DE60013124T2

DE60013124T2 - Reverse transkriptase testsatz, dessen benutzung, und verfahren zur analyse der rt-aktivität in biologischen proben

Info

Publication number: DE60013124T2
Application number: DE60013124T
Authority: DE
Inventors: Clas Källander; Simon Gronowitz; Ingvar Pettersson
Original assignee: Cavidi Tech AB
Current assignee: Cavidi Tech AB
Priority date: 1999-06-24
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2020-06-17
Also published as: CN1218047C; PT1185705E; AU764566B2; OA11973A; BRPI0011812B8; AU6150300A; DE60013124D1; JP2003503073A; JP4808345B2; EA004880B1; CN1358232A; EA200101191A1; ZA200110064B; BRPI0011812B1; ES2225179T3; SE9902410D0; US6849406B1; BRPI0011812A; MXPA01012951A; EP1185705A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Reverse Transkriptase (RT)- Testkit für die Analyse der RT-Aktivität in biologischen Proben. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des RT-Assaykits für die qualitative und quantitative Analyse der RT-Aktivität in einer biologischen Probe, optional gefolgt von einer Überprüfung des Status einer mit RT-Aktivität in Beziehung stehenden Störung oder Erkrankung, basierend auf dem Ergebnis der Analyse der RT-Aktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die reverse Transkriptase (RT) ist ein Schlüsselenzym, das für die Synthese von DNA aus viraler RNA aller Retroviren verantwortlich ist, einschließlich dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) (Baltimore-70, Temin-70, Barre-Sinoussi et al-83). Dieser Prozess involviert drei unterschiedliche enzymatische Aktivitäten: die Synthese des ersten DNA-Strangs, den Abbau des viralen RNA-Strangs in dem DNA/RNA-Hybrid und die Synthese des zweiten DNA-Strangs (für eine Übersicht siehe Goff).
Retroviren können entweder in exogener oder in endogener Form oder beiden existieren. Der Hauptunterschied ist derjenige, dass ein endogener Retrovirus die Keimlinie betreten hat und so seine DNA in allen Zellen des Organismusses vorliegt gegenüber einem exogenen Retrovirus, der nur in Zellen eindringen kann, die den geeigneten Rezeptor für dieses spezifische Virus aufweisen. Endogene Retroviren (ERVs) beim Menschen werden als HERVs bezeichnet. Die integrierte provirale Form eines endogenen Retrovirus weist dieselbe fundamentale Struktur auf wie diejenige eines exogenen Retrovirus. Die Integration einiger HERVs in die Keimlinie soll vermutlich vor 35 bis 45 Millionen Jahren stattgefunden haben. Diese retroviralen Sequenzen bilden 1 % des Säugergenoms und daher auch des menschlichen Genoms. Sie liegen daher in allen menschlichen Zellen vor und werden gemäß den gewöhnlichen Mendel'schen Gesetzen vererbt.
Viele HERV-Familien liegen im humanen Genom vor. Die Kopienzahl pro haploidem menschlichem Genom von HERVs variiert zwischen einer einzelnen Kopie bis zu Tausenden von Kopien für unterschiedliche Familien. Die höchste Nukleotidsequenzkonservierung wird im Pol-Gen angetroffen. Dieses Merkmal wurde verwendet, um die Beziehung zwischen HERV-Familien abzuleiten. Obwohl viele der HERVs und ihre ORFs defektiv sind wurden mRNA-Transkripte von den meisten HERV-Familien in unterschiedlichen Gewebstypen nachgewiesen (betrachtet in Wilkinson et al 1994, Leib-Mösch und Seifarth 1996). Zusätzlich wurden Virionpartikel mit Polymerase- und Proteaseaktivität in normalen menschlichen Plazentas, Oocyten, Teratokarzinomen, Säugerkarzinomgeweben und Speicheldrüsen einiger Autoimmunpatienten beobachtet (betrachtet in Wilkinson et al., 1994, Umovitz und Murphy, 1996, Tönjes et al., 1997). Stressbedingungen wie Anoxie und UV-Bestrahlungen könnten auch die Expression der HERVs auslösen, wie beobachtet für infektiöse Retroviren (betrachtet von Duvic, 1995).
Etliche HERVs wurden auf chromosomalen Bruchpunkten innerhalb des Genoms lokalisiert (Di Cristofano et al., 1995, Meese et al., 1996). Die Rekombination zwischen HERV-Sequenzen, lokalisiert an den unterschiedlichen chromosomalen Stellen, kann zu genomischen Neuanordnungen einschließlich Translokationen, Inversionen, Duplikationen und Deletionen führen. Solche Rekombinationsereignisse sind für die Erzeugung einer genomischen Instabilität verantwortlich, die ein wichtiges Merkmal der Evolution ist. Zusätzlich sind viele Tumoren durch spezifische genomische Neuanordnungen gekennzeichnet, und man nimmt an, dass diese eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese spielen. Die Beziehung zwischen der Gegenwart infektiöser Retroviren und der Entwicklung von Tumoren im Wirt legt nahe, dass HERVs mit Krebs assoziiert sind. Virionteilchen und Retrovirus-verwandte Antigene werden häufig bei primären Tumorproben ebenfalls in Abwesenheit infektiöser Viren beobachtet (Weiss, 1984, Faff et al., 1992). Zusätzlich wurde demonstriert, dass Antikörper, die gegen Retrovirusproteine gerichtet waren, in den Seren von Patienten mit Krebs vorlagen (Weiss, 1984). Außerdem wird festgestellt, dass HERV-Sequenzen in bestimmten Tumor-abgeleiteten Zelllinien hoch exprimiert werden (betrachtet in Löwer et al., 1996).
Endogene Proviren können auch mit exogenen Varianten rekombinieren (Martinelli et al., 1990). Neue Rekombinanten erhalten einen veränderten Phänotyp. Dies kann zu der schnellen Evolution neuer infektiöser Retroviren beitragen. Das env-Gen wird im wesentlichen betroffen, da Mutationen in anderen Teilen schädlich und nicht-kompatibel mit der Partikelbildung sein können. Es wird festgestellt, dass einige Retrovirusstämme symbiotisch in einer Art und pathogen in einer anderen sind. Diese Feststellungen legen ein schweres Problem bei Xenotransplantationen nahe. Symbiotische ERVs, bereitgestellt durch transplantierte Gewebe, könnten in dem neuen Wirt pathogen sein. Sie könnten auch in der Lage sein, mit Zelloberflächenrezeptoren in Wechselwirkung zu treten, die für die retrovirale Fusion benötigt werden, die auf Zellen des neuen Wirts vor liegen. Zusätzlich kann eine Rekombination mit endogenen Retrovirussequenzen innerhalb des Genoms des Gewebsempfängers auftreten und neue infektiöse Retroviren erzeugen, die sich in der Population verbreiten. Sowohl endogene als auch exogene Retroviren können zur vertikalen und horizontalen Übertragung von genetischem Material innerhalb und zwischen Arten beitragen und Mechanismen für die Evolution neuer pathogener Mittel bereitstellen.
