JP4808345B2 - 逆転写酵素アッセイキット、その使用および生物学的サンプルにおけるｒｔ活性の分析方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、生物学的サンプルにおけるＲＴ活性を分析するための逆転写酵素（ＲＴ）アッセイキットに関する。本発明はまた、ＲＴ活性分析の結果に基づいてＲＴ活性に関連する異常または疾患の状態を評価することを必要に応じて伴う、生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の定性的および定量的な分析を行うための方法およびＲＴアッセイキットの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
逆転写酵素（ＲＴ）は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）を含むすべてのレトロウイルスにとってウイルスＲＮＡからのＤＮＡ合成を担う極めて重要な酵素である（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ−７０、Ｔｅｍｉｎ−７０、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他−８３）。このプロセスは、第１ＤＮＡ鎖の合成、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドにおけるウイルスＲＮＡ鎖の分解、および第２ＤＮＡ鎖の合成の３つの異なる酵素活性を伴う（総説については、Ｇｏｆｆを参照のこと）。
【０００３】
レトロウイルスは、外因性形態または内因性形態のいずれかで、あるいはその両方で存在し得る。その主な違いは、その特定ウイルスに対する適した受容体を有する細胞に進入し得るだけの外因性レトロウイルスとは対照的に、内因性レトロウイルスは生殖細胞に進入しているということ、従ってそのＤＮＡが生物のすべての細胞に存在するということである。ヒトにおける内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、ＨＥＲＶと呼ばれている。内因性レトロウイルスのこの組み込まれたプロウイルス形態は、外因性レトロウイルスの機能的構造と同じ機能的構造を有する。一部のＨＥＲＶの生殖細胞内への組み込みは３５００万年前〜４５００万年前に生じたと考えられている。これらのレトロウイルス配列は哺乳動物ゲノムの１％を構成し、従って同様にヒトゲノムの１％を構成している。従って、レトロウイルス配列はすべてのヒト細胞に存在し、通常のメンデル則に従って遺伝している。
【０００４】
ＨＥＲＶの多くのファミリーがヒトのゲノムに存在している。半数体のヒトゲノムあたりのＨＥＲＶのコピー数は、種々のファミリーについて１コピーから数１０００コピーの間で変化している。最も大きなヌクレオチド配列保存がｐｏｌ遺伝子において見出されている。この特徴は、ＨＥＲＶファミリー間の関係を導き出すために使用されている。多くのＨＥＲＶおよびそのＯＲＦは不完全であるが、ｍＲＮＡ転写物が、いくつかの組織タイプにおいてほとんどのＨＥＲＶファミリーから検出されている（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ他（１９９４）、Ｌｅｉｂ−ＭｏｓｃｈおよびＳｅｉｆａｒｔｈ（１９９６）に総説される）。さらに、ポリメラーゼ活性およびプロテアーゼ活性を有するビリオン粒子が、正常なヒトの胎盤、卵母細胞、奇形ガン、乳ガン組織において、そして一部の自己免疫患者の唾液腺において認められている（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ他（１９９４）、ＵｒｎｏｖｉｔｚおよびＭｕｒｐｈｙ（１９９６）、Ｔｏｎｊｅｓ他（１９９７）に総説される）。無酸素およびＵＶ照射のようなストレス条件はまた、感染性レトロウイルスについて認められているような様々なＨＥＲＶの発現を誘導し得る（Ｄｕｖｉｃ（１９９５）に総説される）。
【０００５】
いくつかのＨＥＲＶはゲノム内の染色体中断点に局在化している（Ｄｉ Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏ他、１９９５；Ｍｅｅｓｅ他、１９９６）。種々の染色体部位に存在するＨＥＲＶ配列間の組換えは、転座、逆位、重複および欠失を含むゲノムの再配置を生じさせることがある。そのような組換え事象は、進化の重要な特徴であるゲノムの不安定性を生じさせるもとである。さらに、多くの腫瘍は、腫瘍形成において極めて重要な役割を果たしていると考えられる特定のゲノム再配置によって特徴付けられる。宿主における感染性レトロウイルスの存在と腫瘍発達との関係は、ＨＥＲＶがガンと関連していることを示唆している。ビリオン粒子およびレトロウイルス関連抗原が、非感染性ウイルスの非存在下でもまた、原発性腫瘍サンプルにおいて頻繁に認められている（Ｗｅｉｓｓ、１９８４；Ｆａｆｆ他、１９９２）。さらに、レトロウイルスタンパク質に対する抗体がガン患者の血清において明らかにされている（Ｗｅｉｓｓ、１９８４）。その上、ＨＥＲＶ配列が、ある種の腫瘍由来細胞株において非常に発現していることが見出されている（Ｌｏｗｅｒ他（１９９６）に総説される）。
【０００６】
内因性プロウイルスもまた外因性変化体との組換えをもたらし得る（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ他、１９９０）。新規な組み換え体は、変化した表現型を受け取る。これは、新しい感染性レトロウイルスが迅速に進化することの一因になり得る。ｅｎｖ遺伝子が主に影響を受ける。これは、他の部分における変異は有害であり、粒子形成と両立し得ないからである。レトロウイルス株の中には、ある種においては共生的であり、別の種では病原性であるものが見出されている。これらの発見は、異種移植における重大な問題を示している。移植された組織によってもたらされる共生的なＥＲＶは、新しい宿主において病原性となり得る。そのようなＥＲＶは、新しい宿主の細胞表面に存在する、レトロウイルス融合に必要な細胞表面受容体と相互作用し得る場合がある。さらに、組織受容者のゲノム内の内因性レトロウイルス配列との組換えが生じることがあり、そして集団内に広がり得る新しい感染性レトロウイルスを生じさせることがある。内因性レトロウイルスおよび外因性レトロウイルスはともに、種内および種間における遺伝物質の垂直伝搬および水平伝搬に寄与し、かつ新しい病原性因子の進化に対する機構を提供し得る。
【０００７】
