CN105331695B - 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 - Google Patents
一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105331695B CN105331695B CN201510740984.1A CN201510740984A CN105331695B CN 105331695 B CN105331695 B CN 105331695B CN 201510740984 A CN201510740984 A CN 201510740984A CN 105331695 B CN105331695 B CN 105331695B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- rna
- plasma
- sample
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 162
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 147
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 37
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 86
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 68
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 53
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 53
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 11
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 11
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 10
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 208000029618 autoimmune pulmonary alveolar proteinosis Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 3
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- -1 Takara) Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091092825 miR-24 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091032978 miR-24-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091064025 miR-24-4 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091043187 miR-30a stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091046841 MiR-150 Proteins 0.000 description 1
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 description 1
- 108091028049 Mir-221 microRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 240000001307 Myosotis scorpioides Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 108091023663 let-7 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091063478 let-7-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091049777 let-7-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108091064399 miR-10b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091031326 miR-15b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041042 miR-18 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091062221 miR-18a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091080321 miR-222 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091088477 miR-29a stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091029716 miR-29a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091092089 miR-29a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091066559 miR-29a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229940072651 tylenol Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法，属于分子生物学领域，采用miRFLP测定法，其步骤包括：待测样本与动态miRNA标准混合均匀，经过miRNA逆转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR扩增产物的荧光片段长度多态性分析，在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰，降低反应背景信号，避免miRNA3’末端同源序列的干扰；采用生物素‑琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉素磁珠富集逆转录及PCR反应物，增加上样量，减低方法误差，加入细菌RNA作为保护试剂，降低测定误差，本方法可以对0.4μl的样本进行直接测定，在128个分子的测定水平，测定变动范围降低至9.9％，本方法测定的灵敏度显著提高，测定误差范围显著缩小。
Description
技术领域
本发明涉及一种血浆miRNA定量检测的方法，尤其涉及一种直接对血浆miR-122进行绝对定量检测的方法。
背景技术