Es wurde festgestellt, dass sowohl infektiöse Retroviren als auch ERVs immunregulatorische Funktionen ausüben (betrachtet von Krieg et al., 1992). Diese Wirkungen wurden im wesentlichen bei Mäusen untersucht, es gibt jedoch einige Beobachtungen, die die Existenz ähnlicher Mechanismen für HERVs unterstützen. Wenn HERV-Sequenzen eine Immunreaktion deregulieren können, können sie zu Autoimmunerkrankungen führen. Diese Wirkungen könnten direkt von HERV-Proteinen moduliert werden oder indirekt durch Beeinflussung der Expression von Molekülen, die an der Immunreaktion beteiligt sind. HERV-Proteine können auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Der Verlust der Selbsttoleranz gegenüber diesen Proteinsequenzen könnte zu Autoimmunreaktionen gegen die Zellen führen, die sie ausdrücken. Antikörper, die folgend auf eine retrovirale Infektion erzeugt werden, könnten mit HERV-kodierten Proteinen kreuzreaktiv und für den Verlust der Toleranz verantwortlich sein. Dieses Phänomen wurde bei transgenen Mäusen beobachtet (Zinkemagel et al., 1990). Zusätzlich konnte der Verlust der Toleranz gegenüber ERV-kodierten env-Proteinen bei Mäusen beobachtet werden, die spontan eine Autoimmunglomerulonephritis entwickelten (betrachtet von Krieg et al., 1990 und 1992). Einige Beobachtungen beim Menschen könnten die Existenz von kreuzreaktiven Antikörpern zwischen endogenen und exogenen Retrovirusproteinen unterstützen. Antikörper gegen retrovirale Proteine wurden in Seren von Autoimmunpatienten nachgewiesen (betrachtet von Krieg et al., 1992, Umovitz und Murphy, 1996). In bestimmten Fällen wurde festgestellt, dass die Seren mit exogenen Retroviren reagierten. Retrovirusinfektionen sind mit dem Ausbruch von Autoimmunerkrankungen assoziiert (betrachtet von Krieg et al., 1990 und 1992). Weiterhin zeigen infektiöse retrovirale Proteine eine Teilähnlichkeit mit Selbstantigenen, die häufig Ziele für Autoantikörper sind (betrachtet von Krieg et al., 1992). Sie können Autoimmunreaktionen gegen solche Ziele auslösen, ein Mechanismus, der als molekulare Mimikrie bezeichnet wird. Ähnlichkeiten von HERV-Proteinen mit bekannten Selbstantigenen sind bis jetzt jedoch noch nicht nachgewiesen worden.
Assays auf eine RT-Aktivität sind zu akzeptieren Techniken für den Nachweis und die Quantifizierung von Retroviren in Zellkulturen geworden. Sie werden zusammen mit p24-Antigenassays als Bestätigungstests für eine HIV-Isolierung verwendet (Jackson-88, Gupta-87). RT ist auch eins der Hauptziele bei dem Versuch, effiziente Antivirusmittel gegen HIV zu finden. Ein konventioneller RT-Aktivitätsassay wird durchgeführt, indem ein löslicher Enzymassay mit einer künstlichen Matrizen-Pimerkonstruktion und Tritium-markiertem Deoxynukletidtriphosphat als Nukleotidsubstrat durchgeführt wird (Baltimore-71, Lee et al.–87). Dieses frühe System basierte auf dem Nachweis des Einbaus von Radioaktivität in Trichloressigsäure (TCA), ausfällbare RNA/DNR-Hybride. Die Verwendung von beta-emittierenden Nukleotiden macht die Verwendung von Szintillationsflüssigkeiten für den Nachweis der Radioaktivität nötig, was häufig zu einer schlechten Reproduktionsfähigkeit aufgrund von Quenching-Problemen führt. Dieses Verfahren ist relativ aufwändig und nicht einfach auf ein Screening im großen Umfang großer Mengen von Proben anwendbar. Es ist auch sehr sensitiv gegenüber den Wirkungen störender Faktoren in den Proben.
Während der letzten Dekade intensiver Forschungen im Hinblick auf HIV wurden die RT-Assays unter Verwendung unterschiedlicher Techniken verbessert. Die Einführung von I¹²⁵-markiertem Substrat ergab eine erhöhte Sensitivität und eliminierte das Quenching und die Verwendung von Szintillationsflüssigkeiten (Neumüller et al.–90). Die Einführung von Matrizen oder Primern, gebunden an feste Phasen, vereinfachte die Auftrennung zwischen Substrat und Produkt, eliminierte die Notwendigkeit von TCA-Präzipitationen und führte zu einem "Ein-Rohr-RT-Assay" (Gronowitz et al.–90, EP 0 447 442 B1 ).
Kürzlich wurde die Verwendung von Radioaktivität als Markierung in einem RT-Assay durch Verwendung von modifizierten Nukleotidbasen, enthaltend entweder antigene Epitope oder Strukturen mit hoher Affinität zu definierten Liganden eliminiert. Die Gegenwart dieses Epitope oder Strukturen in dem neu synthetisierten RNA/DNA-Hybrid wird dann für die Bindung von Antikörpern oder Liganden verwendet, konjugiert mit z.B. ELISA-Enzymen. Die Menge der ELISA-Enzyme, die gebunden ist, wird dann in einem sekundären Enzymassay bestimmt.
Porstmann et al., 1991, verwenden 5-Bromdeoxyuridin-(BrdU)triphosphat als Nukleotidsubstrat in einem RT-Assay. Die Menge des eingebauten BrdUMP wird in einem zweiten Schritt in einem Immunassay bestimmt unter Verwendung von alkalischer Phosphatase konjugierten monoklonalen Anti-BrdU-Antikörpern.
Eberle und R. Seibl, 1992, messen den Einbau von Digoxigenin-markiertem dUTP anstatt radioaktiv-markierten dTTP in neu synthetisierte DNA. Um in der Lage zu sein, die Auftrennung von nicht-aufgebauten Nukleotiden aus der neu synthetisierten DNA durchzuführen, wird auch Biotin-markiertes dUTP der Reaktionsmischung zugeführt. Nach der reversen Transkription wird die neu synthetisierte doppelt markierte DNA auf Streptavidin-beschichteten ELISA-Vertiefungen immobilisiert und photometrisch durch Bindung von Peroxidasekonjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörpern überprüft. Diese Verfahren war die Grundlage für einen RT-Assaykit, der von Boehringer Mannheim kommerziell erhältlich ist.
Urabe et al. entwickelten 1994 einen nicht-radioaktiven RT-Assay, basierend auf dem Einbau von Biotin-dUTP in einem immobilisierten odT/prA-Konstrukt. Die Menge von eingebautem Nukleotidsubstrat wird photometrisch nach Addition von Streptavidin-konjugierter alkalischer Phosphatase gemessen. Der nächste Stand der Technik zu der vorliegenden Erfindung wurde von Ekstrand et al., 1996, entwickelt. In diesem Assay band Poly(rA) kovalent an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und diente als Matrize für den Einbau von BrdUMP während dem reversen Transkriptionsschritt. Die Menge des in die DNA inkorporierten BrdUMP wird dann immunologisch gemäß einem ähnlichen Verfahren, wie von Porstmann et al., 1991, verwendet, bestimmt. Das Verfahren ist als RT-Bestimmungskit von Cavidi Tech, Uppsala Schweden erhältlich.
