| 1517 | 353000 | 268 | >100 | >4 | >100 | N |
Контроли с рекомбинатными КТ
| 1-1001 | 32 | >4 | 9.5 |
| КТ дикого типа | 1.7 | 0.12 | 1.6 |
'Гетерогенность в последовательности VI79Τ/Α/Ι
Таблица 4
Действие ΑΖΤ-ΤΡ и 64Т-ТР на КТ ВИЧ, выделенную из плазмы пациента
| Код пациента | Выход ПЦР | фг ЕТ/мл плазмы | ΑΖΤ-ΤΡ Ю^мкМ)/ кратность увеличения | |
| 3507* | 54000 | 83 | 0.13 | 0.8 |
| 622 | 529000 | 400 | 0.23 | 1.4 |
| 160 | 363000 | 350 | 0.27 | 1.7 |
| 2098 | >750000 | 5533 | 0.35 | 2.2 |
| 48 | 189000 | 30.8 | 0.47 | 2.9 |
| 181 | 550000 | 831 | 0.50 | 3.1 |
| 807 | 420000 | 294 | 0.50 | 3.1 |
| 662 | 750000 | 4567 | 0.50 | 3.1 |
| 1144 | 110000 | 76.7 | 0.56 | 3.5 |
| 656* | >75000 | 1921 | 1.25 | 7.8 |
| 1320* | 43000 | 420 | 1.32 | 8.3 |
| 393 | 750000 | 388 | 3.2 | 20 |
| 1030 | 207000 | 173 | 3.2 | 20 |
Р4Т-ТР Мутации по аминокислотам___________________________________
1С£0(мкМ)/ 41 44 67 69 70 210 215 219 75 116 118 151 181 184 кратность Μ Е Ц Τ ΚίΤΚνΡνΟΥΜ увели-чения
0.020 0.6
0.028 0.8 N
0.043 1.3
0.048 1.5
0.085 2.6
0.049 1.5
0.070 2.7
0.065 2.0
| Νϋ# | V | ||||||
| 0.17 | 5.2 Ь β N | И | Υ | I | с | ||
| 0.59 | 19.6 | νν | Υ | I | V | ||
| 0.42 | 12.7 | X Υ | м | ||||
| 1.1 | 33 | К 8 |
Контроли с рекомбинатными КТ
| РТ дикого типа | 0.16 | 1.0 | 0.033 | 1.0 | |
| Т698->83а | 4.00 | 25 | 0.49 | 15 Ь | 8-38 |
#Не определено из-за нерегулярности профиля. *КТ в образце 656 имела как Ь1001, таки 181С замены, которые, как известно, дают повторную сенсибилизацию (См. ссылки 10 и 11). КТ в образце 1320 имела замену М184У, которая, как известно, дает повторную сенсибилизацию (См. ссылку 12). “Эта КТ содержит вставку Т698->38.
Claims (8)
1. Способ тестирования фенотипической чувствительности к лекарству у инфицированного оболочечным вирусом индивидуума, представляющего собой млекопитающее, путем тестирования по ферменту, упакованному в оболочечный вирус, выделенный из биологического образца, полученного от указанного индивидуума, включающий следующие стадии:
а) к образцу добавляют агент, инактивирующий фермент, для инактивации полимеразной активности, отличной от той, которая присутствует в оболочечном вирионе,
б) удаляют агент, инактивирующий фермент, антитела, блокирующие ферментативную активность, эндогенные ингибиторы ферментативной активности и противовирусные лекарства,
в) осуществляют лизис вирусных частиц с высвобождением фермента,
- 9 006161
г) выделяют концентрированный очищенный вирусный фермент, полученный на стадии (в), и определяют профиль чувствительности к лекарству у индивидуума на основе выделенного фермента с помощью чувствительных ферментных анализов.
2. Способ по п.1, где индивидуум, представляющий собой млекопитающее, является человеком.
3. Способ по п.1 или 2, где биологический образец представляет собой образец крови.
4. Способ по п.3, где образец крови представляет собой образец плазмы.
5. Способ по п.4, где оболочечный вирус представляет собой ретровирус.
6. Способ по п.5, где ретровирус представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и фермент представляет собой обратную транскриптазу (теуегае 1гап5спр1а5с. КТ) ВИЧ.
7. Способ по п.1, где профиль чувствительности к лекарству у индивидуума используют для выбора лекарственной терапии для этого индивидуума.