成熟miRNA是一类由22个碱基(nt)组成的、具有调控基因表达作用的单链小分子核糖核酸，镶嵌于4种Argonaute(Ago)之一的蛋白质中，形成RNA介导的基因沉默复合体(RISC)。RISC在mRNA上滑动，当在mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)区域遇上与miRNA互补的靶序列时，就会抑制利用该mRNA进行的蛋白质生产。miRNA是现今发现的唯一一类通过与被调控的靶基因3’-UTR碱基序列配对而发挥调控作用的调控因子，使miRNA与被调控的靶基因之间建立起独特的1对1或1对多的特异性，影响并参与维持细胞的生理状态和分化程度。通过对细胞的影响，特定miRNA表达量的变化影响并维持组织的特征，反映生物个体的生理病理特征，预示其作为鉴定多种疾病的生物标记的可能性。例如脊椎动物都拥有的、进化保守的miR-122，只在肝细胞中富集，每个肝细胞中所含拷贝数可达5万之多。不论何种原因导致肝细胞的损坏时，miR-122被释放，经血液带至全身，血液中的miR-122水平变化就可以揭示肝脏受损的情形。血液中富含RNA降解酶，因此游离RNA分子在血液中的存活期仅为几分钟，而成熟miRNA分子受蛋白质复合体的保护而不被降解。事实上，室温下放置24小时或10次以内反复冻融处理对血清miRNA浓度没有影响。血液，也包括其它体液，如脑脊液、尿液、泪液等含有的miRNA，都具有这样的特质，使其成为最具潜力的无创诊断生物标记物。
大量的文献报道，都证实血清miR-122水平升高可以专一地揭示肝细胞的实时损伤。肝细胞含有多达5万个miR-122(Bissels,2009)，肝脏一旦受到损害，受损肝细胞的miRNA释放到血液，引起血液miRNA水平的改变。健康人血液中miR-122的含量维持在每微升300个拷贝数左右。以成人4升血液计算，约100个肝细胞受损释放进入血液的miR-122可以使每微升血液miR-122的水平升高1.25个拷贝数，对应每微升血浆为2.5个拷贝。miRNA在血液中的半衰期小于24小时，因此血液中miR-122拷贝数的改变可以实时而专一地反映肝损害的程度。因此血液miR-122绝对分子数目的定量测定对于肝细胞损伤程度的实时研判具有特殊的意义，目前尚缺乏健康人血清miR-122浓度的基础值数据，和具有实用价值的miRNA客观测定方法。
目前应用的miRNA定量测定技术主要有：逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)、RNA-seq深度测序法、microArray杂交测定法、NanoString nCounter及纳米微孔测序法。这些测定方法有一些共同点，如：需要纯化的RNA、灵敏度低、内源性标准、数据校准等，测定结果为miRNA含量相对倍数，而非拷贝数。除了RT-qPCR法，其余方法均有测定灵敏度低的缺陷，如其中最灵敏的NanoString nCounter法的测定低限为1amol或6x10^5个分子以上的水平，而miR-seq和microArray的测定低限更高，0.1fmol分子以上，不满足临床诊断的需要。循环miRNA表达量的巨大变动，加上miRNA拥有超短的长度、相似的序列、二级构象、末端修饰、含有相同序列的前体及长度差异性等特性，给目前miRNA定量测定技术的客观性带来很大的挑战。
RT-qPCR等测定方法需要测定样本中至少一个内源性标准RNA分子作为衡量目标分子定量的基准值。这个(些)内源性标准RNA分子必须是在样本中恒量表达的。迄今为止，还没有发现理想的内源性标准RNA分子。有的测定方法，如NanoString nCounter利用表达丰度最高的前100个miRNA的平均值作为参照值，虽然在一些测定中这些校正方法可能有帮助，但没有从根本上摆脱对内源性标准RNA分子的依赖，得到的定量结果仍然是相对的。RNA极易被RNases降解，测定结果受样本采集方式、保存、纯化方法的影响导致不同的结论。这是影响利用RNA作分子诊断的最大障碍，为了克服这个障碍有赖于发现与所研究对象无关的‘看家基因’作对照。Beta-actin、GAPDH、U6、RNU24等基因为常用的对照基因，miR-16、miR-10b、miR-30a、miR-24等为常用的血清miRNA参照物，认为其表达水平是相对恒定不变的，但愈来愈多的研究发现这些常用的看家基因的表达与疾病或病理状态是相关的，不是理想的参照物。
测定技术的灵敏度决定了这些方法对RNA纯化富集的依赖，不可能直接测定血清样本中的miRNA的含量。例如，血清经加热处理后，可通过microArray杂交法可以直接测量其中高度富集的miRNA的含量，因方法定量底限为106拷贝以上，没有被广泛的采纳。
健康人血清中可以测到miR-122的存在，但含量极低，肝损伤患者血清miR-122浓度有上百倍的提升，因此对测定方法的灵敏度和测定范围要求极高，也正因为如此，RT-qPCR是目前应用于血清miRNA定量最灵敏的技术。qPCR定量法以DNA在PCR扩增的循环数来间接地反映初始DNA/RNA的浓度，有两种报道方式：相对定量的扩增倍数和拷贝数的绝对定量。前者需要在样本中同时测定目标miRNA和可以作为内参标准的恒定表达的RNA,以二者间的循环数之差，来衡量目标miRNA的浓度差异。后者需要进一步对独立测定的系列稀释的合成RNA片段进行测定，得到校正曲线，从而获得待测物的绝对分子拷贝数目。前者可以通过对内参RNA的同时测定来排除样本杂质对PCR效率的影响，但迄今还没能发现理想的内参标准。后者可以给出更易于理解的miRNA拷贝数，但需要分别测定的校正曲线进行勘校，不能排除样本杂质对PCR效率的影响，因此也对纯化RNA的质量要求极高，难于大规模应用和客观重复。
RNA提取步骤给循环miRNA定量测定造成很大的误差和不确定性。McDonald等人测定RNA纯化步骤对相同血清样本含量颇丰的miR-15b、miR-16、miR-24的定量结果的误差达到1倍以上(McDonald，2011)。不同个体或不同处理的血清样本更会对定量结果产生不可预估的影响。RNA提取步骤带来的测定误差，也与提取的方法和不同商家的提取试剂盒有关。Brunet-Vega等人分析了用5种RNA提取试剂盒分离纯化的血浆RNA中miR-18a/miR-21/miR-29a的含量，尽管PCR步骤的重复性很好，不同样本间参入的合成RNA参照物的测定误差超出了容忍的范围，总有一些miRNA的PCR扩增效率受到不同程度的影响，揭示了使用外源合成RNA参照物衡量血浆miRNA水平的难度(Brunet-Vega,2015)。
循环miRNA定量测定结果的客观性和重复性，受到样本类型、个体差异、RNA提纯及所使用的miRNA测定技术平台的影响。miRNA定量检测方法的客观性、灵敏度及标准化是将研究成果转化为临床疾病诊断应用的瓶颈和关键，对过去8年循环miRNA研究结果的总结，一致认为miRNA的测定技术尚不能满足临床诊断的需求。
为了抗衡RNA纯化、样本质量及机器、操作、耗材等外在因素对miRNA测定结果的影响，本申请的发明人开发了通过DNA片段长度多态性荧光定量分析来完成miRNA的分子数绝对定量检测的方法(即miRFLP定量分析法)。miRFLP测定法，采用欧米伽引物对样品中miRNA和内置RNA标准在同一反应管中进行同时检测，由同步测得的标准分子数量为动态定量的标准尺度，获得待测miRNA的相对峰值，从而滤掉样本杂质和RNA片段对反应效率的影响，通过对比实测的标准曲线而得到miRNA绝对拷贝数。这样做，对RNA纯度的要求大大降低，可对未经纯化的样本中少至10个拷贝数的目标miRNA进行直接测定，实现对miRNA的客观定量测定，参见中国专利申请CN2014103626962，CN 2012101083125。但这样的操作，不能像纯化RNA那样对样本产生富集作用，上样量仅为0.4μl，经过PCR反应前的稀释，实际测定样本体积仅为0.02μl，产生较大的测定误差，限制了方法的应用。