Ein anderes Prinzip für den Nachweise der RT-Aktivität, kommerziell von NEN (New England Nuclear, USA) ausgenutzt, ist die Verwendung sequenzspezifischer Sonden für den Nachweis neu synthetisierter cDNA. Die enzymatische Reaktion verwendet ein heteropolymeres RNA-Molekül mit einem Oligonukleotidprimer mit 20 Basen, komplementär zu den RNA-Sequenzen nahe dem 5'-Ende. Ein kompletter cDNA-Strang wird während der RT-Reaktion erzeugt. Nach der Hydrolyse der Matrizen-RNA wird die cDNA mit zwei unterschiedlichen Oligonukleotidsonden hybridisiert, Fang- und Nachweis-Sonde. Die Fangsonde wird verwendet um die cDNA an eine Mikrotiterplattenvertiefung zu binden. Die Nachweissonde wird mit Meerrettichperoxidase konjugiert, was nach einem Waschschritt zur Entfernung von nicht verwendetem Nukleotidsubstrat und freien Sonden eine Farbreaktion ergibt.
Die Nachweisempfindlichkeit bei dieser letzten Assayart kann durch die Polymerase-Kettenreaktionsvervielfältigung der cDNA, erzeugt durch die RT-Reaktion, erhöht werden. Die amplifizierte DNA kann danach mit unterschiedlichen Arten markierter Sonden nachgewiesen werden (Silver 93, Heneine 1995, US5817457, US5849494).
Für einige Anwendungen des Kenntnisses der RT-Aktivität in biologischen Proben ist es wünschenswert, einen RT-Assay, der quantitative Ergebnisse gibt, zu verwenden. Solche Anwendungen umfassen die Überwachung von Erkrankungen oder Störungen, bei denen der RT-Assay sich aus Messungen ergibt, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemacht werden und diese dann verglichen werden und Diagnose von Erkrankungen oder Störungen, bei denen das Niveau der RT-Aktivität mit Standardniveaus verglichen wird um anzuzeigen, ob der Patient eine Risiko aufweist oder tatsächlich an der Erkrankung oder der Störung leidet.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, ein Assay zu verwenden, der so empfindlich wie möglich ist, d.h. in der Lage ist, so geringe Mengen der RT-Aktivität wie möglich in biologischen Proben zu messen, so dass die Gegenwart und die Menge der RT-Aktivität mit Störungen und Erkrankungen in einem frühen Stadium in Beziehung gesetzt werden kann.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen RT-Assay bereit, der einfach für Screening-Zwecke zu verwenden ist und der für die RT-Aktivität sehr empfindlich ist.
Präziser gesagt betrifft die vorliegende Erfindung einen reverse Transkriptase (RT)-Assaykit, der ein oder mehrere Packungen enthält, enthaltend Festphasen-gebundene Polyriboadenylsäure (prA) und/oder Polydeoxyadenylsäure (pdA)-Matrize(n), erhältlich durch Kontaktieren einer auf Polystyrol basierenden Festphase mit einer Kupplungslösung, umfassend 1-Methylimidazol und prA und/oder pdA, gefolgt von einer Inkubation, Waschen mit einem Waschpuffer, Trocknen und Verpacken. Das Kit umfasst auch RT-Typ adaptierte, separat verpackte Assaybestandteile, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Mischung von oder separat einem Puffer, pH ≅ 7–8, divalenten Metallionen, Chelator, Polyamin, RNase-Inhibitor, Reduktionsmittel, Salz, Stabilisator und Detergens und eine Mischung von oder separat lyophilisiertem Desoxynukleotidtriphosphat, Primer, Schutzmittel und konzentriertem Waschpuffer, geschriebenen Instruktionen zur Verwendung des Assaykits können mit enthalten sein. Optional umfasst das Kit ein lyophilisiertes Referenzenzym(e). Optional umfasst das Kit weiterhin Komponenten eines Nachweissystems, umfassend lyophilisierte alkalische Phosphatase-konjugierte anti-BrdU-monoklonale Antikörper, alkalischen Phosphatase-Substratpuffer und alkalisches Phosphatasesubstrat, wie z.B. pNPP-Tabletten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des RT-Assaykits gemäß der Erfindung, ist die Festphase eine Mikrotiterplatte und ein Aliquot der Kupplungslösung, die 100 mM 1-Methylimidazol, pH ≅ 5–7 und 0,5 bis 2 mg/ml prA und/oder pdA enthält, wird jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von einer In kubation bei einer Temperatur von 10 bis 60°C für 0,5 bis 10 Stunden und Waschen jeder Vertiefung zur Entfernung des 1-Methylimidazols mit dem Waschpuffer, der Bis-trispropan, pH ≌ 5–7 umfasst.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des RT-Assaykits gemäß der Erfindung werden 100 μl der Kupplungslösung, die 100 mM 1-Methylimidazol, pH ≌ 6,25 und 1 mg/ml prA und/oder pdA umfasst, jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für ungefähr 2 Stunden, Waschen jeder Vertiefung mit 2 × 300 μl Waschpuffer, der 10 mM Bis-trispropan, pH ≌ 6,25 umfasst, Trocknen der Platten bei 37°C für 25 Minuten und Platzieren der Platten in Folientaschen und Vakuumversiegelung der Taschen.
In einer weiteren Ausführungsform des RT-Assaykits gemäß der Erfindung, werden die Assaykomponenten aus der Gruppe gewählt, bestehend aus den Puffern Tris und Hepes, pH ≌ 7–8, den divalenten Metallionen Mg²⁺ und Mn²⁺, den Chelatbildnern Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglykolbis(β-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), und den Polyaminen Spermin und Spermidin, den RNase-Inhibitoren Heparinsulfat und Dextransulfat, den Reduktionsmitteln Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE) und Glutathion, den Salzen NaCl und KCl, den Stabilisierungsmitteln Serum aus neugeborenen Kälbern (NCS) und Rinderserumalbumin (BSA), den Detergenzien Tween 20 und Triton X-100, dem Desoxynukleotidtriphosphat BrdUTP, dem Primer Oligo dT oder Oligo dN, wobei N ein anderes T-Analog ist, wie z.B. U und den Schutzmitteln ATP, GTP und CTP.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Verwendung eines Assaykits gemäß der Erfindung für die qualitative und quantitative Analyse der RT-Aktivität in einer biologischen Probe gerichtet, z.B. einer biologischen Probe, die gewählt ist aus Zellextrakten und biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Thoraxflüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung gemäß der Erfindung folgt eine Überprüfung des Status einer mit RT-Aktivität in Beziehung stehenden Störung oder Erkrankungen, basierend auf dem Ergebnis der Analyse der RT-Aktivität.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren einer qualitativen und quantitativen Analyse der RT-Aktivität in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte der Verwendung und folgend den geschriebenen Instruktionen für den RT-Assaykit gemäß der Erfindung für die Bestimmung der RT-Aktivität in der biologischen Probe, z.B. einer biologischen Probe, die aus Zellextrakten und biologischen Flüssigkeiten gewählt wird, wie z.B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Thoraxflüssigkeit.