感染性レトロウイルスおよびＥＲＶはともに様々な免疫調節機能を示すことが見出されている（Ｋｒｉｅｇ他（１９９２）に総説される）。これらの作用は、主としてマウスで研究されているが、ＨＥＲＶについて類似した機構が存在することを裏付ける観測結果がいくつか得られている。ＨＥＲＶ配列が免疫応答を脱調節し得る場合、ＨＥＲＶ配列により自己免疫疾患が生じ得る。これらの作用は、ＨＥＲＶタンパク質によって直接的に調節され得るか、あるいは免疫応答に関与する分子の発現に影響を及ぼすことによって間接的に調節され得る。ＨＥＲＶタンパク質は細胞表面に露出し得る。これらのタンパク質配列に対する自己耐性の喪失は、それらにさらされている細胞に対する自己免疫反応を生じさせることがある。レトロウイルス感染後に産生される抗体は、ＨＥＲＶによってコードされるタンパク質との交差反応性を有する場合があり、耐性を喪失させるもとであり得る。この現象はトランスジェニックマウスで認められている（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ他、１９９０）。さらに、ＥＲＶによってコードされるｅｎｖタンパク質に対する耐性の喪失が、自己免疫性の腎糸球体症を自発的に発症するマウスで認められた（Ｋｒｉｅｇ他（１９９０および１９９２）に総説される）。ヒトにおけるいくつかの観測結果により、内因性レトロウイルスタンパク質と外因性レトロウイルスタンパク質との交差反応性抗体の存在を裏付けることができる。レトロウイルスタンパク質に対する抗体が自己免疫患者の血清中に検出されている（Ｋｒｉｅｇ他（１９９２）、ＵｒｎｏｖｉｔｚおよびＭｕｒｐｈｙ（１９９６）に総説される）。ある種の場合には、血清が外因性レトロウイルスとも反応することが見出された。レトロウイルスの感染は自己免疫疾患の発症と関連している（Ｋｒｉｅｇ他（１９９０および１９９２）に総説される）。さらに、感染性レトロウイルスのタンパク質は、自己抗体に対する高頻度の標的である自己抗原に対する部分的な類似性を示す（Ｋｒｉｅｇ他（１９９２）に総説される）。自己抗体は、そのような標的に対する自己免疫応答を開始させることができる。これは、分子模倣と呼ばれる機構である。しかし、知られている自己抗原に対するＨＥＲＶタンパク質の類似性は未だ検出されていない。
【０００８】
ＲＴ活性に関するアッセイは、細胞培養物におけるレトロウイルスの検出および定量に対する受け入れられる技術になっている。それらは、ＨＩＶの単離に対する確認試験として使用されるｐ２４抗原アッセイと一緒になっている（Ｊａｃｋｓｏｎ−８８、Ｇｕｐｔａ−８７）。ＲＴはまた、ＨＩＶに対する効率的な抗ウイルス剤を見出す試みにおける主要な標的の１つである。従来のＲＴ活性アッセイは、人工的なテンプレート−プライマー構築物およびヌクレオチド基質としてのトリチル化デオキシヌクレオチド三リン酸を用いた可溶性酵素のアッセイを利用することによって行われている（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ−７１、Ｌｅｅ他−８７）。この初期のシステムは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈殿し得るＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドへの放射能取込みを検出することに基づいていた。β線放射性ヌクレオチドの使用は、放射能を検出するためにシンチレーション液を使用することを必要とし、これは、多くの場合、クエンチング問題のために良好な再現性をもたらしていない。この方法は比較的面倒であり、非常に多くのサンプルを大規模にスクリーニングすることに適合させることは容易ではない。この方法また、サンプル中の妨害因子の作用に対して非常に敏感である。
【０００９】
ＨＩＶに関する集中的な研究が行われたこの１０年間において、ＲＴアッセイは、種々の技術を使用して改善されている。Ｉ^１２５で標識された基質の導入は、増大した感度をもたらし、そしてシンチレーション液のクエンチングをなくし、その使用が不要になった（Ｎｅｕｍｕｌｌｅｒ他−９０）。固相に結合させたテンプレートまたはプライマーの導入は、基質と生成物との分離を単純化し、ＴＣＡ沈殿の必要性をなくし、そして「ワンチューブＲＴアッセイ」をもたらした（Ｇｒｏｎｏｗｉｔｚ他−９０、ＥＰ０４４７４４２Ｂ１）。
【００１０】
より近年において、ＲＴアッセイにおける標識としての放射能の使用は、規定されたリガンドに対して大きな親和性を有する抗原性のエピトープまたは構造のいずれかを含有する修飾されたヌクレオチド塩基の使用によって少なくなっている。これらのエピトープまたは構造を新しく合成されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに存在させることは、その後、例えば、ＥＬＩＳＡ酵素などと結合した抗体またはリガンドを結合させるために使用されている。その後、結合したＥＬＩＳＡ酵素の量が二次酵素アッセイにおいて測定される。
【００１１】
Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ他（１９９１）は、５−ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）三リン酸をＲＴアッセイにおけるヌクレオチド基質として利用している。取り込まれたＢｒｄＵＭＰの量が、二次的な工程において、アルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体を使用する免疫アッセイで測定される。
【００１２】
ＥｂｅｒｌｅおよびＲ．Ｓｅｉｂｌ（１９９２）は、放射能標識されたｄＴＴＰの代わりに、ジゴキシゲニンで標識されたｄＵＴＰの新しく合成されたＤＮＡ内への取込みを測定している。取り込まれなかったヌクレオチドを新しく合成されたＤＮＡから分離することを可能にするために、ビオチンで標識されたｄＵＴＰもまた反応混合物に加えられている。逆転写後、新しく合成された二重標識ＤＮＡが、ストレプトアビジンがコーティングされたＥＬＩＳＡウエルに固定化され、ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体を結合させることによって光度測定的に評価される。この手法は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されているＲＴアッセイキットの基礎である。
【００１３】
Ｕｒａｂｅ他（１９９４）は、固定化されたｏｄＴ／ｐｒＡ構築物におけるビオチン−ｄＵＴＰの取込みに基づく非放射性ＲＴアッセイを開発している。取り込まれたヌクレオチド基質の量が、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼの添加後に光度測定的に測定される。本発明に最も近い先行技術が、Ｅｋｓｔｒａｎｄ他（１９９６）によって開発された。そのアッセイにおいて、９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに共有結合させたポリ（ｒＡ）は、逆転写工程時におけるＢｒｄＵＭＰの取込みに対するテンプレートとして役立つ。ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵＭＰの量が、その後、Ｐｏｒｓｔｍａｎ他（１９９１）によって使用されたように同様な手法に従って免疫学的に測定される。この方法は、ＲＴ測定キットとしてＣａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）から入手することができる。