免抽提miRFLP测定法也可直接用于对细胞或血浆裂解液中游离miRNA和蛋白质复合物中的miRNA进行定量测定，但是，健康人每微升血浆miR-122含量仅为数百个，miRFLP直接测定法需要对样本进行稀释以降低3’适配寡聚核苷酸引物对RT及PCR反应的影响。miRFLP直接测定法的实际测定最大样本量为0.02μl，在412个分子水平时，miR-122的测定变动范围为21.7％，因此方法灵敏度和测定误差范围均有待提高。细胞产生的分泌泡也经血液进行代谢，分泌泡内含有对病理状态更具诊断意义的生物标记物。细胞分泌泡包含各种细胞组份，有RNA、蛋白质、miRNA前体等，也包括受蛋白质复合物保护的成熟miRNA。由于受细胞膜的保护，免抽提miRFLP测定法无法测定细胞分泌泡里面的miRNA。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种改进的miRFLP测定方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法，采用miRFLP法，其步骤包括：将待测miRNA样本与动态miRNA标准混合均匀，然后经过miRNA逆转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR扩增产物的荧光片段长度多态性分析，在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰。
作为优选的技术方案:对待测样本进行预处理,所述预处理采用的预处理试剂为10％或90％的二甲基亚砜，预处理方式为室温孵育或加热处理。具体方法为：将待测miRNA样本与预处理试剂混合，室温孵育或加处理，然后再与动态miRNA标准混合。
作为优选的技术方案：所述对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰的方法为碳链修饰或氨基修饰或增加一个与所述适配寡聚核苷酸链序列相同的寡聚核苷酸链。
作为优选的技术方案：对miRNA逆转录产物及PCR反应物进行富集。
作为进一步优选的技术方案：富集时采用生物素-琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉素磁珠。
作为优选的技术方案：所述待测miRNA样本为含有miR-122的样本。
作为进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本来自血浆、血清、血液或体液，待测miRNA样本不经过RNA提取，直接进行检检测。
作为进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本中加入细菌RNA。
作为进一步优选的技术方案：在低温冷冻保存样本时，加入10％的二甲基亚砜以保持细胞分泌泡的完整性
作为更进一步优选的技术方案：所述待测miRNA样本中加入表面活性剂，在75℃下保温3min，以释放受蛋白质保护的miRNA。
作为优选的技术方案：所述miRNA逆转录过程中，采用的引物为经过生物素标记的欧米伽引物。
现有的miRFLP定量分析方法，其步骤如图1中A所示，首先利用欧米伽引物对miRNA进行逆转录，以miRNA为模版合成出相应的欧米伽引物次生探针。用含有与相应次生探针序列和PCR靶点序列互补的适配寡聚核苷酸链(adapter)为模版，利用新生成的欧米伽引物次生探针进行cDNA加尾，形成PCR扩增模版。最后用一对荧光标记的PCR通用引物对反应中所有PCR扩增模版进行竞争性同步扩增，完成miRFLP的反应步骤。该方法的缺陷是适配寡聚核苷酸链既可以作为欧米伽次生引物的模版，也可用作为DNA合成引物。利用产物的长度，适配寡聚核苷酸链作为欧米伽次生引物的模版可以精确地区分成熟miRNA与其前体产生的片段，但作为引物时，不能区分miRNA的成熟体及前体的降解产物。本发明对适配寡聚核苷酸链的3’末端进行了一系列的修饰，阻止适配寡聚核苷酸引发的多聚反应。采用的修饰方法可以是对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰，如碳链修饰，可以改造寡核苷酸的空间距离，修改和抑制DNA聚合酶活性；必要时也可以加长碳链长度，达到所需的效果。其它的修饰方法如对适配寡聚核苷酸链3’末端进行氨基修饰等，也可达到同样的效果。在适配寡聚核苷酸链的3’末端加上一个序列相同的寡聚核苷酸短链，如：AATTAAA，也可起到阻止DNA聚合酶活性的功效。这样3’末端修饰过的适配寡聚核苷酸链，只能用作模版，用于对待测miRNA的长度进行精确分析，本发明的定量分析检测方法如图1中的B所示，在适配寡聚核苷酸3’末端加上不同的序列，也能使从适配寡聚核苷酸链产生的PCR产物用长度差异加以区分。
欧米伽引物可以专一识别miRNA 3’末端，低温杂交条件下高效地逆转录捕获的miRNA；适配寡聚核苷酸链序列与目标miRNA的序列互补，可以识别miRNA5’末端。miRNA前体等RNA片段可能生成的欧米伽次生探针与adapter序列产生错配，或无法延长，或产生不同长度的PCR扩增模版。
本发明中，优选采用生物素标记的欧米伽引物对短链RNA进行捕获，RT反应，然后用琼脂糖链霉素或链霉素磁珠进行纯化，使样本的实际上样量达到0.4μl，并因此大大改善了方法的测定误差。
游离RNA极易受到核酸酶攻击而降解，难于保存和定量，一直是RNA临床诊断应用的难题。循环miRNA受蛋白质包裹保护，部分循环miRNA还可能进一步受到细胞分泌泡脂质膜的保护，因而异常的稳定。将miRNA从蛋白质中释放后用RNA酶抑制剂(RI)保护，可直接进行测定，避免样本收集、运输、保存、RNA纯化过程带来的丢失和降解。已有用RT-qPCR技术对血清样本中miRNA利用高浓度表面活性剂(1.25％Tween-20)裂解，直接测定的实验报道，但没有考虑到样本个体差异和酶反应效率的影响，高浓度表面活性剂对反应的抑制，因而没有实用价值。利用内置标准RNA的miRFLP测定法可以排除样本个体差异和反应效率的影响，客观地对不同样本中的miRNA释放处理后直接进行定量测定，避免了RNA的提取，简化操作，避免RNA丢失和降解，降低测定误差和增加测定的重复性。
血浆样本中核酸酶活性各不相同，加上循环miRNA的含量低，因此，核酸酶的降解以及试管管壁的吸附均可对定量结果带来不可预期的影响。本发明的免提取miRFLP直接测定法，优选利用细菌RNA作为保护载体对血浆进行稀释，对样本进行保护，增加测定的重复性，尤其是对低含量循环miRNA的测定。所述细菌可以采用大肠杆菌DH5a等等。原核生物不产生miRNA，因此任何一种细菌产生的RNA均可用于本发明作为miRNA测定时的RNA保护载体。测试结果表明，10ng/μl的细菌RNA对表2是对用TRIZol试剂纯化的肝损伤患者血浆RNA和血浆直接测定结果的比较。由于RNA纯化过程的丢失和降解，纯化RNA的定量结果低于血浆直接测定的结果，仅为直接测定结果的33.5％-38.9％。人工合成RNA或M2噬菌体RNA等不含有待测miRNA片段的RNA均可作为细菌RNA的代替物。
经过上述改进的免提取miRFLP直接测定法在检测的专一性、灵敏度和重复性方面均有提高，可用与于对血浆中循环miR-122和循环miR-451的直接测定。对25个健康人血浆测定结果显示，女性循环miR-122的平均值为每微升血浆1409个分子，男性每微升血浆含3169个分子。对这两组数据进行t-检验，得出的P值为0.046，显示二者的差别具有统计意义。而血浆miR-122水平与年龄的统计结果显示没有关联。与常用的肝损伤血清学指标ALT、AST等相比，循环miR-122显示出更好的灵敏度。对8个ICU住院病人血浆miR-122的测定结果，证实循环miR-122高表达是一个普遍现象。