Auf dieses Verfahren folgt eine Überprüfung des Status einer mit RT-Aktivität in Beziehung stehenden Störung oder Erkrankung, basierend auf dem Ergebnis der Analyse der RT-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen und eine detailliertere Beschreibung der Ausführungsformen illustriert, jedoch sollten diese Ausführungsformen nicht als den Umfang des Schutzes begrenzend angesehen werden, definiert durch die beigefügten Ansprüche.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Die RT-Aktivität wurde in einem Medium aus einer Kultur der PK 15-Zelllinie mit zwei Verfahren bestimmt. Die Absorptionswerte, die erhalten wurden, wurden gegen die Menge der der Reaktionsmischung zugefügten Medien aufgetragen.
2 Direkte RT-Bestimmung in Gelenkflüssigkeitsproben, gesammelt von Patienten, die an rheumatoider Arthritis leiden. Die Werte, die aufgetragen sind, wurden aus 1 μl-Proben und einer RT-Reaktion über Nacht erhalten.
3 Die RT-Aktivität wurde in einem Extrakt eines Brustkrebses durch zwei Verfahren bestimmt. Die erhaltenen Absorptionswerte werden gegen die Menge des zugefügten Extrakts zu der Reaktionsmischung aufgetragen.
4 Direkte Bestimmung der RT-Aktivität in Extrakten von Brustkrebs-Biopsien. Die aufgetragenen Absorptionswerte gegen die, Proteinkonzentration jeder Probe wurden von 1 μl-Extrakt und einer RT-Reaktion über Nacht erhalten.
5 Die RT-Aktivität in einem A) Medium einer Kultur von HTLV 1-transformierten Zellen und B) einem Medium von BLV-infizierter Kultur wurden durch zwei Verfahren bestimmt. Die Absorptionswerte, die erhalten wurden, wurden gegen die Menge der zu der Reaktionsmischung zugefügten Probe aufgetragen.
6 Direkte Bestimmung der RT-Aktivität im Serum aus SIV-infizierten Makaken. Die Absorptionswerte, die in einem 4-Stunden-RT-Assay erhalten wurden, wurden gegen die Serumprobennahme pro Tag aufgetragen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Der RT-Assaykit der Erfindung umfasst drei unterschiedliche Typen von Komponenten, nämlich

1) eine Matrize, bestehend aus einer Polyriboadenylsäure (prA) oder Polydeoxyadenylsäure (pdA), angebunden an eine feste Phase.
2) Reaktionsmischungen, die den Enzymen ermöglichen einen neuen DNA-Strang in einer Primer-abhängigen Weise unter Verwendung des angebundenen Matrizen-Polynukleotids zu polymerisieren.
3) Komponenten eines Nachweissystems für den immunologischen Nachweis von in vitro synthetisiertem DNA-Strang.

1) FESTPHASENGEBUNDENE MATRIZE
Ein Verfahren wurde entwickelt, wodurch prA oder pdA an bestimmten Arten von Mikrotiterplatten in einer Weise angebunden werden können, was es den Polynukleotiden ermöglicht als Matrizen für einen Primer-abhängigen dNTP-Einbau durch virale und zelluläre RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymerasen (reverse Transkriptasen, RTs) zu dienen. Es wurde nachgewiesen, dass es bei kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatten, CavaLink^TM und NucleoLink^TM von Nalge Nuc International arbeitet. Die prA-gekoppelten Mikrotiterplatten, die für die Assaykits gemäß der Erfindung verwendet werden, werden von NucleoLink^TM-Streifen erzeugt. Verfahren und Puffer sind in Tabelle 1 beschrieben. Der Bindungsmechanismus ist nicht bekannt, da das Verfahren nicht zu den vom Hersteller empfohlenen oder vorgeschlagenen Verfahren korrespondiert oder in der Literatur explizit festgehalten ist. Ein möglicher Reaktionsmechanismus involviert reaktive Gruppen, eingeführt während des Herstellungsverfahrens jedoch andere als diejenigen, die für die bekannte und beabsichtigte Verwendung der spezifischen Oberflächen aufgepfropft sind. Ähnliche Ergebnisse sollten mit anderen auf Polystyrol-basierenden Mikrotiterplatten aus anderen kommerziellen quellen erhalten werden. Ein Verfahren für die chemische Aktivierung von Polystrol um eine Oberfläche mit ähnlichen Eigenschaften wie der der CovaLink^TM-Platten zu erhalten, wurde veröffentlicht (Zammatteo et al.–96). Etliche andere Verfahren für die Anbindung von Polynukleotiden an Kunststoffoberflächen wurden ebenfalls veröffentlicht (Zammatteo et al.–96, Greogorius et al.–95, Niveleau et al.–93, Rasmussen et al.–91, Ghosh und Musso-87).
2) RT-TYP ADAPTIERTE REAKTIONSMISCHUNGEN
Die allgemeinen Bedingungen zum Erhalt eines Nukleotideinbaus durch RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymerasen in löslichen Systemen unter Verwendung gereinigter Enzyme sind einfach und wohl bekannt. Sie beinhalten einen Puffer, der den pH bei ungefähr 7,5 erhält, ein divalentes Metallion, Mg²⁺ oder ggf. Mn²⁺, ein Salz zur Einstellung der Ionenstärke, für einige Enzyme ein Reduktionsmittel und ein bisschen eines Detergens. Wenn sie mit diesem einfachen Reaktionspuffer versehen sind, werden die Enzyme in der Lage sein, zugefügte Matrize, Primer und Deoxynukleotidtriphosphate zur Synthese eines DNA-Strangs zu verwenden. Dieses allgemeine Konzept zieht die Unterschiede in optimalen oder besonders angepassten Reaktionsbedingungen nicht mit in die Beziehung ein, die zwischen unterschiedlichen Klassen oder Typen reverser Transkriptasen benötigt werden. Ein anderer wichtiger Aspekt ist die gewünschte Fähigkeit der Reaktionsmischung, die Zugabe von nicht-behandelten biologischen Flüssigkeiten oder Zellextrakten als Quelle der RT-enzymatischen Aktivität zu tolerieren.
Systematische Tests unter Verwendung von sowohl Rohproben, wie z.B. Zellkulturüberständen als auch gereinigten Enzymen ergaben andere Reaktionsbestandteile, die verwendet werden um Reaktionsmischungen zu erzeugen, die optimiert sind oder an spezifische reverse Transkriptasen speziell angepasst wurden.
Tabelle 2 enthält eine Übersicht der verwendeten Bestandteile, um die individuellen RT-Typ angepassten Reaktionsmischungen zusammenzusetzen. Die Zusammensetzungen typischer Reaktionsmischungen sind in Tabelle 3 angegeben.
