CN113862341A - 一种单链微核糖核酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：S1：制备血清；S2：制备反应液；S3：进行逆转录；S4：制备检测液。本发明在在制备反应液和进行逆转录时加入乙二胺二邻苯基乙酸钠缩短制备反应液和混合液的时间，加入的谷胱甘肽能够提高后续检测的准确性，进行逆转录时获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，将制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
Description
技术领域
本发明是一种单链微核糖核酸的检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
微RNA(miRNA)是由约22个核糖核苷酸组成的非编码RNA，在细胞发育、凋亡、分化、增值等重要的的生理病理过程中发挥重要作用。在人的体液中，如血液、尿液、唾液等广泛存在miRNA，这些miRNA的表达谱与载组织细胞中一样，在肿瘤等病理状态下会发生特征性的改变，这些特定的miRNA表达谱是肿瘤细胞特异性生物标志物之一，是一种新的无创上性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。因此，建立一种准确迅速的单链微核糖核酸的检测方法尤为必要。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种单链微核糖核酸的检测方法，能够准确迅速的进行检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
为了实现上述目的，本发明提供了一种单链微核糖核酸的检测方法的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备血清
S2：制备反应液
将1-5μL的步骤S1得到的提取液作为待测样品与乙二胺二邻苯基乙酸钠、谷胱甘肽、多聚腺苷酸聚合酶、核糖核酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸和三磷酸腺苷的水溶液混合后，反应20-30min，得到反应液；
S3：进行逆转录
取1-5μL的步骤S2中的反应液，与乙二胺二邻苯基乙酸钠、RNA酶抑制剂、Quant逆转录酶、三磷脱氧核糖核苷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和逆转录引物的水溶液混合后，反应20-30min，得到混合液；
S4：制备检测液
采用上述方案，步骤S1用于制备血清来进行检测，步骤S2用于在miRNA的3’端加上多聚腺苷酸尾巴，步骤S2和步骤S3中加入的乙二胺二邻苯基乙酸钠可以提高检测的准确性，现有技术中制备反应液和混合液时间超过了1h，步骤S2中加入的谷胱甘肽能够缩短制备反应液和混合液的时间，提高了检测效率，步骤S3进行逆转录获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，步骤S4中制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
优选的，步骤S1具体为：取患者的静脉血4-6mL，以12000rpm转速离心15min，分离得到的血清，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测。
采用上述方案，利用纯化柱纯化后的血清，更有利于检测。
优选的，步骤S1中，离心的温度为35-40℃。
优选的，步骤S2中，反应的温度保持为35-40℃。
采用上述方案，保持多聚腺苷酸聚合酶的高度活性，从而能够有效的在miRNA的3’端加上多聚腺苷酸尾巴。
优选的，步骤S2中，所述水溶液为0.1-1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1-1μg谷胱甘肽、3-5单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5-1μg核糖核酸、0.1-1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5-1.5μg氯化钠、0.2-0.6μg乙二胺四乙酸、0.01-0.4μg三磷酸腺苷和40-60μL的40℃纯水充分震荡混匀后形成。
优选的，步骤S3中，所述水溶液为0.1-1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、10-15单位RNA酶抑制剂、3-5单位Quant逆转录酶、1.5-2μg三磷脱氧核糖核苷、0.5-1μg氯化钠、0.2-0.5μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2-4μg逆转录引物和40-60μL的40℃纯水充分震荡混匀形成。
采用上述方案，保持Quant逆转录酶的高度活性，从而有效的进行逆转录，获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸。
优选的，步骤S3中，RNA酶抑制剂为异硫氰酸胍、焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物中的一种。
采用上述方案，加入的RNA酶抑制剂可以与多种RNA酶结合，使其失活，避免有影响逆转录过程。
优选的，步骤S4具体为：将步骤S3中的混合液加入脱氧核糖核酸聚合酶混合液、上游引物和下游引物的混合物中，在70℃条件下反应30s，在40℃条件下，反应2min。
优选的，步骤S4中，所述混合物由2-4单位脱氧核糖核酸聚合酶、1-4μg上游引物、1-4μg通用型下游引物与40-60μL的40℃纯水充分震荡混合后形成。
优选的，步骤S4中，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’。
采用上述方案，选取的上游引物序列为miRNA744的上游引物序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：在制备反应液和进行逆转录时加入乙二胺二邻苯基乙酸钠缩短制备反应液和混合液的时间，加入的谷胱甘肽能够提高后续检测的准确性，进行逆转录时获得与miRNA互补的单链脱氧核糖核酸，制备的检测液通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA，从而进行准确迅速的检测，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：
S1：制备血清