【００１４】
ＮＥＮ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、米国）によって商業的に利用されている、ＲＴ活性を検出するための別の原理は、新しく合成されたｃＤＮＡを検出するために配列特異的プローブを利用することである。この酵素反応では、５’端に近いＲＮＡ配列に対して相補的な２０塩基のオリゴヌクレオチドプライマーとのヘテロポリマーＲＮＡ分子が利用されている。完全なｃＤＮＡ鎖がＲＴ反応のときに産生される。テンプレートＲＮＡを加水分解した後、ｃＤＮＡは２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プローブおよび検出プローブ）とハイブリダイゼーションさせられる。捕獲プローブは、ｃＤＮＡをマイクロプレートのウエルに結合させるために使用される。検出プローブは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合しており、これは、使用されなかったヌクレオチド基質および遊離のプローブを除くための洗浄を行った後、発色反応をもたらす。
【００１５】
最後のタイプのアッセイにおける検出感度は、ＲＴ反応により得られたｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって増大させることができる。増幅されたＤＮＡは、その後、種々のタイプの標識プローブを用いて検出することができる（Ｓｉｌｖｅｒ（９３）、Ｈｅｎｅｉｎｅ（１９９５）、米国特許第５８１７４５７号、米国特許第５８４９４９４号）。
【００１６】
生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の知識を何らかの適用のために使用する場合、定量的な結果をもたらすＲＴアッセイを使用することが望ましい。そのような適用は、異なる時間で行われた測定に由来するＲＴアッセイの結果が比較される疾患または異常のモニターリング、およびＲＴ活性のレベルを標準的なレベルと比較したときに、患者が、問題としている疾患または異常の危険性を有しているかどうか、あるいは実際に問題としている疾患または異常に罹患しているかどうかが示される疾患または異常の診断を含む。
【００１７】
いくつかの場合には、できる限り高感度であるアッセイ、すなわち、できる限り小さい量のＲＴ活性を生物学的サンプルにおいて測定することができ、その結果、ＲＴ活性の存在および大きさを初期段階の異常および疾患と関連させることができるアッセイを使用することが望ましい。
【００１８】
（発明の説明）
本発明は、スクリーニング目的のために容易に使用され、かつＲＴ活性に対して非常に高感度であるＲＴアッセイを提供する。
【００１９】
より詳しくは、本発明は、ポリスチレン系固相を、１−メチルイミダゾールならびにポリリボアデニル酸（ｐｒＡ）および／またはポリデオキシアデニル酸（ｐｄＡ）を含む結合溶液と接触させ、その後、インキュベーション、洗浄緩衝液による洗浄、乾燥およびパッケージングを行うことによって得ることができる固相結合型のｐｒＡテンプレートおよび／またはｐｄＡテンプレートを含有する１つまたは数個のパッケージを含む逆転写酵素（ＲＴ）アッセイキットに関する。このキットはまた、緩衝液（ｐＨ約７〜８）、二価金属イオン、キレート化剤、ポリアミン、ＲＮａｓｅ阻害剤、還元剤、塩、安定化剤および界面活性剤の混合物またはそれらのそれぞれからなる群から選択されるＲＴタイプに適合して個々にパッケージ包装されたアッセイ成分、ならびに凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド三リン酸、プライマー、保護剤および高濃度洗浄緩衝液の混合物またはそれらの単独、ならびにアッセイキットの使用に関する文書化された説明書を含む。必要に応じて、このキットは、凍結乾燥された参照用酵素（１つまたは複数）を含む。必要に応じて、このキットはさらに、凍結乾燥されたアルカリホスファターゼ結合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体、アルカリホスファターゼ基質緩衝剤およびアルカリホスファターゼ基質（ｐＮＰＰ錠剤など）を含む検出システムの成分を含む。
【００２０】
本発明によるＲＴアッセイキットの好ましい実施形態において、固相はマイクロタイタープレートであり、そして１００ｍＭの１−メチルイミダゾール（ｐＨ約５〜７）ならびに０．５〜２ｍｇ／ｍｌのｐｒＡおよび／またはｐｄＡを含む結合溶液のアリコットが各ウエルに加えられ、その後、インキュベーションが１０〜６０℃の温度で０．５〜１０時間にわたって行われ、そして１−メチルイミダゾールを除くために、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ約５〜７）を含む洗浄緩衝液で各ウエルが洗浄される。
【００２１】
本発明によるＲＴアッセイキットの特に好ましい実施形態において、１００ｍＭの１−メチルイミダゾール（ｐＨ約６．２５）ならびに１ｍｇ／ｍｌのｐｒＡおよび／またはｐｄＡを含む結合溶液の１００μｌが各ウエルに加えられ、その後、インキュベーションが室温で約２時間行われ、そして１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ約６．２５）を含む洗浄緩衝液の２ｘ３００μｌで各ウエルが洗浄され、そしてプレートを３７℃で約２５分間乾燥して、プレートをホイルバッグに入れ、バッグが真空シールされる。
【００２２】
本発明によるＲＴアッセイキットのさらなる実施形態において、アッセイ成分は、緩衝剤としてＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓ（ｐＨ約７〜８）、二価金属イオンとしてＭｇ^２＋およびＭｎ^２＋、キレート化剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− 四酢酸（ＥＧＴＡ）、ならびにポリアミンとしてスペルミンおよびスペルミジン、ＲＮａｓｅ阻害剤としてヘパリン硫酸およびデキストラン硫酸、還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）およびグルタチオン、塩としてＮａＣｌおよびＫＣｌ、安定化剤として新生児子ウシ血清（ＮＣＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシヌクレオチド三リン酸としてＢｒｄＵＴＰ、プライマーとしてオリゴｄＴまたはオリゴｄＮ（この場合、ＮはＵなどの別のＴアナログである）、ならびに保護剤としてＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰからなる群から選択される。