Das reverse Transkriptase-Assayverfahren unter Verwendung des Kits der Erfindung wird wie unten beschrieben durchgeführt. Der erste Schritt in dem Assay ist die Zugabe von 100 μl der Reaktionsmischung zu jeder Vertiefung der prA-gekoppelten Mikortiterplatte, gefolgt von einer 20- bis 60-minütigen Präinkubation bei 33°C. Die Probe, die die reverse Transkriptase enthält, wird dann in 50 μl Puffer zugefügt, was ein endgültiges Assay-Volumen von 150 μl ergibt und dann wird die Mikrotiterplatte bei 33°C inkubiert. Jede Probe wird Duplikat-Mikrotiterplatten zugefügt, um für zwei Assayzeiten zur Verfügung zu stehen, standardisiert auf 3 Stunden und über Nacht, was 16 bis 20 Stunden bedeutet. Ein Schritt-für-Schritt-Verfahren wird in den geschriebenen Instruktionen oder dem Manual für den Verwender bereitgestellt, die in jedem Kit enthalten sind. Es enthält Vorschläge oder Instruktionen, um generische reverse Transkriptase-Assaybestandteile für einige oder alle der folgenden Anwendungen anzupassen: 1) Quantifizierung der RT-Aktivität, 2) Screening der RT-Aktivität in Zellextrakten, Zellüberständen und/oder biologischen Flüssigkeiten, einschließlich aber nicht begrenzt auf Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Thoraxflüssigkeit, 3) Bestimmung der RT-Aktivität-blockierenden Antikörper, 4) Bestimmung von IC₅₀-Werten von RT-Aktivitäts-inhibierenden Substanzen.
Unter Verwendung dieser Reaktionsmischungen und der an feste Phase gebundenen Matrizen entwickelten wir die beanspruchten Assays die entweder bei direkten Messungen der RT-Aktivität empfindlicher waren als andere vorher beschriebene Assays, basierend auf Festphasen-gebundene Matrizen oder einen Nachweis von vorher unbekannten reverse Transkriptase-Aktivitäten ermöglichen.
3. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DES IN VITRO SYNTHETISIERTEN DNA-STRANGS
Die Polymerase in der Probe synthetisiert einen DNA-Strang unter Verwendung von Bromdioxyurdidintriphosphat (BrdUTP), das in der Reaktionsmischung bereitgestellt wird.
Das inkorporierte BrdUMP wird durch einen BrdU-bindenden monoklonalen Antikörper nachgewiesen, konjugiert an alkalische Phosphatase. Die alkalische Phosphataseaktivität des gebundenen Antikörpers wird dann durch Zugabe einer Substratlösung, die para-Nitrophenylphosphat, pNPP, enthält quantifiziert. Die Substratlösung wird gelb, wenn das pNPP durch alkalische Phosphatase gespalten wird. Die optische Dichte (OD) wird in einem Standard-ELISA-Reader mit einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Der OD-Wert, korrigiert im Hinblick auf den Hintergrund, ist proportional zu der RT-Aktivität in der Probe.
Der Nachweisschritt wird wie unten beschrieben durchgeführt. Ein Schritt-für-Schritt-Verfahren wird in den geschriebenen Instruktionen oder dem Manual für den Verwender bereitgestellt, die in jedem Kit enthalten sind. Die Zusammensetzungen der Pufferlösungen sind in Tabelle 4 angegeben.
Nach dem reverse Transkriptaseassay wird die Mikrotiterplatte entweder unter Verwendung einer der kommerziell erhältlichen ELISA-Platten-Waschvorrichtungen oder durch serielles Eintauchen der Platte in Eimer mit Waschpuffer gewaschen. Der konjugierte Antikörper wird optional in dem Kit in lyophilisierter Form bereitgestellt. Nach Rekonstitution mit 1%igem Triton X-100 in doppelt destilliertem Wasser werden 100 μl der Antikörperlösung jeder Vertiefung zugefügt und die Mikrotiterplatte wird 90 Minuten bei 33°C inkubiert. Um überschüssigen Antikörper zu entfernen wird die Platte darauffolgend auf dieselbe Weise ein zweites Mal gewaschen. Die Substratlösung wird aus dem Puffer hergestellt und pNPP-Tabletten optional mit dem Kit bereitgestellt. Die OD-Werte werden dann in geeigneten Zeitabständen gemessen.
Die lineare Beziehung zwischen der Menge der gebundenen alkalischen Phosphatase und der Konzentration des gelben Produkts bricht bei hohen OD-Werten ab. Durch Messung der OD zu unterschiedlichen Zeitpunkten ist es möglich, geeignete Werte zu erhalten, d.h. OD-Werte innerhalb des linearen Ablesebereichs des bestimmten Instruments, sowohl für Proben mit hohen als auch niedrigen Mengen des gebildeten Produkts während des reverse Transkriptaseassayschritts. Die Referenz RT-Enzyme, die optional in einigen aber nicht allen Kits enthalten sind, sind kalibriert, um Titrationskurven mit geeigneten OD-Werten zu ergeben, wenn die OD nach 30 Minuten, 2 Stunden und 16 bis 20 Stunden, d.h. über Nacht, gemessen wird.
Die verbesserte Leistung, die mit den RT-Assaykits der Erfindung erhalten wird, wird in Tabelle 5 demonstriert. HIV-1-RT-Titrationskurven wurden durch den vorher bekannten Lenti-RT-Kit von Cavidi Tech AB und mit einem Assaykit der vorliegenden Erfindung erhalten. Die OD-Werte können gegen die RT-Enzymkonzentration aufgetragen und an eine gerade Linie unter Verwendung des geringsten Quadratfits (least square fits) angepasst werden. Die k-Werte in Tabelle 6 sind die Neigungen der berechneten geraden Linien und sind ein Maß der Empfindlichkeit des Assays. Es kann gesehen werden, dass die Assaykits der Erfindung k-Werte aufweisen, die in einer sehr viel höheren Ordnung angesiedelt sind. In praktischen Worten bedeutet dies geeignete Messungen für Proben, die in sehr viel niedrigerer Konzentration einer HIV-1-reversen Transkriptase aufweisen und/oder eine Zeitersparnis. Kürzere reverse Transkriptase-Assayzeiten und/oder eine kürzere alkalische Phosphatase-Ablesezeit bedeutet kürzere Umsetzzeiten für die Verwender der Kits der vorliegenden Erfindung.
TYPISCHE BESTANDTEILE DES KITS DER ERFINDUNG

A: Zwei Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit prA und/oder pdA angehaftet.
B: Eine Probenverdünnung und Reaktionspuffer, enthaltend eine RT-Typ-adaptierte Mischung der Bestandteile I bis IX, wie aufgeführt in Tabelle 2.
C: Lyophilisierter Reaktionskomponenten X bis XII, gemischt oder in separaten Gefäßen bereitgestellt.
D: Lyophilisiertes Referenzenzym, entweder rekombinant, gereinigte natürliche oder virale Teilchen.
E: Konzentrierter Waschpuffer.
F: Lyophilisierter alkalischer Phosphatase-konjugierter Anti-BrdU-monoklonaler Antikörper, bezeichnet als "RT-Produkt-Tracer".
G: Alkalischer Phosphatase-Substratpuffer und pNPP-Tabletten.
H: Geschriebene Instruktionen oder Manual

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Verbesserter Nachweis von PERV (endogener Schweineretrovirus)-RT in Zellüberständen.