血浆miRNA可以在低温条件下长期保存，并在经历了10次以上的反复冻融后，纯化RNA为测定样本，含量不会发生明显的改变。miRNA在血浆中的存在形式有两种，大部分血浆miRNA嵌合于ago蛋白质内，如血浆中的miR-122/21/155等，成熟miRNA主要被蛋白质包裹的形式存在(游离miRNA)；而let-7/miR-451等则除了被蛋白质包裹，还进一步被细胞分泌泡裹挟。细胞分泌泡的多寡与被检测目标的生理病理状态有关，如肿瘤病人血浆中细胞分泌泡的数量就比正常人高出数倍。目前还没有直接的测定方法对DNA、RNA和蛋白质在血浆中不同存在形式的数量比例作出准确的评估。免抽提miRFLP测定法利用加热松散蛋白质结构，释放出miRNA，并进行定量测定，因为表面活性剂含量甚微，不破坏膜结构，因而不能测定细胞分泌泡中的RNA。因此，miRFLP测定法测定的是自由态的、蛋白质包裹的miRNA。在不加入冻存保护剂时，反复冻融对细胞分泌泡膜结构造成破坏，释放出的miRNA会增加血浆中能被免抽提miRFLP检测法检测到的。
活细胞冻存时，优选加入冻存保护剂，如二甲基亚砜或甘油，增加膜的通透性，避免微晶的形成，降低细胞受冻融过程所受的损伤。没有冻存保护剂，反复冻融对细胞膜结构造成破坏，破坏的程度与冻融次数有关。细胞分泌泡(exosome)的膜成份来自细胞膜，二者具有相同的特性。用反复冻融的方法处理，血浆中细胞分泌泡裹挟的内含物可以随着膜结构的破坏而释放，增加样本中能被免抽提miRFLP检测法检测到的miRNA的数量。10％的二甲基亚砜避免水溶液形成微晶，增加细胞膜的通透性，广泛应用于细胞的冻存保护；血浆中加入10％的二甲基亚砜可以在低温冻存时保存细胞分泌泡的完整性，可用于区分细胞分泌泡内外的物质成份及含量的分别测定。高浓度二甲基亚砜使蛋白质变性，并在浓度达到93％时使蛋白质完全结晶，灭活核酸酶。含90％二甲基亚砜的血浆在20℃温度下不影响细胞分泌泡的膜结构，加热后，膜结构被破坏，miRNA游离出来，增加被检测目标的浓度，测定结果与经过6次及以上的冻融处理引起血浆miR-122/451浓度的升高一致。含90％二甲基亚砜的血浆，经加热处理，可释放出细胞分泌泡内的物质，具有与经过6次及以上反复冻融相等的效果。含10％二甲基亚砜的血浆在20℃的低温条件下对RT及PCR反应没有抑制作用，并增加细胞膜的通透性，降低miRFLP测定处理过程中对膜结构的损伤。在本发明中，10％浓度的二甲基亚砜用于血浆冷冻保存时对细胞分泌泡完整性的保护，和游离蛋白质包裹的miRNA的测定；90％浓度的二甲基亚砜则用于对细胞分泌泡包裹的miRNA或RNA或DNA的测定。
本发明进一步应用是制备任何用于miRNA测定的试剂或试剂盒套装。本发明可以单独进行商业化利用，也可以作为特定应用试剂盒的组成部分。本发明也包括在任何试剂盒、服务、指导和手册中利用免抽提miRFLP直接测定法对待测miRNA相对荧光强度的计算方法。也包括在任何试剂盒、服务、指导和手册中利用对数回归方程模型作为miRNA相对荧光强度-miRNA分子数校正曲线换算miRNA绝对数目的计算方法。
以上的描述说明仅以miR-122为例，不应解读为对本发明应用范围的限制。成熟miRNA、siRNA具有与miR-122一样的物理、化学特性，将上述的miR-122改为miRNA或siRNA一样适用。本发明也适用于鉴定各种大分子RNA中的一段或几段较小的序列，从而达到对体液中各种不同RNA片段的定性、定量测定。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)利用3’修饰的适配寡聚核苷酸，降低反应背景信号，避免RNA3’末端同源序列的干扰；
(2)利用比如生物素-链霉素偶联试剂对RT及PCR反应物进行富集，增加上样量，减低方法误差；
(3)加入细菌RNA作为保护试剂，降低测定误差；
(4)经过改进的miRFLP直接测定法可以对0.4μl血浆进行直接测定，比现有的方法提高了20倍；在128个分子的测定水平时，测定变动范围降低至9.9％，比现有的方法降低50％以上，检测的专一性、灵敏度和重复性方面均有显著提高。
(5)利用90％浓度的二甲基亚砜对样本预处理，可以对游离miRNA和细胞分泌泡内含miRNA的进行区别定量测定。
附图说明
图1：miRFLP的测定原理图；
图中A为现有的即改进前的miRFLP的测定原理；B为本发明即改进后的miRFLP的测定原理；
图2：不同浓度SDS、Triton X-100以及Tween-80对miRFLP测定法的影响。
图3：免抽提miRFLP直接测定法测定血浆miR-122浓度的线性范围评估结果图。
图4：冻融次数对血浆miR-122浓度测定的影响。
图5：冻融次数对血浆miR-451浓度测定的影响。
图6：APAP处理的小鼠肝病理组织学分析-HE染色对肝损伤诊断比较。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：不同浓度SDS、Triton X-100以及Tween-80等对miRFLP测定法的影响
许多表面活性剂，如SDS、Tween-20、Triton X-100等，在低浓度时可以促进DNA合成，常用于增加RT或PCR反应效率。高浓度表面活性剂抑制酶反应效率，但也可帮助溶解细胞膜成份，以及解离蛋白质的三级结构。发明人将100mm培养皿中达到90％饱和度的H1299细胞用胰酶消化，经过PBS洗涤后等分为6份，加入PBS、0.5％SDS、1％Triton X-100、0.5％Tween-80，进行裂解。经75℃加热5分钟后，迅速冰上冷却，混匀后经10000g离心10分钟，取上清，用miRFLP测定法对miR-15a/b,miR-155,miR-222进行测定。稀释样本使每个RT反应中所含的表面活性剂浓度如图2中所示。由于每个反应中动态分子标准是恒量的，其最终的扩增效率可以用来衡量不同浓度表面活性剂对miRFLP测定反应效率的抑制影响，其结果见图2，图2中，样本13为没有样本miRNA目标的方法对照，显示一条分子量为120nt–127nt的动态分子标准带；样本1–6除了动态分子标准带，在90nt左右有一个miR-15a/b的强带，产物的亮度显示不同处理方式对RT/PCR反应效率的综合影响程度。从图2的结果比较可以看出，0.02％的Tween-80、0.04％的Triton X-100以及0.004％的SDS对miRFLP测定反应的效率抑制影响不大。低于相应浓度的表面活性剂溶液可以用来裂解蛋白质，帮助miRNA从蛋白质复合物中释放。
实施例2：3’末端修饰的适配寡聚核苷酸链对miRFLP测定法的影响
利用检测miR-150/146a/222/146b的miRFLP测定法，将cDNA延长所用的适配寡聚核苷酸链用3’末端加上“AATTTAA”的适配寡聚核苷酸链，对三个不同浓度的miRXref miRNA参照物进行测量比较，结果列于表1。采用3’末端修饰后的适配寡聚核苷酸链得到的荧光强度读值，普遍比3’末端未经修饰的适配寡聚核苷酸链得到的荧光强度读值低。修饰的适配寡聚核苷酸链没有引物功能，减少非特异PCR模版的数量，更好地维持了方法测定的线性关系。荧光强度的检出可利用增加PCR循环数或降低稀释倍数加以提高，弥补PCR模版下降带来的测定底限的降低。如图1B所示，利用3’末端修饰的适配寡聚核苷酸链可以区分成熟miRNA与其前体，这个实验证实了给适配寡聚核苷酸链加上与所测RNA不配对的序列，不影响miRFLP测定方法。发明人也用了短链碳代替寡聚核苷酸对适配寡聚核苷酸链的3’末端进行修饰，均得到类似结果。
表1：3’末端修饰的适配寡聚核苷酸链对miRFLP测定法的影响。
实施例3：免抽提miRFLP直接测定法的性能分析