【００２３】
本発明はまた、生物学的サンプル、例えば、血漿、血清、脊髄液、滑液および胸膜液などの、細胞抽出物および生物学的流体から選択される生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の定性的および定量的な分析を行うための本発明によるアッセイキットの使用に関する。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明による使用は、ＲＴ活性分析の結果に基づいてＲＴ活性に関連する異常または疾患の状態を評価することを伴う。
【００２５】
さらに、本発明は、生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の定性的および定量的な分析方法に関する。この方法は、生物学的サンプル、例えば、血漿、血清、脊髄液、滑液および胸膜液などの、細胞抽出物および生物学的流体から選択される生物学的サンプルにおけるＲＴ活性を測定するための本発明によるＲＴアッセイキットに関する文書化された説明書を使用する工程、および前記説明書に従う工程を含む。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明による方法は、ＲＴ活性分析の結果に基づいてＲＴ活性に関連する異常または疾患の状態を評価することを伴う。
【００２７】
次に、本発明は、図面の参照および実施形態のより詳しい説明によって例示されるが、これらの実施形態は、特許請求の範囲の請求項において規定される保護の範囲に対する限定と見なしてはならない。
【００２８】
（発明の実施形態の詳細な説明）
本発明のＲＴアッセイキットは３つの異なるタイプの成分を含む：すなわち、
１）固相に結合させたポリリボアデニル酸（ｐｒＡ）またはポリデオキシアデニル酸（ｐｄＡ）からなるテンプレート。
２）結合させたテンプレートポリヌクレオチドを使用してプライマーに依存する様式で新しいＤＮＡ鎖を酵素に重合させることができる反応混合物。
３）インビトロで合成されたＤＮＡ鎖を免疫学的に検出するための検出システムの成分。
【００２９】
１）固相結合テンプレート
ポリヌクレオチドがウイルスおよび細胞のＲＮＡおよびＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、ＲＴ）によるプライマー依存的なｄＮＴＰ取込みのテンプレートとして役立ち得る様式でｐｒＡまたはｐｄＡをある種のタイプのマイクロタイタープレートに結合させることができる方法が開発された。２つの市販されているマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得られるＣｏｖａＬｉｎｋ^ＴＭおよびＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ^ＴＭ）において機能することが示された。本発明によるアッセイキットのために使用されるｐｒＡ結合型マイクロタイタープレートが、ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ^ＴＭ細片から製造される。手順および緩衝液は表１に記載されている。結合機構は、手順が製造者によって推奨または示唆されている方法に対応しておらず、あるいは文献にも明示的に述べられていないので不明である。考えられる反応機構は、その特異的な表面の知られている使用および意図された使用のためにグラフト化された反応性基ではなく、製造手順のときに持ち込まれた反応性基が関わっている。同様の結果が、他の市販供給物から得られる他のポリスチレン系マイクロタイタープレートを用いて得られることが予想される。ＣｏｖａＬｉｎｋ^ＴＭの性質と等しい性質を有する表面を得るためにポリスチレンを化学的に活性化する方法が発表されている（Ｚａｍｍａｔｔｅｏ他−９６）。ポリヌクレオチドをプラスチック表面に結合させるためのいくつかの他の方法もまた発表されている（Ｚａｍｍａｔｔｅｏ他−９６、Ｇｒｅｇｏｒｉｕｓ−９５、Ｎｉｖｅｌｅａｕ−９３、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ他−９１、ＧｈｏｓｈおよびＭｕｓｓｏ−８７）。
【００３０】
２）ＲＴタイプに適合した反応混合物
精製された酵素を使用する可溶性システムにおけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド取込みを得るための一般的な条件は単純であり、よく知られている。そのようなシステムは、ｐＨを約７．５に保つ緩衝液、二価金属イオンのＭｇ^２＋または時にはＭｎ^２＋、イオン強度を調節するための塩、一部の酵素の場合には還元剤および少量の界面活性剤を含む。この単純な反応緩衝液が提供された場合、酵素は、加えられたテンプレート、プライマーおよびデオキシヌクレオチド三リン酸を利用して、ＤＮＡ鎖を合成することができる。この一般的な概念は、異なるクラスまたはタイプの逆転写酵素の間における、必要とされる最適な反応条件または特に適合させた反応条件の違いを考慮していない。別の重要な局面は、ＲＴ酵素活性の供給源として未処理の生物学的流体または細胞抽出物を添加することに耐える反応混合物の所望される能力である。
【００３１】
細胞培養上清などの粗サンプルおよび精製酵素の両方を使用した系統だった試験により、特定の逆転写酵素のために最適化された反応混合物、または特定の逆転写酵素のために特に適合化された反応混合物を作製するために使用される他の反応成分が明らかにされた。
【００３２】
表２は、個々のＲＴタイプに適合した反応混合物を組み立てるために使用される成分の概要を含む。典型的な反応混合物の組成は表３に示されている。
【００３３】
本発明の逆転写酵素アッセイ法は、下記に記載されているように行われる。アッセイの最初の工程は、１００μｌの反応混合物をｐｒＡ結合型マイクロタイタープレートの各ウエルに加え、その後、２０分〜６０分のプレインキュベーションを３３℃で行うことである。その後、逆転写酵素を含有するサンプルを５０μｌの緩衝液において加える。これにより１５０μｌの最終アッセイ容量になる。その後、マイクロタイタープレートは３３℃でインキュベーションされる。それぞれのサンプルが、３時間および一晩（１６時間〜２０時間を意味する）に規格化された２つのアッセイ時間を考慮した二連のマイクロタイタープレートに加えられる。段階的な手順は、それぞれのキットに含まれる文書化された説明書または使用者マニュアルに示されている。そのような説明書または使用者マニュアルは、下記の適用のいくつかまたはすべてのために一般的な逆転写酵素アッセイ成分をどのように適合させるかに関する示唆または指示を含む：１）ＲＴ活性の定量化、２）細胞抽出物、細胞上清および／または生物学的流体（血漿、血清、脊髄液、滑液および胸膜液（これら限定されない）を含む）におけるＲＴ活性のスクリーニング、３）ＲＴ活性阻止抗体の測定、４）ＲＴ活性阻害物質のＩＣ_５０値の測定。