Von der Schweinezelllinie PK-15 (Schweineniere) ist bekannt, dass sie kontinuierlich geringe Mengen PERV produziert Überstände von einer Kultur von PK 15-Zellen wurden seriell verdünnt. Die Fähigkeit des C-Typ-RT-Assays von Cavidi Tech AB und des Mn²⁺-Assay der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der RT-Aktivität in jeder Verdünnung wurden überprüft. Die in 1 dargestellten Daten ergeben sich aus einem RT-Assay über Nacht.
Das Assaykit der Erfindung zeigt eine ungefähr 25-fach erhöhte Empfindlichkeit im Vergleich mit derjenigen des vorherigen Stands der Technik. Es war nicht möglich mehr Probe zu verwenden um diesen Unterschied in der Detektionsempfindlichkeit zu kompensieren, da der C-Typ-Assay an erhöhten Hintergrundniveaus litt, sowie Abweichung von der Linearität mit der Zeit und/oder Probenmenge bei höheren Überstandkonzentrationen (> 2 μl/Vertiefung).
Der Assaykit der Erfindung kann in Studien im Hinblick auf den möglichen Transfer von exogenem Retrovirus und/oder die Aktivierung von endogenem Retrovirus im Zusammenhang mit einer Xenotransplantation verwendet werden.
BEISPIEL 2
Direkte Messung der reversen Transkriptase in Gelenkflüssigkeiten. Kürzlich durchgeführte DNA-Hybridisierungsexperimente haben eine Assoziation zwischen bestimmten rheumatischen Störungen und der Gegenwart von Retrovirus-assoziierten Sequenzen nahegelegt. Gefrorene Proben von Gelenkflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider Arthritis wurden von der Abteilung für Rheumatologie am Karoliska sjukhuset, Stockholm, Schweden erhalten. Die Proben wurden von Zellen und Abfall durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vor dem Einfrieren befreit. Die Proben wurden aufgetaut, seriell verdünnt und im Hinblick auf die RT-Aktivität untersucht.
Die erhaltenen Aktivitäten wurden auf OD₄₀₅/Stunde rekalkuliert. 2 stellt die RT-Aktivitäten dar, gefunden unter Verwendung von 1 μl Probe und einer Enzymreaktion über Nacht in dem Gelenkflüssigkeits-RT-Assay der Erfindung. Es wurde keine RT-Aktivität in irgendeiner der untersuchten Proben durch den Lenti- oder C-Typ-RT-Assay von Cavidi Tech AB nachgewiesen.
BEISPIEL 3
Nachweis der RT-Aktivität in Extrakten aus menschlichem Brustkrebs. Ein exogenes oder endogenes menschliches Gegenstück zu dem (Maus-Brust-Tumorvirus) MMTV ist bei der Ätiologie von menschlichem Brustkrebs impliziert. Unter Verwendung von rekombinanten MMTV-RT zur Optimierung der Assaybedingungen, konnte die RT-Aktivität in Extrakten von Brustkrebsen ohne vorherige Konzentration oder Reinigung nachgewiesen werden. Gefrorene Extrakte aus menschlichem Brustkrebs wurden von der Abteilung für Onkologie an der Akademiska sjuhuset, Uppsala, Schweden erhalten. Das Tumorgewebe wurde homogenisiert und in einem Standardpuffer suspendiert (pH 7,4). Die Überstände wurden nach Aufklärung durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit gesammelt. Die Proben wurden getaut, seriell verdünnt und im Hinblick auf die Gegenwart einer RT-Aktivität in dem Mg²⁺+-RT-Assay der Erfindung und im Lenti- oder C-Typ-RT-Assay von Cavidi Tech AB untersucht.
3 zeigt ein repräsentatives Beispiel der erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung einer RT-Reaktion über Nacht, kombiniert mit einer 2-stündigen AP-Reaktion. Der Unterschied in der Nachweisempfindlichkeit zwischen dem Mg²⁺-Assay der Erfindung und dem Lenti-RT-Assay von Cavidi Tech AB betrug das ungefähr 400-fache. In dem C-Typ-RT-Assay von Cavidi Tech AB wurde keine Aktivität nachgewiesen.
4 illustriert die Variation der RT-Aktivitäten, nachgewiesen durch den Mg²⁺-Assay in Tumorextrakten von unterschiedlichen Patienten. Das Assaykit der Erfindung kann in Studien verwendet werden im Hinblick auf eine mögliche Rolle von exogenen oder endogenen Retroviren bei der Ätiologie von Brustkrebs wie auch für diagnostische Zwecke verwendet werden.
BEISPIEL 4
Nachweis von (menschlichen T-Zellleukämievirus) HTLV-ähnlichen Viren in Überständen von Zellkulturen.
Einige HTLV-infizierte Individuen können onkologische oder myelopathische Störungen entwickeln. In bestimmten Teilen von Japan und Südasien wurde die Erkrankungs-assoziierte adulte T-Zellleukämie zuerst beschrieben. Eine neurologische Störung, die tropische spastische Paraparese, wurde ursprünglich bei Patienten aus der Karibik beschrieben. Verfahren, die in der Lage sind, eine Aussetzung gegenüber dem Virus und/oder kontinuierliche Gegenwart von niedriger viraler Aktivität nachzuweisen sind wünschenswert.
Ein hoch-verwandtes bovines Virus, bovines Leukämievirus (BLV) ist ein Pathogen bei Kühen mit großen ökonomischen Konsequenzen für die Rinder- und Milchzuchtindustrie. BLV wurde verwendet um einen Assay für die BLV/HTLV-RT-Aktivität zu optimieren.
5A illustriert den Unterschied in der Nachweisempfindlichkeit zwischen dem Assaykit der Erfindung und dem Lenti-RT-Assay von Cavidi Tech AB. Zellkulturüberstände der HTLV-1-transformierten Zelllinie MT-2 wurden seriell verdünnt und die zwei RT-Assays wurden verwendet um die Menge der RT-Aktivität in jeder Probe zu bestimmen. Die verwendete RT-Reaktionszeit war über Nacht (14 Stunden).
5B zeigt die korrespondierenden Daten von Verdünnungsansätzen von Überständen von FLK-BLV-Zellen. (Diese Zelllinie ist chronisch von BLV infiziert.) Der Gesamtgewinn an Nachweisempfindlichkeit betrug das ungefähr 25-Fache für das HTLV-Enzym bzw. das 30-Fache für das BLV-Enzym. Der Anstieg der Empfindlichkeit war essentiell um ein signifikantes Signal von dem Überstand der MT-2-Zellen zu erhalten.
BEISPIEL 5
Direkte Bestimmung der RT-Aktivität in Rohseren von SIV-infizierten Makaken.
Die Quantifizierung der RT-Aktivität in Serum kann für den Nachweis einer Virusreplikation während einer akuten Lenti-Virusinfektion verwendet werden. Die Serum-RT-Aktivität wird später durch Erzeugung von RT-inhibitorischem Antikörper gelöscht.