取患者的静脉血4mL，以12000rpm转速离心15min分离得到的血清，离心的温度为35℃，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测；
S2：制备反应液
将0.1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1μg谷胱甘肽、3单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5μg核糖核酸、0.1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5μg氯化钠、0.2μg乙二胺四乙酸、0.01μg三磷酸腺苷与40μL的40℃纯水充分震荡混合后，将1μL步骤S1得到的提取液加入其中，反应20min，得到反应液，反应的温度保持为35℃；
S3：进行逆转录
将0.1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、10单位异硫氰酸胍、3单位Quant逆转录酶、1.5μg三磷脱氧核糖核苷、0.5μg氯化钠、0.2μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2μg逆转录引物和40μL的40℃纯水充分震荡混匀后，将1μL步骤S2中的反应液加入其中，反应20min，反应的温度保持为35℃；
S4：制备检测液
将2单位脱氧核糖核酸聚合酶、1μg上游引物、1μg通用型下游引物与40μL的40℃纯水充分震荡混合后，将1μL的步骤S3混合液加入其中，在70℃条件下反应30s，然后在40℃条件下，反应2min，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’；
反应结束后通过荧光定量检测仪检测miRNA744。
实施例2
一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：
S1：制备血清
取患者的静脉血6mL，以12000rpm转速离心15min分离得到的血清，离心的温度为40℃，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测；
S2：制备反应液
将1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、1μg谷胱甘肽、5单位多聚腺苷酸聚合酶、1μg核糖核酸、1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1.5μg氯化钠、0.6μg乙二胺四乙酸、0.4μg三磷酸腺苷与60μL的40℃纯水充分震荡混合后，将5μL步骤S1得到的提取液加入其中，反应30min，得到反应液，反应的温度保持为40℃；
S3：进行逆转录
将1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、15单位异硫氰酸胍、5单位Quant逆转录酶、2μg三磷脱氧核糖核苷、1μg氯化钠、0.5μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、4μg逆转录引物和60μL的40℃纯水充分震荡混匀后，将5μL步骤S2中的反应液加入其中，反应30min，反应的温度保持为45℃；
S4：制备检测液
将4单位脱氧核糖核酸聚合酶、4μg上游引物、4μg通用型下游引物与60μL的40℃纯水充分震荡混合后，将5μL的步骤S3混合液加入其中，在70℃条件下反应30s，然后在40℃条件下，反应2min，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’；
反应结束后通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA744。
实施例3
一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：
S1：制备血清
取患者的静脉血5mL，以12000rpm转速离心15min分离得到的血清，离心的温度为37℃，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测；
S2：制备反应液
将0.5μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.5μg谷胱甘肽、4单位多聚腺苷酸聚合酶、0.8μg核糖核酸、0.8μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1μg氯化钠、0.4μg乙二胺四乙酸、0.2μg三磷酸腺苷与50μL的40℃纯水充分震荡混合后，将3μL步骤S1得到的提取液加入其中，反应25min，得到反应液，反应的温度保持为37℃；
S3：进行逆转录
将0.5μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、12单位氧钒核糖核苷复合物、4单位Quant逆转录酶、1.8μg三磷脱氧核糖核苷、0.8μg氯化钠、0.4μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、3μg逆转录引物和50μL的40℃纯水充分震荡混匀后，将3μL步骤S2中的反应液加入其中，反应25min，反应的温度保持为37℃；
S4：制备检测液
将2单位脱氧核糖核酸聚合酶、1μg上游引物、1μg通用型下游引物与40μL的40℃纯水充分震荡混合后，将1μL的步骤S3混合液加入其中，在70℃条件下反应30s，然后在40℃条件下，反应2min，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’；
反应结束后通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA744。
实施例4
一种单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤：
S1：制备血清
取患者的静脉血5mL，以12000rpm转速离心15min分离得到的血清，离心的温度为40℃，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测；
S2：制备反应液
将0.1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.5μg谷胱甘肽、4单位多聚腺苷酸聚合酶、0.8μg核糖核酸、0.5μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1.5μg氯化钠、0.4μg乙二胺四乙酸、0.4μg三磷酸腺苷与50μL的40℃纯水充分震荡混合后，将1μL步骤S1得到的提取液加入其中，反应20min，得到反应液，反应的温度保持为35℃；