【００３４】
これらの反応混合物および固相結合型テンプレートを使用して、本発明者らは、固相結合型テンプレートに基づく他の以前に記載されたアッセイよりもＲＴ活性の直接測定において高感度であるか、あるいはこれまで知られていない逆転写酵素活性の検出を可能にする特許請求の範囲に記載されたアッセイを設計した。
【００３５】
３．インビトロ合成されたＤＮＡ鎖の免疫学的検出
サンプル中のポリメラーゼは、反応混合物に提供されたブロモデオキシウリジン三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）を使用してＤＮＡ鎖を合成する。
【００３６】
取り込まれたＢｒｄＵＭＰは、アルカリホスファターゼに結合させたＢｒｄＵ結合モノクローナル抗体によって検出される。その後、結合した抗体のアルカリホスファターゼ活性が、パラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を含有する基質溶液を加えることによって定量される。基質溶液は、ｐＮＰＰがアルカリホスファターゼによって切断されたときに黄色く変色する。光学密度（ＯＤ）が標準的なＥＬＩＳＡ読み取り装置で４０５ｎｍの波長において測定される。バックグラウンドに対して補正されたＯＤ値はサンプル中のＲＴ活性に比例する。
【００３７】
検出工程は、下記に記載されているように行われる。段階的な手順は、それぞれのキットに含まれる文書化された説明書または使用者マニュアルに示されている。緩衝液溶液の組成は表４に示されている。
【００３８】
逆転写酵素アッセイの後、マイクロタイタープレートは、市販のＥＬＩＳＡプレート洗浄機のいずれかを使用して、あるいは洗浄緩衝液を含むバケットにプレートを順次浸漬することによって洗浄される。結合化抗体が、必要に応じて、凍結乾燥形態でキットに提供される。２回蒸留した水における１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で再構成した後、１００μｌの抗体溶液が各ウエルに加えられ、そしてマイクロタイタープレートは３３℃で９０分間インキュベーションされる。過剰な抗体を除くために、プレートは、再度、同じ様式で続いて洗浄される。基質溶液が、キットとともに必要に応じて提供される緩衝液およびｐＮＰＰの錠剤から調製される。その後、ＯＤ値が好適な時間間隔で測定される。
【００３９】
結合したアルカリホスファターゼ酵素の量と黄色生成物の濃度との直線関係は、ＯＤ値が大きいところで崩れる。種々の時間でＯＤを測定することによって、逆転写酵素アッセイ工程のときに形成される生成物の大きな量および少ない量の両方について有用な値（すなわち、特定の装置の直線的な読み取り範囲内にあるＯＤ値）を得ることができる。すべてではないが、一部のキットには必要に応じて含まれる参照用ＲＴ酵素は、３０分後、２時間後および１６時間後〜２０時間後（すなわち、一晩）にＯＤが測定されたときに有用なＯＤ値を有する滴定曲線を得るために校正される。
【００４０】
本発明のＲＴアッセイキットを用いて得られる改善された性能が表５に明らかにされている。ＨＩＶ−１のＲＴ滴定曲線が、以前に知られているＬｅｎｔｉＲＴキット（Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢ）を用いて、そして本発明のアッセイキットを用いて得られた。ＯＤ値はＲＴ酵素の濃度に対してプロットすることができ、そして最小二乗適合法を使用して直線にフィットさせることができる。表６におけるｋ値は、計算された直線の傾きであり、アッセイ感度の尺度である。本発明のアッセイキットは１桁大きいｋ値を有することが理解され得る。実用的な面で、このことは、はるかに低い濃度のＨＩＶ−１逆転写酵素を含有するサンプルから有用な測定値をもたらし、かつ／または時間の節約になる。逆転写酵素アッセイ時間が短くなること、および／またはアルカリホスファターゼの読み取り時間が短くなることは、本発明のキットの使用者には所要時間の短縮を意味する。
【００４１】
本発明のキットの典型的な構成要素
Ａ．ｐｒＡおよび／またはｐｄＡを結合させた２つの９６ウエルマイクロタイタープレート。
Ｂ．表２に列記された成分Ｉ〜ＩＸのＲＴタイプに適合した混合物を含有するサンプル希釈用および反応用の緩衝液。
Ｃ．別のバイアルで混合されるか、または別のバイアルで提供される凍結乾燥された反応成分Ｘ〜ＸＩＩ。
Ｄ．組換え体、精製された天然型またはウイルス粒子のいずれかである凍結乾燥された参照用酵素。
Ｅ．高濃度の洗浄緩衝液。
Ｆ．凍結乾燥されたアルカリホスファターゼ結合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（「ＲＴ産物トレーサー」と表示される）。
Ｇ．アルカリホスファターゼ基質緩衝液およびｐＮＰＰの錠剤。
Ｈ．文書化された説明書またはマニュアル。
【００４２】
【実施例】
実施例１
細胞上清におけるＰＥＲＶ（ブタ内因性レトロウイルス）ＲＴの改善された検出
ブタの細胞株ＰＫ−１５（ブタ腎臓）は、少量のＰＥＲＶを絶えず産生していることが知られている。ＰＫ１５細胞の培養物に由来する上清を順次希釈した。Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＣタイプＲＴアッセイおよび本発明のＭｎ^２＋アッセイの各希釈におけるＲＴ活性検出能を調べた。図１に示すデータは、一晩のＲＴ活性から得られたものである。
【００４３】
本発明のアッセイキットは、先行技術のアッセイキットと比較して約２５倍増大した活性を示している。検出感度における差を補償するために、より多くのサンプルを使用することはできなかった。Ｃ型アッセイは、より大きな上清濃度（＞２μｌ／ウエル）での時間および／またはサンプル量の場合、増大したバックグラウンドレベルおよび直線性からのずれに悩まされたからである。
【００４４】
本発明のアッセイキットは、外因性レトロウイルスの考えられる転移に関する研究、および／または異種移植に関連する内因性レトロウイルスの活性化に関する研究において使用することができる。
【００４５】
実施例２
滑液における逆転写酵素の直接測定