综合改进后的免抽提miRFLP直接测定法的操作过程如下：将待测目标miRNA与动态miRNA标准混合均匀，经过miRNA逆转录、cDNA加尾修饰、用琼脂糖链霉素偶联试剂对生物素标记的欧米伽产物进行富集和纯化、荧光PCR同步扩增处理，最后用DNA测序仪进行DNA片段长度和荧光定量的分析：
RNA变性液：5μl 1％Tween-80,200μl 5xRT缓冲液，100μl ddH2O；动态分子标准混合液；2μl RNA动态分子标准(含：standard 1RNA(动态分子标准1，下以此类推)：12万；standard 2RNA：2万；standard 3RNA：3340；standard 4RNA:600，动态分子标准的RNA序列见表12，其碱基序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，0.2μlRNase Inhibitor，1.8μl ddH2O；用10ng/μl的细菌RNA溶液稀释miRNA定量标准(miRXrefreference)，稀释后的miRNA分子标准依次为，每μl 200,000、40,000、8,000、1,600、320、64、13拷贝。将6μl RNA变性液同2μl待测RNA样本(或不同稀释度的miRNA定量标准)混合，加热至75℃，3分钟，冰上冷却。加入4μl动态分子标准混合液，混合均匀。再加入4μl 5nM 5’生物素标记的欧米伽探针混合物(含：针对standard 1，2，3，4及miRNA目标的探针，探针序列见表13，其碱基序列分别为SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.21)。混合均匀后进行杂交，杂交反应条件为：63℃10分钟，进入5次循环：55℃1min–20℃1min，然后维持在4℃。加入4μl逆转录酶混合液(2μl MMTV逆转录酶，1μl dNTP，1μl水，Takara)，混匀后进入40次温度循环：4℃1分钟，20℃1分钟，37℃1分钟，55℃1分钟。最后85℃变性5分钟。加入60μl 3’末端加尾的适配引物缓冲液(30μl JumpStartTMTaq ReadyMix，10nM 3’末端加尾的适配寡聚核苷酸,1μl0.1ug/μl RNase A，30μl无菌水，Sigma)，cDNA反应依次在不同温度下保温：95℃2分钟,60℃10分钟,(72℃1分钟–37℃3分钟)x20次,72℃5分钟,保存在室温。加入10μl琼脂糖链霉素，混匀，吸附10分钟，798g离心2分钟,吸走上清液，加入100μl 1xTE，混匀，798g离心2分钟，去除上清液。加入由15μl JumpStartTMTaq ReadyMix(Sigma)，0.5uM PCR引物和15μl水配成30μl的PCR反应液，进行荧光PCR扩增，PCR反应条件为：95℃2分钟，40次温度循环：95℃10秒-68℃3分钟-72℃30秒。最后在72℃孵化10分钟。通用PCR引物为：[5’Fam]GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTA及CACCGACAGGAGACCTGTTCT(GenScript)。反应完成后，将PCR产物以1:20或1:50的稀释度稀释后用ABI 3730xl型DNA分析仪进行荧光片段长度多态性分析。
表2显示了对稀释后的miRNA分子标准，miRXplore Universal Reference(Miltenyi Biotec)的三次独立测定值的方法误差，表中括号中的数值是改进前miRFLP测定法测底结果的方法误差。每个反应中所含合成miRNA分子数分别为:400,000、80,000、16,000、3,200、640、128、26个等量混合的miR-30a/122/192a/92a/451合成小RNA以及空白对照。每个测定反应均设置三次重复实验，以判定测定的误差范围。表2列出了三组重复实验所得不同分子数水平的相对荧光强度的误差范围，显示出miR-122的miRFLP分析法的有效定量检测范围为128-80,000个，在此分子数范围的检测误差范围小于20％，并可在此检测范围外对待测目标作出相对定量的测定。与不同分子数水平的目标miRNA经由改进前miRFLP测定法测定的检测误差相比，改进后的miRFLP分析法显示出的miRNA定量测定范围、检测误差水平，均大大超出改进前miRFLP测定法，改进后的miRFLP分析法的精确度见表3，与改进前的精确度比较见表4。括号中的数值是改进前miRFLP测定法的精密度误差。
表2：用miRXplore Universal Reference(Miltenyi Biotec)作miRNA分子标准，三次独立测定结果在不同分子数水平的误差范围。
括号中的数值是改进前miRFLP测定法的精密度误差。
表3：改进后miRFLP测定法的方法精确度。
括号中的数值是改进前miRFLP测定法的精密度误差。
表4：与改进前miRFLP测定的精密度的比较结果。
括号中的数值是改进前miRFLP测定法的精密度误差。
实施例4：不同温度下加热处理对血浆miRNA释放的影响
发明人对血浆进行了免抽提miRFLP直接测定，首先将血浆用10ng/μl的细菌RNA溶液以1:10稀释，取2微升与6微升RNA变性液混合，分别加热至75℃、85℃、95℃各3分钟，冰上冷却。余下的操作步骤与实施例3所述相同。
结果如表5所示，75℃保温3分钟给出最大的miRNA检出值，随着温度升高，检出值下降。变性温度低于75℃时，不能将核酸酶完全灭活，影响RNA的测定。
表5：变性温度对循环miRNA定量测定的影响。
浓度单位：miRNA拷贝数/微升血浆。
实施例5：细菌RNA对血浆miRNA的保护作用实验
血浆中miRNA含量一般较少，受血浆中核酸酶的降解影响较大。利用血浆直接测定时，上样量受到限制，容易因管壁吸附，造成损失，增大血浆直接测定产生的测定误差。在样本中加入适量的载体RNA可以减少吸附损失，减少核酸酶对miRNA的降解，降低测定误差。将两个病人的血浆用RSB缓冲液及含有10ng/μl细菌RNA(大肠杆菌DH5a)的RSB缓冲液分别稀释，然后进行测定，具体的操作步骤与测试实例3中所述相同。结果如表6所示，在S1-1血浆中加入细菌RNA对血浆miR-122有明显的保护作用。发明人用M2噬菌体RNA和合成的RNA代替细菌RNA进行了同样的测试，均得到类似的结果。
表6：细菌RNA对miRNA定量测定的保护作用。
浓度单位：miRNA拷贝数/微升血浆。
实施例6：RNA纯化步骤和血浆直接测定对miRNA定量效果影响的比较
将2μl血浆用200μl TRIZol LS试剂进行处理，混匀后加入100ng的细菌RNA。匀浆按商家推荐的标准操作步骤进行纯化处理，RNA在-20℃下用酒精过夜沉淀。样本重复三次。发明人对等量的血浆和纯化RNA进行免抽提miRFLP直接测定，操作步骤与测试实例3所述相同，所得结果列于表7。以血浆直接测定的结果为基准值，即使加入了大量细菌RNA作为保护剂，RNA纯化后测定结果的回收率仅为35％左右。样本中不同miRNA，miR-122及miR-451的回收率均接近35％，间接说明RNA纯化、miRFLP测定以及免抽提miRFLP直接测定过程中均没有发生miRNA的选择性丢失。
表7：等量血浆miR-122/451直接测定结果与经RNA纯化后测定结果的比较
表7中各miRNA的测定率以血浆直接测定值为基准值，100％。
实施例7：免抽提miRFLP直接测定法的检测线性范围评估。
发明人选取了两个血浆N1和N11进行免抽提miRFLP直接测定，用以对免抽提miRFLP直接测定法的检测线性范围进行评估。每μl N1血浆约含200,000个miR-122,每微升N11血浆约含800个miR-122。用N1与N11血浆以1:1混合，得到N2；再以N2与N11以1:1混合得到N3；以此类推，得到混合样本N2至N10。将N1–N11血浆用10ng/μl的细菌RNA溶液以1:10稀释，每个样本重复四次。取2微升稀释液与6微升RNA变性液混合，加热至75℃3分钟，冰上冷却。余下的操作步骤与测试实例3所述相同，唯一的改变为：用2微升