8. Набор, включающий письменные инструкции или инструкции на носителе информации для проведения тестирования фенотипической чувствительности к лекарству у млекопитающего, инфицированного оболочечным вирусом, в соответствии со способом по любому из пп.1-7, агент, инактивирующий фермент, для инактивации полимеразной активности, комплект для осуществления чувствительного ферментного анализа, и по меньшей мере одно рассматриваемое лекарство.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29776401P | 2001-06-14 | 2001-06-14 | |
| PCT/SE2002/001156 WO2002103040A1 (en) | 2001-06-14 | 2002-06-14 | Viral drug susceptibility testing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200301244A1 EA200301244A1 (ru) | 2004-06-24 |
| EA006161B1 true EA006161B1 (ru) | 2005-10-27 |
Family
ID=23147646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200301244A EA006161B1 (ru) | 2001-06-14 | 2002-06-14 | Тестирование чувствительности вирусов к лекарству |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7875422B2 (ru) |
| EP (1) | EP1395676B1 (ru) |
| JP (1) | JP4455054B2 (ru) |
| CN (1) | CN1539022B (ru) |
| AP (1) | AP1592A (ru) |
| AT (1) | ATE316150T1 (ru) |
| AU (1) | AU2002309447B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0210361B8 (ru) |
| DE (1) | DE60208788T2 (ru) |
| EA (1) | EA006161B1 (ru) |
| ES (1) | ES2257553T3 (ru) |
| HK (1) | HK1065070A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA03011564A (ru) |
| OA (1) | OA12620A (ru) |
| PL (1) | PL209075B1 (ru) |
| PT (1) | PT1395676E (ru) |
| WO (1) | WO2002103040A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200309551B (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2014301960A1 (en) * | 2013-06-26 | 2016-01-07 | Phylogica Limited | Method of monitoring cellular trafficking of peptides |
| EP3649249A4 (en) * | 2017-07-04 | 2021-03-03 | Cavidi AB | METHOD OF EVALUATING THE SENSITIVITY OF A VIRUS TO A TREATMENT BY MEASURING ENZYMACTIVITY AND SYSTEM FOR IT |
| CN108896759B (zh) * | 2018-06-27 | 2020-05-19 | 南京医科大学 | 受试物致敏性检测方法及其试剂盒 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707439A (en) * | 1984-10-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Screening test for reverse-transcriptase containing virus such as non-A, non-B hepatitis, NANBH |
| US6268123B1 (en) | 1993-06-01 | 2001-07-31 | Retro-Tech Gmbh | Direct and biochemically functional detection process of retrovirus in biological samples |
| DE19608687A1 (de) * | 1996-03-06 | 1997-09-11 | Retro Tech Gmbh | Verfahren und Test-Kit für den nichtradioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase |
| SE9902410D0 (sv) * | 1999-06-24 | 1999-06-24 | Cavidi Tech Ab | Reverse transcriptase assay kit, use thereof and method for analysis of RT activity in biological samples |
| SE0001132D0 (sv) | 2000-03-29 | 2000-03-29 | Cavidi Tech Ab | Method of concentrating and recovering a viral enzyme activity from biological samples |
-
2002
- 2002-06-14 AT AT02736442T patent/ATE316150T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-06-14 PT PT02736442T patent/PT1395676E/pt unknown
- 2002-06-14 PL PL367829A patent/PL209075B1/pl unknown
- 2002-06-14 BR BRPI0210361A patent/BRPI0210361B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-06-14 WO PCT/SE2002/001156 patent/WO2002103040A1/en active IP Right Grant
- 2002-06-14 ES ES02736442T patent/ES2257553T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-14 EA EA200301244A patent/EA006161B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-06-14 US US10/479,511 patent/US7875422B2/en active Active
- 2002-06-14 AP APAP/P/2003/002923A patent/AP1592A/en active
- 2002-06-14 DE DE60208788T patent/DE60208788T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-14 MX MXPA03011564A patent/MXPA03011564A/es active IP Right Grant
- 2002-06-14 CN CN028155971A patent/CN1539022B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-14 EP EP02736442A patent/EP1395676B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-14 AU AU2002309447A patent/AU2002309447B2/en not_active Ceased