近年のＤＮＡハイブリダイゼーション実験は、ある種のリウマチ性異常と、レトロウイルス関連配列の存在との関連を示唆している。慢性関節リウマチ患者に由来する滑液の凍結サンプルをＫａｒｏｌｉｎｓｋａ ｓｊｕｋｈｕｓｅｔ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スェーデン）のリウマチ学部門から得た。サンプルは、凍結前の低速遠心分離により細胞および細胞片が除かれていた。サンプルを解凍し、順次希釈して、ＲＴ活性について調べた。
【００４６】
得られた活性をＯＤ_４０５／ｈに再計算した。図２には、本発明の滑液ＲＴアッセイにおいて１μｌのサンプルおよび一晩の酵素反応を使用して見出されたＲＴ活性が示されている。ＲＴ活性は、Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＬｅｎｔｉまたはＣ対応のＲＴアッセイにより調べられたサンプルのいずれにおいても検出されなかった。
【００４７】
実施例３
ヒト乳ガンに由来する抽出物におけるＲＴ活性の検出
ＭＭＴＶ（マウス乳腫瘍ウイルス）に対する外因性または内因性のヒト対応体はヒト乳ガンの病因に関与している。ＭＭＴＶの組換えＲＴを使用して、アッセイ条件を最適化することによって、ＲＴ活性を、事前の濃縮または精製を行うことなく乳ガンに由来する抽出物において検出することができる。ヒト乳ガンに由来する凍結された抽出物をＡｋａｄｅｍｉｓｋａ ｓｊｕｋｈｕｓｅｔ（Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）の腫瘍学部門から得た。腫瘍組織はホモジネートされ、標準緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁された。上清が低速遠心分離による清澄化の後に回収された。サンプルを解凍し、順次希釈し、そして本発明のＭｇ^２＋ＲＴアッセイおよびＣａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＬｅｎｔｉまたはＣタイプのＲＴアッセイにおいてＲＴ活性の存在について調べた。
【００４８】
図３には、２時間のＡＰ反応と組み合わせた一晩のＲＴ反応を使用して得られた結果の代表的な例が示されている。本発明のＭｇ^２＋ＲＴアッセイとＣａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＬｅｎｔｉＲＴアッセイとの検出感度の差は約４００倍であった。Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＣタイプＲＴアッセイでは活性は検出されなかった。
【００４９】
図４には、種々の患者に由来する腫瘍抽出物において本発明のＭｇ^２＋ＲＴアッセイによって検出されたＲＴ活性の変動が例示されている。
【００５０】
本発明のアッセイキットは、乳ガンの病因における外因性レトロウイルスまたは内因性レトロウイルスの考えられる役割に関する研究において使用することができ、そして診断目的のために使用することができる。
【００５１】
実施例４
細胞培養物に由来する上清におけるＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウイルス）様ウイルスの検出
一部のＨＴＬＶ感染者は腫瘍学的異常または脊髄障害性異常を発症し続ける。日本および南アジアの特定地域において、関連した疾患の成人Ｔ細胞白血病が最初に記載された。神経学的異常である熱帯性痙性対不全麻痺がカリブ出身者の患者において最初に記載された。ウイルスに対する曝露および／または低レベルのウイルス活性の持続した存在を検出することができる方法が望まれる。
【００５２】
非常に関連するウシウイルスのウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、酪農業および牧畜業にとって大きな経済的結果を伴うウシの病原体である。ＢＬＶを使用して、ＢＬＶ／ＨＴＬＶのＲＴ活性に対するアッセイを最適化した。
【００５３】
図５Ａには、本発明のアッセイキットとＣａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ ＡＢのＬｅｎｔｉＲＴアッセイとの検出感度の差が例示されている。ＨＴＬＶ１で形質転換された細胞株ＭＴ−２に由来する細胞培養上清を順次希釈して、２つのＲＴアッセイを、それぞれのサンプルにおけるＲＴ活性の量を測定するために使用した。使用したＲＴ反応時間は一晩（１４時間）であった。
【００５４】
図５Ｂには、ＦＬＫ−ＢＬＶ細胞に由来する１組の希釈された上清の対応するデータが示されている。（この細胞株はＢＬＶが慢性的感染している）。
【００５５】
検出感度の全体的な利得は、それぞれ、ＨＴＬＶ酵素の場合には約２５倍であり、ＢＬＶ酵素の場合には３０倍であった。感度の増大は、ＭＴ−２細胞の上清から有意なシグナルを得るためには必須であった。
【００５６】
実施例５
ＳＩＶ感染マカークに由来する粗血清におけるＲＴ活性の直接測定
血清中のＲＴ活性の定量を、急性レンチウイルス感染時のウイルス複製を検出するために使用した。血清中ＲＴ活性は、その後、ＲＴ阻害抗体の産生により抑えられた。
【００５７】
４頭のカニクイサル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の一群を使用し、処置研究における未処置コントロールには１０サル感染量（ＭＩＤ５０）のＳＩＶｓｍを感染させた。感染後の示された時間においてサンプリングされた血清を順次希釈し、本発明のＬｅｎｔｉＲＴアッセイを用いてＲＴ活性についてアッセイした。５μｌの血清サンプルが４時間のＲＴ反応に含まれ、得られた吸光度の値をＯＤ_４０５／ｈに再計算して、感染後の日数に対してプロットした。図６を参照のこと。
【００５８】
本発明のＬｅｎｔｉＲＴアッセイは、感染の急性期のときにサンプリングされた血清の分析によってウイルス複製を検出するのに十分な感度を有する。ヒト献血者におけるＨＩＶ陽性に対するスクリーニングのために現在使用されている試験は、ＨＩＶ−１タンパク質に対する抗体の検出に基づいており、感染の急性期の段階にある感染者を検出することができない。これらの試験は、一部の国においては、ＥＬＩＳＡでウイルス抗原を検出することによって、またはＰＣＲでウイルスゲノムを検出することによって補われている。両タイプの試験は、ＨＩＶウイルス間の大きな遺伝子的および免疫学的な変化のために、変化したウイルス株を検出することができない場合がある。ＲＴは、すべてのレトロウイルスの複製にとって不可欠な機能を有し、このアッセイは、急性感染を検出するための注目される代替法を提供する。
【００５９】
表１
ｐｒＡコーティングＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ^ＴＭマイクロタイタープレートを製造
するための手順