MyOneTMStreptavidin C1代替10微升的琼脂糖链霉素试剂。依据CFDA的《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》及美国临床实验室标准化组织(Clinical and LaboratoryStandards Institude以下称为CLSI)的相关标准为依据，对所得结果进行线性范围评估，结果如图3所示，显示本发明的免抽提miRFLP直接测定法的检测线性范围在844–212585拷贝数/微升血浆的浓度区间有良好的线性回归拟合，满足临床对miRNA分析的要求。表8中为回归方程及精密度检测，结果显示，不精密度
满足判断式,说明数据的精密度好可作线性评价。
表8回归方程及精密度检测：
测试实例8：冻融次数对血浆miR-122/451浓度测定的影响。
在不加入冻存保护剂的条件下，反复冻融对膜结构造成破坏，破坏的程度随着冻融次数而增加。用反复冻融的方法处理血浆，分泌泡中的miRNA可能随着释放的miRNA会增加血浆中能被免抽提miRFLP检测法检测到的miRNA的数量。将血浆S11-1均匀分装成20微升，冻于-20℃的冰箱，温度范围为-14℃至-28℃。4-12小时后在室温解冻，血浆完全融化后，混匀，此为一个完整循环。将分装的血浆样本用不同次数的循环反复处理，然后进行测定，具体的miRFLP测定操作步骤与测试实例3中所述相同。结果显示，经过5次以内的冻融处理对血浆miR-122/451的浓度没有明显的影响(图4和图5)，但经过6次及以上的冻融处理引起血浆miR-122/451浓度的明显升高，miR-451的浓度升高达到12倍，见表9。有意思的是，5次以内的冻融处理对血浆miRNA浓度测定的误差变动很小，仅为8.9％和19.3％，说明5次以内的冻融处理对分泌泡膜结构没有大的影响。6次以上及10次以下的冻融处理是血浆miRNA的浓度测定值大幅升高，而误差变动也仅为12.1％以下，说明冻融6次后可以完全破坏分泌泡膜结构。miRNA测定量在细胞分泌泡被破坏后达到最大值，随着进一步的冻融处理而出现降低，
表9：反复冻融处理对血浆miRNA浓度测定的影响。
单位:miRNA拷贝数/微升血浆
测试实例9：二甲基亚砜对血浆miR-122/451浓度测定的影响。
二甲基亚砜对细胞分泌泡进行保护可以影响血浆miR-122/451浓度的测定。将血浆S11-1用不同浓度二甲基亚砜进行稀释，然后分成两组进行加热处理。一组在20℃孵育5分钟，另一组在50℃孵育5分钟，加入细菌RNA及RI，然后进行免抽提miRFLP测定，具体的测定操作步骤与测试实例3中所述相同。10％的二甲基亚砜避免水溶液形成微晶，增加细胞膜的通透性，广泛应用于细胞的冻存保护；高浓度二甲基亚砜使蛋白质变性，并在浓度达到93％时使蛋白质完全结晶。免抽提miRFLP测定结果显示，不同二甲基亚砜浓度也对免抽提miRFLP测定结果造成不同的影响。90％的二甲基亚砜使蛋白质变性(其中包括核酸酶)，保护蛋白质松弛后游离的miRNA不受降解，测得的结果与经过5次以内冻融处理血浆的miR-122/451浓度一致。90％的二甲基亚砜在20℃温度下不影响细胞分泌泡的膜结构，加热后，膜结构被破坏，miRNA游离出来，增加被检测目标的浓度，测定结果与经过6次及以上的冻融处理引起血浆miR-122/451浓度一致。90％的二甲基亚砜在50℃加热处理具有与经过6次及以上反复冻融相等的效果。
含10％二甲基亚砜的血浆经加热处理后，抑制RT反应，但在20℃的低温条件下对RT及PCR反应没有抑制作用，并增加细胞膜的通透性，降低miRFLP测定处理过程中对膜结构的损伤，因此测定的结果是游离蛋白质包裹的miRNA部份。随着二甲基亚砜浓度的增加，更多被蛋白质包裹的miRNA游离出来，相继被核酸酶降解，直到浓度达到90％，达到能够抑制核酸酶活性的临界点。同样的趋势在miR-122/miR-451均可重复的表现出来。
表10：二甲基亚砜对血浆miR-122/451浓度测定的影响。
单位:miRNA拷贝数/微升血浆
测试实例10：对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤与循环miR-122浓度的关系
我们利用对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导小鼠肝损伤模型，评估循环miR-122浓度与肝损伤程度的关系。选用的药物为市售的泰诺，含APAP，分为三个剂量组，高剂量组300mg/kg体重(HD)、中剂量组150 mg/kg体重(MD)、低剂量组50mg/kg体重(LD)。小鼠经口服APAP的LD50为338mg/kg，腹腔注射LD50为300mg/kg。BALB/C小鼠6-8周龄，雌雄各半，灌胃前禁食12小时，口服。给药后2小时、8小时、24小时和48小时进行血样采集，每只动物采集到抗凝血样约100-200微升。检测循环miR-122/451的表达水平，并取循环miR-122/451高表达的小鼠肝脏做病理切片，进行病理组织学分析。循环miRNA的测定和病理组织学分析均以盲样实验的方式进行。给药2小时后，循环miR-122浓度在不同剂量组均有不同程度的升高，8小时时持续升高，在24小时左右达到最大浓度，并在48小时时有所降低。选取各时间段的肝组织进行病理组织学分析，可见肝损伤与循环miR-122浓度具有相关性，表11。图6病理图片上标注为小鼠耳牌号和所使用物镜的放大倍数，相应的处理方式和所测得的血清miR-122浓度见表11。
表11：APAP处理的小鼠肝脏中循环miR-122浓度与肝损伤的病理组织学分析比较。
表12：动态标准RNA的序列。
表13：探针序列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1. 一种非诊断目的的直接对miRNA 进行绝对定量检测的方法，其中采用miRFLP 法，其步骤包括：将待测miRNA 样本与动态miRNA 标准混合均匀，然后经过miRNA 逆转录、cDNA加尾、PCR 同步扩增及PCR 扩增产物的荧光片段长度多态性分析，其特征在于：先对待测miRNA样本进行预处理, 所述预处理方式为采用质量百分浓度10％的二甲基亚砜室温20℃孵育，或采用质量百分浓度90％的二甲基亚砜50℃加热处理，所述待测miRNA样本来自血浆，所述待测miRNA 样本经过所述预处理后，不经过RNA 提取，直接进行检测；并且在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰，所述对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰的方法为碳链修饰或增加一个与所述适配寡聚核苷酸链序列相同的寡聚核苷酸链，以阻止适配寡聚核苷酸引发的多聚反应。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：对miRNA 逆转录产物及PCR 反应物进行富集。
3.根据权利要求2 所述的方法，其特征在于：富集时采用生物素-琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉素磁珠。
4.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述待测miRNA 样本预处理后加入细菌RNA，然后进行检测。
5.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：在-20℃保存待测miRNA 样本时，加入10％的二甲基亚砜。