- 2002-06-14 JP JP2003505361A patent/JP4455054B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-14 OA OA1200300318A patent/OA12620A/en unknown
-
2003
- 2003-12-09 ZA ZA2003/09551A patent/ZA200309551B/en unknown
-
2004
- 2004-09-10 HK HK04106865A patent/HK1065070A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002103040A1 (en) | 2002-12-27 |
| BR0210361A (pt) | 2004-06-22 |
| AP1592A (en) | 2006-03-20 |
| AP2003002923A0 (en) | 2003-12-31 |
| PL209075B1 (pl) | 2011-07-29 |
| OA12620A (en) | 2006-06-12 |
| CN1539022B (zh) | 2011-04-13 |
| ATE316150T1 (de) | 2006-02-15 |
| BRPI0210361B8 (pt) | 2021-07-27 |
| HK1065070A1 (en) | 2005-02-08 |
| CN1539022A (zh) | 2004-10-20 |
| AU2002309447B2 (en) | 2007-05-24 |
| EP1395676A1 (en) | 2004-03-10 |
| DE60208788D1 (de) | 2006-04-06 |
| PL367829A1 (en) | 2005-03-07 |
| US7875422B2 (en) | 2011-01-25 |
| JP4455054B2 (ja) | 2010-04-21 |
| PT1395676E (pt) | 2006-06-30 |
| ES2257553T3 (es) | 2006-08-01 |
| EA200301244A1 (ru) | 2004-06-24 |
| ZA200309551B (en) | 2005-02-23 |
| US20040170958A1 (en) | 2004-09-02 |
| EP1395676B1 (en) | 2006-01-18 |
| JP2004530433A (ja) | 2004-10-07 |
| MXPA03011564A (es) | 2004-03-18 |
| DE60208788T2 (de) | 2006-11-09 |
| BR0210361B1 (pt) | 2014-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Comas-Garcia et al. | Efficient support of virus-like particle assembly by the HIV-1 packaging signal | |
| Chang et al. | The origin of HIV-1 isolate HTLV-IIIB | |
| Dooher et al. | Conservation of a stepwise, energy-sensitive pathway involving HP68 for assembly of primate lentivirus capsids in cells | |
| OA11973A (en) | Reverse transcriptase assay kit, use thereof and method for analysis or RT activity in biological samples. | |
| US20060194227A1 (en) | Heteroduplex tracking assay | |
| van der Kuyl et al. | The evolution of subtype B HIV-1 tat in the Netherlands during 1985–2012 | |
| EA006161B1 (ru) | Тестирование чувствительности вирусов к лекарству | |
| Aytay et al. | Development of a sensitive PCR inhibition method to demonstrate HBV nucleic acid inactivation | |
| EP1226270A2 (en) | Improved assay and reagents therefor | |
| US20210139947A1 (en) | Method for assessing susceptibility of a virus to treatment by measuring enzyme activity and a system therefore | |
| Louvel et al. | Detection of drug‐resistant HIV minorities in clinical specimens and therapy failure | |
| Rusconi et al. | Loss of lamivudine resistance in a zidovudine and lamivudine dual-resistant HIV-1 isolate after discontinuation of in vitro lamivudine drug pressure | |
| Ingram | Cyclophilin A Enhances HIV-1 Reverse Transcription in Human Microglial Cells | |
| Council et al. | Deep Sequencing Reveals Compartmentalized HIV-1 in the Semen of Men with and without STI-associated Urethritis | |
| US7691572B2 (en) | Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs | |
| OA19385A (en) | Method for assessing susceptibility of a virus to treatment by measuring enzyme activity and a system therefore. | |
| AU2002309447A1 (en) | Viral drug susceptibility testing | |
| Mottaghinia | Germline Colonization by Retroviruses: A New Rodent Model to Understand Host-Virus Interactions at the Early Stages of Retroviral Endogenization | |
| Reeves et al. | Mild HIV-specific selective forces overlaying natural CD4+ T cell dynamics explain the clonality and decay dynamics of HIV reservoir cells | |
| Sharaf | Mechanisms of HIV-1 persistence and post-treatment control | |
| Koch | Dominant effect of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gag-pol on viral fitness and resistance to protease inhibitors | |
| GS00 | eee|, kk--HIV-1. Bru Q Group lll. Related to the pool established at LTCE | |
| Zanet | Investigating markers of cellular aging in Human Immunodeficiency Virus infected and uninfected adults | |
| Hehl | Analysis of the interaction of HIV-1 reverse transcriptase and integrase proteins | |
| Gonzalez-Hernandez | The Expression of Human Endogenous Retroviruses is modulated by the Tat protein of HIV-1. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY KZ RU |