Eine Gruppe von Cynomolgus-Makaken (Macaca fascicularis), die als unbehandelte Kontrollen in einer Behandlungsstudie verwendet wurden, wurden mit 10 Affen-infektiösen Dosierungen (MID50) von SIVsm infiziert. Serum, das zu bestimmten Zeiten nach der Infektion genommen wurde, wurde seriell verdünnt und im Hinblick auf die RT-Aktivität unter Verwendung des Lenti-RT-Assays der Erfindung überprüft. 5 μl Serumproben wurden in einer 4-stündigen RT-Reaktion eingeschlossen und die erhaltenen Absorptionswerte wurden in OD₄₀₅/Stunde rekalkuliert und gegen die Tage nach der Infektion aufgetragen (siehe 6).
Der Lenti-RT-Assay der Erfindung ist empfindlich genug um die Virusreplikation durch Analyse von Serum nachzuweisen, das während der akuten Phase der Infektion genommen wurde. Die z.Zt. verwendeten Tests zu einer Überprüfung der HIV-Positivität bei menschlichen Blutspendern basieren auf dem Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1-Proteine und können infizierte Personen während des akuten Stadiums der Infektion nicht nachweisen. Diese Tests werden in einigen Ländern durch den Nachweis von viralem Antigen durch ELISA oder viralem Genom durch PCR ergänzt. Beide Typen von Tests können u.U. abweichende Virusstämme aufgrund der großen genetischen und immunologischen Variationen unter den HIV-Viren nicht nachweisen. RT hat eine nicht ersetzbare Funktion der Replikation für die Retroviren und der gegenwärtige Assay bietet eine attraktive Alternative für den Nachweis akuter Infektionen.
TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3 BESTANDTEILE IN DEM OPTIMIERTEN LENTI REVERSE TRANSKRIPTASEASSAY DER ERFINDUNG
TABELLE 3 (Fortsetzung) BESTANDTEILE IN DEM OPTIMIERTEN BLV/HTLV REVERSE TRANSKRIPTASEASSAY DER ERFINDUNG
TABELLE 3 (Fortsetzung) BESTANDTEILE IN DEM OPTIMIERTEN Mg²⁺ REVERSE TRANSKRIPTASEASSAY DER ERFINDUNG
TABELLE 3 (Fortsetzung) BESTANDTEILE IN DEM OPTIMIERTEN Mn²⁺ REVERSE TRANSKRIPTASEASSAY DER ERFINDUNG
TABELLE 3 (Fortsetzung) BESTANDTEILE IN DEM GELENKFLÜSSIGKEITS-REVERSE TRANSKRIPTASEASSAY DER ERFINDUNG
TABELLE 4
TABELLE 4
TABELLE 4 (Fortsetzung)
TABELLE 6
LITERATURSTELLEN

Baltimore D. (1970) RNA-dependet DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226:1209–1211.
Baltimore D, Smoler D (1971) Primer requirement and template specificity of the DNA polymerase of RNA tumor viruses. PNAS 68, 1507–11
Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret 5, Gruest J., Dauguet C, Axler-Blin C, Vezinet Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W, Montagnier L (1983). Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220(4599):868-71.
Bird RE, Chang-Yeh A. (1996) Methods and kits for detecting viral transcriptase activity in a sample using an acidic pH or an elevated temperature. US5817457.
Di Cristofano A, Strazullo M, Longo L, La Mantia G (1995) Characterization and genomic mapping of the ZNF80 locus: expression of this zinc-finger gene is driven by a solitary LTR of ERV9 endogenous retroviral family. Nucleic Acids Res 23(15):2823–30
Duvic M (1995) Human immunodeficiency virus and the skin: selected controversies. J Invest Dermatol 105(1 Suppl):1175–1215.
Eberle J and R. Seibl (1992) A new method for measuring reverse transcriptase activity by ELISA. J. Virol. Methods 40:347–356
Ekstrand D.H.L., Awad R.J-K., Källander C.F.R. and Gronowitz J.S. (1996) A sensitive assay for the detection and quantification of RT activity, based on the use of carrier bound template and non-radioactive product detection, with special reference to HIV isolation. Biotechnology and Applied Biochemistry, 23, 95–105.
Faff O, Murray AB, Schmidt J, Leib-Mosch C, Erfle V, Helmann R, Thelen K, Löwer J, Kurth R (1992). Retrovirus-like particles from the human T47D cell line are related to mouse mammary tumour virus and are of human endogenous origin. J Gen Virol 73:1087–97.
Ghosh SS, Musso GF (1987) Covalent attachment of oligonucleotides to solid supports. Nucleic Acids Res 15(13):5353–72.
Goff S.P. (1990) Retrovirus reverse transcriptase: Synthesis, Structure and Function. Review. J.Acquir.Imm.Defic.Syndr. 3:817–31.
Gregorius K, Mouritsen S, Elsner HI (1995) Hydrocoating: a new method for coupling biomolecules to solid phases. J Immunol Methods 181(1):65–73
Gronowitz JS., Neumüller M., Lennerstrand J., Bhikabahai R., Unge T., Weltman H & Källander CFR. (1991) Carrier bound templates for single tube reverse transcriptase assays and for combined purification and activity analyses, with special reference to HIV. Biotech.Appl.Biochem 13:127–142.
Gupta P., Balachandran, Grovit K., Webster D., and Rinaldo C. (1987) J.Clin.Microbiol. 25,1122–1125
Heneine W, Yamamoto S, Switzer WM, Spira TJ, Folks TM. (1995) Detection of reverse transcriptase by a highly sensitive assay in sera from persons infected with human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 171:120–1216
Heneine W, Folks; Thomas M, Switzer WM, Yamamoto S. (1995) Methods for sensitive detection of reverse transcriptase. US5849494.
Jackson B., Sannerud K., Rhame F., Tsang R. and Balfour H.H. (1987) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 7, 185–192
Krieg AM, Steinberg AD (1990) Retroviruses and autoimmunity. J Autoimmun. 3(2):137–66
Krieg AM, Gourley MF, Perl A (1992) Endogenous retroviruses: potential etiologic agents in autoimmunity. FASEB J 6(8):2537–44.
Källander CFR, Gronowitz JS, Neumüller TM, Karlström RA, Långström-Persson UM (1988). Method for polymerase activity determination. Svensk patent no 8804344–3, EP 0 447 442 B1 .
Lee M., Sano K., Morales F.E. and D.T. Imagawa (1987) Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantitate human immunodeficiency virus. J. Clin.Microbiol. 25:1717–21.
Leib-Mösch C and Seifarth W (1996) Evolution and biological significance of human retroelements. Virus genes 11:133–145.
Löwer R, Löwer J, Kurth R (1996) The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Natl Acad Sci U 5 A 93(11):5177–84.
Martinelli SC, Goff SP (1990) Rapid reversion of a deletion mutation in Moloney murine leukemia virus by recombination with a closely related endogenous provirus. Virology 174(1):135–44.
Meese E, Gottert E, Zang KD, Sauter M, Schommer S, Mueller-Lantzsch N (1996) Human endogenous retroviral element k10 (HERV-K10): chromosomal localization by somatic hybrid mapping and fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 72(1):40–2.