6.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述miRNA 逆转录过程中，采用的引物为经过生物素标记的欧米伽引物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510740984.1A CN105331695B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
| PCT/CN2016/102786 WO2017076172A1 (zh) | 2015-11-04 | 2016-10-21 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510740984.1A CN105331695B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105331695A CN105331695A (zh) | 2016-02-17 |
| CN105331695B true CN105331695B (zh) | 2020-02-11 |
Family
ID=55282458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510740984.1A Active CN105331695B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105331695B (zh) |
| WO (1) | WO2017076172A1 (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105331695B (zh) * | 2015-11-04 | 2020-02-11 | 成都诺恩基因科技有限公司 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
| CN107385014B (zh) * | 2017-06-13 | 2020-12-22 | 深圳大学 | 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法 |
| CN108707663B (zh) * | 2018-04-19 | 2022-03-08 | 深圳华大基因股份有限公司 | 用于癌症样本miRNA测序定量结果评价的试剂、制备方法和应用 |
| CN109517928B (zh) * | 2018-12-05 | 2020-02-07 | 中南大学湘雅二医院 | 乙型肝炎病毒miR-3和人肝脏特异性miR-122三重荧光定量PCR检测试剂盒 |
| CN113736913B (zh) * | 2020-05-28 | 2023-08-29 | 成都诺恩基因科技有限公司 | 基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒 |
| CN111534569A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-14 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用 |
| CN113151398A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-07-23 | 广州复能基因有限公司 | 外泌体中核酸分子的检测方法 |
| CN116926168B (zh) * | 2023-09-18 | 2023-12-22 | 南方科技大学 | 一种二级信号放大的microRNA检测方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102618651A (zh) * | 2012-01-19 | 2012-08-01 | 成都诺恩生物科技有限公司 | 一种用于短链rna检测的欧米茄结构寡核苷酸引物及其应用 |
| CN102851352A (zh) * | 2011-06-27 | 2013-01-02 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法 |
| CN103866009A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-18 | 东华大学 | 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法 |
| CN104120184A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-10-29 | 成都诺恩生物科技有限公司 | 一种利用扩增dna片段长度多态性测定短链rna的方法 |
| CN104894251A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-09 | 基因科技（上海）有限公司 | 一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070054287A1 (en) * | 2005-05-31 | 2007-03-08 | Applera Corporation | Method for identifying medically important cell populations using micro rna as tissue specific biomarkers |
| WO2007032817A2 (en) * | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Applera Corporation | Pure mirna sample preparation method |
| KR20130140934A (ko) * | 2012-05-09 | 2013-12-26 | 삼성전자주식회사 | 세포주, 세포 배양액 또는 생체 시료의 마이크로베지클로부터 마이크로ｒｎａ를 직접 추출하는 방법 |
| CN105331695B (zh) * | 2015-11-04 | 2020-02-11 | 成都诺恩基因科技有限公司 | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 |
-
2015
- 2015-11-04 CN CN201510740984.1A patent/CN105331695B/zh active Active
-
2016
- 2016-10-21 WO PCT/CN2016/102786 patent/WO2017076172A1/zh active Application Filing
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102851352A (zh) * | 2011-06-27 | 2013-01-02 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法 |
| CN102618651A (zh) * | 2012-01-19 | 2012-08-01 | 成都诺恩生物科技有限公司 | 一种用于短链rna检测的欧米茄结构寡核苷酸引物及其应用 |