S3：进行逆转录
将1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、15单位焦磷酸二乙酯、4单位Quant逆转录酶、2μg三磷脱氧核糖核苷、0.8μg氯化钠、0.3μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、3μg逆转录引物和60μL的40℃纯水充分震荡混匀后，将1μL步骤S2中的反应液加入其中，反应30min，反应的温度保持为35℃；
S4：制备检测液
将3单位脱氧核糖核酸聚合酶、3μg上游引物、3μg通用型下游引物与60μL的40℃纯水充分震荡混合后，将3μL的步骤S3混合液加入其中，在70℃条件下反应30s，然后在40℃条件下，反应2min，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’；
反应结束后通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA744。
试验例1不同实验参数对试验结果的影响
对比例1-4：与实施例相对应的对比例实验中，除了步骤S2中不加入乙二胺二邻苯基乙酸钠以及步骤S3中不加入乙二胺二邻苯基乙酸钠外，其他实验步骤与相应的实施例各步骤完全相同，具体实验结果详见表2。
试验例2miRNA744样本检测
选取三组实验组和三组对照组通过实施例1-4和对比例1-4的检测方法进行miRNA744样本检测。56例经病理诊断为胰腺癌患者为实验组，其中46例为病理诊断已发生淋巴结或远端转移，20例为病理诊断未发生淋巴结或远端转移；24例健康人和26例胰腺炎疾病为对照组。
通过实施例1-4和对比例1-4的检测方法进行检测，样本的检测结果如表1-2所示：
表1利用实施例1-4随机检测116例临床病例miRNA744的结果
由表1可知，利用实施例1-4的检测方法进行检测时，实验组中66例胰腺患者的血清检测结果阳性率达到95％以上，而对照组中26例健康人和24例胰腺炎中仅有1例呈阳性，说明利用本发明的检测方法能够对miRNA744进行较为准确的检测。
表2利用对比例1-4随机检测116例临床病例miRNA744的结果
由表2可知，利用对比例1-4的检测方法进行检测时，实验组中66例胰腺患者的血清检测结果阳性率达到90％以上，而对照组中23例健康人和25例胰腺炎中有2例呈阳性，与表1的结果对比，说明步骤S2中加入乙二胺二邻苯基乙酸钠步骤S3中加入乙二胺二邻苯基乙酸钠，能够提高检测miRNA744的准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备血清
S2：制备反应液
将1-5μL的步骤S1得到的提取液作为待测样品与乙二胺二邻苯基乙酸钠、谷胱甘肽、多聚腺苷酸聚合酶、核糖核酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、乙二胺四乙酸和三磷酸腺苷的水溶液混合后，反应20-30min，得到反应液；
S3：进行逆转录
取1-5μL的步骤S2中的反应液，与乙二胺二邻苯基乙酸钠、RNA酶抑制剂、Quant逆转录酶、三磷脱氧核糖核苷、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和逆转录引物的水溶液混合后，反应20-30min，得到混合液；
S4：制备检测液。
2.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S1具体为：取患者的静脉血4-6mL，以12000rpm转速离心15min，分离得到的血清，然后利用纯化柱纯化后的提取液用于检测。
3.根据权利要求2所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S1中，离心的温度为35-40℃。
4.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S2中，反应的温度保持为35-40℃。
5.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述水溶液为0.1-1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1-1μg谷胱甘肽、3-5单位多聚腺苷酸聚合酶、0.5-1μg核糖核酸、0.1-1μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5-1.5μg氯化钠、0.2-0.6μg乙二胺四乙酸、0.01-0.4μg三磷酸腺苷和40-60μL的40℃纯水充分震荡混匀后形成。
6.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述水溶液为0.1-1μg乙二胺二邻苯基乙酸钠、10-15单位RNA 酶抑制剂、3-5单位Quant逆转录酶、1.5-2μg三磷脱氧核糖核苷、0.5-1μg氯化钠、0.2-0.5μg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2-4μg逆转录引物和40-60μL的40℃纯水充分震荡混匀形成。
7.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S3中，RNA酶抑制剂为异硫氰酸胍、焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S4具体为：将步骤S3中的混合液加入脱氧核糖核酸聚合酶混合液、上游引物和下游引物的混合物中，在70℃条件下反应30s，在40℃条件下，反应2min。
9.根据权利要求8所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S4中，所述混合物由2-4单位脱氧核糖核酸聚合酶、1-4μg上游引物、1-4μg通用型下游引物与40-60μL的40℃纯水充分震荡混合后形成。
10.根据权利要求8所述的一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于，步骤S4中，上游引物序列为：5’—TTGGGCAAGGTGCGGGGCTAGG—3’，上游引物序列为：5’—GACCGAGTAAGGTTGAGGTTAG—3’。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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