１００μｌの結合液を各ウエルに加える。
プレートを室温で２時間インキュベーションする。
各ウエルを２ｘ３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄する。
プレートを３７℃で２５分間乾燥する。
プレートをホイルバッグに入れ、真空シールする。
−２０℃で保存する。
【００６０】
表２
ＲＴタイプに適合した逆転写酵素アッセイを組み立てるために使用される成分

略号
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− 四酢酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＤＴＥ：ジチオエリトリトール
ＮＣＳ：新生児子ウシ血清
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
【００６１】
表３
本発明の最適化されたＬｅｎｔｉ逆転写酵素アッセイの成分

表３（続き）
本発明の最適化されたＢＬＶ／ＨＴＬＶ逆転写酵素アッセイの成分

本発明の最適化されたＭｇ^２＋逆転写酵素アッセイの成分

表３（続き）
本発明の最適化されたＭｇ^２＋逆転写酵素アッセイの成分

本発明の最適化された滑液逆転写酵素アッセイの成分

【００６２】
表４
検出システムの成分

【００６３】
表５
ＲＴ酵素濃度と、Ｃａｖｉｄｉ ＴｅｃｈのＬｅｎｔｉＲＴアッセイおよび本発明の改善されたアッセイを用いて得られたＯＤ値との相関
Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈの 改善されたアッセイ
ＬｅｎｔｉＲＴアッセイ
pg/ml ３時間ＲＴ／３０分ＡＰ ３時間ＲＴ／３０分ＡＰ