| CN103866009A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-18 | 东华大学 | 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法 |
| CN104120184A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-10-29 | 成都诺恩生物科技有限公司 | 一种利用扩增dna片段长度多态性测定短链rna的方法 |
| CN104894251A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-09 | 基因科技（上海）有限公司 | 一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MicroRNA-derived Fragment Length Polymorphism Assay;Xiaoping Xie,et al;《SCIENTIFIC REPORTS》;20150320;第5卷;9356 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017076172A1 (zh) | 2017-05-11 |
| CN105331695A (zh) | 2016-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105331695B (zh) | 一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法 | |
| Hooten et al. | Age-related changes in microRNA levels in serum | |
| Gouin et al. | A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles | |
| JP6155194B2 (ja) | 良性甲状腺新生物と悪性甲状腺新生物を区別するためのバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ | |
| CN103210092B (zh) | 修饰的茎-环寡核苷酸介导的反转录和碱基间隔限制的定量pcr | |
| CN113604564A (zh) | 一种检测外泌体相关microRNA分子的方法 | |
| Floris et al. | MiRNA analysis by quantitative PCR in preterm human breast milk reveals daily fluctuations of hsa-miR-16-5p | |
| WO2016015686A1 (zh) | 一种利用扩增dna片段长度多态性定量测定短链rna的方法 | |
| JP2010510769A (ja) | 食道癌の診断ならびに患者の生存の予後および改善のための方法および組成物 | |
| CN106967794B (zh) | 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法 | |
| WO2021000893A1 (en) | Mirna receptivity analysis of the endometrium | |
| US20100136547A1 (en) | Pure miRNA Sample Preparation Method | |
| CN112501257B (zh) | 一种基于核酸自组装无酶催化的circRNA活细胞内成像的可视化传感器 | |
| Tie et al. | Circulating miRNA and cancer diagnosis | |
| CN113999896B (zh) | 一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用 | |
| WO2019197954A1 (en) | IDENTIFICATION OF MUSCULAR miRNAS AS MOLECULAR BIOMARKERS AND CO-ADJUVANT FOR THE TREATMENT OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY | |
| Tomei et al. | The Salivary miRNome: A promising biomarker of disease | |
| KR102478976B1 (ko) | 핵산 분자의 검출 | |
| CN109957611B (zh) | 一种特异性定量PCR反应混合液、miRNA定量检测试剂盒以及检测方法 | |
| KR102293039B1 (ko) | 근육 노화 진단용 miRNA 마커 및 이를 이용한 진단방법 | |
| Ge et al. | A universal linker-RT PCR based quantitative method for the detection of circulating miRNAs | |
| CN103740853B (zh) | 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-134检测试剂盒及其检测方法 | |
| Neethirajan | miRNA Sensing in Livestock: Challenges and Potential Approaches | |
| Zendjabil | Preanalytical, analytical and postanalytical considerations in circulating microRNAs measurement | |
| CN115927632A (zh) | 一种经穿刺组织检测前列腺癌的标志物tRF-Ala-CGC-1-M6及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 610041 B6 501, 88 Keyuan South Road, hi tech Zone, Chengdu, Sichuan. Applicant after: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 610041 B6 501, 88 Keyuan South Road, hi tech Zone, Chengdu, Sichuan. Applicant before: CHENGDU NUOEN BIOLOG TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 610000 floor B6, No. 88, Keyuan South Road, high tech Zone, Chengdu, Sichuan Patentee after: CHENGDU NUOEN BIOLOG TECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 610041 B6 501, 88 Keyuan South Road, hi tech Zone, Chengdu, Sichuan. Patentee before: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region before: China |
|
| CP03 | Change of name, title or address |