Neumüller M., Karlström A.R., Källander C.F.R. and J.S. Gronowitz (1990) Improved assays for DNA-polymerizing enzymes by the use of enzymatically synthetized 5-(¹²⁵I)iodo-2'deoxyuridine triphosphat, illustrated by direct quanitation of anti-HIV reverse transcriptase antibody and by serum DNA polymerase analyses. Biotech.Appl.Biochem. 12:34–56.
Niveleau A, Sage D, Reynaud C, Bruno C, Legastelois S, Thomas V, Dante R (1993) Covalent linking of haptens, proteins and nucleic acids to a modified polystyrene support. Immumol Methods 139(1–2):177–87.
Porstmann T., Meissner K., Glaser R., Döpel S.-H. and G. Sydow (1991) A sensitive non radioactive assay specific for HIV associated reverse transcriptase. J. Virol.Meth. 31:181–188.
Rasmussen SR, Larsen MR, Rasmussen SE (1991) Covalent immobilization of DNA onto polystyrene microwells: the molecules are only bound at the 5' end. Anal Biochem 198(1):138–42.
Silver J, Maudru T, Fujita K and Repaske R (1993) An RT-PCR assay for the enzyme activity of reverse transcriptase capable of detecting single virions. Nucleic Acids Res 21:3593–3594.
Temin HM, Mizutani S (1970) RNA-dependet DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226:1211–1213.
Tönjes RR, Boller K, Limbach C, Lugert R, Kurth R. Characterization of human endogenous retrovirus type K virus-like particles generated from recombinant baculoviruses (1997) Virology 233(2):280–91.
Urabe T, Sano K, Nakano T, Odawara F, Lee MH, Otake T, et al. (1994) Differentiation between human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-2 isolates by nonradioisotopic reverse transcriptase-typing assay. J Clin Microbiol; 32:1870–75.
Umovitz HB and Murphy WH (1996) Human endogenous retroviruses: Nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin Microbiol Rev 9: 72–99.
Weiss R: The search for human RNA tumor viruses. In R Weiss, N Teich, H Varmus and J Coffin (eds) RNA Tumor viruses (2^nd ed vol 1) 1205 1281. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, New York, 1984.
Wilkinson DA., Mager DL. and Leong J.-A. (1994). Endogenous human retroviruses. In "The Retroviridae" (JA Levy, Ed), vol 3, pp 465–535, 3 vols Plenum Press, New York.
Zammatteo N, Girardeaux C, Delforge D, Pireaux JJ, Remacle J (1996) Animation of polystyrene microwells: application to the covalent grafting of DNA probes for hybridization assays. Anal Biochem 236(1):85–94.
Zinkemagel RM, Cooper S, Chambers J. Lazzarini RA, Hengartner H, Arnheiter H (1990) Virus-induced autoantibody response to a transgenic viral antigen. Nature 345:68–71.

Claims

Reverse Transkriptase (RT)-Testkit, das eine oder mehrere Packung(en) umfasst, enthaltend Festphasen-gebundene Polyriboadenylsäure (prA)- und/oder Polydesoxyadenylsäure (pdA)-Matrizen, erhältlich durch Kontaktierung einer Festphase auf Polystyrolbasis mit einer Kupplungslösung, die 1-Methylimidazol umfasst, und prA und/oder pdA, gefolgt von Inkubation, Waschen mit einem Waschpuffer, Trocknen und Verpacken, RT-Typ adaptierte, separat gepackte Testkomponenten, ausgewählt aus einer Mischung aus, oder getrennt voneinander, einem Puffer mit einem pH-Wert von ≌ 7–8, divalenten Metallionen, einem Chelatbildner, Polyamin, RNase-Inhibitor, Reduktionsmittel, Salz, Stabilisierungsmittel und Detergens, und eine Mischung aus, oder getrennt voneinander, lyophilisiertem Desoxynukleotidtriphosphat, Primer, Schutzmittel und konzentriertem Waschpuffer.
RT-Testkit gemäss Anspruch 1, das ferner lyophilisierte(s) Referenzenzym(e) umfasst.
RT-Testkit gemäss Anspruch 1 oder 2, das ferner Komponenten eines Nachweissystems umfasst, das lyophilisierten, alkalischen, phosphatasekonjugierten Anti-BrdU-monoklonalen Antikörper, alkalischen Phosphatasesubstratpuffer und alkalisches Phosphatasesubstrat umfasst.
RT-Testkit gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die verpackte(n) Festphasen-gebundene(n) Matrize(n) Mikrotiterplatten-gebundene Matrize(n) ist/sind, erhältlich durch Kontaktierung jeder Quelle der Platte mit einem Aliquot der Kupplungslösung, die 100 mM 1-Methylimidazol, pH ≌ 57, und 0,5–2 mg/ml prA und/oder pdA umfasst, gefolgt von Inkubation bei einer Temperatur von 10–60°C für 0,5–10 Stunden, und Waschen jeder Quelle zur Entfernung des 1-Methylimidazols mit dem Waschpuffer, der Bistrispropan, pH ≌ 5–7 umfasst, gefolgt von Trocknen und Verpacken der Platte.
RT-Testkit gemäss Anspruch 4, worin die verpackte(n) Mikrotiterplatten-gebundene(n) Matrize(n) erhalten wird/werden durch Kontaktieren jeder Quelle der Platte mit 100 μl der Kupplungslösung, die 100 mM 1-Methylimidazol, pH . 6,25, und 1 mg/ml prA und/oder pdA umfasst, und nachfolgende Inkubation bei Raumtemperatur für etwa 2 Stunden, Waschen jeder Quelle mit 2 × 300 μl des Waschpuffers, der 10 mM Bis-trispropan, pH ≌ 6,25, umfasst, Trocknen der Platten bei 37°C für ≌ 25 Minuten und Einlegen der Platten in Folienbeutel und Vakuumverschliessen der Beutel.
RT-Testkit gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Testkomponenten ausgewählt sind aus den Puffern Tris und HEPES, pH ≌ 7-8, den divalenten Metallionen Mg2+ und Mn²⁺, den Chelatbildnern Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), und den Polyaminen Spermin und Spermidin, den RNase-Inhibitoren Heparinsulfat und Dextransulfat, den Reduktionsmitteln Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE) und Glutathion, den Salzen NaCl und KCl, den Stabilisierungsmitteln für Serum aus neugeborenen Kälbern (NCS) und Rinderserumalbumin (BSA), den Detergenzien Tween 20 und Triton X-100, dem Desoxynukleotidtriphosphat BrdUTP, dem Primer Oligo dT und den Schutzmitteln ATP, GTP und CTP.
Verwendung eines Testkits gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 zur qualitativen und quantitativen Analyse der RT-Aktivität in einer biologischen Probe.
Verwendung gemäss Anspruch 7, worin die biologische Probe ausgewählt ist aus biologischen Flüssigkeiten und Zellextrakten.
Verwendung gemäss Anspruch 8, worin die biologische Flüssigkeit ausgewählt ist aus Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Thoraxflüssigkeit.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Bewertung des Status einer Störung oder Erkrankung, die mit der RT-Aktivität in der biologischen Probe in Verbindung steht, auf Basis des Ergebnisses der Analyse der RT-Aktivität.