pg/ml 一晩ＲＴ／２時間ＡＰ 一晩ＲＴ／２時間ＡＰ

pg/ml 一晩ＲＴ／一晩ＡＰ 一晩ＲＴ／一晩ＡＰ

ｎｄ＝実施せず
【００６４】
表６
Ｃａｖｉｄｉ ＴｅｃｈのＬｅｎｔｉＲＴアッセイおよび本発明の改善された
Ｌｅｎｔｉ ＲＴ アッセイを用いて得られたｋ値

（参考文献）
【００６５】
【表１】

【００６６】
【表２】

【００６７】
【表３】

【００６８】
【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】 ＲＴ活性をＰＫ１５細胞ラインの培養物に由来する培地において２つの方法で測定した説明図。得られた吸光度の値を、反応混合物に添加された培地の量に対してプロットした。
【図２】 慢性関節リウマチ患者から採取された滑液サンプルにおける直接的なＲＴ測定の説明図。プロットされた値は１μｌのサンプルおよび一晩のＲＴ反応から得られた。
【図３】 ＲＴ活性を乳ガンに由来する抽出物において２つの方法で測定した説明図。得られた吸光度の値は、反応混合物に添加された抽出物の量に対してプロットされる。
【図４】 乳ガン生検物に由来する抽出物におけるＲＴ活性の直接測定の説明図。各サンプル中のタンパク質濃度に対してプロットされた吸光度の値は、１μｌの抽出物および一晩のＲＴ反応から得られた。
【図５】 ＲＴ活性をＡ）ＨＴＬＶ１形質転換細胞の培養物の培地およびＢ）ＢＬＶ感染培養物に由来する培地において２つの方法で測定した説明図。得られた吸光度の値を、反応混合物に添加されたサンプルの量に対してプロットした。
【図６】 ＳＩＶ感染マカクに由来する血清におけるＲＴ活性の直接測定の説明図。４時間のＲＴアッセイで得られた吸光度の値を血清のサンプリング日に対してプロットした。

Claims (14)

1. 逆転写酵素（ＲＴ）アッセイキットであって、
   ポリスチレン系固相を、１−メチルイミダゾールならびにポリリボアデニル酸（ｐｒＡ）および／またはポリデオキシアデニル酸（ｐｄＡ）を含む結合溶液と接触させ、その後、インキュベーション、洗浄緩衝液による洗浄、乾燥およびパッケージングを行うことによって得ることができる固相結合型のｐｒＡテンプレートおよび／またはｐｄＡテンプレートを含有する１つまたは数個のパッケージ、
   ｐＨ７〜８の緩衝液、二価金属イオン、キレート化剤、ポリアミン、ＲＮａｓｅ阻害剤、還元剤、塩、安定化剤および界面活性剤の混合物またはそれらの単独からなる群から選択されるＲＴタイプに適合して個々にパッケージされたアッセイ成分、ならびに
   凍結乾燥されたデオキシヌクレオチド三リン酸、プライマー、保護剤および高濃度洗浄緩衝液の混合物またはそれらの単独、ならびに
   アッセイキットの使用に関する文書化された説明書
   を含むＲＴアッセイキット。
2. 凍結乾燥された参照用酵素をさらに含む、請求項１に記載のＲＴアッセイキット。
3. 凍結乾燥されたアルカリホスファターゼ結合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体、アルカリホスファターゼ基質緩衝剤およびアルカリホスファターゼ基質を含む検出システムの成分をさらに含む、請求項１および２のいずれかに記載のＲＴアッセイキット。
4. 前記固相はマイクロタイタープレートであり、１００ｍＭのｐＨ５〜７の１−メチルイミダゾールならびに０．５〜２ｍｇ／ｍｌのｐｒＡおよび／またはｐｄＡを含む前記結合溶液のアリコットが各ウエルに加えられ、その後、インキュベーションが１０〜６０℃の温度で０．５〜１０時間にわたって行われ、そして１−メチルイミダゾールを除くために、ｐＨ５〜７のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンを含む前記洗浄緩衝液で各ウエルが洗浄され、そしてプレートを乾燥してパッケージングされる、請求項１に記載のＲＴアッセイキット。
5. １００ｍＭのｐＨ６．２５の１−メチルイミダゾールならびに１ｍｇ／ｍｌのｐｒＡおよび／またはｐｄＡを含む前記結合溶液の１００μｌが各ウエルに加えられ、その後、インキュベーションが室温で行われ、１０ｍＭのｐＨ６．２５のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンを含む前記洗浄緩衝液の３００μｌで各ウエルが２回洗浄され、プレートを３７℃で乾燥して、プレートをホイルバッグに入れ、バッグが真空シールされる、請求項４に記載のＲＴアッセイキット。
6. 前記アッセイ成分は、緩衝剤としてｐＨ７〜８のＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓ、二価金属イオンとしてＭｇ^２＋およびＭｎ^２＋、キレート化剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’− 四酢酸（ＥＧＴＡ）、ならびにポリアミンとしてスペルミンおよびスペルミジン、ＲＮａｓｅ阻害剤としてヘパリン硫酸およびデキストラン硫酸、還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）およびグルタチオン、塩としてＮａＣｌおよびＫＣｌ、安定化剤として新生児子ウシ血清（ＮＣＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０（登録商標）およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、デオキシヌクレオチド三リン酸としてＢｒｄＵＴＰ、プライマーとしてオリゴｄＴ、ならびに保護剤としてＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載のＲＴアッセイキット。
7. 生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の定性的および定量的な分析を行うための請求項１〜６のいずれかに記載されるアッセイキットの使用。
8. 前記生物学的サンプルは生物学的流体および細胞抽出物から選択される、請求項７に記載の使用。
9. 前記生物学的流体は、血漿、血清、脊髄液、滑液および胸膜液から選択される、請求項８に記載の使用。
10. ＲＴ活性分析の結果に基づいて、異なる時間で行われた測定から得られた結果が比較されるレトロウイルス逆転写に関連する疾患または異常をモニタリングすることを伴う、請求項７〜９のいずれかに記載の使用。
11. 生物学的サンプルにおけるＲＴ活性の定性的および定量的な分析方法であって、生物学的サンプルにおけるＲＴ活性を測定するための請求項１〜６のいずれかに記載されるＲＴアッセイキットを使用する、方法。
12. 前記生物学的サンプルは生物学的流体および細胞抽出物から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記生物学的流体は、血漿、血清、脊髄液、滑液および胸膜液から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. ＲＴ活性分析の結果に基づいてレトロウイルス逆転写に関連する異常または疾患の状態をモニタリングすることを伴う請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。

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